CN104185684B - 对根肿病具有抗性的ho/ll芸苔 - Google Patents

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Abstract

本公开内容关注包含一种或多种选自下组的性状的芸苔属植物或其部分：与同一物种的野生型植物相比，高油酸含量、低亚麻酸含量、升高的除草剂抗性、细胞质雄性不育的恢复系、和升高的根肿病(芸苔根肿菌)抗性。本公开内容进一步涉及这些性状中涉及的基因的野生型和突变体等位基因、与其连锁的分子标志物、及其使用方法。

Description

对根肿病具有抗性的HO/LL芸苔
优先权要求
本申请要求2011年9月27日提交的美国专利申请系列号13/246,757的优先权。
发明领域
本公开内容涉及对疾病有抗性的植物，例如对疾病，即根肿病(clubroot)有抗性的欧洲油菜(Brassica napus)植物。本公开内容还涉及与根肿病抗性连锁的分子标志物。在具体的实施方案中，公开内容涉及通过例如使用与根肿病抗性连锁的分子标志物将根肿病抗性引入植物中的组合物和方法。具体的实施方案涉及使用特定核酸序列来鉴定有可能具有根肿病抗性表型的植物的方法。
发明背景
根肿病是一种分布广泛的疾病，其对许多芸苔(Brassica)生长区引起严重的问题。参见例如Dixon(1999)Grower April 29:28-9。该疾病由芸苔根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)(一种单细胞生物体)引起。疾病的症状包括根畸形，伴有最终腐烂的硬肿胀(棒状物(clubs))。疾病还经由降低的生长而引起发育迟缓，并且在水应激下观察到叶的萎蔫。对疾病的化学控制是无效的。
芸苔属包含商业目的的几种物种，诸如芜菁(B.rapa)(例如大白菜(Chinesecabbage)、小白菜(pak choi)、芜菁(turnip))；欧洲油菜(例如含油种子，瑞典芜菁(swede))；芥菜(B.juncea)(例如芥菜(mustard))；黑芥(B.nigra)(例如黑芥(blackmustard))；和甘蓝(B.oleracea)(例如花椰菜(cauliflower)、花茎甘蓝(broccoli)、甘蓝(cabbage)、抱子甘蓝(Brussels sprouts)、皱叶甘蓝(savoy cabbage)、羽衣甘蓝(borecole)、苤蓝(kohl rabi)、羽衣甘蓝，等等)。虽然芸苔属物种内的亚种通常是有性相容的，但是芸苔属的不同物种之间不一定如此。例如，芜菁和甘蓝没有相同数目的染色体(10条染色体对9条染色体)，并且因此不是有性相容的。这使性状从一种芸苔物种转移至另一种变得特别困难。
已经在芸苔属内描述了对根肿病的抗性的几种来源。参见例如Bradshaw等(1997)Ann.Appl.Biol.130:337-48；Gowers(1982)Euphytica 31:971-6。一些抗性是单基因的，一些是多基因的，一些是显性的，而一些是隐性的。已经在芜菁和欧洲油菜中描述了单基因显性抗性，诸如例如芜菁大白菜中的单基因显性抗性。Yoshikawa(1983)Japan AgriculturalResearch Quarterly17(l):6-11。已经显示了具有此抗性的大白菜F1杂种针对根肿病具有良好的保护，尽管少量根肿病菌株(“种”)已经能够突破此抗性。
认为根肿病感染是芸苔栽培业的主要威胁。为了得到根肿病抗性芸苔品种的育种尝试会产生大量需要筛选根肿病抗性的分离植物。对育种材料筛选根肿病抗性的目前实践包括对单独的植物测定表型，其经由在用芸苔根肿菌病原体接种植物后观察所述植物的表型反应进行。这种已经麻烦且费时的方法进一步伴随目前对根肿病病原体或任何感染性材料运输的管理限制。前述考虑因素使对育种材料筛选根肿病抗性的成本变得非常高，而且还通过限制可同时测试的品系数目而显著阻碍育种的努力。
发明概述
本文中描述了芸苔植物及其部分，其中植物包含至少一种选自下组的性状：高油酸和/或低亚麻酸含量；对芸苔根肿菌的抗性；对除草剂(例如草甘膦或咪唑啉酮除草剂)的抗性；和细胞质雄性不育的恢复系。在一些实施方案中，芸苔植物选自下组：芜菁、欧洲油菜、芥菜、黑芥、和甘蓝。例如在具体的实施方案中利用欧洲油菜。具体的实施方案提供了芸苔植物及其部分，其中植物显示与同一物种的野生型植物相比的高油酸和/或低亚麻酸含量，显示与同一物种的野生型植物相比对芸苔根肿菌的抗性，显示与同一物种的野生型植物相比对咪唑啉酮的抗性，且包含细胞质雄性不育系统恢复系基因。具体的实施方案可以包括在包含芸苔根肿菌的田地中种植依照本发明的芸苔植物或其部分的方法。
在具体的实施方案中，植物(或其部分)可以包含就对于植物的第一亲本天然的且对于第二亲本非天然的遗传等位基因而言纯合的基因组，其中第二亲本显示比第一亲本显著更少的油酸和/或更高的亚麻酸含量。在一些例子中，植物(或其部分)包含在至少一个基因座中杂合或近交组合的来自第一亲本的等位基因，所述基因座选自定位于选自下组的连锁群的基因座：芸苔物种的N14、N4、N5和N1。在具体的例子中，可以通过一种或多种以SEQID NO:5、6、14、和15列出的标志物定位来自第一亲本的等位基因。
本文中还描述了与欧洲油菜中的高油酸(HO)和/或低亚麻酸(LL)表型连锁(例如连锁；紧密连锁；或极端紧密连锁)的核酸分子标志物。在具体的实施方案中，与HO表型连锁的标志物与fad2基因中的突变连锁。在具体的实施方案中，与LL表型连锁的标志物与fad3基因中的突变连锁。在一些实施方案中，可以使用与欧洲油菜中的HO/LL表型连锁的标志物将HO/LL表型引入其它植物(例如其它芸苔物种)中。一些实施方案包括使用至少一种与欧洲油菜中的HO/LL表型连锁的核酸分子标志物的方法，例如但不限于用以鉴定具有HO/LL表型的植物；和/或将HO/LL表型引入新的植物基因型和种质(例如经由标志物辅助育种或遗传转化)。
进一步描述了用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段，和用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段。在一些例子中，用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段是欧洲油菜植物中fad2基因中第411位的“C”至“T”突变。在一些例子中，用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段是欧洲油菜植物中fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变。
还描述了用于鉴定携带促成芸苔属植物中HO表型的基因的植物的手段。在一些例子中，用于鉴定携带促成HO表型的基因的植物的手段是探针，该探针与包含第411位的“C”至“T”突变的欧洲油菜fad2基因区段特异性杂交，但是不与没有此突变的野生型欧洲油菜fad2基因的相同区段杂交。还描述了用于鉴定携带促成芸苔属植物中LL表型的基因的植物的手段。在一些例子中，用于鉴定携带促成LL表型的基因的植物的手段是探针，该探针与包含第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变的欧洲油菜fad32基因区段特异性杂交，但是不与没有此突变的野生型欧洲油菜fad32基因的相同区段杂交。
在一些实施方案中，本发明的芸苔植物的种子可以包含至少63％油酸(C18:1)。例如，本发明的芸苔植物的种子可以包含至少77％油酸(C18:1)。在本发明的一些实施方案中，芸苔植物的种子可以包含不超过6％亚麻酸(C18:3)。例如，芸苔植物的种子可以包含不超过1.5％亚麻酸(C18:3)。
在一些实施方案中，本发明的植物(或其部分)可以包含与选自下组的核苷酸序列的互补物特异性可杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO:7和12。在这些和其它实施方案中，植物或其部分可以对咪唑啉酮(例如选自下组的咪唑啉酮：imazamethbenz、甲氧咪草烟(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、和咪唑乙烟酸(imazethapyr))有抗性。具体的实施方案包括控制田间的至少一种杂草的方法，其中田间含有至少一种芸苔植物或其部分，并且对田间的至少一部分施用咪唑啉酮。
本文中还描述了与欧洲油菜中的根肿病抗性表型连锁(例如连锁；紧密连锁；或极端紧密连锁)的核酸分子标志物。在一些实施方案中，可以使用与欧洲油菜中的根肿病抗性表型连锁的标志物将根肿病抗性表型引入其它植物(例如其它芸苔物种)中。可以使用与欧洲油菜中的根肿病抗性表型连锁的标志物将根肿病抗性表型引入其它植物(例如其它芸苔物种)中。一些实施方案包括使用至少一种与欧洲油菜中的根肿病抗性表型连锁的核酸分子标志物的方法，例如但不限于用以鉴定具有根肿病抗性表型的植物；和/或将根肿病抗性表型引入新的植物基因型(例如经由标志物辅助育种或遗传转化)。在具体的例子中，可以利用选自下组的引物或其功能等同物通过DNA扩增测定和/或鉴定与根肿病抗性连锁的标志物：SEQ ID NO:18-22。
进一步描述了用于将根肿病抗性引入芸苔植物中的手段，和用于鉴定携带促成根肿病抗性的基因的植物的手段。在一些例子中，用于将根肿病抗性引入芸苔植物中的手段是长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的基因组DNA的连续区段，该标志物与欧洲油菜植物中的根肿病抗性连锁。还描述了用于鉴定携带促成根肿病抗性的基因的植物的手段。在一些例子中，用于鉴定携带促成根肿病抗性的基因的植物的手段是探针，该探针与基因组DNA的连续区段特异性杂交，所述连续区段长度为300bp，并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增。
通过参考附图进行的几个实施方案的以下详细描述，前述和其它特征会变得更加显而易见。
附图简述
图1包括从欧洲油菜品种DMS100和Quantum克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列。顶部显示了从DMS100克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:7)，底部显示了从Quantum克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。箭头标示“C”至“T”的单核苷酸突变，这产生终止密码子(“TAG”)(有阴影)。以粗体和下划线显示了突变体等位基因特异性正向(SEQ ID NO:5)和反向(SEQ ID NO:6)引物，用于突变体等位基因特异性标志物的基于PCR的鉴定。
图2包括与从DMS100(SEQ ID NO:8)，Quantum(SEQ ID NO:10)，及从发表的欧洲油菜fad2基因(BNfad2)(SEQ ID NO:11)克隆的基因组核苷酸序列简并的fad2基因的氨基酸序列。箭头标示源自DMS100中的单核苷酸突变(“C”至“T”)的终止密码子位置。
图3包括从DMS100和Quantum克隆的fad3c基因的基因组核苷酸序列。顶部显示了从DMS100克隆的fad3c基因(SEQ ID NO:12)，而底部显示了从Quantum克隆的fad3c基因(SEQ ID NO:13)。与芜菁和拟南芥(Arabidopsis)中的fad3基因的外显子4、5、6和7对应的外显子是框示的，而与芜菁和拟南芥中的fad3基因的内显子4、5、和6对应的内含子是未框示的。箭头标示“G”至“A”的单核苷酸突变。以粗体和下划线显示了正向(SEQ ID NO:14)和突变体等位基因特异性反向(SEQ ID NO:15)引物，用于突变体等位基因特异性标志物的基于PCR的鉴定。
图4包括关联突变体等位基因特异性标志物和源自Quantum和DMS100杂交的184种双重单倍体(DH)品系的脂肪酸含量的表(顶部)，及从fad2基因的突变体等位基因特异性标志物扩增的PCR产物的电泳结果(底部)。
图5包括数量性状基因座(QTL)图，其显示了通过本发明的标志物检出的一个主要(N5)和一个次要(N1)QTL区(对于高油酸(C18:1))，和三个QTL区(N4和N14)(对于低亚麻酸(C18:3))。
图6包括杂种种子生成方案中的细胞质雄性不育系统的一种用途的图示。
图7包括FAME图，其显示多种植物杂交的脂肪酸概貌的分布。
图8包括例示性的根肿病抗性、高油酸、和低亚麻酸芸苔植物中开花日期的分布的显示。
