KR20110079012A

KR20110079012A - 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커 및 이를 이용한 검정방법

Info

Publication number: KR20110079012A
Application number: KR1020090135961A
Authority: KR
Inventors: 김신제; 이순봉; 윤길영
Original assignee: 주식회사 에프앤피
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2011-07-07
Also published as: KR101323515B1

Abstract

본 발명은 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커 및 이를 이용한 검정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커 및 이를 이용한 검정방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커는 독야청청 유래 저항성 집단으로부터 개발되어 저항성 품종을 육성하기 위해 사용할 수 있으며, 이로 인해 식물체에 바이러스를 직접 접종하지 않고 당대에 저항성 개체를 선발할 수 있어 육종기간을 단축시킬 수 있다. 또한 환경적 영향을 많이 받는 병검정에 비해 유전정보를 이용함으로써 안정하고 정확한 식물체 선발이 가능하며, CMV 저항성 인자를 밝히는데 FP11 유래의 CMV 저항성 분자마커와 더불어 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

오이모자이크 바이러스(CMV), 저항성 분자마커, 독야청청 유래, 검정방법

Description

오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커 및 이를 이용한 검정방법{Molecular marker for cucumber mosaic virus resistance and detection method using the same}

본 발명은 저항성 품종을 육성하고, 오이모자이크 바이러스 저항성 인자를 밝히는데 유용한 신규한 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커 및 이를 이용한 검정방법에 관한 것이다.

식물병이란 식물기주에 대한 병원균 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 나타나는 기주세포와 조직의 기능이상으로서, 식물의 형태, 생리 등에 비정상적인 변화가 나타난 상태를 말하며, 식물병을 일으키는 원인으로는 곰팡이(Fungi), 박테리아(Bacteria), 선충(Nematode), 마이코플라스마(Mycoplasma), 원생동물(Protozoa) 및 바이러스(Virus) 등이 있다.

한편, 오이모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus; 이하 ‘CMV’)는 식물 바이러스 중에서도 기주 범위가 가장 넓은 식물병원성 바이러스로서, 직경이 약 30nm되는 구상바이러스이며, 접목, 즙액 및 해충 등으로 식물에게 전염되어 전세계적으로 쌍자엽 및 단자엽의 약 900여 종의 식물에 큰 경제적 피해를 주고 있다. 또한, 식물이 CMV에 감염되면 잎, 줄기 및 과실에 모자이크 증상이 나타나며, 특히 병에 걸린 잎은 작아지고 쪼글쪼글해지며 잎맥을 따라 괴리가 생기게 되고, 과실에는 녹색농담의 모자이크가 나타나며 울퉁불퉁해져 상품가치가 떨어지게 된다.

따라서 오이모자이크 바이러스 등 식물병 바이러스로부터 식물의 감염을 방지하기 위한 방법들이 개발된 바 있는데, 이와 관련된 종래기술들을 살펴보면, 대한민국 특허등록 제293,567호에서는 국내에서 분리한 CMV 외피 단백질 유전자를 토마토에 형질 전환시켜 CMV에 대한 저항성 계통을 개발하는 방법을 개시하고 있고, 대한민국 특허출원 제1993-0029605호에는 작물에 병을 일으키는 CMV에 대하여 저항성을 갖는 형질전환 작물을 제조하기 위해 CMV 외피 단백질 유전자의 RNA를 공격하는 망치머리형 라이보자임이 개시된 바 있다. 그러나 상기 종래기술들에 의한 병 저항성 품종들의 개발 방법은 병 저항성 인자들을 갖는 다른 품종으로부터 계속적인 역교배를 통해 그 인자를 도입하여야 하며, 도입 단계마다 저항성 시험을 거쳐 선발해야 하는 등 복잡한 방법으로 인한 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다.

한편, 오이모자이크 바이러스는 일반적으로 계통 간에 상당한 변이가 존재하며 이들 바이러스에 의한 감염은 단독감염 보다 2종 이상의 복합감염인 경우가 많은 것으로 알려져 있다. 특히 고추를 대상으로 고추 바이러스의 감염에 대하여 최근에 보고된 조사보고서에 의하면, 한 종류의 바이러스에 의한 단독감염은 2002년 72.4%에 비해 2006년에는 37.0%로 감소한 반면, 복합감염은 25.1%에서 51.0%로 약 두 배가 증가한 것으로 나타났다. 또한, 이 중에서 복합감염의 경우, 반 이상은 오이모자이크 바이러스에 의한 감염인 것으로 나타났다.

