ES2613553T3 - Enzimas CAR y producción mejorada de alcoholes grasos - Google Patents

Enzimas CAR y producción mejorada de alcoholes grasos Download PDF

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Abstract

Variante de polipéptido de ácido carboxílico reductasa (CAR) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con el polipéptido de CAR silvestre de SEQ ID NO: 7, en la que dicha variante de polipéptido de CAR se modifica por ingeniería genética para que tenga al menos una mutación en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en S3R, D18R, D18L, D18T, D18P, E20V, E20S, E20R, S22R, S22N, S22G, L80R, R87G, R87E, V191S, F288R, F288S, F288G, Q473L, Q473W, Q473Y, Q473I, Q473H, A535S, D750A, R827C, R827A, I870L, R873S, V926A, V926E, S927K, S927G, M930K, M930R y L1128W, en la que la expresión de dicho polipéptido de CAR variante en una célula huésped recombinante da como resultado un título superior de composiciones de alcoholes grasos en comparación con una célula huésped recombinante que expresa el polipéptido de CAR silvestre de SEQ ID NO: 7.

Description

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determinadas realizaciones preferidas, la fuente de carbono es biomasa. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono es glucosa. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono es sacarosa.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se refiere a cualquier material biológico del que se derive una fuente de carbono. En algunas realizaciones, se procesa una biomasa para dar una fuente de carbono, que es adecuada para la bioconversión. En otras realizaciones, la biomasa no requiere procesamiento adicional para dar una fuente de carbono. La fuente de carbono puede convertirse en un biocombustible. Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es vegetación o materia vegetal, tal como maíz, caña de azúcar o césped de pradera. Otra fuente de biomasa a modo de ejemplo es productos de desecho metabólicos, tales como materia animal (por ejemplo, estiércol de vaca). Las fuentes de biomasa a modo de ejemplo adicionales incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos de desecho de la industria, la agricultura, silvicultura y domésticos, incluyendo, pero sin limitarse a, residuo de fermentación, ensilado, paja, madera, aguas cloacales, basura, desechos urbanos celulósicos y restos de comidas. El término “biomasa” también puede referirse a fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos).
Tal como se usa en el presente documento, el término “aislados”, con respecto a productos (tales como ácidos grasos y derivados de los mismos) se refiere a productos que están separados de componentes celulares, medios de cultivo celular, o precursores químicos o sintéticos. Los ácidos grasos y derivados de los mismos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por tanto, los ácidos grasos y derivados de los mismos pueden recogerse en una fase orgánica o bien de manera intracelular o bien de manera extracelular.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “purificar”, “purificado” o “purificación” significan la retirada
o el aislamiento de una molécula de su entorno, por ejemplo, mediante aislamiento o separación. Las moléculas “sustancialmente purificadas” están libres en al menos aproximadamente el 60% (por ejemplo, libres en al menos aproximadamente el 70%, libres en al menos aproximadamente el 75%, libres en al menos aproximadamente el 85%, libres en al menos aproximadamente el 90%, libres en al menos aproximadamente el 95%, libres en al menos aproximadamente el 97%, libres en al menos aproximadamente el 99%) de otros componentes con los que se asocian. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la retirada de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de un aldehído graso o un alcohol graso en una muestra. Por ejemplo, cuando se produce un aldehído graso o un alcohol graso en una célula huésped recombinante, el aldehído graso o alcohol graso puede purificarse mediante la retirada de proteínas de la célula huésped. Después de la purificación, el porcentaje de un aldehído graso o un alcohol graso en la muestra aumenta. Los términos “purificar”, “purificado” y “purificación” son términos relativos que no requieren pureza absoluta. Por tanto, por ejemplo, cuando se produce un aldehído graso o un alcohol graso en células huésped recombinantes, un aldehído graso purificado o un alcohol graso purificado es un aldehído graso o un alcohol graso que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos).