图9包括凝胶图像，其显示了与芸苔中根肿病抗性连锁的分子标志物的鉴定。与根肿病抗性连锁的鉴定的标志物条带以红色突出显示，并且在此情况中，扩增片段的大小是333bp(将总共33个额外的碱基对添加至SEQ ID NO:18和19的引物(将26个碱基添加至SEQID NO:18的5’端，并且将7个碱基添加至SEQ ID NO:19的5’端，如分别在SEQ ID NO:20和21中给出)以便于使用ABI 3130遗传分析仪的检测)。提供了测试的每个品系的根肿病反应。
序列表
使用如37 C.F.R.§1.822中限定的核苷酸碱基的标准字母缩写显示所附序列表中所列的核酸序列。仅显示每个核酸序列的一条链，但是应当理解通过任意参考展示链而包括互补链。
SEQ ID NO:1-2是用于从亲本系DMS100和Quantum的基因组欧洲油菜DNA扩增fad2基因的引物。
SEQ ID NO:3-4是用于从亲本系DMS100和Quantum的基因组欧洲油菜DNA扩增fad31基因的引物。
SEQ ID NO:5是突变体特异性正向引物，用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad2等位基因。
SEQ ID NO:6是反向引物，用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad2等位基因。
SEQ ID NO:7是从欧洲油菜品种DMS100克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是与从欧洲油菜品种DMS100克隆的基因组核苷酸序列简并的fad2基因产物的氨基酸序列，该序列以如标示的“终止”密码子中断。
SEQ ID NO:9是从欧洲油菜品种Quantum克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是与从欧洲油菜品种Quantum克隆的基因组核苷酸序列简并的fad2基因产物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是与来自欧洲油菜品种BNfad2的基因组核苷酸序列简并的fad2基因产物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是从欧洲油菜品种DMS100克隆的fad3c基因的基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是从欧洲油菜品种Quantum克隆的fad3c基因的基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是正向引物，用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad32等位基因。
SEQ ID NO:15是突变体特异性反向引物，用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad32等位基因。
SEQ ID NO:16和17是用于从亲本系DMS100和Quantum的基因组欧洲油菜DNA扩增fad32基因的引物。
SEQ ID NO:18-21是可用于鉴定和/或测定根肿病抗性标志物的例示性引物序列。
SEQ ID NO:22是在与SEQ ID NO:20和21一起使用时用于扩增经标记的DNA片段的经荧光标记的M13通用引物序列，用于检测。
发明详述
I.几个实施方案的概述
本文中描述了包含根肿病抗性表型的芸苔(例如欧洲油菜)植物及其后代。本文中还描述了从此类芸苔植物获得的植物部分，包括植物的种子和植物材料。在具体的实施方案中，对根肿病的抗性可以是单基因的和/或多基因的。在具体的实施方案中，对根肿病的抗性可以是显性的和/或隐性的。
使用包含根肿病抗性表型的欧洲油菜植物，已经鉴定出与根肿病抗性表型紧密连锁的分子标志物。特别地，鉴定出一个简单序列重复(SSR)标志物基因座，其与根肿病抗性表型紧密连锁。此SSR标志物特别可用于将此表型引入其它植物(例如其它欧洲油菜品种和其它芸苔物种)中，例如经由传统的植物育种进行，而且还可用于鉴定可能具有此表型的植物(例如在通过重组遗传工程产生的植物中)。在芸苔育种项目中利用至少一种与根肿病抗性表型紧密连锁的分子标志物可以大大降低对育种材料筛选根肿病抗性的时间和成本。例如，利用此类标志物可以降低对昂贵的根肿病抗性筛选的需要，由此显著有助于根肿病抗性芸苔品种的育种。
II.术语
回交：回交方法可以用于将核酸序列导入植物中。几十年以来已经广泛使用回交技术来将新性状导入植物中。Jensen,N.编Plant Breeding Methodology,John Wiley&Sons,Inc.,1988。在一个典型的回交方案中，将感兴趣的初始品种(回归亲本)与携带要转移的感兴趣基因的第二品种(非回归亲本)杂交。然后，将来自此杂交的所得后代与回归亲本再次杂交，并重复该过程，直到获得如下的植物，其中在来自非回归亲本的转移基因外，在转化植物中恢复回归植物的基本上所有期望的形态学和生理学特征。
根肿病抗性：植物对根肿病的抗性或耐受性指在包含芸苔根肿菌的田间种植时与相同植物的非抗性和/或非耐受性品系相比升高的生长、生产力、和/或植物中根小结大小和/或数目的降低。如本文中使用的，根肿病抗性还包括对根肿病抗性的耐受性。根肿病抗性可以由一种或多种基因、等位基因、或事件赋予。
遗传基因座：如本文中使用的，术语“遗传基因座”指染色体上的位置。
基因组基因座：如本文中使用的，术语“基因组基因座”指生物体的整组染色体内的位置。
连锁不平衡：如本文中使用的，术语“连锁不平衡”指两个基因座之间或性状与标志物之间的统计学关联。
连锁的、紧密连锁的、和极端紧密连锁的：如本文中所使用的，基因或标志物间的连锁指染色体上的基因或标志物显示一起传递到下一代个体的可测量概率的现象。两种基因或标志物彼此越接近，此概率变得越接近(1)。如此，术语“连锁的”可以指以大于0.5的概率(其从独立分类预期，其中标志物/基因位于不同染色体上)与某个基因一起传递的一种或多种基因或标志物。由于染色体上两个基因或标志物的接近性与基因或标志物会一起传递到下一代个体的概率直接相关，术语“连锁的”在本文中也可以指在同一芸苔染色体上彼此位于约2.0Mb内的一种或多种基因或标志物。因此，两种“连锁的”基因或标志物可以相隔约2.1Mb；2.00Mb；约1.95Mb；约1.90Mb；约1.85Mb；约1.80Mb；约1.75Mb；约1.70Mb；约1.65Mb；约1.60Mb；约1.55Mb；约1.50Mb；约1.45Mb；约1.40Mb；约1.35Mb；约1.30Mb；约1.25Mb；约1.20Mb；约1.15Mb；约1.10Mb；约1.05Mb；约1.00Mb；约0.95Mb；约0.90Mb；约0.85Mb；约0.80Mb；约0.75Mb；约0.70Mb；约0.65Mb；约0.60Mb；约0.55Mb；约0.50Mb；约0.45Mb；约0.40Mb；约0.35Mb；约0.30Mb；约0.25Mb；约0.20Mb；约0.15Mb；约0.10Mb；约0.05Mb；约0.025Mb；约0.012Mb；和约0.01Mb。基因可以与驻留于基因外显子或内含子内的标志物“连锁”。在此情况中，连锁的基因和标志物之间的相隔0.00Mb。
与fad2“连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N5和N1中的核苷酸序列，例如欧洲油菜fad2基因中第411位的“C”至“T”突变。与fad3“连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N14和N4中的核苷酸序列，例如欧洲油菜fad32基因中的第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变。
标志物和/或基因也可以与表型(例如牵涉连锁基因或与连锁标志物连锁的基因的表型)“连锁”。一些实施方案包括与HO、LL、咪唑啉酮抗性、和/或根肿病抗性表型连锁的标志物。与HO/LL表型“连锁的”标志物的具体例子包括与fad2和fad3连锁的标志物。与根肿病抗性表型“连锁的”标志物的具体例子包括长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段。如本领域技术人员应当理解，若添加或从位于退火时使用的特定引物的远端末端间的基因组DNA跨距扣除核苷酸，则此SSR的长度会有所变化。
如本文中使用的，术语“紧密连锁的”可以指在同一染色体上彼此位于约0.5Mb内的一种或多种基因或标志物。因此，两种“紧密连锁的”基因或标志物可以相隔约0.6Mb；约0.55Mb；0.5Mb；约0.45Mb；约0.4Mb；约0.35Mb；约0.3Mb；约0.25Mb；约0.2Mb；约0.15Mb；约0.12Mb；约0.1Mb；约0.05Mb；和约0.00Mb。与fad2“紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N5和N1中的某些核苷酸序列，例如欧洲油菜fad2基因中第411位的“C”至“T”突变。与fad3“紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N14和N4中的某些核苷酸序列，例如欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变。与根肿病抗性表型“紧密连锁的”标志物的具体例子包括长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段。
如本文中使用的，术语“极端紧密连锁的”可以指在同一染色体上彼此位于约100kb内的一种或多种基因或标志物。因此，两种“极端紧密连锁的”基因或标志物可以相隔约125kb；约120kb；约115kb；约110kb；约105kb；100kb；约95kb；约90kb；约85kb；约80kb；约75kb；约70kb；约65kb；约60kb；约55kb；约50kb；约45kb；约40kb；约35kb；约30kb；约25kb；约20kb；约15kb；约12kb；约10kb；约5kb；约1kb；和约0kb。与fad2“极端紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N5和N1中的某些核苷酸序列，例如欧洲油菜fad2基因中第411位的“C”至“T”突变。与fad3“极端紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N14和N4中的某些核苷酸序列，例如欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变。与根肿病抗性表型“极端紧密连锁的”标志物的具体例子包括长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段。
连锁的，紧密连锁的，和极端紧密连锁的遗传标志物可以用于标志物辅助育种项目来鉴定包含连锁表型和/或基因类型的个体，以及将这些性状和/或基因育种到芸苔品种中。
基因座：如本文中使用的，术语“基因座”指基因组上与可测量的特征(例如，性状)对应的位置。SNP基因座通过与基因座内含有的DNA杂交的探针限定。
标志物：如本文中使用的，标志物指可以用于鉴定具有特定等位基因(例如fad2、fad32和长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段)的植物的基因或核苷酸序列。标志物可以描述为给定基因组基因座处的变异。遗传标志物可以是短的DNA序列，诸如单碱基对变化(单核苷酸多态性，或“SNP”)周围的序列，或长的DNA序列，例如小卫星/简单序列重复(“SSR”)。“标志物等位基因”指特定植物中存在的标志物型式。如本文中使用的，“标志物”包括指染色体上用来鉴定染色体上独特位置的基因座。基因型可以通过使用一种或多种标志物限定。因此，“标志物”包括指位于基因组的染色体上的基因中的一个或多个核苷酸位置。
分子标志物特别可用于加速经由回交将基因或数量性状基因座(QTL)导入良种栽培种或育种系中的方法。可以使用与基因连锁的标志物来选择拥有期望性状的植物，并且可以使用遍及基因组的标志物来选择在遗传上与回归亲本相似的植物。Young和Tanksley(1989)Theor.Appl.Genet.77:95-101；Hospital等(1992)Genetics 132:1199-210。
