CN103937841A - 烯酰辅酶a水合酶在己二酸生物合成中的应用 - Google Patents

Abstract

一种烯酰辅酶A水合酶在己二酸生物合成中的应用，本发明所采用的烯酰辅酶A水合酶不仅具有催化3‐羟基己二酰辅酶A向2,3‐烯‐己二酰辅酶A转化的活性，它在己二酸合成途径中还具有更好的催化能力。通过将其替换已有烯酰辅酶A水合酶(Crt)，大肠杆菌内己二酸的产量提高了数倍。本发明所鉴定的烯酰辅酶A水合酶从一定程度克服了现有己二酸生物合成途径效率不高的瓶颈，为己二酸以及类似化合物的生物合成提供了更大的潜力。

Description

烯酰辅酶A水合酶在己二酸生物合成中的应用

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的基因应用，具体是一种来源于Ralstoniaeutropha H16的烯酰辅酶A水合酶在己二酸生物合成中的应用。

背景技术

己二酸是一种重要的化工原料，其主要用途是作为尼龙‐6，6合成的前体。己二酸全球每年的需求量达到260万吨。目前己二酸的主要制备方法是通过在石油中提炼得到环己烷，再将其进一步氧化得到己二酸。由于石油资源的日趋紧缺，这种基于石油化工的生产方法的主要问题是资源的不可再生性。

针对这个问题，人们提出了各种利用可再生资源生物合成己二酸的途径，其中包括利用己二酸以及脂肪酸降解的逆向反应合成己二酸。这个合成途径主要包括5个步骤：1)乙酰辅酶A及琥珀酰辅酶A缩合形成3‐羰基己二酰辅酶A；2)3‐羰基己二酰辅酶A还原成3‐羟基己二酰辅酶A；3)3‐羟基己二酰辅酶A脱水形成2，3‐烯‐己二酰辅酶A；4)2，3‐烯‐己二酰辅酶A加氢形成己二酰辅酶A；5)己二酰辅酶A水解成己二酸。目前本实验室已在大肠杆菌中成功构建该途径，并在导入该途径的工程菌株发酵液中检测到少量的己二酸生成。

烯酰辅酶A水合酶是脂肪酸b‐氧化途径中的一个关键酶，它能催化Δ‐2，3‐烯酰辅酶A水化生成3‐羟酰辅酶A。同时该酶也能催化3‐羟酰辅酶A的脱水反应，这个特性已被应用到基于逆向β‐氧化的一系列C4‐C6化合物生物合成途径中。目前使用最多的是来源于Clostridiumacetobutylicum中的烯酰辅酶A水合酶(Crt),该酶已被证明可催化多种C4‐C63‐羟酰辅酶A的脱水反应，同时也用在了上述己二酸的合成途径中。作为一种主要天然生产正丁醇的菌种，来源于Clostridium acetobutylicum中的酶很可能对于C4的化合物更有亲和性，而对C6化合物的催化效率可能不高。因此从其它菌种中筛选到更适合C6合成的烯酰辅酶A水合酶来进一步提高工程菌株中己二酸的产量将具有重大的工业意义。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103555643A公开(公告)日2014.02.05，公开了一种用于产生己二酸和其他化合物的微生物，其具有己二酸、6‐氨基己酸或己内酰胺途径。所述微生物生物体含有至少一种编码己二酸、6‐氨基己酸或己内酰胺途径中各自的酶的外源性核酸。本发明另外提供了产生己二酸、6‐氨基己酸或己内酰胺的方法。该方法可以包括在产生己二酸、6‐氨基己酸或己内酰胺的条件下和足以产生己二酸、6‐氨基己酸或己内酰胺的时间内培养产生己二酸、6‐氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体，其中所述微生物生物体以足以产生各自产物的量表达至少一种编码己二酸、6‐氨基己酸或己内酰胺途径酶的外源性核酸。但该技术并没有实验数据支撑其所述的己二酸合成途径，也没有任何细节表明在该途径中采用何种基因更适合己二酸合成。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种烯酰辅酶A水合酶在己二酸生物合成中的应用，采用来源于Ralstoniaeutropha H16的烯酰辅酶A水合酶Ech代替来源于ClostridiumacetobutylicumATCC824的烯酰辅酶A水合酶Crt，在其它遗传背景与发酵培养条件都一致的情况下，显著提高了己二酸产量，为解决现有问题提供了新的思路和方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种烯酰辅酶A水合酶在己二酸生物合成中的应用，将来源于Ralstoniaeutropha H16的烯酰辅酶A水合酶用于己二酸的发酵生产。

所述的应用具体是指：在含有葡萄糖的培养基中培养含有编码3‐羰基己二酰辅酶A硫解酶的基因、编码3‐羟基酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码反‐2‐烯酰辅酶A还原酶的基因、编码磷酸丁酰转移酶的基因、编码丁酸激酶的基因以及编码烯酰辅酶A水合酶基因的基因工程菌，并从培养液中回收得到己二酸。

