CN106554999B - 高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库构建方法、试剂盒及其用途 - Google Patents

高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库构建方法、试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库的构建方法、试剂盒及其用途。所述构建方法包括第一轮扩增；消化引物；第二轮扩增；纯化回收所有DNA条带；测序；分析。

Description

高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库构建 方法、试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学诊断技术领域，具体地说是涉及一种高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库的构建方法、试剂盒及其用途。
背景技术
单基因糖尿病是糖尿病特殊类型中的一种。它是由单一基因缺陷所引起，是病因最明确的糖尿病，但在临床上诊断困难、复杂，确诊率低。从临床表现、临床诊断的角度而言，单基因糖尿病可分为以下几个型别：新生儿糖尿病（NDM）、青少年的成人起病型糖尿病（MODY）、线粒体糖尿病（MDM）、严重胰岛素抵抗综合征、少见的伴随糖尿病的其他综合征等。
新生儿糖尿病（NDM）通常指出生后6个月内发生的糖尿病，它是以严重的代谢紊乱为表现，是一组异质性的单基因遗传病，以胰岛素分泌不足和高血糖为特征，国外报道估计发病率约为1/400,000-1/300,000新生儿，国内相关数据较少。由于该病需要胰岛素治疗，而且对该病病因认识不清，因此相当长时间内被视为Ⅰ型糖尿病的早发类型。按照疾病转归的不同又分为两个亚型：暂时性新生儿糖尿病（TNDM）和永久性新生儿糖尿病（PNDM），两者最根本的区别是遗传学基础的不一致。TNDM主要常见的遗传学病变是6q24缺陷，该病大部分在一年内缓解。PNDM最常见的遗传学改变是KCNJ11和ABCC8基因的突变，这两个基因编码胰岛β细胞KATP通道的Kir6.2亚单位和磺脲类受体（SUR）1亚单位，KCNJ11和ABCC8基因杂合子激活突变是NDM的主要致病基因。该病患者发病年龄较晚，宫内发育迟缓，低出生体重所占比例较小但病情严重，多以酮症起病，伴空腹C肽及胰岛素水平下降的临床特点。此外由于KCNJ11和ABCC8编码的Kir6.2、SUR在胰腺外神经、心肌、骨骼肌组织也表达，因此患儿常伴有神经系统和其他系统的发育障碍。目前已确认10余个NDM致病基因，包括：KCNJ11和ABCC8、胰岛素基因（INS）、葡萄糖激酶（GCK）、GLIS家族锌指三基因（GLIS3、PTF1A、FOXP3）、真核生物翻译起始因子2激酶3（EIF2AK3）、胰岛素启动因子1（IPF1）等基因。
（一）NDM发病的分子机制
（1）NDM与KCNJ11和ABCC8基因
KATP通道是动物代谢和细胞膜活动联系在一起的重要通道，分布于胰岛β细胞、脑、肾脏、骨骼肌等多种组织细胞中。胰岛β细胞上的KATP通道通过影响胰岛素的分泌进而调节血糖，近年来研究发现，KCNJ11和ABCC8基因的突变与糖尿病的发生密切相关。
当编码胰岛β细胞KATP通道的Kir6.2亚单位的KCNJ11或编码SUR1亚单位的ABCC8基因发生杂合子激活突变时，KATP通道与细胞内ATP亲和力下降，在葡萄糖刺激下无法正常关闭，细胞膜持续处于超极化状态，胞内钙离子无法内流，导致β细胞内胰岛素无法正常释放。又因为以上两种亚单位在不同组织的广泛分布，基因突变不仅引起高血糖，同时伴有其他临床症状和体征，如发育迟缓、肌无力、癫痫等症状。80%的KCNJ11突变为新发，其余为常染色体显性遗传。ABCC8突变可以是显性、隐性的激活突变，也可以是激活和失活突变的复合杂合子。大部分ABCC8突变是新发的，也有显性和隐性遗传模式。
对于此类突变的NDM的治疗可采用磺脲类降糖药。
（2）NDM与INS基因
INS突变所致的患者通常表现为酮症酸中毒或明显的高血糖，临床表现与由KCNJ11和ABCC8基因突变所致的PNDM相似，但发病年龄略晚。INS编码前胰岛素原，PNDM中INS基因的突变位点常位于前胰岛素原的关键区域，显性突变引起胰岛素原错误折叠，其聚集在内质网，引起内质网应激，最终导致β细胞功能障碍和凋亡。INS隐性突变可引起胰岛素生物合成减少导致PNDM，其表现较显性突变更严重。
（3）NDM与GCK基因
GCK基因是胰岛β细胞中糖代谢的关键调节因子，编码葡萄糖激酶，其纯合突变可引起葡萄糖激酶的缺乏而导致PNDM，杂合突变会导致MODY2的发生，且通常仅表现为轻微的高血糖。2001年报道的两个糖尿病家系发现的两个出生仅一天就发病的PNDM患儿的基因分析显示为GCK基因的纯合错义突变，而其父母均为轻至中度糖耐量减低的GCK杂合突变携带者。
（4）NDM与FOXP3基因
FOXP3基因编码带有锌指结合区域的转录因子FKH家族的DNA结合蛋白，这一区域的突变常导致严重的临床综合征——IPEX综合征，它是一种X连锁综合征，临床上不仅表现为NDM，同时伴随自身免疫性甲状腺疾病、小肠绒毛萎缩的顽固性腹泻、溶血性贫血等症状。
（二）二代测序检测NDM的意义
第二代测序技术因具有高通量、低成本、测序错误率低等特点，在近几年得到快速发展，应用第二代高通量测序技术，可以对混合的核酸分子进行序列测定，同时分辨和测出每个独立的序列，使得大批量的目标序列测序能够同时进行。
目前，国内的NDM尚未引起足够的重视，单基因糖尿病相对罕见，发病散发，募集困难，一些基础数据和临床研究均来自欧美国家，国内大部分的NDM仍被误认为Ⅰ型糖尿病。
对于新生儿糖尿病来说，目标基因的二代测序技术相比于逐个基因筛查是一个经济有效且快速的方法，目标基因检测不但有助于临床上疾病的分型，还可以根据不同的致病基因进行靶向治疗，不同致病基因或同一致病基因的不同突变位点都影响到患儿的预后和治疗选择，及早明确致病基因才能更好地对症下药，更好地控制患儿血糖。例如，由KCNJ11和ABCC8基因突变导致的NDM的患儿可以利用磺脲类降糖药代替胰岛素进行治疗，不仅能使患儿摆脱胰岛素的治疗，而且能更好地改善血糖控制及可能存在的神经系统异常等其他伴随症状，极大提高患儿的生活质量和临床预后。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的发明人进行了广泛深入的研究，由此完成本发明。
本发明的一个目的是提供一种构建高通量检测新生儿糖尿病（NDM）致病基因突变位点的测序文库的方法。
本发明的另一个目的是提供一种构建高通量检测新生儿糖尿病（NDM）致病基因突变位点的测序文库的试剂盒。
本发明利用PCR反应在待检测区域两端各引入一段寡核苷酸序列，这两段寡核苷酸序列分别与illumina公司的D5接头引物（D5adaptor）序列和N7接头引物（N7adaptor）序列相同，两端引入D5和N7寡核苷酸序列的待检测PCR产物可以直接作为测序文库应用于illumina公司的Nextseq 500/550，Hiseq 2000/2500/3000、Miseq等测序仪进行高通量测序。
本发明在产物两端引入寡核苷酸序列的同时，结合了多重PCR的扩增策略，可以同时实现对样本的一个或多个特定基因进行扩增，直接得到样本的一个或多个特定基因的测序文库。
本发明在样品的PCR产物两端分别引入可区分的D5接头引物序列和N7接头引物序列，其中D5接头引物和N7接头引物中包含的标签（index）信息可以用作后续区分不同样品的标签序列。
本发明中，所述D5接头引物序列由5’端通用的测序引物序列、标签序列（即，i5，见下文粗体部分）和3’端通用的测序引物序列串联连接组成，以及所述N7接头引物序列由5’端通用的测序引物序列、标签序列（即，i7，见下文粗体部分）和3’端通用的测序引物序列串联连接组成。
本发明中，利用PCR反应在产物两端各引入一段寡核苷酸序列，所述两段寡核苷酸序列分别与D5接头引物序列和N7接头引物序列相同，其中，所述D5接头引物序列选自：
D501
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Figure BDA0001138315610000041
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCT）（SEQ ID NO:1）、
D502
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Figure BDA0001138315610000042
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCT）（SEQ ID NO:2）、
D503
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Figure BDA0001138315610000043
