CN112639478A - 用于验证培养装置性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本文报道了一种用于确定在哺乳动物或细菌细胞的培养过程中获得的过程数据是否受到问题影响的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在针对表达重组异源多肽的所述哺乳动物或细菌细胞所产生的代谢模型中，拟合表达相同重组异源多肽的相同哺乳动物或细菌细胞的所述培养过程中获得的所述过程数据，和(ii)如果建模拟合显示关于原始数据的偏移大于10％，或所述建模拟合具有的由Pearson卡方检验确定的chi2值大于5，则确定所述培养受到问题影响。
Description
本发明属于细胞培养领域，更确切地说属于高通量细胞培养领域。本文报道了确定细胞培养是否受问题影响的方法。实验确定的数据的对齐或/和一致性控制尤其在计算机代谢建模中开发。借由使用通过细胞模型的代谢通量分析，可以基于模型与实验之间的拟合来检查体外数据的一致性。
背景技术
现代生物治疗药物在治疗复杂的多因素疾病(如癌症、糖尿病或类风湿性关节炎)中满足了日益增长的需求。大多数生物治疗药物在已建立的哺乳动物细胞系(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)或已明确表征的细菌菌株(如大肠杆菌(E.coli))中产生。
传统上，细胞系开发和过程开发对于基于细胞的生物过程而言既费时又繁琐，这是因为除其他因素外，还需要基因扩增和克隆选择。这与为正在进行临床前和临床评价的许多候选药物快速提供足够材料的需求相矛盾。
用于生产生物治疗药物的细胞系开发速度的加快，为支持计算机方法用于时间和劳动密集型体外和体内方法的发展产生了强大的动力。
深入表征高产细胞系和生物过程对于确保大量选择合适的克隆以强力且一致地生产用于临床前和临床应用的大量高质量生物治疗药物至关重要。这要求在生物过程开发中应用适当的方法，以实现细胞克隆和过程的有意义的表征。
利用过程分析技术(PAT)进行线上过程监控的最新进展以及对工业细胞培养中关键产物质量属性的日益关注，极大地增加了当今可用过程数据的广度和数量。
为了从此类丰富的过程数据中提取信息并预测生物过程性能，基于统计模型的多变量数据分析在当前应用的方法中承担主要位置(Pais等人，Curr.Opin.Biotechnol.30C(2014)161–167；Schaub等人，见：Hu WS,Zeng A-P,编辑，Genomics and systems biologyof mammalian cell culture.Berlin Heidelberg:Springer.2012,133–163.http://link.springer.com/chapter/10.1007/10_2010_98)。已平行开发用于几种哺乳细胞系的机理代谢模型(Dietmair等人，Biotechnol.Bioeng.109(2012)1404–1414；Nolan和Lee,Metab.Eng.13(2011)108–124；Provost等人，Bioprocess Biosyst.Eng.29(2006)349–366；Selvarasu等人，Mol.Biosyst.6(2010)152–161；Sheikh等人，Biotechnol.Prog.21(2005)112-121)。这种模型之所以具有吸引力是因为它们可以利用新获得的基因组信息(Birzele等人，Nucl.Acids Res.38(2010)3999–4010；Brinkrolf等人，Nat.Biotechnol.31(2013)694–695；Lewis等人，Nat.Biotechnol.31(2013)759–765)和定量代谢物测量，仅根据细胞外数据即可对细胞内状态进行全面评估。以这种方式，它们还可以在过程开发和克隆选择中与诸如微型生物反应器等规模缩小的发酵系统很好地对接(Bareither和Pollard,Biotechnol.Prog.27(2011)2–14；Hsu等人，Cytotechnol.64(2012)667-678)。这些系统获得越来越多的认可，因为它们可以提供更具有预测性的克隆表征，因为过程条件可以保持在更接近受控过程的情况下，如较大规模(Porter等人，Biotechnol.Prog.26(2010)446–1454and1455-1464；Rameez等人，Biotechnol.Prog.30(2014)718-727)。
Charaniya,S.,等人(J.Biotechnol.147(2010)186-197)公开了用于发现具有高生产力过程特征的采矿生产数据。其中，基于核的方法与基于最大余量的支持向量回归算法相结合，用于积分所有过程参数并开发关键细胞培养性能参数的预测模型。该模型还用于根据过程参数在预测过程结果中的相关性来识别和排序过程参数。
Popp,O.,等人(Biotechnol.Bioeng.113(2016)2005-2019)公开了用于支持代谢克隆性能的全面表征的混合方法。这种方法将代谢物谱分析与多元数据分析和通量组学相结合，以实现与预期细胞表型相关的关键代谢特征的数据驱动机理分析。作者已经将该方法应用于定量和比较一组10个重组CHO-K1生产者克隆和宿主细胞系中的代谢性能，并能够得出一组扩展的克隆性能标准，这些标准不仅捕获生长和产物形成，而且还纳入有关细胞内克隆生理和过程中代谢变化的信息。使用这些标准可以对克隆进行定量排名，并可以识别产生较高产物滴度的高产CHO-K1克隆之间的代谢差异。
WO 2011/140093公开了一种评估受试者中非酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎和/或肝纤维化的严重程度的方法，该方法包括从受试者获得身体样品并确定当与健康个体的样品相比时该样品中至少一种氧化脂肪酸产物的水平。
WO 2011/136515公开了仅在最近，基因组规模技术能够进行系统级分析以阐明哺乳动物细胞中蛋白产生的复杂生物分子基础，从而有望增进对过程的了解并推导基于知识的方法以进行进一步的过程优化。该文件描述了一种使用这种基于知识的方法进行合理细胞培养过程的方法。
Paul,W.,等人(https://dc.engconfintl.org/ccexvi/161/)公开了代谢/过程建模和结果的新方法。他们已发现混合代谢模型为细胞内代谢通量计算和预测未来细胞的代谢状态提供了一种新方法。这些模型实现了代谢驱动的过程控制。人工神经网络以高置信度和平均低均方根误差(RMSE)～20％(POC)成功地获得代谢通量估计值。
当前基于代谢模型的方法依赖于手动将数据插入已开发的模型中。可能会发生数据输入错误并损害整个模型输出的情况。当完全执行时，异常值检测方法依赖于不稳定的数据结构，而不依赖于生物学相关性和数据的交叉验证。
发明内容
本发明的一个目的是提供使用计算机建模和代谢通量分析来识别或确定受问题影响的细胞培养物的方法，该问题即实验确定的数据的对齐和/或一致性控制。通过确定模型与实验数据之间的拟合优度，可以识别受问题影响的培养。该问题可能是技术问题，也可能是生物学问题。技术问题基于用于执行培养的硬件故障。生物学问题是基于细胞本身，例如，是由于培养的细菌或真菌污染所致。优选地，该问题是与用于执行和/或监控培养的硬件(即，探针、器皿、电子、装置、分析等)相关的技术问题。
因此，本文提供了通过确定实验数据与(已建立的)代谢模型的拟合优度(GoF)来验证培养性能的方法。
根据本发明的所有方法均包括任一以下第一组步骤：
-使用针对表达相同重组异源多肽的相同细胞生成的代谢模型，拟合表达重组异源多肽(优选为抗体)的细胞克隆培养过程中获得的过程数据，以及
-当获得的拟合显示关于原始数据的偏移大于10％时，确定培养受问题影响；
或以下第二组步骤：
-接收培养细胞克隆的过程数据，其中该细胞克隆产生与所述细胞异源的多肽，优选为抗体，
-使用针对所述细胞建立的代谢模型对数据进行拟合，并通过统计相关方法(优选为Pearson卡方检验)确定的chi2(也称为χ2)值来表征，以及
-如果chi2值大于5，则确认过程数据受问题影响。
附图说明
图1 14天进料分批培养实验的代谢模型拟合，其中含有损坏的且已校正的进料浓度数据。根据离散的测量过程中数据(具有通用误差方差的黑箱)，将14天的分批进料培养分为5个不同的代谢阶段(水平线)。黑线拟合产生的代谢物的消耗速率(基于漂移量)。测量和建模数据的偏移量(A)表示损坏的数据输入。显示了校正的数据集(B)的测量数据和建模数据的匹配。
图2比率的平均值和标准偏差的相关图，该比率是根据已测得的量相对于协调模型率绘制的。显示的是发酵9(浅灰色圆圈)、14(灰色倒三角形)和51(黑色正方形)。虚线表示1:1相关线。速率由测量的量确定。
图3不同培养和模型情景组合的2值。显示的2是每个代谢阶段中2的中位值，以及检测发酵批次的模型变体(模型1至模型6)(另见表3)。热图右侧的数字是重复组。
图4显示了表达相同产物的两个不同重组CHO克隆(克隆1和克隆2)的活细胞密度和乳酸动力学。通过进料分批过程培养细胞，并在过程控制分析中通过离散线上分析。
图5在14天的分批进料过程中表达相同产物的重组CHO克隆1和克隆2的建模速率。显示了所有五个代谢阶段(水平线)的测量(协调)速率(具有通用误差方差的黑框)和建模(黑箱)速率。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“通量分析”表示生化化学计量反应和途径的数学检查。
如本文所用，术语“通量平衡分析”简称“FBA”表示借助于线性代数的生化化学计量模型的优化，以最大化或最小化既定目标函数。
如本文所使用，术语“约束通量分析”表示通量分析，其中代谢模型中每个反应的最大和最小允许通量值被约束为不超过指定值。
如本文所用，术语“基因组规模”表示生物体的遗传能力到生化化学计量反应上的详尽映射。基因组规模模型从生物的测序基因组信息中得出，并通过文献信息和实验验证进一步确定。
如本文所用，术语“过程中控制”表示控制、分析和解释培养过程所需的用于评估物理培养参数的连续(例如，几分钟内的值)或离散(例如，每天一个值)值、量和水平以及细胞表型和代谢型参数的方法和方式。为此，可以线上、在线或离线生成参数。