所述的编码3‐羰基己二酰辅酶A硫解酶的基因为PaaJ，来源于大肠杆菌；

所述的编码3‐羟基酰基辅酶A脱氢酶的基因为PaaH1，来源于真氧产碱杆菌H16RalstoniaeutrophaH16；

所述的编码反‐2‐烯酰辅酶A还原酶的基因为Ter，来源于眼虫藻Euglena gracilis；

所述的编码磷酸丁酰转移酶的基因为Ptb，来源于丙酮丁酸梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC824；

所述的编码丁酸激酶的基因为Buk1，来源于丙酮丁酸梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC824；

所述的编码烯酰辅酶A水合酶基因为Crt，来源于丙酮丁酸梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC824；

所述的编码烯酰辅酶A水合酶基因为Ech，来源于真氧产碱杆菌RalstoniaeutrophaH16。

所述的基因工程菌通过PCR或化学合成得到核苷酸序列，连接表达载体得到重组质粒，最后通过将重组质粒转化大肠杆菌获得。

所述的核苷酸序列包括：Ter、PaaJ、PaaH1、Crt、Ech、Ptb、Buk1。

所述的表达载体包括：pTrc99A质粒和pZS*27mcherry质粒，具体为Ter和PaaJ在pTrc99A质粒表达，PaaH1、Crt/Ech、Ptb、Buk1在pZS*27mcherry质粒表达。

所述的大肠杆菌是指：大肠杆菌E.coliQZ1111，记载于中国专利申请号201310203945.9申请日:2013.05.28，公开号:CN103243064A。

所述的基因通过对Clostridium acetobutylicumATCC824crt基因进行同源性比对(BLAST)到，来源于Ralstoniaeutropha H16的编码烯酰辅酶A水合酶的核苷酸序列如Seq ID No.1所示(GENBANK序号：4249793)，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

附图说明

图1为本发明己二酸体内合成途径中涉及的质粒图谱。

图2为实施例中不同的烯酰辅酶A水合酶在己二酸生产中的效果示意图；

图中样品取自第120小时发酵液上清，每组样品有3个平行样。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

己二酸生物合成途径的构建

本实施例中生物合成途径的构建是基于质粒的异源表达方式，所采用的菌株、质粒、酶与培养基等包括：表达质粒为pTrc99A及pZS*27mcherry；表达宿主为大肠杆菌E.coliQZ1111；克隆宿主为大肠杆菌E.coliDH5α；基因操作工具包括：限制性内切酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶；LB培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，氨苄青霉素浓度为100mg/L，卡那霉素浓度为50mg/L。

1)PCR扩增及重组质粒的构建：设计引物序列，以相应菌株全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切并连接到经同样内切酶酶切的表达质粒载体上，其中：Ter和PaaJ在pTrc99A质粒表达，PaaH1、Crt/Ech、Ptb、Buk1在pZS*27mcherry质粒表达。

2)将表达质粒载体转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行测序验证，其中：Ter是来源于Euglena gracilis的反‐2‐烯酰辅酶A还原酶，PaaJ是来源于大肠杆菌的3‐羰基己二酰辅酶A硫解酶，PaaH1是来源于Ralstoniaeutropha H16的3‐羟基酰基辅酶A脱氢酶，Ptb是来源于Clostridium acetobutylicumATCC824的磷酸丁酰转移酶，Buk1是来源于ClostridiumacetobutylicumATCC824的丁酸激酶，Crt是来源于Clostridium acetobutylicumATCC824的烯酰辅酶A水合酶，Ech是来源于Ralstoniaeutropha H16的烯酰辅酶A水合酶。

所述的引物序列如下：

PaaJ‐上游：5’‐CGTCGGTACCATTACAGGAGAAGCCTGATG‐3’

PaaJ‐下游：5’‐CTGCGGATCCTCAAACACGCTCCAGAATCAT‐3’

PaaH1‐上游：5’‐TAGAGGTACCATGAGCATCAGGACAGTGGG‐3’

PaaH1‐下游：5’‐CGGAGGATCCTTACTTGCTATAGACGTACA‐3’

Crt‐上游：5’‐GAGCGGATCCAGGAGGATTAGTCATGGAAC‐3’

Crt‐下游：5’‐CGTCACGCGTTTATCTATTTTTGAAGCCTTC‐3’

Ech‐上游：5’‐TTCAGGATCCAGGAGGATTAGTCATGCCGTACGAAAACATCCT‐3’

Ech‐下游：5’‐GCTGACGCGTTTAGCGATGCTGGAAATTCG‐3’

Ter‐上游：5’‐CCGACGATCGATGATTGTAAAACCAATGGT‐3’

Ter‐下游：5’‐CTTCACGCGTTTAAATCCTGTCGAACCTTTC‐3’

Ptb‐Buk1‐上游：5’‐CGTGGTACCGCTAGCGTGATTAAGAGTTTTAATGAAAT‐3’

Ptb‐Buk1‐下游：5’‐TTGGATCCCCCGGGTTATTTGTATTCCTTAGCTTTTTC‐3’