如本文中使用的，术语“标志物”可以指芸苔染色体DNA的克隆区段(例如，SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:12的核苷酸序列的区段)，并且还可以或备选地指与芸苔染色体DNA的克隆区段互补的DNA分子。
一些实施方案包括标志物的“衍生物”。如本文中使用的，术语“衍生物”可以指特定标志物序列的修饰。就分子标志物而言的例示性此类修饰是与本文中公开的标志物的核酸序列相关的一个或多个碱基的取代、插入、和/或缺失，其保留，略微改变，或提高分子标志物在鉴定一种或多种性状(例如芸苔或其它含油种子作物物种中的根肿病抗性，和高油酸和/或低亚麻酸性状)中的功能。本领域技术人员可以例如通过使用用于预测和优化序列结构的计算机建模技术容易地确定此类衍生物。因此，术语“衍生物”包括与本文中公开的一种或多种标志物序列基本上相同，使得衍生物标志物能够拥有标志物辅助育种中使用的公开的功能性的核酸序列。
标志物辅助育种：如本文中使用的，术语“标志物辅助育种”可以指在一种或多种复杂性状(例如HO、LL、咪唑啉酮抗性、和/或根肿病抗性)方面直接育种的方法。在当前的实践中，植物育种人员尝试鉴定与农艺学期望的性状连锁的容易地可检出的性状，诸如花颜色、种皮外观、或同工酶变体。植物育种人员然后通过追踪容易地可检出的性状的分离来追踪分离的育种群体中的农艺学性状。然而，存在着可用于植物育种中使用的非常少的这些连锁关系。
标志物辅助育种提供了用于改善植物品种的时间和成本有效的方法。应用标志物辅助育种的几个例子牵涉使用同工酶标志物。参见例如Tanksley和Orton编(1983)Isozymes in Plant Breeding and Genetics,Amsterdam:Elsevier。一个例子是与对番茄中的线虫有害生物的抗性的基因关联的同工酶标志物。受到称作Mi的基因控制的抗性位于番茄的染色体6上，并且与Aps1(即一种酸性磷酸酶同工酶)非常紧密连锁。Aps1同工酶标志物间接选择Mi基因的用途提供如下的优点，即可以用标准的电泳技术明确测定群体中的分离；可以在幼苗组织中对同工酶标志物评分，消除对将植物维持至成熟的需要；以及同工酶标志物等位基因的共显性容许区别纯合子和杂合子。参见Rick(1983)于Tanksley和Orton,见上文。
在一些实施方案中，可以经由使用核酸探针检测植物中的标志物存在。探针可以是DNA分子或RNA分子。可以通过本领域中已知的手段，例如使用DNA分子模板合成RNA探针。探针可以含有标志物的整个或部分的核苷酸序列和来自芸苔基因组的额外的、连续的核苷酸序列。这在本文中称为“连续探针”。所述额外的、连续的核苷酸序列称为初始标志物的“上游”或“下游”，这取决于来自芸苔染色体的连续核苷酸序列是在初始标志物的5’还是3’侧，如按照惯例理解的。对于与HO性状连锁的标志物的例子，所述额外的、连续的核苷酸序列可以位于芸苔染色体上初始标志物与fad2基因的第411位之间。对于与LL性状连锁的标志物的例子，所述额外的、连续的核苷酸序列可以位于芸苔染色体上初始标志物与fad3基因的第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基之间。如本领域普通技术人员认可的，可以几乎无限重复获得标志物中纳入的额外的、连续的核苷酸序列的方法(仅受限于染色体的长度)，由此沿着芸苔染色体鉴定额外的标志物。可以在本发明的一些实施方案中使用所有上文描述的标志物。
可以合成或通过克隆制备寡核苷酸探针序列。合适的克隆载体是本领域技术人员公知的。寡核苷酸探针可以是标记的或未标记的。存在用于标记核酸分子的极其多种技术，包括例如但不限于：通过缺口平移的放射性标记；随机引发；用末端脱氧转移酶(deoxytransferase)的加尾；等等，其中采用的核苷酸例如用放射性32P标记。可以使用的其它标记物包括例如但不限于：荧光团；酶；酶底物；酶辅因子；酶抑制剂；等等。或者，自身或与其它反应剂一起提供可检测信号的标记物的使用可以用受体结合的配体替换，其中受体是标记的(例如，通过上文指定的标记物进行)，从而自身或与其它试剂一起提供可检测信号。参见例如Leary等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4045-9。
探针可以含有与初始标志物的核苷酸序列不连续的核苷酸序列；此探针在本文中称为“非连续探针”。非连续探针的序列与芸苔染色体上的初始标志物的序列足够接近地定位，从而非连续探针与相同基因(例如fad2或fad3)遗传连锁。例如，在一些实施方案中，非连续探针可以位于芸苔染色体上的初始标志物的500kb；450kb；400kb；350kb；300kb；250kb；200kb；150kb；125kb；120kb；100kb；0.9kb；0.8kb；0.7kb；0.6kb；0.5kb；0.4kb；0.3kb；0.2kb；或0.1kb内。
探针可以是要检测的标志物的精确拷贝。探针也可以是包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的核酸分子，所述核苷酸序列与芸苔染色体DNA的克隆区段(例如，如以SEQ IDNO:7中包含核苷酸位置411的区段和SEQ ID NO:12中包含基因的第三个内含子的5’剪接位点的第一个核苷酸位置的区段限定)是基本上相同的。如本文中使用的，术语“基本上相同的”可以指超过85％相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列与参照序列可以是85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％相同的。
探针也可以是与要检测的标志物的精确拷贝(“DNA靶物”)“特异性可杂交”或“特异性互补”的核酸分子。“特异性可杂交”和“特异性互补”是如下的术语，其指示足够的互补性程度，使得核酸分子和DNA靶物之间发生稳定的且特异性的结合。因此，在一些例子中，探针可以是DNA靶物的互补物。然而，核酸分子与要特异性可杂交的其靶序列不需要是100％互补的。在存在有足够的互补性程度以避免核酸在期望特异性结合的条件下，例如在严格杂交条件下对所有非靶序列的非特异性结合时，核酸分子是特异性可杂交的。因此，在一些例子中，探针与DNA靶物的互补物可以是基本上相同的。例如，探针与DNA靶物的互补物可以是85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％相同的。
探针可以包含在包含额外的核酸序列的核酸分子内；例如启动子；转录信号；和/或载体序列。可以使用探针限定与基因紧密连锁的别的标志物，所述基因牵涉HO、LL、咪唑啉酮抗性、和/或根肿病表型(例如fad2和fad3)。如此鉴定的标志物可以与本公开内容中命名的例示性标志物等同，并且因此在本发明的范围内。
产生特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质及杂交核酸序列的组成和长度而有所变化。一般地，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)会决定杂交严格性，尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定严格性程度需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且例如在Sambrook等(编)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,1989,第9章和第11章；及Hames和Higgins(编)NucleicAcid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985中讨论。关于核酸杂交的更为详细的用法说明书和指导可以参见例如Tijssen,“Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays,”于Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分,第2章,Elsevier,NY,1993；和Ausubel等编,Current Protocols in MolecularBiology,第2章,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
如本文中所使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与DNA靶物之间存在有小于25％错配时发生杂交的条件。“严格条件”包括其它特定的严格性水平。如此，如本文中使用的，“温和(moderate)严格性”条件是具有超过25％序列错配的分子不会杂交的那些条件；“中等(medium)严格性”条件是具有超过15％错配的分子不会杂交的那些条件；而“高严格性”条件是具有超过10％错配的分子不会杂交的那些条件。“非常高严格性”的条件是具有超过6％错配的分子不会杂交的那些条件。
在具体的实施方案中，严格条件是于65℃在6x盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液、5x登哈特(Denhardt)氏溶液、0.5％SDS、和100μg剪切的鲑鱼精巢DNA中杂交，接着于65℃在2xSSC缓冲液和0.5％SDS中，接着是1x SSC缓冲液和0.5％SDS中，最终0.2x SSC缓冲液和0.5％SDS中序贯清洗15-30分钟。
咪唑啉酮：如本文中使用的，术语“咪唑啉酮”指干扰植物中酶乙酰乳酸合酶(ALS)(又称为乙酰羟酸合酶(AHAS))的作用的除草剂，该干扰最终可以导致植物死亡。咪唑啉酮的例子包括但不限于：咪草酸(imazamethbenz)；甲氧咪草烟(imazamox)；甲咪唑烟酸(imazapic)；灭草烟(imazapyr)；灭草喹(imazaquin)；和咪唑乙烟酸(imazethapyr)。
如本文中使用的，“咪唑啉酮抗性”指至少部分以在与同一物种的野生型植物相比时对抗性植物的健康和/或生活力的损伤降低、改善和/或消除为特征的表型。咪唑啉酮抗性包括对咪唑啉酮的耐受性。咪唑啉酮抗性可以由改变乙酰乳酸合酶(ALS)，又称为乙酰羟酸合酶(AHAS)，且容许该酶对抗或耐受咪唑啉酮作用的一种或多种基因、等位基因、或事件赋予。赋予咪唑啉酮抗性的例示性基因包括但不限于那些例如由Lee等(1988)EMBO J.7:1241，及Miki等(1990)Theor.Appl.Genet.80:449(两篇都通过提及完整并入本文)描述的基因。植物对咪唑啉酮的抗性或耐受性可以容许在栽培有植物的区域中为了控制杂草而需要时使用咪唑啉酮。
InDel：如本文中使用的，术语“InDel”一般用于描述基因中的插入或缺失。因此，“InDel”指可以作为插入、缺失、或其组合的特定突变。如本文中使用的，“插入”或“添加”指与天然存在的分子相比分别导致一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加的氨基酸或核苷酸序列变化。
油含量：如本文中使用的，“油含量”指植物或植物部分(例如种子)中的油表征。在一些实施方案中，油含量以全干燥种子的百分比表示。在一些实施方案中，特定的种子油含量是特定植物品种特征性的，并且可以用于区别所述特定品种的植物与同一物种的其它植物。可以经由使用多种分析技术，诸如例如但不限于NMR、NIR、FAME分析、和Soxhlet提取测量油含量。
在具体的实施方案中，特征性油含量可以包括“百分比油酸”和/或“百分比亚麻酸”的描述。如本文中使用的，“百分比油酸”指如通过FAME分析测量的油酸占总种子油的百分比。如本文中使用的，“百分比亚麻酸”指如通过FAME分析测量的亚麻酸占总种子油的百分比。
FAME分析可以用于测量样品中总脂肪酸中特定脂肪酸的百分比组成。就种子油而言，可以如下测定百分比，即从种子提取油样品，生成所述油样品中存在的脂肪酸的甲酯，并且使用气相层析分析样品中的各种脂肪酸的比例。如此测定的油含量可以是品种的区别性特征。
序列同一性：如本文中在两种核酸或多肽序列的背景中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以指两种序列中在规定的比较窗里为了实现最大对应性而比对时相同的残基。
在提及蛋白质使用序列同一性百分比时，认可的是，不相同的残基位置经常相差保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基用具有类似化学特性(例如，电荷、疏水性或空间效应)的其它氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能特性。
