CN108004275A - 一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用，属于生物工程领域。本发明是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达β‑酮硫解酶基因、3‑羟酰基‑辅酶A脱氢酶基因、3‑羟基己二酰脱氢酶基因、5‑羧基‑2‑戊烯酰辅酶A还原酶基因、己二酰辅酶A，并替换启动子；己二酸的摇瓶产量可达到2.23g/L，产率达51.6％。此重组菌的启动子进行替换，不需额外添加诱导剂，节约成本。

Description

一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用，属于生物工程领域。
背景技术
己二酸(Adipic acid，adipate)又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，广泛应用于化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面。目前己二酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在己二酸的化学合成过程中主要以苯为原料，通过化学方法合成，原料和中间产物毒性很强，而且过程中产生大量的N2O等温室气体，环境污染严重且不可持续。
为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成己二酸的方法有生物催化法和全生物合成方法。主要的生物催化法主要是利用微生物催化合成己二酸前体顺，顺-粘康酸，然后再利用金属催化剂催化合成己二酸。全生物合成己二酸的方法包括：大肠杆菌以葡萄糖为底物利用乙酰CoA和琥珀酰CoA作为底物全生物合成；酿酒酵母利用脂肪酸氧化法全生物合成己二酸。以葡萄糖为底物全生物合成己二酸具有工艺流程简单、总投入成本低、可循环利用等突出优点，因此备受研究人员青睐。但是上述反应在生产己二酸的过程中均需添加诱导剂，昂贵的诱导剂价格限制了全生物合成己二酸方法的应用。本发明在全生物合成己二酸方法的基础上，改变启动子，实现了不加诱导剂即可生产己二酸，节约成本，具有广阔的应用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种不加诱导剂即可生产己二酸的重组大肠杆菌。
本发明的第一个目的是提供一种产己二酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过量表达β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因、3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因和己二酰辅酶A合成酶基因；其中，β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因、3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因以启动子PUTRrpsT启动表达，己二酰辅酶A合成酶基因以PUTRlpp启动表达。
在本发明的一种实施方式中，所述β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因、3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因的NCBI登录号分别为Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648。
在本发明的一种实施方式中，所述基因Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648以pHHD01K为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述己二酰辅酶A合成酶基因的NCBI登录号为Tfu_2576和Tfu_2577。
在本发明的一种实施方式中，所述基因Tfu_2576和Tfu_2577以pTrc99a为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达异源基因β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(Tfu_2399)，3-羟基己二酰脱氢酶基因(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(Tfu_1648)，己二酰辅酶A合成酶(Tfu_2576，Tfu_2577)；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648以启动子替换为PUTRrpsT的pHHD01K为表达载体；基因Tfu_2576、Tfu_2577以启动子替换为PUTRlpp的pTrc99a为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述异源基因β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(Tfu_2399)，3-羟基己二酰脱氢酶基因(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(Tfu_1648)，己二酰辅酶A合成酶(Tfu_2576，Tfu_2577)来自褐色喜热裂孢菌。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子PUTRrpsT在Obtaining a Panel ofCascade Promoter-5′-UTR Complexes in Escherichia coli(S Zhou,R Ding,J Chenet,Acs Synthetic Biology,2017,6(6))中报道。
在本发明的一种实施方式中，所述载体pHHD01K在Engineering E.coli for thebiosynthesis of 3-hydroxy-γ-butyrolactone(3HBL)and 3,4-dihydroxybutyric acid(3,4-DHBA)as value-added chemicals from glucose as a sole carbon source(HDhamankar,Y Tarasova,CH Martin,KLJ Prather,Metabolic Engineering,2014,25:72)中报道。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子PUTRlpp在Obtaining a Panel ofCascade Promoter-5′-UTR Complexes in Escherichia coli(S Zhou,R Ding,J Chenet,Acs Synthetic Biology,2017,6(6))中报道。
本发明第二个目的是提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)以质粒pHHD01K为骨架载体，连接基因片段Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648得到重组质粒pAD-13；
(2)以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒pAD-12；
(3)以质粒pAD-12，pAD-13为模板，使其启动子分别更换为PUTRlpp，PUTRrpsT，得到质粒pAD-12*，pAD-13*；
(4)将pAD-12*，pAD-13*转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种应用所述重组大肠杆菌发酵生产己二酸的方法，所述方法是以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌于35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时降温至30℃诱导培养。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以2～4％的接种量，将重组大肠杆菌接种至装有3L SOB培养基的5L发酵罐中，搅拌转速400～500rpm，通气量1～2vvm，以2M NaOH维持pH为6.8～7.2，发酵温度37℃，培养至OD600为0.6-0.8时降温至30℃诱导。
在本发明的一种实施方式中，所述SOB培养基的成分为1～3g/100ml胰蛋白胨、0.1～1g/100ml酵母粉、0.01～0.1g/100ml NaCl、2～3mM KCl、5～15mM MgCl2、0.5～1g/100ml葡萄糖、20～60μg/ml硫酸卡那霉素、20～60μg/ml氨苄青霉素。
在本发明的一种实施方式中，所述SOB培养基的成分为2g/100ml胰蛋白胨、0.5g/100ml酵母粉、0.05g/100ml NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、0.8g/100ml葡萄糖、50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml氨苄青霉素。
本发明的第四个目的是提供所述重组大肠杆菌在化工生产、有机合成、医药制造、润滑剂制造中的应用。
本发明的有益效果：
与化学法相比，大肠杆菌全生物法合成己二酸，极大程度地降低了对环境的污染程度。与前期已报道的生物法合成己二酸相比，本发明中所提到发酵工艺实现了大肠杆菌BL21(DE3)高产己二酸，并且减少了诱导剂的使用，节约成本。
以葡萄糖为唯一碳源，摇瓶发酵产量为2.23g/L，产率为51.6％。由于构建的重组大肠杆菌生长状况比较好，能长时间在SOB培养基中生长产己二酸比较稳定，不使用诱导剂，节约成本。
附图说明
图1为己二酸合成途径；
图2为pAD-12质粒图谱；
图3为pAD-12*质粒图谱；
图4为pAD-13质粒图谱；
图5为pAD-13*质粒图谱。
具体实施方式
表1下述实施例涉及的引物序列表
实施例1：重组质粒pAD-12构建及重组大肠杆菌的获得
Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648、Tfu_2576、Tfu_2577的序列已于申请日前在NCBI中公布。
NcoⅠ和Hind III双酶切质粒pTrc99a，切胶回收质粒片段，用引物pcr出Tfu_2576、Tfu_2577，切胶回收得到目的基因片段，然后将这三个片段用吉布森JABSBAN连接至质粒pTrc99a，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pAD-12。NcoⅠ和EcoRⅤ酶切质粒pAD-12与PUTRlpp目的基因片段，切胶回收目的基因片段，然后将两个目的片段用T4DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pAD-12*。
其他质粒使用同样的方法进行构建，质粒pHHD01K通过EcoR I和BamHI进行双酶切，切胶回收质粒片段。用引物pcr出Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648片段，切胶回收目的片段，然后将这五个片段用吉布森连接到质粒pHHD01K上形成pAD-13质粒；pAD13和PUTRrpsT用Ava I和EcoR I双酶切处理，切胶回收目的基因片段，然后将两个目的片段用T4DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pAD-12*质粒。
将pAD-12*、pAD-13*转入BL21(DE3)制备重组大肠杆菌。
实施例2：重组大肠杆菌初步摇瓶发酵及结果分析
发酵培养基：SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mMKCl+10mM MgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。
发酵条件：2％接种量，接种于摇瓶发酵培养基SOB中，使其初始OD600为0.1。37℃、200r/min培养至OD600为0.6-0.8左右时改为30℃、200rpm/min培养。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。上罐发酵己二酸产量为2.23g/L，产率为51.6％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgga tggcgatctt tctgaccaa 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aaagaggtat atattaatga gcgatttcga tctgta 36
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
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<210> 5
<211> 85
<212> DNA
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<212> DNA
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g 61
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<212> DNA
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<400> 18
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g 61
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<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
agggcaatct cagcggcctg ta 22