따라서 복합내병성 품종의 요구도가 높아지고, 품종개발 과정에서 신속하고 정확한 병검정 방법이 필요하다. 그러나 생물검정의 경우 환경적 영향을 많이 받기 때문에 복합내병성 품종 육성을 위한 선발방법으로 병검정을 하지 않고 저항성 연관 유전인자를 분석함으로써 저항성 개체를 선발하도록 하고자 하였다. 이는 병검정에 의한 선발 오류를 줄이고 당대에 동형접합체와 이형접합체의 구분을 가능하게 함으로써 정확한 선발 및 육종기간의 단축이 가능하다.

이에 본 발명자들은 이러한 종래기술의 문제점을 해결하고자 종래의 FP11 유래 집단으로부터 개발된 분자마커와는 다른 독야청청 집단으로부터 저항성 분자마커를 개발하고, 이러한 분자마커의 특이적인 핵산단편을 이용하여 식물체에서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성 여부를 신속하고 정확하게 검정할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 식물체에 바이러스를 직접 접종하지 않고 당대에 저항성 개체를 선발할 수 있는 독야청청 집단으로부터 유래되는 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커, 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체 검출용 프라이머, 상기 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커를 이용한 검정방법 및 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머에 의해 증폭될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열로 이루어지고, 상기 서열번호 1로 기재되는 유전자를 증폭시킬 수 있는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체 검출용 프라이머를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 2 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 또는 상기 프라이머 쌍을 이용하여 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체의 검정방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분석은 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), DNA 시퀀 싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern blot) 및 서던 블럿(Southern blot)seq이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 또는 프라이머를 이용하여 식물체의 게놈 DNA를 연속적으로 획득 및 분석하는 것을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체의 유전자형(genotype)을 결정하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 또는 프라이머 쌍, 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 오이모자이크 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커는 독야청청 유래 저항성 집단으로부터 개발되어 저항성 품종을 육성하기 위해 사용할 수 있으며, 이로 인해 식물체에 바이러스를 직접 접종하지 않고 당대에 저항성 개체를 선발할 수 있어 육종기간을 단축시킬 수 있다. 또한 환경적 영향을 많이 받는 병검정에 비해 유전정보를 이용함으로써 안정하고 정확한 식물체 선발이 가능하며, CMV 저항성 인자를 밝히는데 FP11 유래의 CMV 저항성 분자마커와 더불어 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

종래에 개발된 오이모자이크 바이러스(CMV) 저항성 분자마커는 FP11을 근 원(source)으로 개발한 분자마커로써 FP11 유래 집단이나 근원이 다른 독야청청 유래 집단에서 유묘검정시 유용하나, 독야청청 유래 집단의 경우 노지에서 저항성정도가 더 높은 것으로 평가됨에 따라, 본 발명자들은 근원이 다른 독야청청 유래 집단으로부터 새로운 분자마커를 개발하였다.

따라서, 본 발명은 식물체의 CMV-Co 저항성 형질과 연관 정도가 높고 독야청청 유래 집단으로부터 개발된 CMV-Co 저항성 분자마커를 제공한다.

본 발명에서 “CMV-Co 저항성 분자마커”란 식물체의 게놈 내에서 CMV-Co 저항성 유전자와 상당히 근접하여 위치하고, 식물체의 CMV-Co 저항성 형질과 연관 정도가 높은 핵산을 말한다. 따라서, 핵산의 염기서열이 나타내는 어떠한 다형성을 사용하더라도 식물체의 CMV-Co 저항성 유무를 확인할 수 있으며, CMV-Co 저항성 식물체를 검출하는데 이용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 CMV-Co 저항성 분자마커는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산을 포함한다. 여기에서 핵산은 RNA, DNA 및 cDNA를 모두 포함하여, 바람직하게는 DNA를 말한다.

