JP2022511633A - エンドヌクレアーゼ保護による標的化濃縮 - Google Patents
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Abstract
Description
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のRNA又はDNA誘導型エンドヌクレアーゼ複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと
を含む、方法に関する。
好ましくは、RNA又はDNA誘導型エンドヌクレアーゼ複合体は、gRNA-CAS複合体である。したがって、好ましくは、本発明は、核酸分子を含むサンプルからの標的核酸断片を濃縮するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと
を含む、方法に関する。
第2の態様では、本発明は、核酸分子を含むサンプルからアダプター連結標的核酸断片を調製するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと;
e)アダプターを標的核酸断片に連結させるステップと
を含む、方法に関する。
第3の態様では、本発明は、核酸分子を含むサンプルから標的核酸断片を配列決定するための方法であって、標的核酸断片は目的の配列を含み、方法が、
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと;
e)任意選択で、アダプターを標的核酸断片に連結させるステップと;
f)少なくとも1つの標的核酸断片を配列決定するステップと
を含む、方法に関する。
第4の態様では、本発明は、
本明細書で定義した少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体と、
エキソヌクレアーゼと
を含む、核酸分子からの標的核酸断片を濃縮するためのキットオブパーツに関する。
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関する各種用語は、本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用される。そのような用語には、特段の明示のない限り、本発明が関係する技術分野における通常の意味が付与されるものとする。他の詳細に定義された用語は、本明細書で提供された定義と一致する方法で解釈されるものとする。本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の試験の実施において使用することができ、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
好ましくは、本発明は、核酸分子を含むサンプルからの標的核酸断片を濃縮するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のRNA又はDNA誘導型エンドヌクレアーゼ複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと
を含む、方法に関する。
ステップb)において、核酸分子は、少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体で切断される。任意選択で、ステップb)は、核酸分子を第1及び第2のgRNA-CAS複合体と接触させるステップと、複合体が核酸分子を切断できるようにするステップでさらに明示され得る。したがって、一実施形態では、ステップb)は、以下のようにさらに明示することができる:
b1)核酸分子を少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体と接触させ、第1の複合体のgRNAは、前記第1の複合体を目的の配列の上流にある配列に誘導し、第2の複合体のgRNAは、前記第2の複合体を目的の配列の下流にある配列に誘導する、
b2)第1及び第2のgRNA-CAS複合体が核酸分子を切断できるようにし、少なくとも1つの切断された核酸分子は標的核酸断片であり、少なくとも1つの、好ましくは2つの切断された核酸分子(複数可)は非標的核酸断片(複数可)である。
したがって、本発明の第1の態様はまた、少なくとも、
i)上記で定義したステップa)~c)及び任意選択でステップd)を含む、目的の配列を含む核酸サンプルの複雑性を低減するための方法;
ii)上記で定義したステップa)~c)及び任意選択でステップd)を含む、核酸サンプルのサブセットを提供するための方法であって、前記サブセットが1つ又は複数の標的核酸断片を含む、方法;並びに
iii)上記で定義したステップa)~c)及び任意選択でステップd)を含む、目的の配列を含む核酸分子から前記目的の配列を含む断片、すなわち標的核酸断片を単離又は取得するための方法
を提供する。
好ましくは、プロトスペーサー配列の位置は、本発明の方法で使用されるCRISPRヌクレアーゼに依存する。非限定的な例として、CRISPR-ヌクレアーゼSpCAS9は、プロトスペーサー配列内の核酸を切断する。したがって、CAS9が本発明の方法において使用される場合、好ましくは、プロトスペーサー配列は、標的核酸断片に部分的に位置し、また非標的断片に部分的に位置しており、すなわち、プロトスペーサー配列は、標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップしている。したがって、好ましくは、第1及び第2のgRNA-CAS複合体のうちの少なくとも1つのgRNAのガイド配列は、
A)標的核酸断片に含まれるプロトスペーサー配列;
B)非標的核酸断片に含まれるプロトスペーサー配列:及び、
C)標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップするプロトスペーサー配列
からなる群から選択されるプロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる。
本発明の方法は、好ましくは本明細書で定義したステップc)の後に、1つ又は複数の精製ステップを含み得る。任意選択の精製ステップは、プロテイナーゼK処理である。或いは、又はさらに、前記精製は、
I.ステップ(c)の後に得られる消化された核酸サンプルを、1つ又は複数の標的核酸断片に特異的且つ効果的に結合する1つ又は複数の固体支持体に曝露させるステップと;任意選択で、
II.1つ又は複数の固体支持体を洗浄し、1つ又は複数の固体支持体から標的核酸断片を溶出させるステップ
を含み得る。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で上記に定義した方法のためのキットオブパーツを提供する。好ましくは、前記キットは、
本明細書で定義した少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体を含む1つ又は複数のバイアル;
CRISPR-CASタンパク質と複合体を形成してgRNA-CAS複合体を形成するための少なくとも第1及び第2のgRNAを含む1つ又は複数のバイアルと、前記CRISPR-CASタンパク質を含むさらなるバイアル;