Mejoras de cepas
Con el fin de cumplir los objetivos muy altos para el título, el rendimiento y/o la productividad de alcoholes grasos, se hicieron varias modificaciones en las células huésped de producción. FadR es un factor regulador clave implicado en las rutas de biosíntesis de ácidos grasos y degradación de ácidos grasos (Cronan et al., Mol. Microbiol., 29(4): 937943 (1998)). La enzima ACS de E. coli FadD y la proteína de transporte de ácidos grasos FadL son componentes esenciales de un sistema de captación de ácidos grasos. FadL media en el transporte de ácidos grasos al interior de la célula bacteriana, y FadD media en la formación de ésteres de acil-CoA. Cuando no está disponible ninguna otra fuente de carbono, la bacteria capta ácidos grasos exógenos y los convierte en ésteres de acil-CoA, que pueden unirse al factor de transcripción FadR y desreprimir la expresión de los genes fad que codifican para proteínas responsables del transporte (FadL), activación (FadD) y β-oxidación (FadA, FadB, FadE y FadH) de ácidos grasos. Cuando están disponibles fuentes de carbono alternativas, las bacterias sintetizan ácidos grasos como acil-ACP, que se usan para la síntesis de fosfolípidos, pero no son sustratos para la β-oxidación. Por tanto, acil-CoA y acil-ACP son ambas fuentes independientes de ácidos grasos que pueden dar como resultado diferentes productos finales (Caviglia et al., J. Biol. Chem., 279(12): 1163-1169 (2004)). La solicitud provisional estadounidense n.º 611470.989 describe métodos mejorados de producción de derivados de ácido graso en una célula huésped que se modifica por ingeniería genética para tener un nivel de expresión alterado de un polipéptido de FadR en comparación con el nivel de expresión del polipéptido de FadR en una célula huésped silvestre correspondiente.
Hay especulaciones contradictorias en la técnica en cuanto a los factores limitantes de la biosíntesis de ácidos grasos en células huésped, tales como E. coli. Un enfoque para aumentar el flujo a través de la biosíntesis de ácidos grasos es manipular diversas enzimas en la ruta (figuras 1 y 2). El suministro de acil-ACP a partir de acetil-CoA por medio del complejo de acetil-CoA carboxilasa (acc) (figura 3) y la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (fab) puede limitar la tasa de producción de alcohol graso. En un enfoque a modo de ejemplo detallado en el ejemplo 2, el efecto de la sobreexpresión de Corynebacterium glutamicum accABCD (±birA) demostró que tales modificaciones genéticas pueden conducir a un aumento de acetil-coA y malonil-CoA en E. coli. Un posible motivo de una baja tasa de flujo a través de la biosíntesis de ácidos grasos es un suministro limitado de precursores, concretamente acetil-CoA y, en particular, malonil-CoA, y los principales precursores para la biosíntesis de ácidos grasos. El ejemplo 3
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V
GTC 85,30%
Y
TAC 88,80%
V191
GTC A GCC 88,70%
S
AGT 98,00%
F288
TTT G GGG 70,30%
R
AGG 77,20%
S
TCT 85,60%
S
AGC 79,60%
Q473
CAA A GCG 89,50%
F
TTC 89,10%
H
CAC 84,10%
I
ATC 77,20%
K
AAG 90,30%
L
CTA 90,10%
M
ATG 89,00%
R
AGG 88,00%
V
GTG 89,20%
W
TGG 84,50%
Y
TAC 86,00%
A535
GCC A TCC 71,80%
R827
CGC A GCC 93,20%
C
TGT 87,90%
C
TGC 83,20%
V926
GTT A GCT 78,10%
A
GCG 66,30%
A
GCC 69,50%
E
GAG 65,80%
G
GGC 78,60%
S927
AGC G GGG 77,60%
G
GGT 79,30%
I
ATC 90,80%
K
AAG 70,70%
V
GTG 87,90%
M930
ATG K AAG 82,30%
R
CGG 73,80%
R
AGG 69,80%
L1128
TTG A GCG 92,70%
G
GGG 89,70%
K
AAG 94,80%
M
ATG 95,80%
P
CCG 98,40%
R
AGG 90,90%
R
CGG 88,50%
S
TCG 88,90%
T
ACG 96,30%
V
GTG 93,90%
W
TGG 78,80%
Y
TAC 87,90%
A continuación se combinaron sustituciones de aminoácidos que se consideraban beneficiosas para la producción de alcohol graso. Se usó PCR para amplificar partes del gen de carBopt que contenía diversas mutaciones deseadas, y se unieron las partes entre sí usando un método basado en PCR (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. y Pease, L.R. 1989). Se examinó el gen de carBopt sin la etiqueta N-terminal de 60 pb. Las mutaciones combinadas en esta biblioteca de combinación se muestran en la tabla 9.