如本文所使用的，术语“过程数据”表示线上和离线获取的瞬时过程参数值的总和，包括(计算的)结果变量，诸如速率。“过程数据”以时间依赖的方式被获取并存档，即被存储。如本文所用，术语“过程数据”至少包括变量活力；活细胞密度；活细胞体积；营养物(诸如，例如葡萄糖、磷酸盐、氨基酸、脂肪酸)以及代谢物(诸如，例如乳酸、氨)的消耗和产生速率；产物；过程相关参数，诸如，例如物理参数温度、溶解氧浓度、pH、曝气速率、反应器质量、添加的校正液和/或添加的进料。由于形成过程数据的过程参数是分析值，因此容易出现技术问题。这些技术问题尤其涉及例如采样，使用的分析装置，或如果人参与，则涉及人为错误。
如本文所用，术语“哺乳动物细胞克隆”表示已转染编码分泌的异源多肽的核酸并表达所述分泌的异源多肽的哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“代谢通量分析”简称“MFA”表示将生化反应上测得的通量映射到生化化学计量模型上，并且随后使模型内的总误差最小。
如本文所用，术语“代谢网络(重)构建”表示导致代谢反应网络的构建的活动的组合。除了采集生化途径信息外，还需要对代谢网络进行管理和验证才能获得功能性代谢网络重建。
如本文所用，术语“多元数据分析”表示结合统计或数学分析对多个参数的观察和分析。
如本文所用，术语“网络模型”表示生物体生化反应网络的数学表示。
如本文所用，术语“亲代哺乳动物细胞”表示在转染编码分泌的异源多肽的核酸之前的哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“过程中记录的数据的验证”表示通过测量可信度来检查在发酵系统内产生的数据。
如本文所用，术语“统计相关方法”表示统计方法，通过该统计方法可以显示变量对彼此之间i)是否关联和ii)关联的程度。
如本文所用，术语“Pearson卡方检验”表示用于计算观察到的频率分布是否不同于理论分布的方法。它是相关系数，即两个变量的协方差除以它们的标准偏差的乘积。其结果是两个变量X与Y之间的线性相关性的指标。其值介于+1和-1之间，其中1为总正线性相关，0为无线性相关，-1为总负线性相关。
模型生成
明确指出，提供以下模型生成的描述仅仅是为了提供对可用于实施本发明的方法的书面描述。这样做是为了举例说明本发明而不是限制本发明。用于模型构建的多种不同方法和方式是本领域技术人员已知的，并且可以同样地应用于根据本发明的方法中。
根据本发明的方法可以使用任何代谢模型来执行，只要在根据本发明的方法的所有步骤中使用相同的模型即可。
本发明的方法可以使用任何哺乳动物细胞进行，只要该细胞的代谢模型可用或可以通过标准方法获得即可。
在下文中，概述了用于生成在根据本发明的方法中可用的代谢模型的示例性方法。
CHO网络模型构建、通量分析、性能指标和多元数据分析
如Popp,O.,等人报道的方法(Biotechnol.Bioeng.113(2016)2005-2019；还有其中引用的参考文献，也通过引用并入本文)作为用于生成欲在根据本发明的方法中使用的模型的示例性方法。以下对此进行总结，并在实例部分中更详细概述。
根据既定程序并基于以下概述的方法(所有内容通过引用并入本文)，从公开来源(包括数据库和主要文献)构建包括五个区室(细胞溶质、线粒体、ER、高尔基体、生物反应器)的基于基因组的CHO网络模型。
-Oberhardt等人(Mol.Syst.Biol.5(2009)320)公开了基因组规模代谢重建的应用。其中概述了存在几种用于模型建立和分析的资源。根据作者，迄今为止，所有高置信度的基因组规模的代谢重建均通过四步过程手动建立。首先，从与来自线上数据库(诸如KEGG和EXPASY)的信息相结合的基因注释数据建立初始重建，这些信息将已知基因链接到功能类别，并有助于桥接基因型与表型之间的缺口。其次，通过对原始文献的检查来策划初始重建。然后，将重建转换为可以通过基于约束的方法进行分析的数学模型。再次，通过将模型预测与表型数据进行比较来验证重建。在最后的第四步中，对代谢重建进行连续的wet-lab和dry-lab循环，这提高了准确性并允许研究关键假设。
重建包括基于从测序基因组获得的BLAST同源性评分的半自动基因注释数据，并通过详细的、任选的手动采集的生物体特定的文献数据进行扩增，以在模型建立过程中进行缺口分析，从而通过分析不完整但必不可少的代谢途径，将以前未注释的基因功能整合到基因注释知识中。缺口分析过程辅以文献检索，可以揭示先前被忽视的表型数据，并对可能存在于生物体中但目前没有相应基因注释的酶提出假设。该过程用于压缩对特定生物所做的工作。缺口分析步骤对于将基因组规模的重建(作为知识库)转换为作为功能模型的代谢GENRE至关重要，可以对其应用全套网络工具进行分析。
重建通常会努力提供高质量的细胞参数估计值，诸如生长量、比通量、P/O比和ATP维持成本，这些理论值通常用于生物学研究中的假设建立或验证。排除智人代谢的两个现有重建，真核生物网络的平均大小分别是800个代谢物、800个基因和1300个反应物。真核生物基因组中所有ORF的6％至13％通常包含在代谢GENRE中。
可以通过使用13C标记的葡萄糖实验确定细胞内的代谢通量，在该实验中，在化学恒温器培养的细胞生长过程中跟踪标记的碳，并使用计算方法来重建碳在生长过程中进入细胞内部的路径。代谢GENRE也已用作解释代谢物浓度数据的框架。在一项研究中，高通量GC-MS方法用于确定酿酒酵母(S.cerevisiae)中52种代谢物的浓度。将已知环境条件下代谢物浓度的差异映射到改良的啤酒酵母代谢GENRE中，然后将此映射与转录组数据结合以研究细胞中代谢调节的效应器。特别是转录组数据通常与其他数据类型相关联，诸如蛋白质表达数据、蛋白质-蛋白质相互作用数据、蛋白质-代谢物相互作用数据和物理相互作用数据。特别是考虑到多种数据类型，代谢GENRE可能是用于数据解释的有价值的工具。
最好将代谢GENRE视为低分辨率的蓝图，在该蓝图上可以覆盖其他系统、约束和微扰。通过将调节和信号传导数据以及其他高级系统整合到约束集中，代谢GENRE变得越来越便捷并能够表达实际的细胞表型。
作为基于约束的建模中最简单、最有用的方法之一，FBA已成为该领域的标准，通常以生物质反应为目标。FBA通过网络预测代谢通量值，FBA特别是仅产生一种最佳方案，而对于存在多个同等有效的最佳方案是很常见的。通过对FBA的扩展(称为通量变异性分析)，对该概念进行了检验，该扩展探索了整个最佳方案空间，而不是仅选择一个最佳方案，但这是一个重要的警告，应限制FBA结果的解释。
在一些情况下，已经表明，了解一些关键参数足以预测代谢和调节动力学。
经常通过计算机表型与各种体内数据集之间的比较来验证代谢GENRE。对于如何验证模型，没有标准，从现有模型验证中方法的分散表示可以明显看出。最近已努力定量计算机和体内代谢表型之间预期的差异水平。在一项值得注意的研究中，分别在16种不同的生长条件下生长并定量了465种酿酒酵母单基因突变体。对两种已公开表的酿酒酵母代谢GENRE的性能进行的分析显示，灵敏度(正确预测的非必需基因与非必需基因的总数)约为95％，特异性(正确预测的必需基因与必需基因的总数)的范围介于50％和60％之间。通过取消一些体内实验的资格，这些数字(分别)显著提高至约95–98％和69–86％，在进一步的分析中发现这是错误的。
-Sheikh等人(Biotechnol.Prog.21(2005)112-121)公开了重建的代谢网络。在重建的网络中仅考虑注释的ORF。基于生化证据，在文献中还包括其他基因产物。从总基因产物，定义了独特的反应。还考虑运输过程的进一步反应。当不计算运输过程时，最大的途径包括氨基酸、碳水化合物和核苷酸代谢。这些也构成了碳和氮代谢的主干。大多数运输反应都与质子相关的氨基酸和碳水化合物的转运有关。许多转运反应根据生理学因素推断。重要的是要注意，这种网络是通用的，不能解决组织或细胞类型之间的差异。
基于生物质组成的文献中可获得的信息，计算用于生物质合成的代谢物的消耗。该信息采集自研究不同细胞系(包括杂交瘤)的不同来源。计算平均细胞组成，并将其用于估算生物质等式中每个组分的需求：(以％，w/w计)蛋白质，74.2；DNA，1.6；RNA，6.1；碳水化合物4.5；脂质，10.1。构建平均氨基酸组成。胆固醇是唯一包含在生物质等式中的类固醇，因为已知其大量存在于膜中。
与生长和非生长相关的ATP需求是文献估计值或从文献中可获得的实验数据计算得出的。根据文献数据，以P/O比(每摩尔通过电子传输链的电子产生的mol ATP)表示的氧化磷酸化效率选择为2.5。假定以ATP计的聚合成本与在大肠杆菌中发现的相同，即以下大分子的合成和加工成本以mol ATP/mol计：蛋白质，4.3；RNA，0.4；和DNA，1.4。将氨基酸、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的总和与它们各自在ATP中的成本相乘，得出总成本为29.2mmol/g DW。从连续杂交瘤培养估算ATP产量(YxATP)和维持量(mATP)，假设总ATP产量可记为吸氧量和乳酸产量的函数：rATP＝rlac+5*rO2，其中rATP是ATP的产生速率，rlac是乳酸的产生速率，rO2是氧气消耗速率。维持能量模型随生长速率μ的加权线性回归：rATP＝YxATP*μ+mATP得出的mATP估计值为1.55mmol ATP/g DW/h，YxATP估计值为37.8mmol ATP/g DW/h；因此，生长相关的维持ATP被假定为8.6mmol ATP/g DW/h。
在给定的约束下，计算机生长所需的反应相对较少，这反映了代谢网络中包含的灵活性。这些主要涉及主要分解代谢途径(糖酵解、TCA循环和PP途径)、核苷酸代谢和氧化磷酸化。在生物合成途径中缺失生物质前体的反应(主要是脂质和核苷酸代谢)也会使细胞无法生长。一旦考虑到所有细胞组分，必要反应的数量将增加。同样，调节可能使替代路线在任何实际细胞中均不可行。但是，通用计算机细胞包含来自不同细胞类型的反应，这些反应可能永远不会共存于任何给定的细胞中。
但是，培养的动物细胞确实表现出与大肠杆菌和酿酒酵母相似的溢流代谢，这表明在中心碳代谢中可能存在共性。
动物细胞通常表现出第二特征，即谷氨酰胺分解，其特征是谷氨酰胺摄取速率高、线粒体谷氨酰胺酶释放氨、谷氨酸部分氧化从而生成丙氨酸和/或天冬氨酸。顾名思义，谷氨酰胺分解已经在类似于产生乳酸的能量学基础上得到了合理化。然而，与糖酵解不同，谷氨酰胺分解依赖于TCA循环和氧化磷酸化来产生能量。