因此，在序列相差保守取代时，百分比序列同一性可以向上调节以校正不相同残基位点处取代的保守性质。相差此类保守取代的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的技术是本领域普通技术人员公知的。通常，此类技术牵涉将保守取代评分为部分的，而不是完全的错配，由此增加百分比序列同一性。例如，在对相同的氨基酸给予0-1的得分，而对非保守取代给予0得分的情况中，对保守取代给予0-1的得分。可以计算保守取代的得分，例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,CA)中执行的。
如本文中所使用的，术语“序列同一性百分比”可以指在比对窗里比较两个最佳比对序列时测定的数值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗中序列的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过测定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。可以用于测定两种序列间的同一性和相似性的计算机程序包括：GCG程序包(Devereux等(1984)Nucleic AcidsRes.12(1):387)；BLASTP；BLASTN；FASTA；和TFASTA(Atschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403)。
统计学关联的：如本文中使用的，术语“统计学关联的”指两种事件以比可归于偶然性的频率大的频率一起发生的趋势，其中可归于偶然性的频率以预先确定的显著性水平表示。可以通过本领域技术人员公知的许多显著性检验中的任一种，例如ANOVA或t检验测定统计学关联。参见例如Statistical Methods,G.W.Snedecor和W.G.Cochran,Iowa StateUniversity Press,Ames,Iowa(1985)。优选地，alpha的显著性水平小于0.01。例如，本发明的显著性水平范围可以为0-约0.250，例如小于约0.0001,0.00050,0.0010,0.0050,0.010,0.025,0.050,0.100或0.250，包括其间的任何水平。
性状或表型：术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用。出于本公开内容的目的，特别感兴趣的性状包括例如但不限于：高油酸含量；低亚麻酸含量；咪唑啉酮抗性；根肿病抗性；和细胞质雄性不育的能育性恢复。
III.fad2和fad3基因中的HO/LL突变
一些实施方案包括fad2和fad3基因中赋予芸苔属植物中的HO/LL(高油酸(fad2)和低亚麻酸(fad3))表型的突变。本发明的一些实施方案利用包含核酸序列的分离的核酸分子，所述核酸序列包含这些突变之一或两者以对接受分离的核酸分子导入的植物赋予HO/LL性状之任一或两者。另外，此类分离的核酸分子可以包含与芸苔中的HO和/或LL表型紧密连锁的标志物。
欧洲油菜品种DMS100(突变体类型)和Quantum(野生型)在fad2(脂肪酸去饱和酶-2)和fad3(脂肪酸去饱和酶-3)等位基因的克隆中使用。突变体DMS100品种从源自Global XAG019姐妹系杂交的单一F3植物选择的F4批量衍生。DMS100是一种具有约77％的油酸含量和约3％的亚麻酸含量的HO/LL系。Quantum是一种含有相当低的油酸(～66％)含量和高亚麻酸(～7％)含量的商业野生型品种。如本文中详细讨论的，涉及脂肪酸合成途径的酶fad2和fad3去饱和酶的DMS100基因组克隆的测序揭示了每个基因中的单核苷酸突变。其它序列分析显示了突变是DMS100中改变的脂肪酸含量的原因。这两个突变与先前发表的突变(等(1998)Mol.Breeding4:543-50；Jourdren等(1996)Theor.Appl.Genet.93:512-8)截然不同。
一些实施方案利用fad2基因中与特定油含量有关的单核苷酸多态性(SNP)的鉴定，所述特定油含量在一些应用中可以是期望的。芸苔中的油酸(C18:1)含量受到fad2基因影响，所述fad2基因编码负责将油酸去饱和成亚油酸(C18:2)的酶(内质delta 12油酸去饱和酶)。具体的实施方案包括单核苷酸取代突变，其在fad2可读框中引入过早的“终止”密码子，生成截短的表达产物。在某些实施方案中，单核苷酸取代突变位于fad2基因的第411位(参见图1)。例如，突变可以是第411位的“C”至“T”突变，其产生终止密码子“TAG”，并且生成长度仅为185个氨基酸的fad2表达产物。在一些实施方案中，fad2基因中的单核苷酸取代突变生成截短的表达多肽，其作为将油酸去饱和成亚油酸的活性去饱和酶具有降低的功能(例如无功能或基本上无功能)。
fad2基因的失活突变体等位基因通过降低油酸去饱和成亚油酸来促成芸苔中油酸含量的控制。在实施方案中，fad2突变体等位基因包含在包含第411位核苷酸的区域中与SEQ ID NO:7的互补物特异性可杂交的核苷酸序列，如通过与SEQ ID NO:7比对确定的。在具体的实施方案中，fad2突变体等位基因是SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，本发明还包括那些与SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因基本上相同的核苷酸序列。例如在一些实施方案中，核酸分子是fad2同系物(例如直向同系物)，其与SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因是至少约85％相同的。fad2同系物与SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因可以是86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；或99.8％相同的。此类fad2同系物可以从多种生物体(例如芸苔)的对于本领域技术人员容易得到的任何完整或部分基因组容易地鉴定并分离。
一些实施方案还包括SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因的功能性变体。fad2的功能性变体包括例如SEQ ID NO:7的fad2序列、包含一处或多处核苷酸取代、缺失或插入的序列，其中功能性变体降低芸苔细胞中油酸去饱和成亚油酸，其可以通过本领域普通技术人员公知的常规技术测量。例如，可以通过将突变或片段同源重组到在功能性Fad2等位基因方面纯合的植物中，接着从植物常规分离并表征种子油来测定fad2基因的特定变体在芸苔细胞中降低将油酸去饱和成亚油酸的能力。fad2基因的功能性变体可以通过定点诱变，诱导突变创建，或者它们可以以等位变体(多态性，例如SNP)存在。具体的实施方案包括在fad2可读框中引入过早的“终止”密码子，生成截短且无活性的表达产物的突变。
一些实施方案利用fad32基因中与特定油含量有关的单核苷酸多态性(SNP)的鉴定，所述特定油含量在一些应用中可以是期望的。fad3基因编码内质delta-15亚油酸去饱和酶，即一种负责亚油酸(C18:2)去饱和成亚麻酸(C18:3)的酶。具体地，fad32基因促成亚麻酸含量的控制。具体的实施方案包括单核苷酸取代突变，其干扰fad32基因的正确剪接，由此生成不完全翻译的表达产物。在某些实施方案中，单核苷酸取代突变位于fad32基因中内含子的5’剪接位点的第一个碱基。例如，内含子可以是欧洲油菜的fad32基因中的第三个内含子、芜菁的fad32基因中的第六个内含子、或别的植物物种的fad32基因中的同源内含子。例如，突变可以是欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变，其干扰基因的正确剪接(参见图3)。在一些实施方案中，干扰fad32基因的正确剪接，由此生成不完全翻译的表达产物的单核苷酸取代突变可以导致无活性的酶，并且阻断亚油酸(C18:2)去饱和成亚麻酸(C18:3)，最终导致芸苔种子中C18:3积累的降低。
fad3基因的失活突变体等位基因通过降低亚油酸去饱和成亚麻酸来促成芸苔中亚麻酸含量的控制。在实施方案中，fad3突变体等位基因包含在包含fad32基因中内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的核苷酸的区域中与SEQ ID NO:12的互补物特异性可杂交的核苷酸序列，如通过与SEQ ID NO:12比对测定的。在具体的实施方案中，fad3突变体等位基因是SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，本发明还包括那些与SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因基本上相同的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，核酸分子是fad3同系物(例如直向同系物)，其与SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因是至少约85％相同的。fad3同系物与SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因可以是86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；或99.8％相同的。此类fad3同系物可以从多种生物体(例如芸苔)的对于本领域技术人员容易得到的任何完整或部分基因组容易地鉴定并分离。
一些实施方案还包括SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因的功能性变体。fad3的功能性变体包括例如SEQ ID NO:12的fad3序列、包含一处或多处核苷酸取代、缺失或插入的序列，其中功能性变体降低芸苔细胞中亚油酸去饱和成亚麻酸，其可以通过本领域普通技术人员公知的常规技术测量。例如，可以通过将突变或片段同源重组到在功能性Fad3等位基因方面纯合的植物中，接着从植物常规分离并表征种子油来测定Fad3基因的特定变体在芸苔细胞中降低将亚油酸去饱和成亚麻酸的能力。Fad3基因的功能性变体可以通过定点诱变，诱导突变创建，或者它们可以以等位变体(多态性，例如SNP)存在。具体的实施方案包括在fad2可读框中引入过早的“终止”密码子，生成截短且无活性的表达产物的突变。
IV.分子标志物及其应用
本发明的实施方案包括与感兴趣基因(例如fad2或fad3)连锁(例如连锁；紧密连锁；或极端紧密连锁)的分子标志物(即核酸标志物)。例如，在一些实施方案中的感兴趣基因可以是促成芸苔中选自下组的表型或性状的基因：高油酸，低亚麻酸，除草剂抗性(例如草甘膦抗性和咪唑啉酮抗性)，和根肿病抗性。具体的实施方案包括使用此类标志物，例如以转移感兴趣的基因(例如其包含在DNA区段中)，以将感兴趣的基因导入宿主中，以及鉴定生物体或来自生物体的DNA样品中的感兴趣基因的方法。在具体的实施方案中，可以使用SSR标志物转移DNA区段，其包含促成根肿病抗性欧洲油菜品种的根肿病抗性的基因。此类SSR标志物可以包含基因组DNA的连续区段，其长度为300 bp，并且通过例示性引物SEQ IDNO:18和19扩增。
在一些实施方案中，在感兴趣基因侧翼的标志物可以用于转移供体亲本DNA的区段，其明确含有感兴趣的基因。在具体的实施方案中，欧洲油菜连锁群N5和N1中的标志物，或与此类标志物等同的标志物可以用于转移包含来自欧洲油菜品种DMS100的fad2的DNA区段。在这些和其它实施方案中，欧洲油菜连锁群N14和N4中标志物，或与此类标志物等同的标志物可以用于转移包含欧洲油菜品种DMS100的fad32的DNA区段。
在一些实施方案中，使用在感兴趣基因侧翼的标志物以转移明确含有感兴趣基因的供体亲本DNA区段的方法可以包括用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析两个亲本植物的基因组DNA；有性杂交两个亲本植物基因型以获得后代群体，并且对那些后代分析与感兴趣的基因连锁的标志物的存在，将含有与感兴趣基因连锁的标志物的后代与接受体基因型回交以生成第一回交群体，然后，继续进行回交程序，直到获得包含由亲本基因型和感兴趣基因展现的任何期望性状的最终后代。在具体的实施方案中，通过在每个世代的标志物分析选择在每个杂交和回交步骤中获得的个体后代。在一些实施方案中，用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析两个亲本植物的基因组DNA揭示亲本植物之一包括与探针特异性杂交的较少连锁标志物，或与探针特异性杂交的无一连锁标志物。