Tabla 9: Mutaciones de CarB de la primera biblioteca de combinación
Mutación
Codón
E20V
GTG
E20S
TCG
E20R
CGC
V191S
AGT
F288R
AGG
F288S
AGC
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resultados de una fermentación en matraz de agitación que muestra un porcentaje mejorado de producción de alcohol graso usando una mutación de combinación de CarB adicional (carB4). En la figura 4 se presenta una representación gráfica de la eficacia de conversión relativa de variantes de CarB de bajo número de copias. Los resultados notificados en la tabla 11 son de ejecuciones en biorreactor llevadas a cabo en condiciones idénticas.

Tabla 11: Variantes de CAR
Nombre
Mutación/mutaciones Cepa Datos de tanque Notas
carB
Ninguna = silvestre (E20 V191 F288 Q473) la proteína es SEQ ID NO: 7
carB60
Ninguna + etiqueta V324
carB1
A535S V940 83% de FALC; C12/C14=3,4 tiene una copia de TE cromosómico 12H08
carB2
E20R, F288G, Q473I, A535S LH375 97% de FALC; C12/C14=3,6 tiene dos copias de TE cromosómico 12H08
carB2
E20R, F288G, Q473I, A535S LH346 96% de FALC; C12/C14=3,7 tiene una copia de TE cromosómico 12H08
carB3
E20R, F288G, Q473H, A535S Biblioteca combinada L Sin ejemplos ejecutados en biorreactores hasta la fecha
carB4
E20R, F288G, Q473H, A535S, R827A, S927G Biblioteca combinada R (VA-219) 97% de FALC; C12/C14=3,9 tiene dos copias de TE cromosómico 12H08
carA
Ninguna Véase la publicación de patente estadounidense n.º 20100105963 la proteína es SEQ ID NO: 39
FadD9
Ninguna Véase la publicación de patente estadounidense n.º 20100105963 la proteína es SEQ ID NO: 40
Las secuencias de ADN de CarA, FadD9, CarB y CarB60 se presentan en el presente documento como SEQ ID NO: 41, 42, 43 y 44, respectivamente.
Identificación de mutaciones beneficiosas adicionales en la enzima CarB mediante mutagénesis de saturación:
Se desarrolló posteriormente un sistema de examen de plásmido doble y se validó para identificar variantes de CarB mejoradas con respecto a CarB4 para la producción de FALC. Este sistema de plásmido doble cumplía los siguientes criterios: 1) Los clones mutantes producen un alto título de FA para proporcionar flujo de ácidos grasos en exceso de la actividad de CarB. Esto se logra transformando una cepa base (V668 con dos copias de TE cromosómico) con un plásmido (pLYC4, pCL1920_PTRC_carDead_tesA_alrAadp1_fabB[A329G]_fadR) que porta el operón de FALC con una enzima CarB catalíticamente inactiva CarB[S693A] para potenciar la producción de ácidos grasos libres; 2) el plásmido de examen con molde de mutante de carB, preferiblemente menor de 9 kb, es propenso a procedimientos de mutagénesis de saturación y es compatible para la expresión con pLYC4; 3) el intervalo dinámico de actividad de CarB puede ajustarse. Esto se logra combinando un promotor más débil (PTRC1) y codones de iniciación alternativos (GTG o TTG) para ajustar los niveles de expresión de CarB4. 3) Se introdujo una buena estabilidad del plásmido, un módulo de toxina/antitoxina (operón de ccdBA) para mantener la estabilidad del plásmido.