葡萄糖、氧和谷氨酰胺的摄取以在实验观察到的速率固定，而乳酸、氨、谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸不受约束。由于鼠杂交瘤不能合成谷氨酰胺，因此从模型中去除了谷氨酰胺合成酶。同样，去除了必需氨基酸分解代谢的反应，因为杂交瘤细胞系对必需氨基酸的摄取与估计的生物合成需求相同，表明分解代谢很少或没有。最后，其他非必需氨基酸(丝氨酸、天冬酰胺、甘氨酸和脯氨酸)的摄取或产生速率固定在实际速率，按照单克隆抗体的产生速率。这样做是为了防止建模伪影，例如，用天冬酰胺替代谷氨酰胺作为主要的氮底物。
在这些模拟中固有地发现多种方案，特别是用于摄取非必需氨基酸的方案。可以通过与非必需氨基酸有关的通量分布的几种方案来实现目标功能，因为它们在许多途径中相互作用(例如，糖酵解中的丝氨酸/甘氨酸，TCA循环中的天冬氨酸/谷氨酸/谷氨酰胺，谷氨酰胺分解中的天冬酰胺/脯氨酸)。
尽管重组蛋白的产生很可能不是细胞的目标功能，但将理论产生速率与实验值进行比较仍很重要。计算不同生长速率下单克隆抗体的最大理论产生速率，并与实验确定的0.0084mmol/g DW/h的非生长相关值进行比较。在这些模拟中，必需氨基酸不受约束，即可以自由摄取以满足生物质的要求。通过限制葡萄糖和非必需氨基酸来关闭碳平衡。分别通过限制氨的产生和氧的摄取速率来关闭氮和氧化还原的平衡。废物代谢导致大量乳酸产生。糖酵解和谷氨酰胺分解在碳和能量代谢中相互作用。大量糖酵解NADH被乳酸脱氢酶再氧化。NADPH参与谷氨酰胺分解，其中NADPH通过谷氨酸脱氢酶将谷氨酰胺氮吸收到生物质中而生成。NADH和NADPH代谢的相互作用通过转氢酶反应(E.C.1.6.1.2)和能够同时使用这两种辅因子的同工酶发生。
-Selvarasu等人(Biotechnol.Bioeng.102(2009)923-934)使用大肠杆菌iJR904的基因组规模的计算机代谢模型。对其进行轻微改良以模拟DH5a大肠杆菌菌株的行为。该模型由762种代谢物(包括外部代谢物)和932种生化反应(包括运输过程)组成。为了确定代谢通量，Selvarasu等人对受化学计量(代谢物质量平衡)和热力学(反应可逆性)约束的代谢网络模型进行基于约束的通量分析。对所有测得的营养物和产物(包括葡萄糖、海藻糖、氨基酸和乙酸盐)的残留浓度曲线进行预处理，以计算其比消耗或产生速率，然后将其指定为模型中的容量约束。氧吸收速率和二氧化碳释放速率不受约束。最后，使用线性编程(LP)最大化生长阶段细胞生长速率的细胞目标，从而得到一组与最佳表型相对应的代谢通量分布。Selvarasu等人通过使用独立的通量分析程序MetaFluxNet解决了LP问题。将指数生长阶段从光密度值(OD600)测量获得的比生长速率与计算机模型预测的细胞生长进行比较，以验证结果。
在三个不同生长阶段的发酵培养主要由Selvarasu等人探索：以高生长速率为特征的初始指数生长阶段(阶段1，1-3h)、晚期指数生长阶段(阶段2，4-6h)和乙酸盐消耗阶段(早期稳定阶段；阶段3，8-10h)，其中乙酸盐作为主要碳源被消耗。对所有三个阶段进行计算机通量分析。对阶段1和阶段2中所有测得的营养物的比消耗速率进行排序。
Selvarasu等人的发现强调需要在复杂的培养基中准确测量高敏感的营养物，诸如精氨酸、丝氨酸、葡萄糖和海藻糖，因为它们在细胞代谢功能中起着重要作用。这样的测量还可以提供用于设计有效媒介组分的关键信息。
基于通量分布，计算特定代谢物周围所有传入或传出通量的总和(通量和)，以分析其在细胞内的消耗和产生。
尽管Selvarasu等人报道了计算机代谢模型可以很好地预测细胞的生长速率，可以通过考虑补充培养基中的其他重要代谢物来进一步改善预测。这也表明需要定义和准确测量其他关键代谢物，以在复杂培养基条件下精确评估细胞代谢。
通过使ATP通量最小化，同时将其他营养物/产物的生长速率和消耗/产生速率约束在实验值上，可以最好地表征稳定初期的表型状态和代谢行为。然而，必须通过将模拟的代谢行为与从基因表达谱导出的内部通量变化或与实验确定的通量进行比较，以定性或定量地验证所得的模拟代谢通量。
-Selvarasu等人(Mol.Biosyst.6(2010)152–161)报告了小鼠代谢网络的基因组规模重建。基于先前的模型和来自各种资源的相关信息，系统地重建小鼠的基因组规模代谢网络。
Selvarasu等人考虑了先前的mouse26通用模型作为起点。最初，识别并去除模型中的重复或冗余反应。然后，对该模型进行了各种模拟，以验证其产生每个细胞组分的能力，这些细胞组分定义了来自不同碳源的生物质。这使得Selvarasu等人查找网络中缺失的链接或缺口，然后通过添加从几种线上资源(KEGG、RIKEN、MGI、BRENDA和ExPaSy)和小鼠(M.musculus)相关文献中获得的相关酶促和转运反应以及相关文献来填补它们。此外，还包括有关新开放阅读框(ORF)和GPR关联的信息，从而明显扩展了模型的范围。
Selvarasu等人的重建基因组规模小鼠网络的可视化和统计分析均使用网络分析软件BioNetMiner(http://bio.netminer.com)进行。BioNetMiner嵌入的图形布局算法，力导向的Kamada-Kawai和GEM可以有效地可视化大型小鼠网络。此外，可以通过分别使用程度和中间中心度来识别高度连接和桥接的代谢物来对网络拓扑进行统计分析。
一旦重建的基因组规模代谢网络达到化学计量平衡，就可以通过基于约束的通量分析以定量和定性两种方式检查模型的预测能力。最初，在细胞生长阶段的稳定假设下，细胞生物质的产生可以被认为是合理的细胞目标，可以将其最大化以定量细胞生长表型。然后将所得的生长速率与实验观察到的比生长速率进行比较。随后，可以通过模拟基础培养基要求和基因缺失分析来定性评估模型。可以通过使培养基中所有消耗的底物的总和最小化来确定基础营养物组分；在确定的基础培养基条件下，细胞生长最大化，将每个反应通量约束为零。当反应和相应基因的去除导致零生长时，则认为该反应和相应基因至关重要。同样，在细胞生长条件下，可以通过强制每种代谢物的通量总和为零来识别必需代谢物。最后，可以基于基因/代谢物的必要性及其与网络结构特征的相关性来研究小鼠代谢的功能组织。所有这些线性优化问题均由MetaFluxNet和GAMS/CPLEX 10.0解决。
与先前的mouse26模型相比，Selvarasu等人新增加的490种反应，提供有关基因-蛋白质反应(GPR)关联的最新信息，以及有关脂质、氨基酸、碳水化合物和核苷酸代谢的详细说明。该模型由724个基因、715个酶、1162个内部代谢物和1494个反应组成；1246个反应是胞质溶胶(1085)和线粒体(161)内的生化转化，而248个是交换反应，描述了细胞内和细胞外膜(171)与胞质和线粒体(77)之间的代谢物运输。除了生化反应，Selvarasu等人推导了一个平衡等式，用于从生物合成前体(诸如蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、RNA和其他细胞组分)的实验组成中表达细胞生物质，以及用于其转化和组装的相关能量辅因子。在重建过程中，通过检查模型的一致性、准确性和完整性来反复执行所得网络的手动管理，直到模拟结果在数量和质量上与实验观察结果一致。这使得Selvarasu等人寻找知识缺口以完善模型。
使用基于约束的通量分析检测小鼠模型的预测能力，该分析基于产生抗F单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞的批培养数据，该细胞在补充脯氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的DMEM培养基中生长。生物质的产生被最大化以模拟细胞生长条件，从而约束在培养过程中营养物/产物的比消耗/产生速率。在整个分批培养中，所得的生长速率(0.048h-1)高于平均比生长速率(0.0362h-1)。Selvarasu等人认为当在计算机模拟中使用相关测量值以反映指数生长阶段中更实际的操作条件时，可以改善生长预测。
对于定性模型预测，Selvarasu等人对细胞生长所需的基础培养基要求进行计算机分析，最终识别所需的培养基组分。Selvarasu等人包括必需氨基酸、叶酸和磷酸盐，它们与实验观察到的必需组分和实验动物的营养需求几乎一致。但是，计算机分析无法识别某些基础培养基组分，诸如生长因子、辅因子和矿物质(生物素、硫胺素、维生素、钙和镁离子等)。不出乎意料，小鼠细胞的预期生长并不仅仅受葡萄糖摄取的直接影响。相反，它由必需氨基酸的摄取决定，从而证实先前的观察结果，即在葡萄糖缺乏或有限的条件下，与微生物细胞不同，哺乳动物系统可以通过利用其他营养物(如必需氨基酸)存活。
基因必需性分析还允许Selvarasu等人以迭代方式验证和改进新小鼠模型。使用当前和先前的模型预测的所有必需基因均与来自KOMP(KnockOut Mouse Project)数据库的实验报告的必需基因进行比较。大多数计算机上必需基因已通过实验确认，而Selvarasu等人还发现了一些假阳性预测。此类信息可以重新包含在模型中以改善其预测。
从结构和功能点的角度探讨了重建模型的特征。首先，统计网络分析识别了大型群集弱连接反应(占总反应的89％)和119个小群集，具有1至17个连接反应。Selvarasu等人然后计算网络直径，同时排除辅因子代谢物(例如，ATP、H2O、CO2等)，以防止将它们识别为网络中的主要枢纽而没有生物学意义。大型群集的最终网络直径经测量为40。平均路径长度(APL)也被计算为8.51，表明网络中的大多数代谢物可以通过大约3B4反应彼此转化。对三个主要子网络进行类似分析，与先前的模型相比，碳水化合物、氨基酸和脂质代谢显著改善，产生不同的网络直径和APL。
Selvarasu等人还通过计算代谢物的程度和中间中心度来探索网络拓扑，从而识别网络中高度连接和关键的(桥接作用)组分。Selvarasu等人通过比较基本代谢物及其中心度评分，进一步研究网络的拓扑特性。细胞生长的必需代谢物使用通量总和法获得。据观察，必需代谢物的平均中心度评分(度：6.37和中间中心度：0.00198)远高于非必需(2.55和中间中心度)：0.00039)。出乎意料地，代谢中心度与代谢必需性没有明确关联。