在一些实施方案中，可以使用与感兴趣基因连锁的标志物通过遗传转化将感兴趣的基因导入芸苔属的植物中。在具体的实施方案中，欧洲油菜连锁群N5或N1中的标志物，或与此类标志物等同的标志物可以用于将fad2基因转移到芸苔属的植物中。在这些和其它实施方案中，欧洲油菜连锁群N14或N4中的标志物，或与此类标志物等同的标志物可以用于将fad32基因转移到芸苔属的植物中。在这些和其它实施方案中，可以使用SSR标志物来将促成根肿病抗性的基因转移到芸苔属的植物中。此类SSR标志物可包括基因组DNA的连续区段，其长度为300bp，并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增。
在一些实施方案中，通过遗传重组将感兴趣的基因导入芸苔属植物中的方法可以包括用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析植物(例如欧洲油菜品种DMS100)的基因组DNA以鉴定植物中的感兴趣基因；例如通过提取基因组DNA，并用一种或多种酶限制性内切核酸酶消化基因组DNA，来分离植物基因组DNA中包含感兴趣基因的区段；任选地，扩增分离的DNA区段；将分离的DNA区段导入芸苔属宿主植物的细胞或组织中，并用探针分析宿主植物的DNA以鉴定宿主植物中的感兴趣基因，所述探针与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交。在具体的实施方案中，可以将分离的DNA区段导入宿主植物中，使得其稳定整合入宿主植物的基因组中。
在一些实施方案中，可以使用与感兴趣基因连锁的标志物将感兴趣的基因导入与芸苔属植物不同的生物体(例如植物)中。在具体的实施方案中，感兴趣基因是fad2，并且标志物在欧洲油菜连锁群N5或N1中，或者是等同的标志物。在具体的实施方案中，感兴趣的基因是fad3，并且标志物在欧洲油菜连锁群N14或N4中，或者是等同的标志物。在具体的实施方案中，感兴趣的基因是促成根肿病抗性的基因，并且标志物是SSR标志物或等同标志物，所述SSR标志物包含基因组DNA中长度为300 bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的连续区段。
在一些实施方案中，将感兴趣的基因导入与芸苔属植物不同的生物体(例如植物)中的方法可以包括用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析芸苔植物(例如欧洲油菜品种DMS100的植物)的基因组DNA以鉴定植物中的感兴趣基因；例如通过提取基因组DNA，并用一种或多种酶限制性内切核酸酶消化基因组DNA，来分离植物基因组DNA中包含感兴趣基因的区段；任选地，扩增分离的DNA区段；将分离的DNA区段导入与芸苔属植物不同的生物体中，并用探针分析生物体的DNA以鉴定生物体中的感兴趣基因，所述探针与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交。在具体的实施方案中，可以将分离的DNA区段导入生物体中，使得其稳定整合入生物体的基因组中。
在一些实施方案中，可以使用与感兴趣基因连锁的标志物来鉴定包含感兴趣基因的植物。在具体的实施方案中，植物可以是芸苔。在一些实施方案中，可以从植物提取核酸分子(例如基因组DNA或mRNA)。然后，可以使提取的核酸分子与探针接触，所述探针与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交。探针与提取的核酸分子的特异性杂交指示植物中感兴趣基因的存在。
关于分子标志物及其使用方法的一般信息可以参见例如Andrew H.Paterson,“The DNA Revolution”(第2章)于：Genome Mapping in Plants,Andrew H.Paterson编,1996,Academic Press/R.G.Landis Company,Austin,Tex.,pp.7-21。
V.fad2和fad3基因的分子标志物
提供了与芸苔中突变体等位基因fad2和fad3中每种连锁(例如紧密连锁)的分子标志物。鉴定了含有HO性状(fad2)和LL性状(fad3)中牵涉的序列的DNA区段。这些区段位于标志物周围及之间，所述标志物与基因组连锁群中的突变体等位基因连锁(例如紧密连锁)。因此，还提供了包含具有失活突变的突变体fad2或fad3基因的核酸分子。鉴定的区段及其标志物在本文中部分以其在欧洲油菜基因组中连锁群中的位置描述。例如，fad2和与其连锁的分子标志物可以位于连锁群N5和N1中。还在例子中，fad3和与其连锁的分子标志物可以位于连锁群N14和N4中。
鉴定的区段的位置及其标志物可以以重组频率或图距单位表示。在欧洲油菜群体DMS100 x Quantum中实施本文中描述的实施方案。然而，以图距单位计的特定区段和标志物的位置可以参照芸苔近交基因组序列表示。预期的是，以图距单位计对特定区段和标志物给予的数字可以在栽培种间有所变化，并且不是DNA区段和标志物的必要限定的一部分，所述DNA区段和标志物在其它情况中例如以核苷酸序列描述。
芸苔系DMS100种质中存在的fad2和fad32基因中的特定例示性失活单核苷酸突变是造成此品系中观察到的升高的油酸(HO)和降低的亚麻酸(LL)含量的因素。使用与这些中任一处或两处突变连锁的分子标志物，可以使用标志物辅助渐渗来将DMS100及其后代或衍生物的HO/LL性状，和/或DMS100及其后代或衍生物的突变fad2和fad32基因(分别为SEQ IDNO:7(参见图1)和SEQ ID NO:12(参加图3))引入芸苔系中。
使用与突变体fad2或fad3等位基因连锁或驻留于突变体fad2或fad3等位基因内的核酸分子标志物将HO/LL性状引入新植物和种质中以及鉴定具有HO/LL性状的植物的方法可以导致植物发育者节约成本，因为此类方法可以降低或消除对意图引入HO/LL性状的杂交的后代测定表型的需要。
在实施方案中，与HO性状极端紧密连锁的标志物是欧洲油菜fad2基因的第411位(或来自例如芸苔的比对序列的相同位置)的“T”核苷酸，如在图1中描绘并在SEQ ID NO:7中表示的。在实施方案中，与LL性状极端紧密连锁的标志物是欧洲油菜fad32基因中的第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基(或来自例如芸苔的比对序列的相同位置)处的“A”核苷酸，如在图3中描绘并在SEQ ID NO:12中表示的。别的标志物可以鉴定为等同于这些例示性标志物之任一种，例如通过测定别的标志物与例示性标志物之间的重组频率进行。此类测定可以利用基于Mather(1931),The Measurement of Linkage in Heredity,Methuen&Co.,London的方法的改良正交比较(orthogonal contrast)方法，接着是最大似然检验以测定重组频率。Allard(1956)Hilgardia24:235-78。为了在目前公开的方法中使用，若重组频率的数值在任何栽培种中小于或等于0.10(即10％)，则认为别的标志物等同于具体的参照标志物。
与高油酸(HO)性状极端紧密连锁的标志物包括用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段。用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段可以包括来自植物的核酸序列，该核酸序列的检出至少提供强烈的指示，即植物包含核酸序列，该核酸序列包含促成HO性状的突变体fad2等位基因。用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段的例子是欧洲油菜fad2基因的第411位的“T”核苷酸，如在图1中描绘并在SEQ ID NO:7中表示的。与低亚麻酸(LL)性状极端紧密连锁的标志物包括用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段。用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段可以包括来自植物的核酸序列，所述核酸的检出至少提供强烈的指示，即植物包含核酸序列，该核酸序列包含促成LL性状的突变体fad32等位基因。用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段的例子是欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“A”核苷酸，如在图3中描绘并在SEQ ID NO:12中表示的。
涉及与高油酸(HO)性状极端紧密连锁的标志物的是用于鉴定携带促成芸苔属植物中HO表型的基因的植物的手段。此类手段包括在添加至自植物获得的样品时呈现可检测信号的分子，所述植物携带促成芸苔属植物中HO表型的基因。核酸的特异性杂交是可检测信号，因此，与促成HO表型的基因特异性杂交的核酸探针可以是用于鉴定植物的手段，所述植物携带促成芸苔属植物中HO表型的基因。在一些例子中，用于鉴定携带促成芸苔属植物中HO表型的基因的植物的手段是探针，其与欧洲油菜fad2基因中包含第411位“C”至“T”突变的区段特异性杂交，但是不与野生型欧洲油菜fad2基因(例如SEQ ID NO:5)的相同区段杂交。
涉及与低亚麻酸(LL)性状极端紧密连锁的标志物的是用于鉴定携带促成芸苔属植物中LL表型的基因的植物的手段。此类手段包括在添加至自植物获得的样品时呈现可检测信号的分子，所述植物携带促成芸苔属植物中LL表型的基因。核酸的特异性杂交是可检测信号，因此，与促成LL表型的基因特异性杂交的核酸探针可以是用于鉴定植物的手段，所述植物携带促成芸苔属植物中LL表型的基因。在一些例子中，用于鉴定携带促成芸苔属植物中LL表型的基因的植物的手段是探针，其与欧洲油菜fad32基因中包含第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变的区段特异性杂交，但是不与野生型欧洲油菜fad32基因(例如SEQ ID NO:15)的相同区段杂交。
VI.根肿病抗性的标志物
提供了与芸苔中的根肿病抗性连锁(例如紧密连锁)的分子标志物。含有根肿病抗性中涉及的基因的DNA区段与这些标志物连锁。因此，能够使用提供的标志物，利用并操作包含根肿病抗性中涉及的基因的核酸分子。鉴定的标志物及与其连锁的序列可以部分以其在欧洲油菜基因组中连锁群中的位置描述。在一些例子中，与芸苔中的根肿病抗性连锁的标志物是SSR标志物。
在欧洲油菜群体中实施本文中描述的实施方案，所述欧洲油菜群体通过杂交根肿病抗性品种Mendel与含有能育性恢复基因(restr)和草甘膦抗性(gly)的HO/LL欧洲油菜近交物获得。鉴定的标志物的位置及与其连锁的DNA序列(例如基因)可以以重组频率或图距单位表示。以图距单位计的特定序列和标志物的位置可以参照芸苔近交物基因组序列表示。预期的是，以图距单位计对特定区段和标志物给予的数字可以在栽培种间有所变化，并且不是任何DNA序列或标志物的必要限定的一部分，所述DNA序列和标志物在其它情况中例如可以以核苷酸序列描述。
芸苔系Mendel种质中存在的标志物可以与造成此根肿病抗性来源品系中观察到的根肿病抗性的因素连锁。例如，通过使用这些标志物或其等同物，可以使用标志物辅助渐渗将Mendel及其后代或衍生物的根肿病抗性引入芸苔系中。
可以将与芸苔中的根肿病抗性连锁的标志物整合到标志物辅助选择项目中，用于开发新的根肿病抗性基因型和种质。此类项目容许筛选数千个芸苔后代，该芸苔后代例如源自杂交具有一种或多种期望的性状的芸苔近交物和Mendel(或其后代或衍生物)。此类标志物还容许根肿病抗性品系的相当快速且便宜的鉴定，之后在根肿病感染测定法中的生物学筛选期间利用资源，诸如温室，田地，等等。目前，通常在以相当大的费用进行的约束性室内温室试验中实施疾病抗性筛选。