非標的核酸を分解するための1つ又は複数のエキソヌクレアーゼを含むさらなるバイアル;並びに、
任意選択で、非標的核酸を分解するための1つ又は複数の制限酵素を含むバイアル
のうちの少なくとも1つを含む。
材料及び方法
合計3μgのラムダDNA(配列番号5、GenBankアクセッション番号J02459.1)(300ng/μlの10μl)を、制限エンドヌクレアーゼPciI(New England Biolabs)を使用し、以下の成分、2μlの10xNEB 3.1バッファー(New England Biolabs)、3μlのPciIエンドヌクレアーゼ(10U/ml)、及び5μlのヌクレアーゼフリーの水を加えて消化した。得られた20μlの反応混合物を37℃で1時間インキュベートし、その後、酵素を80℃で20分間のインキュベーションによって不活性化した。ラムダDNAの2つのPciI認識部位の概要を図1に示す。
以下の対照反応を実施した:
1.ラムダDNAの制限のみ。これについては、上記のPciI制限反応のみを実施した。
結果
FEMTO Pulse分析の結果を図2に示す:まとめると;
PciI制限酵素で消化したラムダDNAは、約600bp(配列番号6)~約9,000bp(配列番号8)~約40,000bp(配列番号7)の長さを有する、予測された断片を示した。
CRISPR-システムヌクレアーゼ複合体は、DNAをエキソヌクレアーゼの分解から保護することができる。
材料、方法及び結果
作物DNAで本方法を調査するために、メロンVedrantaisのゲノムDNAの423遺伝子座を標的とするようにsgRNAを設計し、これらの標的はそれぞれ5.1~5.9kbpの長さを有する。それぞれの標的については、少なくとも2つのsgRNAの組が、それぞれの標的に隣接する500bpの上流領域と下流領域の両方を標的とするように設計されており、それぞれのsgRNAは、ゲノム内に特有の20ntの長さのガイド配列を含む。
CRISPR-システムヌクレアーゼ複合体は、DNAをエキソヌクレアーゼ分解から保護することができ、それによって目的の標的化領域のDNAが濃縮される。
Claims (17)
- 核酸分子を含むサンプルから標的核酸断片を濃縮するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体で核酸分子を切断し、それにより、エキソヌクレアーゼ切断から保護される目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと
を含む、方法。 - ステップc)におけるエキソヌクレアーゼ消化の前に、標的核酸断片、又は標的核酸断片の末端を保護するさらなるステップを含まない、請求項1に記載の方法。
- i)ステップb)が、第1及び第2のgRNA-CAS複合体と核酸分子を一緒に約1分~約18時間、好ましくは約60分間、約10~90℃、好ましくは約37℃でインキュベートすることによって実施されること;
ii)ステップc)が、切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼとともに約1分~約12時間、好ましくは30分間、約10~90℃、好ましくは約37℃でインキュベートすることによって実施されること
のうちの少なくとも1つである、請求項1又は2に記載の方法。 - 第1及び第2のgRNA-CAS複合体のうちの少なくとも1つがCas9タンパク質を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 第1及び第2のgRNA-CAS複合体のうちの少なくとも1つがsgRNAを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 第1及び第2のgRNA-CAS複合体のうちの少なくとも1つが別個の分子としてcrRNA及びtracrRNAを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 第1及び第2のgRNA-CAS複合体のうちの少なくとも1つがDSBを誘導することができる、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 第1及び第2のgRNA-CAS複合体の両方がDSBを誘導することができる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)において、第1及び第2のgRNA-CAS複合体のうちの少なくとも1つが核酸分子の1つの鎖をニック導入し、核酸分子が、前記第1又は第2のgRNA-CAS複合体によってニック導入された位置の実質的に相補的位置で相補鎖をニック導入する少なくとも第3のgRNA-CAS複合体と接触される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸分子を含むサンプルからアダプター連結標的核酸断片を調製するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと;
e)アダプターを標的核酸断片に連結させるステップと
を含む、方法。 - アダプターが配列アダプターである、請求項10に記載の方法。
- 核酸分子を含むサンプルから標的核酸断片を配列決定するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
a)目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと;
b)少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも1つの非標的核酸断片を生成するステップと;
c)ステップb)で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも1つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと;
d)任意選択で、ステップc)で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと;
e)任意選択で、アダプターを標的核酸断片に連結させるステップと;
f)少なくとも1つの標的核酸断片を配列決定するステップと
を含む、方法。 - 複数の核酸サンプルに対して並行して実施される、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸分子がゲノムDNAである、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸分子が植物、動物、ヒト又は微生物から得られる核酸分子である、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~15のいずれか一項で定義した少なくとも第1及び第2のgRNA-CAS複合体と、
エキソヌクレアーゼと
を含む、核酸分子から標的核酸断片を濃縮するためのキットオブパーツ。 - 核酸分子から少なくとも1つの標的核酸断片を濃縮するための、請求項1~15のいずれか一項に記載の第1及び第2のgRNA-CAS複合体、又は請求項16に記載のキットオブパーツの使用。
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