Selvarasu等人在确定的培养基中识别出一组细胞生长的必需基因。最初，假定单基因反应关联在丰富培养基(RM)以及基础培养基(MM)条件下执行基因缺失分析。在RM条件下的109个必要反应中，有93个与基因相关，有6个与基因无关，还有10个与氨基酸运输有关。有意思的是，必要反应的最高百分比(59％)来自脂质代谢(脂肪酸生物合成和脂肪酸代谢)，这表明它可能是最容易受到环境干扰的子系统之一。在MM条件下，另外6个反应来自氨基酸(5)和碳水化合物(1)代谢。当考虑到GPR关联时，由于目前的基因组规模模型中存在许多同功酶和多功能蛋白，因此仅识别72个必需基因。例如，脂肪酸合酶(fasN)，一种多功能蛋白质，单独催化脂质代谢中的37个反应，而其他基因或蛋白质与代谢网络中的至少两个或多个反应相关。
低百分比(10％)的必要反应的存在表示小鼠的代谢具有高度灵活性和强健性，可通过内部变化来通过替代途径获得相同的表型，从而使两个反应/基因变得不必要，并使网络变得灵活。考虑到探索这样的组合基因/反应，Selvarasu等人进行了双敲除分析。从超过9.5*106对1385个非必要反应，Selvarasu等人仅识别涉及114个独特反应的139个致死对。最重要的对属于两类：(i)产生相同代谢物的两个反应，以及(ii)产生和消耗相同代谢物的随后两个反应。已经成功应用类似的分析方法，并阐明幽门螺杆菌的功能特征，从而证明细胞的稳健性并建议进行多重缺失分析以识别药物靶标。
在用于证明本发明的主要代谢途径(糖酵解、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径、呼吸链)的示例性模型(参见下面实例部分的材料和方法)中，此外还包括主要生物质成分(蛋白质、脂质、RNA、DNA、碳水化合物)、C1代谢和氨基酸降解途径的生物合成。对于重组蛋白产物形成研究，制定相应的一组产物形成反应，考虑重组蛋白的氨基酸组成和代表性糖基化结构(每个产物分子两个唾液酸双角聚糖)。所得模型包含654个反应、583个代谢物，并代表266个ORF。选择与先前关于CHO细胞或鼠细胞系的研究相当的生物质组成(参见，例如，Altamirano等人，Biotechnol.Prog.17(2001)1032–1041；Bonarius等人，Biotechnol.Bioeng.50(1996)299–318；Selvarasu等人，Biotechnol.Bioeng.109(2012)1415–1429)。
使用市售软件包进行模型重建和模型模拟。为了模型验证，已确认所有反应的元素平衡和电荷平衡均已关闭。此外，通量平衡分析(参见，例如，Savinell和Paulson,J.Theor.Biol.154(1992)421–454and 455–473)用于验证各个途径的功能。在CHO发酵过程中采集的时间序列记录数据可用于描述网络中活跃的代谢途径，并支持识别主要同工酶种类。
通过首先将整个发酵过程细分为生理上不同的过程阶段来进行细胞摄取和产生速率的估算。例如，这可以通过计算优化程序来完成，其中使用基于χ2的拟合优度检验确定最佳过程阶段数。在每个过程阶段，假定细胞生理恒定，这表示恒定的生物质比速率。使用非线性回归确定这些生物质比速率。产生的摄取和产生速率可以用作进行代谢通量分析的输入(参见，例如，Maier等人,Biotechnol.Bioeng.100(2008)355–370；Niklas等人,Curr.Opin.Biotechnol.21(2010)63–69；Stephanopoulos等人,1998,Metabolicengineering:Principles and methodologies.San Diego:Academic Press)。证实所计算的通量分布的热力学一致性。
代谢物数据、过程数据和细胞内通量分布的Pearson和Spearman相关性的计算使用市售软件包进行(参见以下实例部分中的材料和方法)。
本发明的实施例
机理代谢建模可用于：
-快速高效地选择/评价高生产者克隆，
-通过调节/优化培养基组成、进料方式和过程参数来提高体积滴度，
-通过调节/优化培养基组成、进料方式和过程参数来提高产物质量，和/或
-将高通量数据和压缩数据积分为可读和可解释的格式。
机理建模实现瞬时解析和分析细胞内代谢通量(MFA)及其优化(FBA)。机理建模的总体目标是用于自动CHO细胞性能分析的高通量方法，从而实现过程优化和/或克隆选择。
但是该方法需要可靠且一致的输入(原始)数据，以提供有用且可靠的结果/读数。
目前，本发明人发现，机理代谢模型也可以用于高通量培养数据的质量控制，诸如
-识别培养过程中的技术问题，例如探针关闭、传感器漂移、管道堵塞、过程中控制分析错误、离线分析错误、培养基制备问题等，
和/或
-过程控制中的预处理/数据一致性检查。
因此，本发明包括用于对任何进行中的和最终的培养数据进行有效、一致且任选地与用户无关的数据一致性检查的方法。根据本发明的方法特别适合于高通量应用。
本文报告了通用模型的使用，即通用模型可用于所有CHO克隆和基于CHO的过程以及大肠杆菌克隆和基于大肠杆菌的过程，作为来自各种不同的线上、在线和离线数据的发酵数据的有效数据积分点以及解释和/或数据分析。该模型允许交叉检查数据并降低数据的自由度(“该值有意义吗？”)。数据中的失拟用于识别损坏/不一致的数据源(例如，传感器缺陷、数据丢失、人为错误等)。因此，可以使用机理代谢模型来更可靠、更有效和快速识别和/或选择和/或评价高生产者克隆；通过调节/优化培养基组成、进料方式和过程参数来提高体积滴度的筛选过程；识别培养期间的技术问题(例如关闭探针)，IPK分析；将高通量数据和压缩数据积分为可读和可解释的格式；可靠的知识生成；或/和过程控制中的预处理/数据一致性检查。
在一个实例中，使用全部稳定表达相同重组单克隆IgG4抗体的不同CHO-K1细胞克隆。每天对培养物采样以进行全面代谢谱分析。
为了详细评估整个培养过程中的代谢细胞性能，采用CHO代谢网络模型。每种培养物细分为五个生理和代谢上不同的过程阶段，从阶段1(Ph1)到阶段5(Ph5)，如下表1所示。如实例1所述确定细胞摄取和产生速率。
表1：示例性代谢模型中采用的宿主细胞系(HCL)和重组CHO克隆的代谢阶段。识别HCL和重组CHO克隆的不同代谢阶段(HCL和10个克隆，3个数据集)。
此步骤包括整个过程的质量平衡，包括进料和采样事件。对于每个过程阶段，使用网络模型计算细胞内通量分布。通过考虑时间依赖性的细胞生理变化，而不是仅依赖于终点数据，可以对每个细胞/克隆/阶段进行全面表征。
通过使用标准化评分，可以将指标类型(诸如细胞外浓度测量、摄取速率和细胞内通量)整合到组合评分方案中。此外，根据时间序列数据的可用性，可以通过分配时间依赖性评分来定量过程中与它们最相关的那部分指标。例如，在该过程的早期，快速细胞生长被认为是更重要的，而在第6天之后，即一旦在建立高细胞数并且大部分产物形成的情况下，则特别需要高比生产力。
总共定义了约40种不同的指标来表征CHO细胞和克隆在重组蛋白和生物质形成以及代谢效率方面的代谢性能(参见下表2)。
表2：定义代谢性能指标。通过聚类由CHO网络模型计算的所选代谢表现参数，将六个代谢表现标准定义为CHO代谢的主要标志：“产物形成”、“细胞生长”、“乳酸形成”、“铵形成”、“代谢克隆效率”和“呼吸作用”。
排序描述了性能指标的高(“1”)或低(“0”)水平是否是偏好的。
由于某些目标性状的特征在于超过一种的指标(例如，良好的生产者克隆都需要高终末滴度和高比生产力)，因此相关的指标分为不同的类别：产物形成、细胞生长、乳酸形成、铵释放、呼吸代谢和代谢克隆效率。
良好的克隆表征模型必须满足几个要求：(i)克隆之间对性能标准的灵敏区分，(ii)克隆性状的全面表征，以及(iii)评估程序至在培养运行中正常变异水平的强健性。
关于第一个目标，产物滴度和细胞生长通常是克隆性能的灵敏量度。使用变异系数作为方差量度，“代谢克隆效率”类别也有助于灵敏的克隆表征标准，而乳酸形成和呼吸代谢的信息较少。尽管如此，它们有助于全面克隆表征，因为它们反映了对过程性能有重大影响的细胞特性，尤其是在较大规模时。
细胞外代谢物数据以及细胞内通量分布可用于计算代谢细胞性能的预定义量度，包括产物滴度、活细胞密度(IVCD)的积分和比生产力，以及生物质的碳产量和产物形成、细胞内谷氨酰胺合成酶速率，并预测维持所需的ATP。
因此，该模型基于对CHO培养物进行深入代谢分析的经验。它是用于重组CHO克隆的机理表征和识别以及过程变异的积分多水平工作流程。更具体地，该模型适用于摇瓶或多孔板中的小规模培养。同样，可以使用受控的多元小规模生物反应器和深入的高通量分析来确定过程参数、关键代谢性能标志物和关键产物质量属性。
在本发明中，将代谢网络模拟环境应用于CHO克隆的表征和高通量数据验证。
已经发现用于基于细胞外测量来模拟细胞内生化反应的相同机理模型(诸如，例如2-氧代戊二酸、5-氧代脯氨酸、乙酸盐、β-丙氨酸、β-D-葡萄糖、β-甲基正亮氨酸、生物质、丁酸、胆碱、柠檬酸盐、CO2、D-葡萄糖酸、D-甘露糖、乙醇胺、甲酸盐、富马酸盐、GABA、甘氨酸、H2S、钾、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-乳酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、肌醇、N-乙酰氨基酪胺、N1-乙酰亚精胺、N1-乙酰精胺、N8-乙酰亚精胺、钠、O2、磷酸盐、正磷酸盐、产物、腐胺、丙酮酸、亚精胺、精胺、琥珀酸酯、硫酸盐、尿苷等)，一旦建立并证明适用于镜像计算机细胞过程，就可以用于新培养数据集的过程中记录数据的验证或一致性检查。
使用现有代谢模型拟合的高通量筛选(HTS)过程中数据显示，模型拟合质量存在较大的偏差，即基于该模型计算得出的拟合线与实验数据有显著差异，即不良拟合。这种不良拟合的原因可能有多种原因，例如，克隆差异、数据不一致、技术问题等。
在这些原因中，技术问题是最危险的，因为可能丢弃合适的克隆。除其他事项外，技术问题可能是，例如，未抽气(CO2、O2)、培养过程中的pH传感器漂移、管道堵塞和尽管泵工作仍未进料、未测量到碎屑、代谢物不可测量(例如，有机酸及其前体、多胺及其前体、糖及其前体、活性糖及其前体、核苷酸及其前体、核苷及其前体、氧化还原当量及其前体、氧化还原活性化合物及其前体、脂质及其前体、内源性宿主蛋白等)、未采样、生物质或代谢物的测量不准确、导致错误值的分析错误等。