또한, 본 발명의 상기 CMV-Co 저항성 분자마커는 서열번호 1의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열을 포함하는 CMV-Co 저항성 식물체 검출용 프라이머를 포함하며, 구체적으로 서열번호 2 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 프라이머, 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 조합 또는 서열번호 2 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 조합에 의해 증폭될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열로 이루어지고, 상기 서열번호 1로 기재되는 유전자를 증폭시킬 수 있는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체 검출용 프라이머를 제공한다. 바람직하게 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어진다.

본 발명에 따른 상기 CMV-Co 저항성 식물체 검출용 프라이머는 CMV-Co 저항성 분자마커의 유전자에 상보적으로 혼성화될 수 있는 프라이머를 말하며, 바람직하게는 상기 CMV-Co 저항성 분자마커의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프라이머 쌍일 수 있다. 상기 “증폭할 수 있는 프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다.

본 발명의 프라이머는 CMV-Co 저항성 형질에 연관된 다형성 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예를 들면: 부가, 결실, 치환)될 수 있으며, 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에 있어서 CMV-Co 저항성 식물체를 검출할 수 있는 상기 프라이머로는 바람직하게 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 2 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 이들 프라이머 쌍을 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열로 구성되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군중에서 선 택되는 프라이머 쌍일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 CMV-Co 저항성 식물체 검출용 프라이머 쌍에 있어서, 하기에 기재된 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍의 경우 CMV-Co 저항성 연관 분자마커를 약 424 bp로 증폭시켰다.

서열번호 2(CM04-F) : 5'-GTGCAGTGGGAGTAATTGTGCTTG-3'

서열번호 3(CM04-4R) : 5'-GAACCTTTCTAGGAAAGCTTCTTTC-3'

또한, 하기에 기재된 서열번호 2 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍의 경우 CMV-Co 저항성 연관 분자마커를 약 378 bp로 증폭시켰다.

서열번호 2(CM04-F) : 5'-GTGCAGTGGGAGTAATTGTGCTTG-3'

서열번호 4(CM04-5R) : 5'-GAATCAGAAGTCAGCTCATTCAACC-3'

본 발명의 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern blot), 서던 블럿(Southern blot) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석에 적합하도 록 디자인될 수 있다. DAF 분석을 위해서는 5~8개의 염기로 이루어진 프라이머를 디자인하여 사용할 수 있다. 예컨대, STS 분석을 위한 프라이머는 RFLP 표지의 말단 염기서열과 일치하게 디자인할 수 있으며, SCAR 분석을 위한 프라이머는 RAPD 표지의 말단 염기서열에 입각하여 디자인할 수 있다. 또한, CAPS 분석을 위한 프라이머는 적절한 제한효소 자리가 포함되도록 디자인할 수 있다.

본 발명의 CMV-Co 저항성 분자마커는 독야청청 유래 저항성 집단으로부터 개발되어 저항성 품종을 육성하기 위해 사용할 수 있으며, 이로 인해 식물체에 바이러스를 직접 접종하지 않고 당대에 저항성 개체를 선발할 수 있어 육종기간을 단축시킬 수 있다. 또한 환경적 영향을 많이 받는 병검정에 비해 유전정보를 이용함으로써 안정하고 정확한 식물체 선발이 가능하며, CMV-Co 저항성 인자를 밝히는데 FP11 유래의 CMV 저항성 마커와 더불어 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 핵산 또는 프라이머에 의해 증폭시켜 특정 뉴클레오티드 밴드를 발현시킴으로써 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커를 이용한 검정방법을 제공한다. 상기 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern blot) 및 서던 블럿(Southern blot)으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 수행할 수 있다. 바람직하게는 RFLP, RAPD 또는 CAPS 분석일 수 있다.

구체적으로, 상기 검정방법은 하기의 단계를 포함하는 CAPS 분석을 통해 수행될 수 있다.

(a) CMV 저항성 및 이병성 식물체로부터 얻은 각 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기를 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b) PCR 산물을 제한효소로 절단하는 단계;

(c) 절단된 DNA 단편들을 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동하는 단계; 및

(d) 전기영동이 완료된 겔의 DNA 밴드 양상을 비교하는 단계.