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCT）（SEQ ID NO:3）、
D504
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Figure BDA0001138315610000044
ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT）（SEQ ID NO:4）、
D505
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Figure BDA0001138315610000045
ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT）（SEQ ID NO:5）、
D506
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Figure BDA0001138315610000046
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCT）（SEQ ID NO:6）、
D507
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Figure BDA0001138315610000047
ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT）（SEQ ID NO:7）和
D508
（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACC
Figure BDA0001138315610000048
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCT）（SEQ ID NO:8）中，以及
所述N7接头引物序列选自：
N701
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000049
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT）（SEQ ID NO:9）、
N702
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000051
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCT）（SEQ ID NO:10）、
N703
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000052
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT）（SEQ ID NO:11）、
N704
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000053
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCT）（SEQ ID NO:12）、
N705
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000054
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCT）（SEQ ID NO:13）、
N706
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000055
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCT）（SEQ ID NO:14）、
N707
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000056
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCT）（SEQ ID NO:15）、
N708
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000057
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT）（SEQ ID NO:16）、
N709
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000058
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCT）（SEQ ID NO:17）、
N710
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA0001138315610000059
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT）（SEQ ID NO:18）、
N711
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA00011383156100000510
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT）（SEQ ID NO:19）和
N712
（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
Figure BDA00011383156100000511
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT）（SEQ ID NO:20）中。
本发明提供了一种基于新型的PCR扩增技术快速构建包括新生儿糖尿病（NDM）9个相关致病基因在内的外显子区域的测序文库的试剂盒，检测的9个致病基因及其可能诱发的单基因糖尿病类型如表1所示：
表1 本发明试剂盒所检测的新生儿糖尿病9个致病基因
Figure BDA0001138315610000061
表2 新生儿糖尿病常见致病基因及常见突变类型
常见致病基因 突变类型
ABCC8 大部分突变为新发，显性、隐性的激活突变，激活或失活突变的复合杂合子
KCNJ11 大部分突变为新发，其余为常染色体显性遗传
INS 显性突变和隐性突变
GCK 纯合突变或复合杂合突变
EIF2AK3 基因变异数十种，包括无义、移码、错义及剪接突变
FOXP3 错义突变
KCNJ11、ABCC8、INS和GCK基因的突变是新生儿糖尿病常见的基因异常，其他一些和胰腺发育有关的基因的异常也会引起新生儿糖尿病，我国目前报道的病例数少，只是冰山之角，表2所述不能涵盖所有的突变类型，相信随着此类疾病的分子遗传诊断平台的建立，将有更多的突变类型将会被发现。
一方面，本发明提供了一种高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库的构建方法，所述致病基因可以包括选自ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF中的一种或多种，优选地所述致病基因可以包括ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF，更优选地所述致病基因可以由ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF组成，
本发明文库构建包括以下步骤：
（一）第一轮扩增：采用包括由与选自上述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分（即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:21）和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:22）中的一者的全部序列或其3’端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸组成的序列，例如，CCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:23））相同的序列和各个基因的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分（即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:21）和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:22）中的另一者的全部序列或其3’端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸组成的序列，例如，TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:24））相同的序列和各个基因的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物的第一轮扩增引物的组合对各样本的一个或多个特定基因进行扩增，此时多重扩增起作用的是每个基因的特异性扩增引物序列，扩增的结果致使每个扩增产物片段的两端都加上了所述通用的测序引物序列的部分或全部，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQID NO:9～SEQ ID NO:20中；