在图1中示出了由不完整的进料数据导致的示例性技术问题的影响。在图1A中示出了基于不完整的进料数据的培养分析。在图1B中示出了具有完整的进料数据的相同培养的分析。可以清楚地看到，由于数据不完整，基于代谢模型产生的拟合不良(模型拟合不良(建模拟合(线)与原始数据(框)的偏移量)。在未质疑或检查数据的情况下，这表明相应克隆的性能不佳。但是实际上数据输入是错误的，即输入了错误的葡萄糖浓度。如果不执行数据一致性检查，则不会发现此问题。
典型的发酵数据集跨越两周的时间，其中有大约15个线上参数和大约30个离线参数的每日数据点。该过程数据集受细胞克隆的生物学差异以及所用装置和培养方法的过程差异的影响。
生物学差异源自例如生物质蓄积、产物形成(速率)、营养物消耗(速率)、废物形成(速率)或细胞活力强健性之间的克隆间差异。
过程差异反映了在容差范围内的技术波动，例如，起始浓度、容器尺寸/几何形状、温度、搅拌速率和均匀性、放气、进料、质量/体积平衡、校正剂的添加/数量。
生物学和技术差异的组合反映在过程数据中。
为了生成可靠的代谢模型，使用通过广谱克隆、产物、规模、数据密度、宿主细胞系和培养平台获得的输入数据。
下表3中示出了用于评估数据质量的示例性数据集。
表3：用于模型开发的51项不同培养实验(批次)的概览表。“HCP”：宿主细胞蛋白；“+”：数据可用；“-”：数据不可用；“na”：不适用，因为宿主细胞系不产生任何产物
使用如上表所示的重复，对模型进行训练和采用。因此，有可能识别出不一致的运行。在图2中示例性地示出了运行9、14和51的分析。
可以看出，由于一些数据点偏离1:1线，因此发酵51与模型不一致。与1:1线的偏移表示相应参数的数据一致性差。
该分析已针对多种发酵重复进行。各个数据及其相关性如图3所示。在各自使用的模型变体中，高χ2(chi^2)值>5或接近0(例如<0.1)的发酵失败。可以看出，某些运行显示的不一致不是基于培养的克隆，而是基于实验、技术缺陷。
不受此解释的限制，一些不一致是由于数据点数量有限(每个培养阶段少于3个或总体少于6个)，由于线上或在线分析装置的技术问题或由于通过抽气分析确定HCP(宿主细胞蛋白)或OUR(氧摄取速率)的错误。
根据本发明的方法可以用于识别不一致的，即错误的输入数据。在以下实例中显示了这一点，其中错误的抽气测量结果导致实验和模型预测之间出现偏差。
Chi2值用于确定相应参数在模型和实验之间的拟合质量。该分析表明，对于所有情况，除了一个，chi2值都在相同范围内。在特殊情景中，分析中包括氧摄取测量值(参见表4)。可以通过识别根本原因来解决这些数据的不足问题。解决了这种矛盾之后，对于所有研究的场景，chi2值都是可以接受的。
表4：针对每种情景分析的中位chi2值。对于情景“模型1”，使用错误的和经过整理的OUR数据的数据集。对于所有其他情景，都使用经过整理的OUR数据集。
| 情景 | OUR | chi<sup>2</sup> |
| 模型1 | 错误数据 | 94.8 |
| 模型1 | 校正数据 | 1.3 |
| 模型2 | 校正数据 | 0.7 |
| 模型3 | 校正数据 | 0.8 |
| 模型4 | 校正数据 | 0.5 |
| 模型5 | 校正数据 | 0.5 |
从具有错误OUR数据的情景“模型1”的chi2值可以看出，模型与实验之间的拟合度不良。使用校正的数据可获得可接受的模型拟合。
氧是动物细胞代谢的关键底物。已报道氧摄取速率(OUR)是细胞活性的良好指标，甚至在某些条件下，也是活细胞数量的良好指标。由于许多不同的原因，OUR的测量很困难。特别地，极低的比消耗速率(0.2×10-12mol细胞h-1)、细胞对溶解氧浓度变化的灵敏度以及在不损害细胞的情况下提供氧的困难是开发OUR测量方法时必须考虑到的问题。已报道基于液相或整个反应器周围的氧平衡以及具有可变或稳定浓度的溶解氧的不同溶液。为了确定OUR，通常使用以下两种方法之一。可以考虑整个反应器(等式(1))或仅考虑液相(等式(2))来记录氧质量平衡：
(参见Ruffieux,P-A.,等人,J.Biotechnol.63(1998)85-95)。
因此，OUR不是直接可测量值。它取决于不同的其他变量并需要进行计算。
通过查看当前情况下的输入数据，可以发现用于计算的数学等式包含错误(错误系数为1000)。在根据本发明的方法对其进行识别之后，用经整理的等式对数据进行重新处理，从而得到改进的chi2值，如表4所示(参见上文)。
根据本发明的方法一方面可以如上所述识别在数据生成期间的技术和操作问题，并且还可以验证输入和计算的数据的正确性。从而证实所确定的数据实际上是相应克隆的特性，即其表型，而不是由于技术或操作错误。这在以下实例中显示。
在相同的培养条件下培养两个克隆。尽管克隆1和克隆2之间的活细胞密度相当(见图4A)，但培养基中的乳酸浓度不同(见图4B)。现在可以质疑克隆2所观察到的低乳酸水平是否可靠，从而证明克隆的基因/表型的特性。通过使用根据本发明的方法，可以确定第二克隆的表型由数据正确反映，而不是由于技术偏差或问题。这通过使用相应的代谢模型进行分析来举例说明。所有代谢阶段1至5的良好模型拟合(协调的和黑箱速率，见图5)显示了测量速率的可行性。低水平乳酸可以通过机理代谢模型有意义地描述。
因此，本发明包括用于以下的方法
-选择/评价细胞克隆，
-通过调节/优化培养基组成、进料方式和过程参数来提高细胞克隆的体积滴度，
-通过调节/优化培养基组成、进料方式和过程参数来提高产物质量，
-在培养运行或过程中控制分析过程中识别技术问题，
-检查过程控制中的预处理/数据一致性。
这些方法的基本要素相同：使用与各个细胞系的机理模型拟合的数据集控制。
本发明的目的是提供一种改进的方法，该方法用于确定培养过程数据是否受到独立权利要求和本文概述的方面所限定的技术问题的影响。在从属权利要求中给出了本发明的实施例。如果本发明的实施例不是互相排斥的，则可以彼此自由地组合。
在细胞培养期间，例如对于产生副产物，需要获取并存档时间相关的，即瞬时过程数据。该过程数据是线上和离线瞬时过程参数的总和。因此，过程数据反映了各个过程参数和结果变量，诸如比速率。通常在预处理步骤中获得结果变量，该预处理步骤涉及例如缺失值的转换、归一化、积分和计算。
培养装置通常配备有自动控制和数据记录系统，由此可以线上电子方式记录和存档采集的过程数据。所获取的线上过程参数包括控制参数和控制动作参数。控制参数包括控制在特定水平(例如，容器温度为37℃)的参数，诸如溶解氧(DO)、pH和容器温度，而控制操作参数包括诸如控制器响应、空气和氧气喷射速率以控制DO、碱的加入速率和二氧化碳喷射的速率以控制pH的参数。其他重要参数，诸如容器体积和覆盖气体流速也可以线上获取。大约每4个小时估算一次体积氧摄取速率(OUR)，而在持续数天的整个运行过程中，几乎连续地采集所有其他线上参数(至少每天一次并直到每秒钟一次)。除了这些值是连续的参数外，还有“离散”参数，诸如不同阀的状态，通常是二进制(“OFF/ON”状态)。这些阀控制不同的端口，以添加接种物、培养基、基料、消泡剂和气体喷射等。此外，通过定期从生物反应器中抽采样品，离线测量与营养物消耗和代谢物产生相关的许多参数(例如，参见下表5)。这些参数包括物理和状态参数、化学参数和生理参数。由于离线参数的采样频率不同，因此所有离线测量都可以使用线性插值方法进行预处理(参见，例如，Charaniya,S.,等人,J.Biotechnol.147(2010)186-197)。
表5：细胞培养过程中一些常规的离线、在线和线上测量参数的概述。
一方面，本发明提供了一种用于确定在细胞克隆的培养过程中获取的过程数据是否受问题影响的方法，所述方法包括以下步骤：
-任选地提供哺乳动物或细菌细胞克隆(表达重组异源多肽)的代谢模型，
-任选地获取用于培养表达重组异源多肽的哺乳动物或细菌细胞克隆的过程数据，
-使用针对表达重组异源多肽的哺乳动物或细菌细胞所生成的代谢模型，拟合表达相同重组异源多肽的相同哺乳动物或细菌细胞克隆培养过程中获得的过程数据，以及
-当建模的拟合关于原始数据的偏移大于10％时，确定培养受问题影响。
一方面，本发明提供了一种用于确定在细胞克隆的培养过程中获取的过程数据是否受问题影响的方法，所述方法包括以下步骤：
-接收细胞克隆培养的过程数据，其中细胞克隆产生与所述细胞异源的多肽，和
-使用针对所述细胞建立的代谢模型对数据进行拟合，并通过统计相关性方法对拟合进行表征，其值1代表完全拟合，优选为通过Pearson卡方检验确定的chi2值，
如果相关性值(chi2值)大于5，从而过程数据受问题影响。
一方面，本发明提供了一种选择表达(和产生)异源多肽的细胞克隆的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)单独培养大量产生相同异源多肽的(分离的或单一)细胞克隆，从而在培养过程中记录瞬时过程数据，
b)使用针对相同细胞(任选地表达相同重组异源多肽)生成的代谢模型分别拟合每个克隆的步骤a)中获取的过程数据，从而针对所有克隆均使用相同的模型，
c)如果在所述代谢模型中，步骤b)获得的拟合对于步骤a)中获得的所述培养的过程数据(i)显示出关于原始数据的偏移大于10％，或(ii)在统计相关方法中确定的相关值，优选为通过Pearson卡方检验确定的chi2值，对于拟合为5或更大，其中1为完全拟合，则确定步骤a)大量培养中的培养受问题影响，
d)对步骤c)中确定的在培养中有问题的细胞克隆重复步骤a)至c)，
或者
如果步骤c)中确定的克隆在培养中没有问题，则从大量克隆中选择克隆，所述克隆具有(i)最高滴度，和/或(ii)产物质量，和/或(iii)代谢性能指标值组合中最高评分(参见实例4)
一方面，本发明提供了一种识别表达(和产生)异源多肽的细胞的改良培养条件的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在第一组培养条件下培养产生或分泌异源多肽的哺乳动物或细菌细胞，从而在培养过程中记录瞬时过程数据，
b)使用针对相同哺乳动物或细菌细胞(任选地表达相同重组异源产生的多肽)生成的代谢模型拟合步骤a)中获取的过程数据，
c)如果在所述代谢模型中，步骤b)中获得的拟合对于步骤a)中获得的所述培养的过程数据(i)显示出关于原始数据的偏移大于10％，或(ii)在统计相关方法中确定的相关值，优选为通过Pearson卡方检验确定的chi2值，对于拟合为5或更大，其中1为完全拟合，则确定步骤a)的培养受问题影响，