在实施方案中，与根肿病抗性表型连锁的标志物是SSR标志物，其包含基因组欧洲油菜DNA中长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的连续区段，所述标志物与欧洲油菜植物中的根肿病抗性连锁。本领域技术人员应当认可，同一基因座的等同标志物可以通过改变引物的长度或位置限定，所述引物用于改变基因组欧洲油菜DNA中通过引物扩增的连续区段的长度。
别的标志物可以鉴定为等同于此例示性标志物，例如通过测定别的标志物与例示性SSR标志物之间的重组频率进行。此类测定可以利用基于Mather(1931),TheMeasurement of Linkage in Heredity,Methuen&Co.,London的方法的改良正交比较方法，接着是最大似然检验以测定重组频率。Allard(1956)Hilgardia 24:235-78。为了在目前公开的方法中使用，若重组频率的数值在任何栽培种中小于或等于0.10(即10％)，则认为别的标志物等同于具体的参照标志物。
与根肿病抗性连锁的标志物包括用于将根肿病抗性引入芸苔属植物中的手段。用于将根肿病抗性引入芸苔属植物中的手段可以包括来自植物的核酸序列，该核酸序列的检出至少提供强烈的指示，即植物包含核酸序列，该核酸序列包含促成根肿病抗性表型的DNA序列。用于将根肿病抗性引入芸苔属植物中的手段的例子是基因组DNA中长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的连续区段，所述标志物与欧洲油菜植物中的根肿病抗性连锁。
涉及与根肿病抗性连锁的标志物的是用于鉴定携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因的植物的手段。此类手段包括在添加至自植物获得的样品时呈现可检测信号的分子，所述植物携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因。核酸的特异性杂交是可检测信号，因此，与促成根肿病抗性的DNA序列特异性杂交的核酸探针可以是用于鉴定植物的手段，所述植物携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因。在一些例子中，用于鉴定携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因的植物的手段是探针，其与基因组DNA中长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的连续区段特异性杂交，但是不与通过相同引物从野生型基因组DNA扩增的任何区段杂交。
在上述内容外，可以在实施方案中使用以SEQ ID NO:18-22列出的引物组或其等同物，以筛选根肿病抗性中涉及的基因的存在。在使用这些引物或其等同物从基因组芸苔DNA样品扩增居间DNA序列时，可以显现扩增的DNA片段(例如通过凝胶电泳)。300bp片段(或使用与SEQ ID NO:18-22功能等同的引物预期的大小的片段)的存在指示获得基因组DNA样品的植物包含根肿病抗性中涉及的基因。
VII.除草剂和根肿病抗性HO/LL芸苔植物
本发明的一些实施方案提供或在其它方面包括芸苔植物(例如欧洲油菜植物)，其在与同一物种的野生型芸苔植物(例如欧洲油菜品种Quantum)比较时具有高油酸和/或低亚麻酸(HO/LL)。在这些和其它实施方案中，芸苔植物可以包含对咪唑啉酮除草剂的抗性的性状。在这些和其它实施方案中，芸苔植物可以包含对根肿病的抗性的性状。因此，本发明的一些实施方案提供或在其它方面包括芸苔植物，其包含高油酸、低亚麻酸、咪唑啉酮抗性、和根肿病抗性的所有性状。
因此，对根肿病有抗性的芸苔植物可以包含与根肿病抗性表型连锁的标志物，而且还包含与HO性状连锁的标志物。在这些和其它实施方案中，芸苔植物还可以包含与LL性状连锁的遗传标志物。例如，对根肿病有抗性的芸苔植物还可以包含一种或多种与突变fad2和/或fad3基因对应的核酸序列。可以通过本领域中的多种已知方法之任一种将这些基因导入芸苔或其它含油种子植物中。另外，可以通过已知的体内或体外方法改变野生型fad2和/或fad3基因以提供例示性的突变fad2和/或fad3基因，或其等同物。此类基因、标志物和突变的例子可以参见但不限于那些披露的美国专利公开文本No.2006/0248611(其全部内容通过提及并入本文)。
在具体的实施方案中，芸苔植物的种子可以包含有利的油概貌。例如，种子可以包含至少63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％或77％油酸(C18:1)。在这些和其它例子中，芸苔植物的种子可以包含不超过6％,5％,4％,3％,2％或1.5％亚油酸(C18:3)。
在本发明的实施方案中，对根肿病有抗性的欧洲油菜植物也可以对咪唑啉酮有抗性或耐受性。
在一些实施方案中，根肿病抗性芸苔植物还可以包含细胞质雄性不育系统恢复系。细胞质雄性不育(CMS)是一种分布广泛且典型的非孟德尔性状。CMS植物不能自花传粉。因此，在雄性能育系旁边种植CMS系时，在不育植物上形成的所有种子会是两个亲本的杂种。与大多数性状不同，CMS是母本传播的(即，它仅经由种子亲本传递至后代)。此特性源自如下的事实，即决定CMS的一种或多种基因位于线粒体DNA(mtDNA)上。与大多数基因(其驻留于核DNA中)不同，mtDNA中的基因在大多数植物物种中仅经由雌性传播。由于母本传播的此特性，有可能容易繁殖雌性CMS系，其通过用雄性能育“维持者”系传粉进行，所述雄性能育“维持者”系在其核基因上与CMS系相同，但是其由于缺乏引起CMS的mtDNA而是雄性能育的。然而，由于CMS的母本传播，使用雌性CMS系生成的杂种植物也是雄性不育的；它们携带赋予雄性不育性的mtDNA。这对于种子作物(例如玉米和芸苔)是成问题的，所述种子作物需要花粉生成以形成收获的产物种子。
幸运的是，在许多作物物种中，已经鉴定出称作能育性恢复系(Rf)的特定显性核基因，其可以抑制雄性不育表型，并且对F1杂种“恢复”能育性。因此，CMS系统的组分包含：(1)CMS系(其含有雄性不育(S)胞质(或mtDNA)，并且在恢复系基因的隐性或维持者等位基因方面是纯合的)；(2)维持者系(其含有能育或正常的mtDNA(F)，但是在核遗传基因座上与CMS系是同基因的)，和(3)恢复系品系(其通常含有雄性不育mtDNA，但是在显性核Rf基因方面是纯合的)。图6中显示了杂种种子生成方案中的这些组分的用途。可用于本发明的雄性不育性系统和恢复系包括但不限于：Polima系统；Ogura系统；美国专利6,365,798中描述的系统；和美国专利公开文本No.2004/0237141中描述的系统(每篇的全部内容通过提及并入本文)。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过提及并入。除非本文中另有记录，DNA纯化、限制酶消化、琼脂糖凝胶分析、DNA片段分离、连接和转化的标准方法可以用于本发明的目的。此类方法记载于例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；及Ausubel等(1987)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York(两篇通过提及并入本文)。
提供以下实施例以例示某些具体的特征和/或实施方案。实施例不应解释为将公开内容限制为例示的具体特征或实施方案。应当预期，本领域技术人员可以辨别并实施本文中在不偏离本发明范围的前提下提供的具体教导的变型或备选。
实施例
实施例1：材料和方法
植物材料
在本研究中使用芸苔品种DMS100(突变体类型)和Quantum(野生型)以克隆fad2(脂肪酸去饱和酶-2)和fad3(脂肪酸去饱和酶-3)等位基因。DMS100是一种具有约77％的油酸含量和约3％的亚麻酸含量的HO/LL(高油酸和低亚麻酸)系。DMS100是从源自Global xAG019姐妹系杂交的单一F3植物选择的F4批量衍生。Quantum是一种商业品种，并且含有低油酸(～66％)和高亚麻酸(～7％)含量。双重单倍体(DH)群体通过至芸苔系Quantum和DMS100之间的杂交的F1植物的小孢子培养物形成。DH群体由604个系组成。通过使用气相层析实施对DH系及其亲本的种子的完全脂肪酸分析。在604个DH系中，随机选择183个进行标志物分析和定位。
基因组DNA提取和量化
使用Qiagen DNeasyTM 96植物测试试剂盒从2周龄温室培养植物的叶提取亲本系和183个DH系两者的DNA。DNA提取规程的详情记载于DNeasyTM 96植物测试试剂盒手册中。此试剂盒容许DNA以高通量提取的96孔形式提取。
对于DNA量化，将PicoGreenTM染料以200倍稀释到1X TE缓冲液中。在微量滴定板中，将100μl稀释的PicoGreenTM染料溶液添加至每孔中，然后添加5μl每种DNA样品或DNA标准品(5μg/ml，10μg/ml和20μg/ml)。然后，将板在板摇动器上短暂搅动，然后使用MolecularDevices的Spectra Max GEMINISTM XS微板荧光计阅读。
PCR扩增
PCR扩增反应含有20至30ng基因组DNA、0.25μM 10聚体引物、2.5 mM MgCl2、0.2mM每种dNTP、1 X PCR缓冲液和0.6个单位的Tag DNA聚合酶。在GeneAmp PCR系统9700中实施扩增，程序为于94℃持续45秒，于55℃至60℃持续30秒，于72℃持续1分钟的35个循环和以72℃持续7分钟结束。
通过琼脂糖凝胶电泳解析感兴趣的PCR扩增产物，并从凝胶切出感兴趣的条带。将切出的条带在含有无菌水的微量离心管中放置，并且在沸水中加热5分钟。用相应的引物对通过PCR扩增溶解的DNA。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)依照制造商的说明书将扩增的产物与PCR2.1-TOPO克隆载体连接。然后，将连接的产物转化到感受态细胞中，并且在含有氨苄青霉素或卡那霉素、X-GAL和IPTG以实现白/蓝选择的LB琼脂板上铺板。将转化板中的白色菌落挑出，并且通过用限制酶EcoRI消化证实克隆的PCR产物的身份，这揭示了预期大小的载体DNA片段和插入片段。含有插入物的阳性克隆由SequetechCorporation(Mountain View,CA)测序。
序列和数据分析
通过使用GCG软件包(Wisconsin University)中的基于SeqWebTM(第2版)网络的序列分析软件分析并比对序列。通过t检验分析测定标志物和高油酸或低亚麻酸(HO/LL)性状之间的连锁联系。使用最小LOD为3.0用JoinMapTM V2.0计算机软件产生遗传连锁图。使用Kosambi函数将图距转化成厘摩(centiMorgans)。使用MapQTL V 3.0软件通过间距定位对与C18:1和C18:3关联的推定QTL区定位。使用LOD得分3.0鉴定潜在影响HO和LL性状的区域。
侵入者(Invader)测定法
对fad2和fad3基因突变特异性的侵入者测定试剂盒经由Third WaveTechnologies(Madison,WI)开发。使用QiaGen Bio-Robot 3000(Valencia,CA)相对于15ng/μl标准化侵入者测定法的DNA样品浓度。按照制造商的说明书在96孔板中实施侵入者测定法。简言之，将DNA样品于95℃变性10分钟。将7μl变性的DNA(15ng/μl)和8μl反应混合物(3μl寡聚物混合物和5μl24mM MgCl2)添加至96孔侵入者测定板的每孔中。然后，将每个反应用15μl矿物油覆盖，并且将板在St.John Associates,Inc.(Beltsville,Maryland)的BioOven III中于63℃温育4小时。使用Molecular Devices的Spectra Max GEMINISTM XS微板荧光计阅读反应板以得到荧光信号。将突变体等位基因的高于背景的百分比信号除以每个样品的野生型等位基因的百分比信号以计算比率。基于计算的比率测定样品的基因型。
实施例2：fad2和fad3等位基因的克隆
通过使用与拟南芥或芜菁fad2基因序列同源的引物扩增来自亲本欧洲油菜系DMS100(突变体)和Quantum(野生型)的fad2基因的基因组DNA片段。等(1998),见上文图1。将通过引物FAD2-2F和FAD2-6R从每个亲本扩增的fad2片段克隆并测序。此引物对从两个亲本中每个扩增出相同长度(986bp)的fad2片段。这两个引物的序列是：
FAD2-2F:CAATCCCTCGCTCTTTCTCCTACC(SEQ ID NO:1)
FAD2-6R:CCTTTCTTGTCACCTTCCCTGTCC(SEQ ID NO:2)