优选地，第一轮扩增引物的组合包括选自下列中的一对或多对，更优选地，第一轮扩增引物的组合包括下列引物，更优选地，第一轮扩增引物的组合由下列引物组成：
Figure BDA0001138315610000071
Figure BDA0001138315610000081
Figure BDA0001138315610000091
Figure BDA0001138315610000101
Figure BDA0001138315610000111
Figure BDA0001138315610000121
Figure BDA0001138315610000131
Figure BDA0001138315610000141
Figure BDA0001138315610000151
Figure BDA0001138315610000161
Figure BDA0001138315610000171
Figure BDA0001138315610000181
Figure BDA0001138315610000191
Figure BDA0001138315610000201
（二）消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
（三）第二轮扩增：以第一轮扩增的产物为模板，采用由与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成的第二轮扩增引物的组合（即，D5接头引物序列和N7接头引物序列的组合），此时扩增起作用的是所述通用的测序引物序列，扩增的结果致使最后的扩增产物又都加上了可区分各样本的对应于D5接头引物序列和N7接头引物序列的标签序列；
第二轮扩增引物的组合，其包括选自由D501～D508（SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8）中之一和N701～N712（SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20）之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分：
Figure BDA0001138315610000202
Figure BDA0001138315610000211
（四）纯化回收：使用纯化磁珠筛选回收目标区域范围之间的所有DNA条带；
（五）测序：回收的产物进行定量后，将不同标签的产物按照测序数据量要求混合后进行上机测序；
（六）分析：基于每个样本的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
另一方面，本发明提供了一种构建高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库的试剂盒，所述致病基因可以包括选自ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF中的一种或多种，优选地所述致病基因可以包括ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF，更优选地所述致病基因可以由ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF组成，
所述试剂盒包括：
第一轮扩增引物的组合：包括由与选自上述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分（即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:21）和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:22）中的一者的全部序列或其3’端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸组成的序列，例如，CCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:23））相同的序列和各个基因的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者的3’端通用的测序引物序列的全部或部分（即，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ IDNO:21）和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（SEQ ID NO:22）中的另一者的全部序列或其3’端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸组成的序列，例如，TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC T（SEQ ID NO:24））相同的序列和各个基因的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物。其中，所述D5接头引物序列选自D501-D508（SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8）中，所述N7接头引物序列选自N701-N712（SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20）中；
第一轮扩增引物的组合是根据待测的所述致病基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5’端分别加上一段与D5接头引物序列和N7接头引物序列的通用的测序引物序列的全部或部分相同的序列，组成第一轮扩增引物组合；
本发明的通用的测序引物序列illumina公司的高通量测序通用的测序引物序列，分别对应D5接头引物和N7接头引物上的3’端通用的测序引物序列；
第二轮扩增引物的组合：由与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成（即，D5接头引物序列和N7接头引物序列的组合）；
第二轮扩增引物的组合是根据样本的数量使用不同的D5接头引物和N7接头引物序列的标签序列组合（标签序列是D5接头引物和N7接头引物序列中的一段序列（即，[i5]和[i7]））以使各样本可区分，采用由与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成的第二轮扩增引物的组合（即，D5接头引物序列和N7接头引物序列的组合）。
本发明中，优选地，所述试剂盒进一步包括DNA聚合酶，所采用的酶均为高保真DNA聚合酶，由此减少扩增带来的DNA突变率。
本发明中，优选地，所述试剂盒进一步包括单链消化酶，所用的单链消化酶为核酸外切酶I（Exonuclease I），该酶为单链特异性3’→5’核酸外切酶，不分解双链DNA及RNA。
本发明中，优选地，NGS技术将显著提高所述致病基因突变的检测效率、灵敏度及特异性。
优选地，本发明试剂盒中，所述第一轮扩增引物的组合可以包括选自SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:316中的一对或多对。
优选地，本发明试剂盒中，第二轮扩增引物的组合可以包括选自由D501～D508（SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8）中之一和N701～N712（SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20）之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分。
本发明优点在于：
本发明开发了一种检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的二代测序文库的构建方法，优点在于：
（1）本发明所涉及的新生儿糖尿病致病基因可达9种，检测区域覆盖各基因全部编码区外显子，检测基因具有代表性，种类多，可以为新生儿糖尿病的分子遗传诊断平台的建立及其治疗研究打下基础。