상기 (a) 단계의 프라이머는 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2 및 3 또는 서열번호 2 및 4로 이루어진 프라이머 조합을 사용할 수 있다. 또한, 상기 (b) 단계의 제한효소는 서열번호 1의 염기서열 내에 존재하는 제한효소라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 RsaⅠ을 사용할 수 있다.

또한, 상기 검정방법은 하기의 단계를 포함하는 RAPD 분석을 통해 수행될 수 있다.

(a) CMV 저항성 및 이병성 식물체로부터 얻은 각 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b) PCR 산물을 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동하는 단계; 및

(c) 전기영동이 완료된 겔의 DNA 밴드 양상을 비교하는 단계.

상기 (a) 단계의 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 핵산을 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 염기서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 일련의 염기서열을 포함하는 프라이머일 수 있다.

나아가, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 핵산 또는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 식물체의 게놈 DNA를 연속적으로 획득 및 분석하는 것을 포함하는 핵내유전자적 웅성불임 식물체의 유전자형(genotype)을 결정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 분자마커는 CMV-Co 저항성 식물체의 유전자형(genotype)을 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 CMV-Co 저항성 식물체의 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 통하여 수행될 수 있으며, 구체적인 방법은 위에서 언급한 바와 같다.

한편, 본 발명에 따른 상기 방법을 통해 CMV-Co 저항성 인자를 확인하기 위한 대상으로는 CMV-Co에 감염될 수 있는 모든 식물체, 바람직하게는 오이, 수박, 호박, 고추, 메론, 배추, 담배, 페튜니아, 목화 및 장미를 포함한다.

나아가 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 CMV-Co 저항성 식물체 검출용 키트를 제공한다. 상기 프라이머는 바람직하게 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머일 수 있다. 상기 키트에는 상기 핵산 또는 프라이머 및 PCR을 이용한 미생물 또는 바이러스 검출키트의 통상적인 구성성분을 포함할 수 있으며, 상기 통상적인 구성성분으로는 반응완충액, DNA 중합효소, dNTP 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산 또는 프라이머를 이용하여 CMV-Co 저항성 식물체를 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 반응 혼합물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

CMV - Co 저항성 계통을 이용한 집단 육성 및 CMV 병검정

본 발명자들은 종래의 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커와 저항성 인자가 다른 독야청청 유래의 저항성 인자를 이용하여 이병성 계통과의 교배를 통해 F2를 육성하였다. 이들 F2 개체들에 오이모자이크 바이러스를 접종하여 저항성 개체와 이병성 개체를 검정하였다.

< 실시예 2>

식물체 DNA 분리

F2 각 개체들의 잎 50mg을 CTAB 버퍼[2%(w/v) 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide), 1.4M 염화나트륨, 30mM EDTA, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 1%(w/v) PVP, 0.2%(v/v) 머캅토 에탄올(mercaptoethanol)] 750㎕에 넣고 각각 마쇄한 후, 65℃에서 1시간 배양하였다. 클로로포름:이소아밀알콜(24:1) 용액을 750㎕ 넣고 잘 섞은 후 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 500㎕를 취하였다. 여기에 1/10 양만큼의 소듐 아세테이트와 2배 양만큼의 100% 에탄올을 넣어 DNA를 침전시켰다. 70% 에탄올로 세척한 후 TE 버퍼(10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)에 녹여 DNA를 분리하였다.

< 실시예 3>

RAPD 를 이용한 저항성 분자마커 개발

분리한 DNA를 저항성 및 이병성으로 나누어 BSA(Bulked Segregant Analysis) 의 방법으로 RAPD를 수행하였다. PCR 반응 조성물은 5개의 DNA가 같은 농도가 섞여있는 주형 DNA 50ng, 10×PCR 완충액(1.5mM MgCl₂ 포함), dNTPs 200μM, taq DNA 중합효소 2 Unit, 오페론사의 RAPD용 프라이머 20μM를 혼합하여 증류수(D.W.)로 총 부피를 25㎕로 조정하였다. 여기서, 오페론사의 RAPD용 프라이머로는 A01 ~ Z20을 사용하였다. 그런 다음, PCR 반응액을 94℃에서 4분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분, 35℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초를 한 사이클로 하여 총 45회 반복실시한 후, 72℃에서 10분간 반응시켜 합성하였다. 반응이 끝난 PCR 반응 산물을 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 저항성 개체를 식별할 수 있는 오페론사의 V19 프라이머(5'-GGGTGTGCAG-3')를 선발하였다(도 1 참조). 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 선발된 V19 프라이머를 이용하여 병검정을 마친 F2 개체들에 확인한 결과 저항성 개체를 선발할 수 있었다(도 2 참조). 이와 같이 증폭된 다형성 밴드를 pGemT-easy vector에 클로닝하여 염기서열을 분석하여 총 835bp의 뉴클레오타이드의 정보를 확보하였다(서열번호 1).