在两个亲本系间，在fad2基因的第411位鉴定出单核苷酸取代突变。图1。野生型Quantum fad2基因含有第411位的“C”核苷酸。然而，HO/LL DMS100fad2基因含有相同位置处的SNP，其中核苷酸变为“T”。此位置处“T”的存在引入终止密码子，并且生成严重截短的fad2表达产物，其长度仅为185个氨基酸。图2。
从GenBank对欧洲油菜内质delta-15亚油酸去饱和酶的fad31和fad32基因座的DNA序列进行搜索并检索(登录号AF056569(fad31)和AF066570(fad32))。使用PrimerExpress引物设计软件(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)从fad31和fad32基因序列设计用于fad31基因座和fad32基因座中每个的三对引物。克隆从每个亲本通过引物对BNFD31-CF(GAGGCTTGGACGACCACTTG)(SEQ ID NO:3)和BNFD31-CR(GACTGGACCAACGAGGAATG)(SEQ ID NO:4)扩增的fad31片段和通过引物对BNFD32-CF(CAAGAATTTGTCCCACAGTACAC)(SEQ ID NO:16)和BNFD32-CR(CAACTGTTGTTAATCCTCCACG)(SEQ ID NO:17)扩增的fad32片段。将fad31的7个DMS100克隆和6个Quantum克隆和fad32的6个DMS100克隆和6个Quantum克隆测序。
序列分析和比对揭示了在fad31方面在DMS100和Quantum克隆之间没有序列差异(数据未显示)。然而，序列比对揭示了fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的单核苷酸突变(“G”至“A”)。图3。此内含子对应于芜菁((2000)Mappingand cloning of Fad3 gene in Brassica rapa subsp.Oleifera.GenBank directsubmission.GenBank登录号AF308975,AF308976,AF308977和AF308978)和拟南芥(Nishiuchi等(1994)Plant Physiol.105:767-8)中fad3基因的内含子6。芜菁和拟南芥的fad3基因含有8个外显子和7个内含子，而本文中检查的欧洲油菜序列覆盖外显子4(部分)、5、6、和7(部分)和内含子4、5、和6。fad3基因中外显子/内含子的此解读得到如下事实的支持，即fad3基因序列在测序的芸苔物种和拟南芥间是高度保守的。
植物内含子含有高度保守的5’剪接位点(外显子/内含子交接：AG/GTAAG)和3’剪接位点(内含子/外显子交接：TGCAG/G)。已经显示了5’剪接位点内含子交接序列中的前两个核苷酸+1G和+2T在研究的超过1000种拟南芥内含子间分别是100％和99％保守。等(2000)Trends Plant Sci.5(4):160-7；及Brown(1996)Plant Mol.Biol.32(3):531-5。剪接的精确性取决于内含子信号识别的机制和5’和3’剪接位点的正确选择。本文中鉴定的5’剪接位点(第530位)的+1G至+1A突变(参见图3)可以消除剪接或者导致外显子跳跃，即受影响的外显子(外显子6)，并且可以在单一剪接事件中除去两个侧翼内含子。等(2000),见上文；及Simpson等(1998)Plant J.15(1):125-31。此类外显子跳跃可以导致缺少由fad3基因的外显子6编码的氨基酸的多肽的合成。此突变还可以阻断正常5’剪接位点的剪接，并且活化不同位置处隐蔽剪接位点，这可以引起受影响外显子以及下游内含子的隐蔽剪接。McCullough等(1993)Mol.Cell.Biol.13(3):1323-31。此类隐蔽剪接可以导致由fad3编码的delta-15亚油酸去饱和酶的早期翻译终止和较短多肽的合成，因为内含子在所有三种可能的阅读框中含有终止密码子，因此外显子7和8仍然会是未翻译的。fad3的不完整翻译可以使酶失活，并且阻断亚油酸(C18:2)去饱和成亚麻酸(C18:3)，这导致芸苔种子中C18:3积累的降低。
这些数据强烈提示了fad2和fad3基因中鉴定的单核苷酸突变是造成芸苔系DMS100中油酸含量升高和亚麻酸含量降低的因素。如分别在图1和3中显示，为了使用PCR扩增检测fad2和fad32的突变体HO/LL等位基因，设计突变体特异性引物FAD2GM(CGCACCGTGATGTTAACGGTTT)(SEQ ID NO:5)和FAD3cGM(ATAAATAATGTTGATCTACTTAT)(SEQID NO:15)。使用与上文描述的两种突变之任一或两者连锁的分子标志物，可以使用标志物辅助渐渗将DMS100及其后代或衍生物的HO/LL性状，和/或DMS100及其后代或衍生物的突变fad2(SEQ ID NO:7)和fad3(SEQ ID NO:12)基因引入芸苔系中。图1和3。
实施例3：fad2和fad3基因的突变体等位基因特异性SNP标志物
使用存在于fad2和fad3基因中的单核苷酸突变作为SNP标志物以标记fad2和fad3基因，用于选择芸苔育种中的高C18:1和低C18:3。设计突变体特异性引物(FAD2GM:CGCACCGTGATGGTTAACGGTTT(SEQ ID NO:5)；和FAD3cGM:ATAAATAATGTTGATCTACTTAT(SEQ IDNO:15))以使用PCR扩增检测fad2和fad32的突变体等位基因。引物设计为使得突变碱基(SNP)在一条引物的3’端，用于等位基因特异性PCR扩增。图1和3。
对fad2特异性的引物扩增出多态性条带，其存在于DMS100和DNA体积(bulks)中(对于高油酸(C18:1))，但是不存在于Quantum和DNA体积中(对于低油酸)。图4。对源自Quantum和DMS100杂交的DH群体测试此基因特异性标志物，其中发现了等位基因分布与高C18:1高度相关。图4；表1。fad3等位基因特异性引物也扩增出存在于DMS100中，而不存在于Quantum中的多态性片段。用DH群体的分析指示此等位基因特异性标志物与低C18:3是统计学关联的。图4；表1。因此，成功开发直接标记fad2和fad3基因突变的两种基因特异性的基于PCR的标志物。鉴于本公开内容，例如基于在足够数目的碱基对里的实质性同源性的本文中公开的标志物的变型或衍生物(包括各种类型的标志物)对于本领域技术人员会容易是显而易见的。
表1
经由使用源自Quantum x DMS100杂交的DH群体的遗传和QTL定位，找到一个主要(N5)和一个次要(N1)QTL区(对于高C18:1)，和三个QTL区(N4和N14)(对于低C18:3)。图5。此QTL定位结果与遗传分析一致，所述遗传分析显示了高C18:1受到一个主基因控制，而低C18:3受到多个基因控制。基于fad2基因的标志物精确位于C18:1的主要QTL基因座的定位位置，这支持如下的事实，即此QTL对应于受到DMS100中的突变影响的功能性fad2基因。这也与先前的研究一致，所述先前的研究证明了fad2基因可以位于连锁群N5上。参见Schierholt等(2000)Theor.Appl.Genet.101:897-901。基于fad3基因的标志物的位置精确匹配连锁群14(C基因组)上C18:3的主要QTL基因座之一的定位位置，这支持如下的结论，此QTL是fad3c(C基因组中的fad3，先前称作fad32)基因，并且其受到DMS100中的第二处突变影响。
实施例4：育种群体的生成
初始育种杂交牵涉HOLL x非HOLL芸苔。使用F1作为双重单倍体供体，并且所有供体植物在三个fad突变体中每个上是半合子的。所有供体植物在三种需要的脂肪酸去饱和酶突变中每种上是半合子的。预测所有三种基因独立分类。因此，鉴于457个收获个体的群体，预期这些个体中的1/8(1/2 x 1/2 x 1/2)会含有所有三种FAD标志物。因此，在457个个体中，预期约57个个体含有促成HO/LL芸苔的所有三种FAD标志物。然而，如图7中显示的FAME分析中观察到的，在此群体中没有看到此预期。
HO/LL x非HO/LL杂交中的脂肪酸概貌的分布不是预期的事情。存在有此群体中比会预期的事情更少的具有低C18:3的个体，和多许多具有非常低C18:1组成的个体。202个个体生成大于70％的C18:1水平，但是仅101个个体生成3.0％下的C18:3水平。仅41个个体具有大于70％C18:1和小于3.0％C18:3的组合。这低于57个个体的预期数目。替代12％含有HO/LL种子油概貌的个体(如预期)，仅9％个体显示此概貌。
还调查组合两组亲本材料的效果。将HO/LL亲本与非HO/LL亲本杂交以生成育种群体。此群体生成大量不满足HO/LL或标准芸苔脂肪酸概貌的DH系，即使亲本是HO/LL或者具有标准的芸苔脂肪酸概貌(C18-1；C18-3)。88个DH系生成通常存在于小于60％C18:1的非芸苔质量材料中的C18:1概貌。这是意料不到的结果，因为供体植物的遗传组成在所有三种FAD突变方面是半合子的。与HO/LL和近HO/LL类型相比，观察到这些材料中C16:0和C18:2两者的更大生成。与HO/LL系相比，这些非芸苔质量类型生成略微升高的C16:0水平，但是这两类品系之间的最大差异是亚麻酸(C18:2)的水平。含有非常低水平的C18:1的品系具有非常高水平的C18:2及还有非常高水平的C18:3。存在有具有非常低水平的C18:3(小于2％)的具有小于60％C18:1的品系，代表我们在先前这些种类的杂交中尚未看到的令人感兴趣的遗传学组合。
鉴于所有三种FAD突变方面半合子的亲本系的遗传预期，会预测大比例的HO/LL系会展现出对根肿病的抗性。然而，在此类植物的后代中观察到的脂肪酸组成的复杂性指示会难以通过杂交半合子FAD植物开发对根肿病具有抗性的HO/LL系。
在HO/LL和非HO/LL亲本的组合期间观察到的另一种复杂性产生后代群体中早期开花的HO/LL系。如图8的开花图中显示的，与开花日期比较育种系的数目的频率。非常少的育种系是早期开花，并且有分布变平的趋势，更多品系展现出后期开花。使用此亲本材料，产生非常早期开花的、HO/LL、且根肿病抗性的品系证明是难得出乎意料的。开花的较大差异在图7中鉴定的抗性品系中也是明显的。
种植表1中鉴定的抗性品系(DAS 34到DAS 74)以返回与HOLL亲本进行育种杂交。表1中的抗性品系在从3月19日至4月2日的第一次开花日期的非常大的差异。4个抗性品系是非常晚开花的，并且不产生花，直到HOLL亲本没有花。值得注意的是，在此实验中开花的4个最早的根肿病抗性品系仅具有三种FDA标志物中的两种。四个非常晚期开花的品系中的两个具有所有三种FAD突变体，并且两个非常晚期开花品系具有两个FAD突变体。这指示在单一芸苔品系中产生根肿病抗性、早期开花、和HOLL种质的复杂性和困难性。
实施例5：FAME分析
对于实施例3中分析的40个不同品系，进行FAME分析以测定品系的脂肪酸含量。下文表2和3中呈现了结果：
表2：FAME分析(C12:0–C18:3)
表3：FAME分析(C20:0–C24:1)
实施例6：除草剂耐受性的选择
对约1000个BC1世代个体(通过将Mendel x HO/LL/rest/gly个体与咪唑啉酮和草甘膦抗性近交物回交得到)调查能育性恢复系基因。确定约156个BC1个体在能育性恢复系方面是纯合的，469个半合子的，且370个个体是野生型。能育(纯合的和半合子的)个体的比例低于鉴于能育性恢复系方面50％纯合和50％半合子的预期定量的预期；实际结果是625能育:469不育，显著偏离预期比率。
对能育(纯合的和半合子的)植物进行其它测定法以测定草甘膦抗性的存在。使用327个草甘膦抗性阴性BC1植物进行咪唑啉酮抗性育种。咪唑啉酮抗性类型产生三种FAD基因方面1:1纯合:半合子的大致比率(对于FAD2为173:150，对于FAD3A为144:177，且对于FAD3C为174:153)，并且在所得的植物中，83个在恢复系基因方面是纯合的，且244是半合子的。对单独的草甘膦抗性阴性品系比较FAD基因及恢复系基因的存在，并且在温室样地中种植鉴定为在三种FAD基因中的两种方面纯合及在恢复系基因方面半合子的植物，用于选择“开花前早熟性”。
对每个植物测定温室条件下的开花前天数，并且将具有两种或三种FAD基因的最早开花植物和恢复系个别用袋自交以生成纯的BC1S1种子。在收获后，测试小种子样品以证实种子油的脂肪酸概貌。这些样品中的油酸(C18:1)含量范围为63.34％至77.34％。亚麻酸(C18:3)含量范围为5.81％至1.32％，并且饱和脂肪酸组成范围为9.64％至6.49％。测试20个最早开花的BC1S1咪唑啉酮抗性、高油酸、低亚麻酸、恢复系基因系的剩余种子，并且均测定为携带根肿病抗性。