（2）本发明构建的高通量测序文库与传统的连接建库构建的文库引入的接头一致，即illumina公司通用的D5接头引物序列和N7接头引物序列，因此可以直接应用于illumina公司的Nextseq 500/550，Hiseq 2000/2500/3000、Miseq等测序仪进行测序。
（3）本发明成本较传统连接建库成本要低。目前传统的二代测序文库是采用将核酸片段进行末端修复，加A处理，连接通用接头引物（adaptor），特异引物富集等步骤进行文库的构建。传统步骤耗费时间较长，试剂较多，成本较高。本发明所采用的PCR序列捕获技术是一种对基因组特定区域进行选择性富集的技术，其通过合适的方法将目标基因从基因组中调取出来进行测序。本发明构建新生儿糖尿病致病基因高通量测序文库耗时短、灵敏性高、重复性好，在二代测序技术平台有很好的应用前景。
（4）本发明具有高通量的优点，一次可进行1-96个样本的文库构建及检测。
（5）安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需后处理，对操作员和环境都无危害。
附图说明
图1是本发明的构建特定基因测序文库的方法的示意图。
具体实施方式
现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
以下实施例中所使用的设备和试剂如下：血液基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司），高速离心机SIGMA 3-30K，核酸扩增仪ABI 9700，多重扩增试剂Qiagen（181942），高保真扩增酶Kapa BiosystemsHiFi HS(kk 2600)，核酸外切酶TakaraExonuclease I(E.coli)，纯化磁珠Beckman Agencourt AMPure XP。
实施例1
共5例正常人全血基因组DNA样本：
（1）引物设计：
1）第一轮扩增引物：
本实施例所用引物为涵盖本发明中9个致病基因的全部带有通用序列的146对二代建库引物，引物序列如下所示，其中下划线处为通用序列：
Figure BDA0001138315610000241
Figure BDA0001138315610000251
Figure BDA0001138315610000261
Figure BDA0001138315610000271
Figure BDA0001138315610000281
Figure BDA0001138315610000291
Figure BDA0001138315610000301
Figure BDA0001138315610000311
Figure BDA0001138315610000321
Figure BDA0001138315610000331
Figure BDA0001138315610000341
Figure BDA0001138315610000351
Figure BDA0001138315610000361
2）第二轮扩增引物：
在本实施例中，第二轮扩增的引物选择时，根据5个样本采用5对标签序列组合，在第二轮扩增时对每个样本的各个目的片段都加上可以区分的标签序列，所设计的引物如下，其中下划线是引入的通用的测序序列：
Figure BDA0001138315610000362
Figure BDA0001138315610000371
表3：本实例中建库5个样本对应5对标签的列表
D501 D502 D503 D504 D505
N701 1# 2# 3# 4# 5#
（2）第一轮扩增：
每对引物单独调试合格后，将146对引物分别加水稀释到100μM，然后等量混合成终浓度为2μM的引物混合液。并将引物根据其物理位置分成2个Well，每个Well分别进行第一轮扩增。
第一轮扩增PCR体系：4.4μL 5ⅹPCR buffer，2.5μL混合引物，1.5μL Taq（5U/μL），2.5μL模板DNA（5ng/μL），超纯水补足体系22μL。PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性95℃保持15min。PCR反应循环条件：
以下进行20个循环：
第1步：95℃进行30s；
第2步：60℃进行4min；
20个循环完成后，72℃保持10min，最后保持在4℃。
（3）消化引物
第一轮扩增产物采用Takara Exonuclease I对第一轮扩增产物进行消化残留引物，酶切体系：Exonuclease I（50U/μL）0.5μL，PCR产物20μL。
酶切反应按下述条件进行：37℃下反应30min；
（4）纯化回收：0.6-0.9x磁珠进行筛选200-400bp之间的片段（此操作可减少第二轮的非特异扩增）
（5）第二轮扩增
通过标签引物上下游分别配对组成5对可区分的标签组合，在第二轮PCR扩增时对5个样本分别加上不同的可识别的标签序列，样本两端标签组合见表4，PCR体系：HiFiHS(kk2600)2x mix 12.5μL，0.75μL正向扩增引物，0.75μL反向扩增引物，1.5μL消化引物后的PCR产物（消化后的PCR产物所加量为60-100ng之间），超纯水补足体系25μL。PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性98℃保持45s。PCR反应循环条件：
以下进行8个循环：
第1步：98℃进行15s；
第2步：60℃进行30s；
第3步：72℃进行30s；
8个循环完成后，72℃保持1min，最后保持在4℃。
表4 样本两端标签组合表
i501 i502 i503 i504 i505
i701 1# 2# 3# 4# 5#
（6）回收：0.8x磁珠纯化结合0.6-0.8x磁珠筛选回收350-400bp范围之间的所有DNA条带；
（7）测序：回收的产物进行定量后，将不同标签的产物按照测序数据量要求混合后进行上机测序（Nextseq 500，PE 150）；
（8）分析：Illumina Nextseq 500产物的测序结果是一系列DNA序列，通过查找测序结果中5个样本各自可区分的标签序列，将获得的测序结果首先与样本一一对应，然后根据每个外显子各自的引物序列，再将序列对应到样本的各个目标区域上。5个样本测序结果中包含了每对引物所对应的区域，每个样本对应的reads数（序列条数）如下表5所示，每对引物扩增区域所对应的序列条数如下表6所示（仅列出4号样本的数据）。
表5 每个样本对应的序列条数和GC_数
序列条数 GC_数(%)
1# 646581 54.01
2# 624361 54.42
3# 644249 53.64
4# 706445 51.99
5# 738185 51.64
表6 4号样本新生儿糖尿病9个致病基因编码区外显子区域目标序列对应的序列条数
Figure BDA0001138315610000381
Figure BDA0001138315610000391
Figure BDA0001138315610000401
Figure BDA0001138315610000411
Figure BDA0001138315610000421
Figure BDA0001138315610000431
表5表明通过上述方法，成功构建了可以直接应用于测序的文库，并且每个文库都能对应的获得相应的测序序列。
表6以其中一个样品为例，列举了多重扩增中146对引物的序列数，表明多重扩增的有效性。
<110> 大连晶泰生物技术有限公司
<120> 高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库构建方法、试剂盒及
其用途
<130> DI16-1227-XC37
<160> 316
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D501
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgcaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D502
<400> 2
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctataca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D503
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D504
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gagtagaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D505
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taaggagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D506