En resumen, se construyó el plásmido de examen pBZ1 (pACYCDuet-1_PTRC1-carB4GTG_rrnBter_ccdAB) a partir de cuatro partes usando el método de clonación In-Fusion HD (Clontech) mezclando razones molares iguales de cuatro partes (PTRC1, carB4 con codones de iniciación ATG/TTG/GTG, terminadores rrnB T1T2 con ccdAB y vector pACYCDuet-1). Se amplificaron por PCR las partes (1 a 4) mediante los siguientes pares de cebadores: (1) PTRC1 cebador directo 5’-CGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCAAATCCGGCTCGTATAATGTGTG-3’ (SEQ ID NO: 45) y cebador inverso 5’-GGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGATACAT-3’ (SEQ ID NO: 46) usando el plásmido pVA232 (pCL1920_PTRC_carB4_tesA_alrAadp1_fabB[A329G]_fadR) como molde. (1) carB4 con codones de iniciación ATG/TTG/GTG -cebador directo carB4 ATG 5’-ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCATGGGCACGAGCGATGTTCACGACGCGAC-3’ (SEQ ID NO: 47); carB4 GTG 5’-ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCGTGGGCACGAGCGATGTTCACGACGCGAC-3’ (SEQ ID NO: 48); y carB4 TTG 5’-ATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCTTGGGCACGAGCGATGTTCACGACGCGAC-3’ (SEQ ID NO: 49); y cebador inverso carB4 rev 5’-TTCTAAATCAGACCGAACTCGCGCAG-3’ (SEQ ID NO: 50), usando el plásmido pVA232 como molde. (3) Los terminadores rrnB T1T2 con ccdAB -cebador directo rrnB T1T2 term 5’-CTGCGCGAGTTCGGTCTGATTTAGAATTCCTCGAGGATGGTAGTGTGG-3’ (SEQ ID NO: 51) y cebador inverso
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S927G, L1128W
P05H7
40,9 2,44 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, L1128W
P15A6
41 2,44 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, M930K, L1128W
P08F5
41,2 2,43 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, I870L, S927G, M930K
P14C7
41,3 2,42 E20R, F288G, Q473I, A535S, I870L, M930K
P16H10
42,1 2,38 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, S927G, M930K, L1128W
P16A1
44,1 2,27 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, L1128W
P14H4
44,2 2,26 E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G
P15C1
46,5 2,15 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, R827C, I870L, S927G, L1128W
P16E5
47,2 2,12 D18R, E20R, S22R, F288G, Q473I, A535S, S927G, M930R, L1128W
P15A3
47,2 2,12 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, V926E, S927G, M930R
P05A2
52,4 1,91 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827C, I870L, V926A, L1128W
CarB2
100 1 E20R, F288G, Q473I, A535S
CarB4
77,8 1,29 E20R, F288G, Q473H, A535S, R827A, S927G
CarB5
48,9 2,04 E20R, S22R, F288G, Q473H, A535S, R827A, S927G
CarB1
ND A535S
CarB silvestre
ND SEQ ID NO: 7
CarBDead
ND S693A
Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto de otra forma. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o una expresión a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en el presente documento, pretende meramente iluminar mejor la divulgación y no supone una 5 limitación en el alcance de la divulgación a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse que indica que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la divulgación. Debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones particulares sólo, y no pretende ser limitativa. Se describen en el presente documento realizaciones preferidas de esta divulgación. Variaciones de esas realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para los
10 expertos habituales en la técnica tras la lectura de la descripción anterior.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0920010A2 (pt) * 2008-10-28 2016-04-19 Ls9 Inc métodos para produzir álcool graxo e surfactante
MX366939B (es) * 2012-04-02 2019-07-31 Reg Life Sciences Llc Producción mejorada de derivados de ácidos grasos.
ES2786633T3 (es) * 2012-04-02 2020-10-13 Genomatica Inc Enzimas CAR y producción mejorada de alcoholes grasos
MX2015001780A (es) 2012-08-10 2015-09-28 Opx Biotechnologies Inc Microorganismos y métodos para la producción de ácidos grasos y productos derivados de ácidos grasos.