其中划线部分是相应的酶切位点。

3)通过将上述构建的质粒导入表达宿主，达到利用微生物发酵生产己二酸的目的，具体步骤包括：

3.1)菌株与培养条件：将上述构建的质粒pTrc99A‐Ter‐PaaJ连同pZS‐Buk1‐Ptb‐PaaH1‐Crt或pZS‐Buk1‐Ptb‐PaaH1‐Ech一同转化至E.coli QZ1111感受态细胞，即pTrc99A‐Ter‐PaaJ和pZS‐Buk1‐Ptb‐PaaH1‐Crt两个质粒共同转化或者pTrc99A‐Ter‐PaaJ和pZS‐Buk1‐Ptb‐PaaH1‐Ech两个质粒共同转化。

经过筛选及活化得到用于发酵生产的菌株。

所述的E.coli QZ1111感受态细胞采用的培养基为发酵培养基，具体为pH为6.8的R/2培养基，其组分及含量为：10g/L葡萄糖、2g/L磷酸氢二铵、6.75g/L磷酸二氢钾、0.85g/L柠檬酸、0.7g/L七水合硫酸镁、0.5％(v/v)微量金属溶液。

所述的微量金属溶液包括：10g/L七水合硫酸亚铁、2.25g/L七水合硫酸锌、1g/L五水合硫酸铜、0.5g/L五水合硫酸锰、0.23g/L十水合硼酸钠、2g/L二水合氯化钙、和0.1g/L钼酸铵。

所述的E.coli QZ1111感受态细胞首先经过LB培养基活化，条件同步骤1)，然后以初始接种量为OD600＝0.05接入到R/2培养基中，待细胞37℃培养至OD约为0.4时，加入50μM IPTG于30℃继续培养数天。

3.2)产物提取及定量测定

发酵液上清通过5倍体积的乙酸乙酯萃取，然后经过浓缩，溶于1倍体积乙酸乙酯，加入1/2体积的BSTFA衍生化试剂，60℃反应30分钟后进行三重四极杆气质联用检测。

通过对己二酸标品作定量标准曲线，检测样品111/55.1(m/z)特征碎片离子的信号强度，在表达Ralstoniaeutropha H16的烯酰辅酶A水合酶(ECH)的菌株中，可以检测到最终发酵液中己二酸的浓度为639±34μg/L。而相同培养条件以及途径中其它基因一致的情况下，表达

Clostridium acetobutylicum ATCC824的烯酰辅酶A水合酶(Crt)菌株的发酵液中己二酸的浓度仅为134±22μg/L。

如图2所示，为在其它遗传背景与发酵培养条件都一致的情况下，本实施例中表达Crt的大肠杆菌与表达Ech的大肠杆菌最终的己二酸产量差异。根据图2可见本发明方法显著提高了己二酸产量，达到476.9％。

Claims (8)

1.一种烯酰辅酶A水合酶在己二酸生物合成中的应用，其特征在于，将来源于Ralstoniaeutropha H16的烯酰辅酶A水合酶用于己二酸的发酵生产。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，在含有葡萄糖的培养基中培养含有编码3‐羰基己二酰辅酶A硫解酶的基因、编码3‐羟基酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码反‐2‐烯酰辅酶A还原酶的基因、编码磷酸丁酰转移酶的基因、编码丁酸激酶的基因以及编码烯酰辅酶A水合酶基因的基因工程菌，并从培养液中回收得到己二酸。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述的编码3‐羰基己二酰辅酶A硫解酶的基因为PaaJ，来源于大肠杆菌；

所述的编码3‐羟基酰基辅酶A脱氢酶的基因为PaaH1，来源于真氧产碱杆菌H16RalstoniaeutrophaH16；

所述的编码反‐2‐烯酰辅酶A还原酶的基因为Ter，来源于眼虫藻Euglena gracilis；

所述的编码磷酸丁酰转移酶的基因为Ptb，来源于丙酮丁酸梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC824；

所述的编码丁酸激酶的基因为Buk1，来源于丙酮丁酸梭菌Clostridium acetobutylicumATCC824；

所述的编码烯酰辅酶A水合酶基因为Crt，来源于丙酮丁酸梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC824；

所述的编码烯酰辅酶A水合酶基因为Ech，来源于真氧产碱杆菌RalstoniaeutrophaH16。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的基因工程菌通过PCR或化学合成得到核苷酸序列，连接表达载体得到重组质粒，最后通过将重组质粒转化大肠杆菌获得。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述的核苷酸序列包括：Ter、PaaJ、PaaH1、Crt、Ech、Ptb、Buk1。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述的表达载体包括：pTrc99A质粒和pZS*27mcherry质粒。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是，Ter和PaaJ在pTrc99A质粒表达，PaaH1、Crt/Ech、Ptb、Buk1在pZS*27mcherry质粒表达。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的来源于Ralstoniaeutropha H16的编码烯酰辅酶A水合酶的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示。