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctgcataaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D507
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca aggagtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D508
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc taagcctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N701
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agattaaggc gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N702
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatcgtact aggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N703
<400> 11
caagcagaag acggcatacg agataggcag aagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N704
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agattcctga gcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N705
<400> 13
caagcagaag acggcatacg agatggactc ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N706
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agattaggca tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N707
<400> 15
caagcagaag acggcatacg agatctctct acgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N708
<400> 16
caagcagaag acggcatacg agatcagaga gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N709
<400> 17
caagcagaag acggcatacg agatgctacg ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N710
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agatcgaggc tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N711
<400> 19
caagcagaag acggcatacg agataagagg cagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 20
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N712
<400> 20
caagcagaag acggcatacg agatgtagag gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D5接头引物序列的3'端通用的测序引物序列
<400> 21
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N7接头引物序列的3'端通用的测序引物序列
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D5接头引物序列的3'端通用的测序引物序列的部分
<400> 23
cctacacgac gctcttccga tct 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N7接头引物序列的3'端通用的测序引物序列的部分
<400> 24
ttcagacgtg tgctcttccg atct 24
<210> 25
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon39-2-F
<400> 25
cctacacgac gctcttccga tctgcttctc tggcttatcg aactca 46
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon39-1-F
<400> 26
cctacacgac gctcttccga tctcaccaga cttagggcct ctagta 46
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon38-2-F
<400> 27
cctacacgac gctcttccga tctatcaatg ggccccttac cg 42
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon38-1-F
<400> 28
cctacacgac gctcttccga tctgaggtct gagggaagca cag 43
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon37-F
<400> 29
cctacacgac gctcttccga tctgcaaatt tctccctagc atccca 46
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon36-F
<400> 30
cctacacgac gctcttccga tctgcttctg tctgccatcc ttaca 45
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon35;exon34-F
<400> 31
cctacacgac gctcttccga tctgatgatg gagaggcgtg agc 43
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon35-F
<400> 32
cctacacgac gctcttccga tctgcctgat gggatggaga agg 43
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon34-F
<400> 33
cctacacgac gctcttccga tctcccgcct tacaactcac ctt 43
<210> 34
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon33-F
<400> 34
cctacacgac gctcttccga tctgagtgag aagacaaggc ctgag 45
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon32-F
<400> 35
cctacacgac gctcttccga tctcagctag tatccgaaag tgcca 45
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon33-F
<400> 36
cctacacgac gctcttccga tctccgtgct ctgaccttct gtc 43
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon31-F
<400> 37
cctacacgac gctcttccga tcttgtctca tgtctccagt gacga 45
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon30-F
<400> 38
cctacacgac gctcttccga tcttcatccc caggtacctg tgt 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon29-F
<400> 39
cctacacgac gctcttccga tcttggagtc ctgagaatca aatctcatg 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon28-F