< 실시예 4>

특이 프라이머에 의한 PCR 증폭 및 제한효소 처리

분석된 염기서열의 양쪽 끝으로부터 프라이머를 제작하여 저항성 모친과 이병성 부친을 주형으로 PCR을 수행하였으며, 증폭된 PCR 생산물을 다시 pGemT-easy vector에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 도 3의 서열번호와 같이 저항성과 이병성의 염기서열에서 다형성을 확인하였고 이를 구분할 수 있는 제한효소 Rsa I를 확인하였다(도 3 참조).

이에 따라, 다형성을 구분하기 용이한 프라이머를 제작하였으며, 제작된 프라이머의 염기서열을 하기 표 1에 기재하였다.

프라이머 서열

순서	프라이머명	염기서열 (5‘→3’)	서열번호
1	CM04-F	GTGCAGTGGGAGTAATTGTGCTTG	2
2	CM04-4R	GAACCTTTCTAGGAAAGCTTCTTTC	3
3	CM04-5R	GAATCAGAAGTCAGCTCATTCAACC	4

상기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하여 CM04-F/CM04-4R, CM04-F/CM04-5R의 두 프라이머 조합을 작성하였다. 마커개발에 사용한 집단의 F2 개체 각각의 DNA 1㎕, 10×PCR 완충액(1.5mM MgCl₂ 포함), dNTPs 200μM, taq DNA 중합효소 2 Unit, 상기의 두 프라이머 조합(CM04-F/CM04-4R, CM04-F/CM04-5R)을 각각 10μM씩 혼합하여 증류수(D.W.)로 총 부피를 25㎕로 반응액을 조성하였다. 그런 다음, PCR 반응액을 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 50초를 한 사이클로 하여 총 30회 반복 실시한 후, 72℃에서 5분간 반응시켜 합성하였다. 반응이 끝난 PCR 반응 산물을 제한효소 Rsa I으로 절단한 후 1.5% 아가로스 겔 상에서 확인하였다.

서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 조합, 서열번호 3 및 서열번호 5의 프라이머 조합을 이용하여 확보한 PCR 생산물을 제한효소 Rsa I으로 절단한 후 전기영동을 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 조합으로 증폭된 DNA 단편의 크기는 424bp이며 제한효소를 처리함으로써 저항성개체는 세 개의 밴드 (249bp, 119bp, 56bp)로, 이병성은 두 개의 밴드 (249bp, 175bp)로 절단되는 것을 확인하였다. 서열번호 3 및 서열번호 5의 프라이머 조합으로 증폭된 DNA 단편의 크기는 378bp이며 제한효소 Rsa I을 처리하여 저항성개체는 203bp, 119bp, 56bp로, 이병성개체는 203bp, 175bp로 절단됨으로써 저항성친과 이병성친의 밴드 패턴이 다른 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 방법으로 PCR 생산물에 제한효소를 처리함으로써 다형성 밴드를 확인할 수 있는 CAPS 마커로 전환하였다.

CAPS 마커로 전환된 프라이머 조합 중 서열번호 3 및 서열번호 5의 프라이머 조합을 사용하여, 마커개발에 사용한 집단의 F2에 대한 개체별 검정을 수행한 사진을 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과 동형접합의 저항성개체는 203bp, 119bp, 56bp로, 동형접합의 이병성개체는 203bp, 175bp로 절단된 밴드의 유형을 보였다. 전환된 CAPS 마커는 저항성 개체를 판별할 수 있고 또한 유전자형을 판별 가능하였다.