实施例7：与根肿病抗性连锁的标志物
使用根肿病抗性欧洲油菜栽培种Mendel以对含有能育性恢复基因(restr)和草甘膦抗性(gly)的HO/LL欧洲油菜近交物产生一系列杂交。将所得的F1后代与咪唑啉酮和草甘膦抗性近交物回交，其中选择HO/LL、能育性恢复、和除草剂耐受性。F1植物在生长习性方面是中间的，并且需要低温春化诱导开花。使用分子标志物表征组合除草剂耐受性、种子油概貌和能育性恢复以鉴定F1个体，用作杂交亲本以开发BC1世代。在生成BC1世代后，使用生物学测定法测定根肿病抗性，所述生物学测定法指示根肿病抗性转移至HO/LL亲本类型。表4提供了对来自40种不同品系的多个植物测试根肿病抗性的结果。将植物分级为种类，其范围为0(抗性)至3(易感)。然后，将作为整体的品系分配从R(抗性)、M(混合抗性)、和S(易感)的字母等级。
表4
40个分开的芸苔品系(多个植物)中测试根肿病抗性的结果
进行Mendel(根肿病抗性)HO/LL近交物与根肿病易感性欧洲油菜近交物的3系杂交。使用生物学测定法对源自此3系杂交的F1世代植物的40个DH系筛选根肿病抗性。表5。种植这些选择的DH系，两个亲本系和三个芸苔品种(NEX 827,NEX 830和NEX 845)，并且从每个收集叶组织。将收集的叶组织冷冻干燥，并且研磨，用于DNA提取。
表5
用于鉴定根肿病分子标志物的DH系。
Loc Seq# Geno_Id 来源ID
7880 140227 BS09PS000170.005
7881 140243 BS09PS000170.021
7882 140251 BS09PS000170.029
7883 145442 BS09PS000170.120
7884 145506 BS09PS000170.184
7885 145551 BS09PS000170.229
7886 145557 BS09PS000170.235
Loc Seq# Geno_Id 来源ID
7887 145645 BS09PS000170.323
7888 145666 BS09PS000170.344
7889 145721 BS09PS000170.399
7890 145733 BS09PS000170.411
7891 145768 BS09PS000170.446
7892 145776 BS09PS000170.454
7893 145779 BS09PS000170.457
7894 145784 BS09PS000170.462
7895 145790 BS09PS000170.468
7896 145791 BS09PS000170.469
7897 145810 BS09PS000170.488
7898 145813 BS09PS000170.491
7899 145814 BS09PS000170.492
7900 145842 BS09PS000170.520
7901 145850 BS09PS000170.528
7902 145853 BS09PS000170.531
7903 145860 BS09PS000170.538
7904 145863 BS09PS000170.541
7905 145864 BS09PS000170.542
7906 145882 BS09PS000170.560
7907 145946 BS09PS000170.624
7908 145978 BS09PS000170.656
7909 146007 BS09PS000170.685
7910 146034 BS09PS000170.712
7911 146037 BS09PS000170.715
7912 146038 BS09PS000170.716
7913 146039 BS09PS000170.717
7914 146043 BS09PS000170.721
Loc Seq# Geno_Id 来源ID
7915 146049 BS09PS000170.727
7916 146058 BS09PS000170.736
7917 146074 BS09PS000170.752
7918 146075 BS09PS000170.753
7919 146091 BS09PS000170.769
7920 21641 BS08PS000120.001
使用QiagenTM微型植物DNA提取试剂盒依照试剂盒的说明书从冷冻干燥的研磨的叶组织提取DNA。使用NanoDropTM 8000量化提取的DNA样品，并且通过用超纯水稀释产生浓度5ng/μL。使用来自5个根肿病抗性DH系(“R-合并物”)(DH系140227,145776,145853,145882和146058)和5个易感性DH系(“S-合并物”)(DH系145506,145645,145666,145842,145850)的等量DNA配制两个分开混合的DNA样品。
使用这两个混合的DNA样品及亲本DNA样品鉴定与芸苔中的根肿病抗性连锁的SSR标志物(简单序列重复标志物)，其使用混合分离子分析方法(bulked segregant analysisapproach)进行：用简单序列重复(SSR)分子标志物，我们采用混合分离分析(BSA)方法，其利用R-合并物、S-合并物、和来自其相应亲本系的DNA样品。然后，用具有已知根肿病抗性的40个个别DH系测试鉴定为在两个混合DNA样品和亲本系之间多态性的SSR标志物。
用总共713个经SSR M13标记的引物对和ABI 3130遗传分析仪筛选两个混合DNA样品和两个亲本系，以鉴定抗性和易感性合并物之间的多态性标志物及亲本DNA。通过制备具有引物(经FAM标记)；HotMasterTM Taq聚合酶；和HotMasterTM反应缓冲液的PCR反应进行筛选，所述引物具有以SEQ ID 20,21,和22(FAM-标记的)列出的序列。用于95℃持续3分钟的1个周期；4个周期的降落概况(其由94℃持续30秒，56℃持续50秒(-2℃/周期)，和72℃持续55秒组成)；94℃持续30秒，51℃持续50秒，和72℃持续55秒的24个周期；72℃持续10分钟的1个周期；和于8℃最终温育直至完成实施PCR反应。将完成的PCR反应稀释(7μL反应稀释入100μL H2O)，并且将4μL稀释的PCR产物与SSR运行缓冲液(10.8μL HiDi甲酰胺和0.2μLGene Scan 600 LIZ标准品DNA)混合，并转移至板，用于ABI 3130xl遗传分析仪。然后，将板短暂快速旋转(最大值500rpm持续几秒)，于95℃变性5分钟，并且在冰上冷却。将板再次快速旋转以确保所有液体在每孔的底部，并且没有气泡。然后，将制备好的板安装到板装配中，并且加载到ABI 3130xl遗传分析仪中。使用GeneMapperTM软件分析数据。
筛选的713个SSR引物对中的42个在抗性DNA合并物(R-合并物)和易感性DNA合并物(S-合并物)之间在DNA扩增中是多态性的，并且观察到的多态性与抗性亲本(Mendel)和易感性近交亲本一致。使用这42种SSR标志物筛选40个单独的DH系、亲本品种、NEX 827、NEX830、和NEX 845以测定标志物与根肿病抗性表型之间的关联。
混合分离子分析鉴定出一个SSR引物对(BN1810)，其产生与根肿病抗性表型紧密有关的333bp DNA片段的扩增。
表6.
BN1810 SSR标志物
BN1810-DAS-M13F：CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTTTCTCCGACCAAAGCTGTTT(SEQ IDNO:20)
BN 1810-有尾(Tailed)R：GTTTCTTAAGGAGCTGGATTCACATGG(SEQ ID NO:21)
M13-6FAM(经荧光标记的引物)：6FAM-CACGACGTTGTAAAACGA(SEQ ID NO:22)
除了两个误分类外，此标志物精确预测测试芸苔系的根肿病反应。来自表6的数据证明了19个抗性个体、13个易感性个体、和6个分类为中等抗性的个体。还用源自Mendel作为抗性亲本的另一DH群体测试此标志物，并且标志物预测抗性与易感性个体的预期分离比率。此另一DH群体中评估的个体并不来自纯合亲本，因此预期一些分离。
表6
单个的DH系、亲本系和DAS芸苔品种(用于测定连锁关系)的根肿病反应和BN1810SSR引物对的标志物等位基因。正确分类表型的标志物等位基因以灰色突出显示，而错分类的标志物等位基因以粗体文本(黄色)突出显示。
*鉴定为与根肿病抗性连锁并且从根肿病抗性亲本系Mendel贡献的等位基因。
实施例8：根肿病抗性基因的鉴定
对欧洲油菜基因组DNA中通过BN1810 SSR引物对扩增的区域测序。使用扩增区的序列探查基因组数据库，用于鉴定包含BN1810 SSR标志物的基因。鉴定包含BN1810 SSR标志物的基因，并且此基因测定为是根肿病抗性的来源。
鉴定的根肿病抗性基因位于芸苔基因组中，并且鉴定出与减数分裂期间联系的基因足够接近的标志物。在根肿病抗性和易感性品种之间杂交的F1群体中筛选鉴定的标志物以进一步鉴定标志物亚组，所述标志物是多态性的，因此可用作以BN1810 SSR标志物表示的根肿病抗性来源的标志物。此亚组中的一些标志物可以比BN1810 SSR标志物更紧密与根肿病抗性连锁。
从提供的品种中分离基因组DNA，并且使用BN1810 SSR引物对探查分离的DNA。若扩增出分离的DNA中在与BN1810 SSR引物对对应的序列之间的序列表明标志物的存在，则数据是潜在的根肿病抗性来源与Mendel中存在的来源是等位的证据。
将提供的品种各自与根肿病易感性品系杂交以生成F1群体。从此F1群体生成双重单倍体(DH)系，并且使用生物学测定法对该品系筛选根肿病抗性。将选择的DH系、两个亲本系、和Mendel种植，并且从每个收集植物组织。从收集的植物组织提取DNA。将提取的DNA样品量化，并且配制来自根肿病抗性DH系和根肿病易感性DH系的混合DNA样品。
在混合分离子分析方法中使用混合的DNA样品以及亲本DNA样品以测定BN1810SSR标志物在根肿病抗性和易感性DNA合并物、亲本、和DH系之间是否是多态性的。若标志物是多态性的，则数据与如下的假设一致，即潜在的根肿病抗性的来源与Mendel中存在的来源是等位的。
虽然本文中已经描述了某些例示性的实施方案，本领域普通技术人员会认可并领会，可以在不偏离所附权利要求书范围的前提下对例示性实施方案做出许多添加、删除和修饰。另外，一个实施方案的特征可以与另一个实施方案的特征组合。

Claims (4)

1.一种用于鉴定包含促成欧洲油菜中的根肿病抗性的DNA序列的植物的方法，该方法包括：
从芸苔植物分离基因组DNA；并
对分离的基因组DNA筛选包含长度约300个核苷酸的多核苷酸的短序列重复(SSR)标志物，所述多核苷酸在聚合酶链式反应中通过引物对SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19、及引物对SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21扩增；
其中所述SSR标志物的存在指示促成该植物中根肿病抗性的DNA序列存在。
2.依照权利要求1的方法，其中所述多核苷酸当被SEQ ID NO:18-19扩增时长度为300个核苷酸，且其中所述多核苷酸当被SEQ ID NO:20-21扩增时长度为333个核苷酸。
3.一种用于在芸苔植物中引入根肿病抗性的方法，该方法包括：
将第一芸苔植物与第二芸苔植物杂交以生成F1芸苔植物，所述第一芸苔植物包括包含长度约300个核苷酸的多核苷酸短序列重复(SSR)标志物，所述多核苷酸在聚合酶链式反应中通过引物对SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19、及引物对SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21扩增；其中所述SSR标志物的存在指示促成该植物中的根肿病抗性的DNA序列存在；
使用标志物辅助选择来鉴定包含所述SSR标志物的F1芸苔植物；并
繁殖鉴定的F1芸苔植物，由此在芸苔植物中引入根肿病抗性。
4.依照权利要求3的方法，其中所述多核苷酸当被SEQ ID NO:18-19扩增时长度为300个核苷酸，且其中所述多核苷酸当被SEQ ID NO:20-21扩增时长度为333个核苷酸。
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