<400> 40
cctacacgac gctcttccga tctacaccaa actgcacatt gcaaa 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon27-F
<400> 41
cctacacgac gctcttccga tctgacactg gcttcttccc agag 44
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon26;exon25-F
<400> 42
cctacacgac gctcttccga tctcgtgaac accatggcat agaca 45
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon26-2-F
<400> 43
cctacacgac gctcttccga tctgggctag gatgatccgg tttag 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon26-1-F
<400> 44
cctacacgac gctcttccga tcttttctcc ctgcttcttg caca 44
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon25-F
<400> 45
cctacacgac gctcttccga tctcttggcc agccagtagt cg 42
<210> 46
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon24-F
<400> 46
cctacacgac gctcttccga tctctctgtg gctgatcaga cctc 44
<210> 47
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon23-F
<400> 47
cctacacgac gctcttccga tctcctttat gagttcaggt tctagc 46
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon22-F
<400> 48
cctacacgac gctcttccga tctccaagac aacggattgg ttcct 45
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTACACGACGCTCTTCCGATCTTATCTCTGGCAGGAGGGATTTACT
<400> 49
cctacacgac gctcttccga tcttatctct ggcaggaggg atttact 47
<210> 50
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCTAGTTACCCATTGTCCTGAGTAG
<400> 50
cctacacgac gctcttccga tcttcctagt tacccattgt cctgagtag 49
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAGACAGTTCCTCCCCTCCA
<400> 51
cctacacgac gctcttccga tctgagacag ttcctcccct cca 43
<210> 52
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon18-F
<400> 52
cctacacgac gctcttccga tctaccctgg agggagttga cc 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon17-F
<400> 53
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<212> DNA
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<220>
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<400> 54
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 55
cctacacgac gctcttccga tctgtaggtg ctcaataaat gcagctttg 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon14;exon13-F
<400> 57
cctacacgac gctcttccga tcttgcggtt cacaaccctg a 41
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon13-F
<400> 58
cctacacgac gctcttccga tctccaagtt ttgggcctta gagga 45
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGACGGTAGATCGGACCACA
<400> 59
cctacacgac gctcttccga tcttgacggt agatcggacc aca 43
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon12-1-F
<400> 60
cctacacgac gctcttccga tctcaagtcc ttgctcaggg atgg 44
<210> 61
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon11--F
<400> 61
cctacacgac gctcttccga tctcctgtgc agaaaggcca aatc 44
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon10-2-F
<400> 62
cctacacgac gctcttccga tctactttga tttctgggag cttagctatc 50
<210> 63
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTATAGATGGCAAAGGCCCTGAG
<400> 63
cctacacgac gctcttccga tctgtataga tggcaaaggc cctgag 46
<210> 64
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGACCTGCTGCTGTCG
<400> 64
cctacacgac gctcttccga tctggagacc tgctgctgtc g 41
<210> 65
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon8-F
<400> 65
cctacacgac gctcttccga tctagcagat tctggttgtg tgtcc 45
<210> 66
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon7-F
<400> 66
cctacacgac gctcttccga tctattccta ataatggttc ttatggcaaa gtga 54
<210> 67
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon6-F
<400> 67
cctacacgac gctcttccga tctccatcta gagggtgcct tacc 44
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGAAGGCGTTCATCCACCAG
<400> 68
cctacacgac gctcttccga tcttgaaggc gttcatccac cag 43
<210> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon5-1-F
<400> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon4-2-F
<400> 70
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon4-1-F
<400> 71
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon3-F
<400> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon2-F