d)i)如果培养具有步骤c)中确定的问题，则使用第一组培养条件重复步骤a)至c)，
或者
ii)如果培养不具有步骤c)中确定的问题，则使用不同于第一组培养条件的第二组培养条件重复步骤a)至c)，
e)i)如果使用第二组培养条件获得的(i)滴度，和/或(ii)产物质量，和/或(iii)代谢性能指标值的组合评分与在第一组培养条件下获得的(i)滴度，和/或(ii)产物质量，和/或(iii)代谢性能指标值的组合评分相比没有改善，则使用相同的第一组培养条件和新的第二组培养条件重复步骤a)至d)，新的第二组培养条件不同于任何先前使用的一组培养条件(即，不同于所述第一组和所述第二组培养条件，以及来自之前方法中使用的所有其他组培养条件的条件)，
或者
ii)如果使用第二方法获得(i)滴度，和/或(ii)产物质量，和/或(iii)的代谢性能指标值的组合评分与在第一组培养条件下获得的(i)滴度，和/或(ii)产物质量，和/或(iii)代谢性能指标值的组合评分相比得到改善，则识别第二组培养条件为改善的培养条件。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，问题是技术问题。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，已经通过用编码异源多肽的核酸转染哺乳动物细胞并表达所述异源多肽并将所述异源多肽分泌到哺乳动物细胞培养基中来获得分泌异源多肽的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞克隆。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，通过统计相关方法确定的拟合的相关值为2或更大。在所有方面的一个实施例和多个实施例中，通过统计相关方法确定的拟合的相关值为1或更大。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，通过Pearson卡方检验确定的拟合的chi2值为2或更大。在所有方面的一个实施例和多个实施例中，通过Pearson卡方检验确定的拟合的chi2值为1或更大。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，偏移是与建模和测量数据的1:1线的偏移大于10％。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个优选实施例中，CHO细胞是CHO-K1细胞。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，融合多肽为重组融合多肽。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，异源多肽是单克隆抗体。在一个实施例中，单克隆抗体是治疗性单克隆抗体。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，过程数据包括至少15个过程参数的瞬时值。在一个实施例中，过程数据包括至少20个过程参数的瞬时值。在一个实施例中，过程数据包括至少30个过程参数的瞬时值。在一个实施例中，过程数据包括至少40个过程参数的瞬时值。在一个优选实施例中，过程数据包括至少12个线上过程参数和至少28个离线过程参数的瞬时值。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，过程数据包括每个过程参数的至少6个瞬时值。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型是基于基因组的代谢模型。在一个实施例中，基于基因组的代谢模型包括五个区室。在一个实施例中，五个区室是细胞质、线粒体、内质网、高尔基体和生物反应器。在一个优选实施例中，代谢模型包括糖酵解、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径和呼吸链的中心代谢途径，主要生物质成分的蛋白、脂质、RNA、DNA和碳水化合物的生物合成，C1代谢以及氨基酸降解途径。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型包括多达1200种代谢物、多达800个基因和多达1500个反应。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型包括至少600个反应、500种代谢物和250个基因(开放阅读框)。在一个优选实施例中，代谢模型包括至少654个反应、583种代谢物和266个开放阅读框。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，碳平衡在代谢模型中关闭。在一个实施例中，通过约束葡萄糖和非必需氨基酸来关闭碳平衡。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，氮和氧化还原平衡在代谢模型中关闭。在一个实施例中，分别通过约束氨产生和氧摄取速率来关闭氮和氧化还原平衡。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，通过首先将整个发酵过程细分为生理上不同的过程阶段(任选地通过计算优化程序；和/或任选地其中过程阶段的最佳数量为：使用基于χ2的拟合优度检验确定)。在一个实施例中，在每个过程阶段中，假设恒定的细胞生理和/或假定恒定的生物质比速率。在一个实施例中，使用非线性回归确定生物质比速率。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，已经使用四步过程建立代谢模型，包括：(i)从基因注释数据和数据库信息建立初始重建，数据库将已知基因链接到功能类别；(ii)使用原始文献中的数据改进模型，并使用基于约束的方法转换为数学模型；(iii)通过将模型预测与表型数据进行比较来验证模型；以及(iv)通过对代谢重建进行连续的wet-lab和dry-lab循环进行改善，以提高准确性。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型仅包括哺乳动物细胞的注释的开放阅读框。在一个实施例中，该模型进一步包含在文献中验证的基因产物。在一个实施例中，该模型进一步包括氨基酸生物合成和代谢途径、碳水化合物生物合成和代谢途径以及核苷酸生物合成和代谢途径。在一个实施例中，代谢模型进一步包括运输过程。在一个实施例中，通过识别和去除重复的和/或冗余的反应来进一步完善代谢模型。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型基于(w/w)74.2％蛋白质、1.6％DNA、6.1％RNA、4.5％碳水化合物和10.1％脂质的平均细胞组成来估算在生物质等式中每种组分的需求。在一个实施例中，生物质等式进一步包括胆固醇。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，氧化磷酸化的效率以每摩尔通过电子传输链携带的电子产生的ATP摩尔比表示为2.5。在一个实施例中，代谢模型进一步使用以ATP计的成本，用于29.2mmol ATP/g干重的生物聚合物(RNA、DNA、蛋白质)的产生。在一个实施例中，代谢模型进一步使用1.55mmol ATP/g Dw/h的值用于维持，并使用37.8mmol ATP/gDW/h的值用于ATP产量和8.6mmol ATP/g DW/h的值用于生长相关维持。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型包括必需氨基酸、叶酸和磷酸盐的摄取速率、代谢速率和分泌速率。在一个实施例中，代谢模型进一步包括生物素、硫胺素、维生素、钙和镁离子的摄、代谢和分泌速率。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，葡萄糖、氧和谷氨酰胺的摄取固定为代谢模型中实验观察到的速率。在一个实施例中，在代谢模型中，乳酸、氨、谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的摄取、代谢和分泌速率不受约束。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，在代谢模型中去除必需氨基酸的摄取速率。在一个实施例中，对于非必需氨基酸(优选对于丝氨酸、天冬酰胺、甘氨酸和脯氨酸)的摄取或产生速率固定为在代谢模型中实验观察到的速率。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型在混合模型方法中结合了遗传和信号调节元件、酶动力学和化学物理参数。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，单克隆抗体的最大产生速率设定为0.0084mmol抗体/g Dw/h的值(DW＝干重)。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，通过受到化学计量(代谢物质量平衡)和热力学(反应可逆性)约束的代谢网络模型的基于约束的通量分析来确定代谢模型的代谢通量。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢模型包括三个不同的阶段。在一个优选实施例中，这三个阶段是(i)从第1天至第3天持续的初始指数生长阶段；(ii)从第4天至第6天的后期指数生长阶段；和(iii)从第8天至第10天的早期平稳阶段。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，在代谢模型的第一阶段中的细胞目标是生物质产生(并且这将被最大化)。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，在代谢模型的第二阶段中的细胞目标是能量优化(并且将被最小化)。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，在代谢模型的第三阶段中的细胞目标是蛋白质产生(并且这将被最大化)。