따라서 도 4 및 도 5와 같이 저항성과 이병성 개체의 구분이 가능하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1은 오페론 프라이머를 이용하여 오이모자이크 바이러스 저항성 DNA(R)와 이병성 DNA(S)를 주형으로 사용하여 RAPD 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 그림에서 R-p는 저항성친, S-p는 이병성친, B-R은 벌크 저항성 DNA(bulked resistant DNA), B-S는 벌크 이병성 DNA(bulked susceptible DNA)을 나타낸다.

도 2는 오페론 V19 프라이머를 이용하여 병검정을 마친 F2 개체들에 대하여 RAPD 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 분석된 염기서열의 양쪽 끝으로부터 프라이머를 제작하여 저항성 모친과 이병성 부친을 주형으로 증폭된 PCR 산물을 pGemT-easy vector에 클로닝하여 염기서열을 분석하여 저항성과 이병성간의 다형성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 조합, 서열번호 2 및 서열번호 4의 프라이머 조합을 이용하여 CAPS 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 CAPS 전환 후 개체별 사진을 나타낸 것이다.

<110> FNP. Inc <120> Molecular marker for cucumber mosaic virus resistance and detection method using the same <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 835 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-Co resistance molecular marker(RAPD marker) <400> 1 gggtgtgcag tgggagtaat tgtgcttgta aatcaaaatt catccattta gaggaagact 60 agaccgccaa gctgtgcagt ttgatattga cactgatgag gatgatttag atagaactgg 120 aggtacaggg gcaatcattc taccaccact aactcctggg gtaaaattca acatcacagt 180 actatgatct agctactgaa tttgaaagaa ctctttggtg gattacctgg tgatgatcca 240 aatctatatt tggagaattt catcaatatt tgtaaatcat ttgataatcc tgtagtggga 300 cgaaatgcaa ttcgtttgag attgttccca ctgtctctat ctggagaggt aactatatgg 360 ttgaatgagc tgacttctga ttcaataaca aactggaggc aattgaaaga agctttccta 420 gaaaggttct ttctaccctc tagaatgtta tagttgaggg atgagattag caactttagg 480 caattggata atgaagcttc gcatgagact tgggcaaggt ttaaaaataa gttgacttaa 540 tgcccaaact ataagatgac tgatgaacac ttgatggaaa tattctacag agctttgaac 600 tcacttacaa agccaatagt ggataatact gcaggaggag cttttataga actcaccttt 660 actgaggctg cagaaatgtt agagagaata actaagacaa gtagatcttg gcataccaga 720 tattctgtgg tagtaagaaa tactgggtct agtataatat cagcttagtg taaaagagaa 780 gaggagcgtg atcaggatat agcgcacatg aaaacctaga tggatctgca caccc 835 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CM04-F <400> 2 gtgcagtggg agtaattgtg cttg 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CM04-4R <400> 3 gaacctttct aggaaagctt ctttc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CM04-5R <400> 4 gaatcagaag tcagctcatt caacc 25

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커.
제1항에 있어서,

상기 핵산은 서열번호 2 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머에 의해 증폭되는 것을 특징으로 하는 오이모자이크 바이러스 저항성 분자마커.
서열번호 1의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열로 이루어지고, 상기 서열번호 1로 기재되는 유전자를 증폭시킬 수 있는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체 검출용 프라이머.
제3항에 있어서,

상기 프라이머는 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어진 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체 검출용 프라이머.
제3항에 있어서,

상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 2 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체 검출용 프라이머.
제3항 내지 제5항의 프라이머로 이루어진 군 중에서 선택된 프라이머를 이용하여 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체의 검정방법.
제6항에 있어서,

상기 분석은 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern blot) 및 서던 블럿(Southern blot)으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체의 검정방법.
제1항 또는 제2항의 핵산 또는 제3항 내지 제5항의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 프라이머를 이용하여 식물체의 게놈 DNA를 연속적으로 획득 및 분석하는 것을 포함하는 오이모자이크 바이러스 저항성 식물체의 유전자형(genotype)을 결정하는 방법.
제3항 내지 제5항의 프라이머로 이루어진 군 중에서 선택된 프라이머, 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 오이모자이크 바이러스 검출용 키트.