WO2014145343A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
WO2014146026A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
CN106795483A (zh) 2013-07-19 2017-05-31 嘉吉公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
CA2955370A1 (en) 2014-07-18 2016-01-21 REG Life Sciences, LLC Microbial production of fatty diols
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
CN105985987B (zh) * 2015-03-02 2020-01-31 苏州安捷生物科技有限公司 一种生物法制备脂肪醇的方法
WO2017161112A1 (en) * 2016-03-17 2017-09-21 Invista Technologies S.A R.L. Carboxylic acid reductase polypeptides and variants having improved activity, materials and processes relating thereto
WO2018144701A2 (en) 2017-02-02 2018-08-09 Cargill Incorporated Genetically modified cells that produce c6-c10 fatty acid derivatives
CN111094558A (zh) 2017-04-03 2020-05-01 基因组股份公司 对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体
CN117120616A (zh) 2021-03-30 2023-11-24 旭化成株式会社 具有羧酸还原活性的重组多肽
WO2023178193A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Genomatica, Inc. Acyl-acp thioesterase variants and uses thereof

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5028539A (en) 1988-08-31 1991-07-02 The University Of Florida Ethanol production using engineered mutant E. coli
US5482846A (en) 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
US5000000A (en) 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
US5424202A (en) 1988-08-31 1995-06-13 The University Of Florida Ethanol production by recombinant hosts
AU7791991A (en) 1990-04-24 1991-11-11 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
US5602030A (en) 1994-03-28 1997-02-11 University Of Florida Research Foundation Recombinant glucose uptake system
US6428767B1 (en) 1995-05-12 2002-08-06 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for identifying the source of carbon in 1,3-propanediol
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US7056714B2 (en) * 2003-03-11 2006-06-06 University Of Iowa Research Foundation, Inc. Carboxylic acid reductase polypeptide, nucleotide sequence encoding same and methods of use
DE102004052115A1 (de) 2004-10-26 2006-04-27 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Mikroorganismen zur Herstellung von Fettsäureestern, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
WO2007136762A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Ls9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof
KR20100015763A (ko) 2007-03-28 2010-02-12 엘에스9, 인코포레이티드 지방산 유도체의 생산 증가
AU2008256921B2 (en) 2007-05-22 2015-01-22 Genomatica, Inc. Hydrocarbon-producing genes and methods of their use
TWI351779B (en) 2007-12-03 2011-11-01 Advance Smart Ind Ltd Apparatus and method for correcting residual capac
US8183028B2 (en) 2007-12-21 2012-05-22 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing olefins
WO2010042664A2 (en) 2008-10-07 2010-04-15 Ls9, Inc. Method and compositions for producing fatty aldehydes
BRPI0920010A2 (pt) * 2008-10-28 2016-04-19 Ls9 Inc métodos para produzir álcool graxo e surfactante
US9175234B2 (en) * 2008-12-23 2015-11-03 REG Life Sciences, LLC Methods and compositions related to thioesterase enzymes
CN102482676A (zh) 2009-05-01 2012-05-30 加州大学评议会 来源于生物质聚合物的脂肪酸脂产物
US20100298612A1 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 Codexis, Inc. Engineered biosynthesis of fatty alcohols
EP2488652A4 (en) * 2009-10-13 2014-04-09 Genomatica Inc MICRO-ORGANISMS FOR THE PREPARATION OF 1,4-BANDANDIOL, 4-HYDROXYBUTANAL, 4-HYDROXYBUTYRYL-COA, PUTRESCIN AND CORRESPONDING COMPOUNDS, AND CORRESPONDING METHODS
WO2011100667A1 (en) 2010-02-14 2011-08-18 Ls9, Inc. Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols
AR084377A1 (es) 2010-04-08 2013-05-15 Ls9 Inc Metodos y composiciones relacionados con enzimas de alcohol graso biosintetico
EP2694663A4 (en) * 2011-04-01 2015-04-29 Genomatica Inc MICRO-ORGANISMS FOR THE PREPARATION OF METHACRYLIC ACID AND METHACRYLATE ESTERS AND METHODS RELATED THEREWITH
ES2808287T3 (es) * 2011-04-01 2021-02-26 Genomatica Inc Métodos y composiciones para la producción mejorada de ácidos grasos y derivados de los mismos
US8617862B2 (en) * 2011-06-22 2013-12-31 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing propylene and methods related thereto
ES2786633T3 (es) * 2012-04-02 2020-10-13 Genomatica Inc Enzimas CAR y producción mejorada de alcoholes grasos

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