<400> 73
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<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon1-F
<400> 74
cctacacgac gctcttccga tctgagtgaa gggatgagct ggtg 44
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 75
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<210> 76
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAV1_exon2-F
<400> 76
cctacacgac gctcttccga tctcacacca aggagatcga cctg 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAV1_exon1;exon2-F
<400> 77
cctacacgac gctcttccga tctcgccagg ctgacttctc at 42
<210> 78
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAV1_exon3-2-F
<400> 78
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<210> 79
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAV1_exon3-1-F
<400> 79
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<210> 80
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 80
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon17-1-F
<400> 81
cctacacgac gctcttccga tctactaaca aagaacaaag atagcccttt cc 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon16-F
<400> 82
cctacacgac gctcttccga tctagacctt tggcttcctc atctg 45
<210> 83
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon15-2-F
<400> 83
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon15-1-F
<400> 84
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon14-F
<400> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> EIF2AK3_exon13-4-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon13-2-F
<400> 88
cctacacgac gctcttccga tcttgccaat atgcaatcga ttagttttcg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon13-1-F
<400> 89
cctacacgac gctcttccga tctttgtatg ctgcatccac tgact 45
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon12-2-F
<400> 90
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon12-1-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon11-F
<400> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon10-F
<400> 93
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon9-2-F
<400> 94
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<210> 95
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon9-1-F
<400> 95
cctacacgac gctcttccga tctaaaccag acagtaagca accatga 47
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon8-2-F
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon8-1-F
<400> 97
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon7-F
<400> 98
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon6-2-F
<400> 99
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon6-1-F
<400> 100
cctacacgac gctcttccga tctgggaatg actttcccat ccttaagt 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cctacacgac gctcttccga tctcattggg cttaaaggtg ctttcaat 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon5-1-F
<400> 102
cctacacgac gctcttccga tctaagctga gagccccaag tagta 45
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<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon4-2-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon4-1-F
<400> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon3-F
<400> 105
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon2-F
<400> 106
cctacacgac gctcttccga tctggcccca aacttcttaa tatcagca 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EIF2AK3_exon1-F
<400> 107
cctacacgac gctcttccga tcttcgcaac tctgtctcat cgtctggt 48
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon11-F
<400> 108
cctacacgac gctcttccga tctcggttcc cttattgttt ctgttc 46
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon4-F
<400> 109
cctacacgac gctcttccga tctccgcctt tagagttact ttcagaca 48
<210> 110
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon3-3-F
<400> 110
cctacacgac gctcttccga tctctgaaca attaaccaaa ctgtcgcaa 49
<210> 111
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon3-2-F
<400> 111
cctacacgac gctcttccga tctttccaag tgtgtcccca agc 43
<210> 112
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon3-1-F