在所有方面的一个优选实施例和多个实施例中，在代谢模型的第一阶段中的细胞目标是生物质产生(并且这将被最大化)，在代谢模型的第二阶段中的细胞目标是能量优化(并且将被最小化)，并且在代谢模型的第三阶段中的细胞目标是蛋白质产生(这将被最大化)。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，代谢网络模型及其混合模型用于任何类型的细胞培养策略，如批次、分批、进料批次、灌注、强化和连续培养，以(i)模拟摄取和消耗速率，(ii)模拟细胞内通量和浓度，以及(iii)检查数据的一致性、准确性和完整性。
在所有方面的一个实施例和多个实施例中，通过将模拟结果与实验结果进行比较，并在重建过程中迭代地检查代谢模型的一致性、准确性和完整性，并采用/校正直至模拟结果在实验结果的10％以内(任选地定量和定性)。
统计模型的拟合优度可用于相对于基础建模过程来表征模型的质量，即模型与实验数据之间的相关性如何。通常，拟合优度将实验值与模型预测的值之间的偏差相加。
描述拟合优度的一种方法是Pearson卡方检验。它基于实验与建模结果频率之间的差异之和，各自均取平方并除以期望值：
其中
Oi表示bin i的实验确定频率(即计数)
Ei表示bin i的建模频率，由零假设提出。
Ei可通过以下计算：
Ei＝(F(Yu)-F(Yl))N
其中
F表示正在分析的分布的累积分布函数
Yu表示第i类的上限，
Yl表示第i类的下限，以及
N表示数据点的数量。
可以将获得的值与卡方分布进行比较，以确定拟合优度。
平均地，可以预期每项约为1。因此，同样期望总数应该与数据点的数量相关。不能被拟合函数自动命中的数据点的个数称为“自由度”的个数。
决定性的是偏差和误差线的相对大小。“优良”点的偏差(Δ)与误差(σ)的比率较小(小于1)；“不良”点的偏差与误差的比率大于1，因此曲线无法通过误差条(如第三个数据点)。平均地，良好拟合将具有与异常小的偏差一样多的异常大的偏差，即平均地，偏差与误差的比率约为1。(当然，在完全拟合中，曲线将正确穿过每个数据点：零偏差)。χ2定义为每个数据点偏差与误差的比率的平方和：
自由度(d.f.)等于数据点的数量减去可校正的参数的数量。
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
实例
材料与方法
产物定量、代谢物和氨基酸分析：
为了定量产物滴度，通过离心除去发酵液细胞中的代谢物和氨基酸浓度。使用Cedex Bio HT生物过程分析仪(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim)，使用特定测定法测量葡萄糖、乳酸和铵的浓度。将无细胞的上清液通过0.2μm或3kDa膜进行无菌过滤，分别用于后续的蛋白质定量或氨基酸分析。如先前所述，通过Poros A HPLC方法对产物滴定度进行定量[Zeck et al.,2012]。使用Agilent RRLC 1200系统(Agilent Technologies,SantaClara)和荧光检测器通过内部方法测量发酵上清液中的氨基酸水平。
蛋白质确定：
为了提取细胞蛋白质含量，使用Mem-PERTM Plus膜蛋白质提取试剂盒(ThermoScientific，Darmstadt)和Cedex HiRes分析仪。第一步，使用Cedex HiRes分析仪收集特定量的活细胞，并将其转移到falcon管中。然后根据所附的Mem-PERTM说明书中的方案2提取哺乳动物细胞悬液的细胞蛋白(说明手册编号89842，Thermo Scientific，Darmstadt)。提取蛋白质并将其收集在1.5mL试管中后，使用Bradford
PlusTM检测试剂盒和微孔板操作规程A(说明手册编号23236，Thermo Scientific，Darmstadt)测量蛋白质浓度。在这种情况下，使用专有的CHO宿主细胞蛋白标准品代替正常的BSA蛋白标准品，以利用给定样品的测得CHO蛋白与专有的宿主细胞蛋白混合物制成的标准曲线之间的平衡性。
然后，将测得的蛋白质含量c蛋白质，测量值与来自Cedex HiRes分析仪的总细胞密度TCD和活力V数据相结合，当然还要与检测试管V蛋白质，试管和含有样品体积V样品的细胞的体积相结合，从而按以下计算每个细胞的蛋白质含量：
测定平均单细胞质量、体积和密度：
为了确定平均细胞质量，首先使用Cedex HiRes分析仪(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)机器确定给定样品的细胞浓度。此外，Cedex HiRes装置可提供形态参数，如细胞直径(用于计算装置内的细胞体积)、细胞活力和蓄积速率。
细胞质量的确定基于以下假设：整个细胞质量m细胞，总计由细胞生物质m细胞生物质(细胞膜、细胞组分、蛋白质等)和水m水的总和组成。
m细胞，总计＝m细胞生物质+m水
将含有细胞的样品移液至平衡的falcon管中，并与上清液分离。洗涤步骤可确保falcon中仅留下细胞。之后，将falcon在80℃的干燥箱中干燥至少24小时以消除水分。因此，可以通过空falcon管mFalcon，空和具有干燥的生物质mFalcon，干燥的falcon管的重量差来测量细胞生物质。组合测得的总细胞密度TCD和样品体积V样品，可以计算出平均细胞质量：
测定氧摄取速率(OUR)：
为了确定氧摄取速率OUR，采用动态方法。动态方法是众所周知的标准程序，通常基于浸没细胞培养物的耗氧量。在发酵过程中，生物反应器内部的溶解氧浓度(通过Clark电极测量)被调节到定义值，因此溶解氧的瞬时变化可以视为0。
对于动态方法的应用，放气被中断一定的时间，仅通过可通过氧探针记录的细胞的呼吸活动导致溶解氧的减少。
我们可以通过溶解氧的消耗来确定，直到重新激活放气为止。
CHO网络模型重建和通量分析：
根据既定程序，从公开来源(包括数据库和主要文献)构建包括五个区室(细胞溶质、线粒体、ER、高尔基体、生物反应器)的基于基因组的CHO网络模型[Sheikh等人,Biotechnol.Prog.21(2005)112–121；Selvarasu et al.,Mol.Biosyst.6(2010)152–161；Oberhardt et al.,Mol.Syst.Biol.5(2009)320]。除了主要代谢途径(糖酵解、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径、呼吸链)外，该模型还描述了主要生物质成分(蛋白质、脂质、RNA、DNA、碳水化合物)、C1代谢和氨基酸降解途径的生物合成。对于所研究的重组蛋白产物，制定相应的一组产物形成反应，考虑重组蛋白的氨基酸组成和代表性糖基化结构(每个产物分子两个唾液酸双角聚糖)。所得模型包含654个反应、583个代谢物，并代表266个ORF。选择与先前关于CHO细胞或鼠细胞系的研究相当的生物质组成(参见，例如，Altamirano等人，Biotechnol.Prog.17(2001)1032–1041；Bonarius等人，Biotechnol.Bioeng.50(1996)299–318；Selvarasu等人，Biotechnol.Bioeng.109(2012)1415–1429)。见以下表6和表7。
表6：网络模拟中使用的CHO-K1细胞的生物质组成。
表7：网络模拟中使用的CHO-K1细胞的大分子组成。
使用Insilico Discovery802TM软件v 3.2(Insilico Biotechnology AG,Stuttgart)进行模型重建和模型模拟。为了模型验证，已确认所有反应的元素平衡和电荷平衡均已关闭。此外，通量平衡分析[Savinell and Paulson,J.Theor.Biol.154(1992)421–454and 455–473]用于验证各个途径的功能。在CHO发酵过程中采集的时间序列记录数据可用于描述网络中活跃的代谢途径，并支持识别主要同工酶种类。最终的网络模型仍然包含内部自由度，仅通过细胞外代谢物的测量和网络化学计量无法解决。在这种情况下，为了确保获得的通量分布具有可比性，最有效的能量代谢途径被认为是活跃的，而其他则无活性。重要的是，这种选择不会影响测量得出的细胞摄取和产生速率的协调值。
通过首先通过计算优化程序将整个发酵过程细分为生理上不同的过程阶段来进行细胞摄取和产生速率的估算。该优化采用进化策略进行[Müller等人,2009,Proceedingsof the 11th Annual conference on Genetic and evolutionary computation.Montréal,Canada:ACM pp.1411–1418.可用：http://dl.acm.org/citation.cfm？id＝1570090]，使用测得的细胞数量、蛋白质产物和细胞外代谢物的时间序列数据作为输入。使用类似于Leighty和Antoniewicz报道的方法的基于χ2的拟合优度检验确定最佳过程阶段数[Metab.Eng.13(2011)745–755]。在每个过程阶段，假定细胞生理恒定，这表示恒定的生物质比速率。使用非线性回归确定这些生物质比速率。根据从不需要进行接种的对照发酵中确定的半衰期数据确定的化学分解影响来校正各个营养物的摄取率。产生的摄取和产生速率用作进行代谢通量分析的输入[Maier等人,Biotechnol.Bioeng.100(2008)355–370；Niklas等人,Curr.Opin.Biotechnol.21(2010)63–69；Stephanopoulos等人,1998,Metabolic engineering:Principles and methodologies.San Diego:Academic Press]和计算出的通量分布的热力学一致性得到证实(即，对于已知的不可逆反应，没有违反方向性)。
性能指标和多元数据分析的定义：
代谢物数据、过程数据和细胞内通量分布的Pearson和Spearman相关性的计算使用统计软件R v2.13.2，Stats软件包[R Core Team,2013],JMP(SAS,Marlow)和Qlucore(Qlucore AB,Lund)。使用Benjamini和Hochberg[Benjamini and Hochberg，1995]的方法将多次检测的p值校正为FDR<0.05或指示的错误发现率(FDR)。每种培养的综合选择评分计算如下：综合评分CS定义为类别评分的加权总和(CASi)