Claims (10)

1.一种产己二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌过量表达β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因、3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因和己二酰辅酶A合成酶基因；其中，β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因、3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因以启动子PUTRrpsT启动表达，己二酰辅酶A合成酶基因以PUTRlpp启动表达。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因、3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因的NCBI登录号分别为Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648以pHHD01K为表达载体。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述己二酰辅酶A合成酶基因的NCBI登录号为Tfu_2576和Tfu_2577。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因Tfu_2576和Tfu_2577以pTrc99a为表达载体。
6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
7.一种构建权利要求1所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以质粒pHHD01K为骨架载体，连接基因片段Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648得到重组质粒pAD-13；
(2)以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒pAD-12；
(3)以质粒pAD-12，pAD-13为模板，使其启动子分别更换为PUTRlpp，PUTRrpsT，得到质粒pAD-12*，pAD-13*；
(4)将pAD-12*，pAD-13*转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。
8.一种应用权利要求1所述重组大肠杆菌发酵生产己二酸的方法，其特征在于，所述方法是以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌于35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时降温至30℃诱导培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是以2～4％的接种量，将重组大肠杆菌接种至装有3L SOB培养基的5L发酵罐中，搅拌转速400～500rpm，通气量1～2vvm，以2M NaOH维持pH为6.8～7.2，发酵温度37℃，培养至OD600为0.6-0.8时降温至30℃诱导。
10.权利要求1所述的重组大肠杆菌在化工生产、有机合成、医药制造、润滑剂制造中的应用。
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