其中wi∈[0,1]和
针对给定的选择过程选择适当的加权因子。每个类别评分CASi被指定为类别(INDi,j)中包含的各个指标的加权平均值
再次使用
和
每个指标INDi,j被确定为给定性能指标PM规模化的规模化和时间加权的平均值：
如上述加权因子和
所述，使用相同的限制应用于
此处，将浓度、摩尔量、生物质比摄取/产生速率、细胞内通量或比率用作性能指标，使用合适的参考值将其标准化为非负无量纲量。可以采用不同的规模化程序来实现这些特性，并在认为需要高值(例如，产物滴定度)的特性与优选低值(例如，副产物产量)的特性之间进行区分。本文所使用的规模化的观察值的范围如下
定义性能指标Pmi,ji,j，使其仅假设非负值，并且
和
分别代表所有克隆和时间点的性能指标的最大值和最小值。通过选择规模化性能指标和权重因子，综合评分CS的可达到值将落在0到1之间。仅当一个克隆对每个指标以及该指标收到非零权重的所有时间点都表现出最大的观测指标值时，才采用后一个值。
单个克隆的滴度评分的示例性计算
考虑最终滴度时，所有其他类别i的产物形成类别评分均设置为w产物形成＝1和wi＝0。由于产物滴度是唯一有效的标准，因此在产物形成类别中的权重将为
而
和
对于规模化性能指标，它是
其中i＝“产物形成”，j＝“代谢阶段的最大滴度”。由于较高的滴度值是优选的，因此可从以下计算
对于示例性克隆，这些值如下表8所示。
表8：根据本文概述的加权程序计算最终滴度评分的实例。
实例1
重组CHO克隆的比较和代谢性能指标的排序
对于克隆比较实验，使用表达相同单克隆IgG4抗体的十个重组CHO-K1克隆(CL4至CL13)。为了对不同产物进行比较研究，使用表达与上述相同的重组人IgG4单克隆抗体的另一克隆CL14和表达单克隆IgG1抗体的另外两个生产克隆(CL2和CL3)。重组CHO-K1克隆在无蛋白质、化学成分明确的专有培养基中培养，用于种子培养和随后的分批进料实验。使用加湿培养箱在摇瓶中进行种子培养，该培养箱的设定点控制为7％CO2和37℃。每三至四天分离一次克隆。对于所有实验，使用直到实验开始的培养相同年龄(21天)的克隆。对于分批进料比较实验，使用无蛋白质且化学成分明确的专有基础培养基，在500mL摇瓶中的230mL培养基中培养CL4至CL13持续13天。从第3天(进料A，每天开始培养量的3％)或第6天(进料B，开始培养量的2％)每天补充两种不含蛋白质和化学成分明确的专有进料培养基(进料A和进料B)。完全受控的克隆培养进料分批实验在2L小型生物反应器(Sartorius Stedim,
)中进行14天，使用与上述相同的无蛋白质、化学成分明确的专有碱和进料培养基。对于类似生产的过程，从第3天(进料A，每天起始培养量的2％)或第6天(进料B，每天起始培养量的2％)每天补充两种相同的无蛋白质和化学成分明确的专有饲料培养基(进料A和进料B)直至第14天。所有培养实验均重复三次。为了分析存活和总细胞密度以及细胞直径，使用自动化Cedex HiRes系统(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim)。根据生产商的说明，使用台盼蓝距染法区分存活细胞和总细胞密度。如先前所述(Zeck等人,2012)，对发酵液中的产物滴度、代谢物和氨基酸浓度进行定量。
为了评估重组CHO克隆的代谢指纹图谱和总体性能，使用代谢通量模型来计算预定义的代谢性能指标(见表2)和相应的评分系统以生成汇总和累积值(见表8)。如此，可以自动和用户独立(避免单独的解释)生成用于CHO克隆开发和选择克隆排序。
实例2
重组CHO克隆培养不同发酵规模的比较
代谢通量分析方法用于建立自动CHO细胞性能分析，以用于高通量使用。为此，如有需要，可以利用丰富的数据集来破坏以各种规模进行的培养，表达各种单克隆抗体(见表3)。用于设计管道的方法包括基因组规模的代谢网络建模、过程阶段的识别、代谢通量分析以及克隆性能指标的分析。进行的统计分析包括减少的χ2检验、交叉验证和重复分析。分析结果可以解决数据集中的转换和转化误差，从而确定χ2检验的接受范围。此外，分析了考虑以宿主细胞蛋白质和氧摄取指标形式存在的其他测量参数的影响。
在初始阶段，建立了代谢分析的综合数据基础。使用进料分批培养数据和综合细胞分析数据，分析基于模型情景的方法，该方法用于检验模型设置中不同假设(不同的细胞生物质组成)的影响以及数据对减少的χ2和性能指标值的影响，并从不同规模的CHO过程进行元素分析，并使用不同的细胞系、克隆、产物或平台进行。不同假设和参数产生模型1至6(见表4和图3)。
实例3
通过OUR和HCP指标分析CHO克隆性能
为此，分析代表HCP和OUR数据集的培养子集的影响(见表3)。在此，已经发现在两种情况下，考虑到附加数据，通过增加χ2可以改善从实验中检索到的信息内容。详细地，当考虑到宿主细胞蛋白(增加13％点)和氧摄取速率(增加25％点)测量结果时，CHO发酵的信息含量显著提高(见表9)。
表9：χ2检验的详细结果。为了分析HCP和OUR指标的影响，仅使用测量HCP和OUR的培养种重新评价模型情景1(模型1)。
实例4
分析具有不同乳酸代谢型的CHO克隆的代谢表型
乳酸是CHO培养的最主要副产物，因此，在过程控制分析中，通常将发酵液中的浓度水平以及细胞比形成和消耗速率作为发酵进行常规分析。CHO克隆发展评价过程的最终候选通常来自相同或相关的CHO亲代细胞和/或库。然而，培养中的代谢型-代谢表型-可能有很大的不同。
在克隆评价过程中，在进料分批实验中评价了表达相同重组产物的两个不同的CHO克隆。如此，克隆1和克隆2的细胞生长仅略有变化，但是，测得的乳酸浓度显示出显著差异(图4)。在培养中期，克隆1达到最大乳酸水平4000mg/L，随后出现重新代谢表型。相反，克隆2甚至没有达到最大500mg/L乳酸，并且在大多数过程时间内的总水平无法测量。为了评价克隆2来源的这种乳酸测量结果是形成真正的代谢型还是来自例如错误指标、损坏的数据等，根据本发明的代谢通量分析方法被用于分析乳酸值的可能性。为此，该模型考虑了乳酸以及除乳酸外的所有测量过程中控制参数。所有克隆1和克隆2的五个代谢阶段的协调乳酸速率和模型“黑箱”速率的匹配证实了克隆2乳酸代谢型的正确性(图5)。
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Claims (11)
1.一种用于确定在哺乳动物或细菌细胞的培养过程中获得的过程数据是否受到问题影响的方法，所述方法包括以下步骤：
使用针对表达重组异源多肽的所述哺乳动物或细菌细胞所产生的代谢模型，拟合表达相同重组异源多肽的相同哺乳动物或细菌细胞的所述培养过程中获得的所述过程数据，
如果符合以下条件，则确定所述培养受到问题影响：
(i)建模拟合显示关于原始数据的偏移大于10％，
或
(ii)所述建模拟合具有的由Pearson卡方检验确定的chi2值大于5。
2.一种用于选择表达异源多肽的细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)单独培养大量的产生所述相同异源多肽的哺乳动物或细菌细胞克隆，从而在所述培养过程中记录瞬时(temporal)过程数据，
b)使用已针对所述相同哺乳动物或细菌细胞产生的相同代谢模型，分别拟合每个克隆在步骤a)中获得的所述过程数据，
c)如果在所述代谢模型中，步骤b)中所获得的所述拟合对于步骤a)中所获得的所述培养的所述过程数据(i)显示出关于所述原始数据的偏移大于10％，或(ii)所述拟合的所述由Pearson卡方检验确定的chi2值为5或更大，则确定步骤a)的培养受到问题影响，
d)对如步骤c)中所确定的在所述培养中有问题的所述克隆重复步骤a)至c)
或
如果没有克隆如步骤c)中所确定的在所述培养中有问题，则从大量克隆中选择具有(i)最高滴度、和/或(ii)最高水平的预期产物质量属性、和/或(iii)代谢性能指标中优选的代谢表型/最高范围的克隆作为表达异源多肽的细胞。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述拟合的由Pearson卡方检验确定的chi2值为1或更大。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述细胞如下：(i)哺乳动物细胞为CHO细胞，和/或(ii)细菌细胞为大肠杆菌。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述异源多肽为抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述过程数据包括至少15个过程参数的瞬时值(temporal value)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述过程数据包括至少12个在线过程参数和至少28个离线过程参数的所述瞬时值。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述过程数据包括每个过程参数的至少6个瞬时值。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中
所述代谢模型为基于基因组的代谢模型，和/或
所述代谢模型包括五个区室：细胞质、线粒体、内质网、高尔基体和生物反应器，和/或
所述代谢模型包括糖酵解、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径和呼吸链的中心代谢途径，主要生物质成分的蛋白质、脂质、RNA、DNA和碳水化合物的生物合成，C1代谢以及氨基酸降解途径。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述代谢模型包括至少600种反应、500种代谢物和250种基因。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述问题为技术问题。
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2021
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