<400> 112
cctacacgac gctcttccga tctagttcat ctgtactgtt gataacatag ttgtt 55
<210> 113
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon2-F
<400> 113
cctacacgac gctcttccga tctcaccctt tatctctgtg tatgaggaac 50
<210> 114
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon1-F
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cctacacgac gctcttccga tctaagagaa ttaattttga tctgtggtag ctaca 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon11;exon10-F
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cctacacgac gctcttccga tctgaggaaa aacacataag gtccacaga 49
<210> 116
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon10-F
<400> 116
cctacacgac gctcttccga tctctgaatg cagctattgc taaagcag 48
<210> 117
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon9-F
<400> 117
cctacacgac gctcttccga tctttaacct ggaccacaga ggtg 44
<210> 118
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon8-F
<400> 118
cctacacgac gctcttccga tcttgattgc ttttagagcc gaagt 45
<210> 119
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon7-F
<400> 119
cctacacgac gctcttccga tcttcactgt gctcttaaga gttagtgg 48
<210> 120
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon6-2-F
<400> 120
cctacacgac gctcttccga tcttgagtct aataccgtgt gtatggattt c 51
<210> 121
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon6-1-F
<400> 121
cctacacgac gctcttccga tctgaagaaa gaaaaaccat ccacagactt ac 52
<210> 122
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC2A2_exon5-F
<400> 122
cctacacgac gctcttccga tctagatgga tgaagtggag gaagtaca 48
<210> 123
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3_exon12-F
<400> 123
cctacacgac gctcttccga tctcctgttc gtccatcctc ctttc 45
<210> 124
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3_exon11-2-F
<400> 124
cctacacgac gctcttccga tctcggatgg cgttctgtgg a 41
<210> 125
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3_exon11-1-F
<400> 125
cctacacgac gctcttccga tctcatccca gtcaccgcca cc 42
<210> 126
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3_exon10-F
<400> 126
cctacacgac gctcttccga tctgcttggg aatggaggaa ccc 43
<210> 127
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3_exon9-F
<400> 127
cctacacgac gctcttccga tctcctgtca ggattaggag cttgg 45
<210> 128
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cctacacgac gctcttccga tctgcactat ccctatccct taccct 46
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctacacgac gctcttccga tctggatgaa gcctgagctg agatc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> GCK_exon9-1-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon7-1-F
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon6-F
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INS_exon2-F
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon2-1-F
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon2;exon1-F
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon1-1-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon2-4-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon2-3-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<223> PTRF_exon1-2-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon1-1-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon39-1-R
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon38-1-R
<400> 174
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgatga cagccttcgc agac 44
<210> 175
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon37-R
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ttcagacgtg tgctcttccg atctcatccc atctgctcca ctcac 45
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon26-2-R
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon25-R
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon24-R
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon23-R
<400> 193
ttcagacgtg tgctcttccg atctgatgtg accaccattc ctccc 45
<210> 194
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon22-R
<400> 194
ttcagacgtg tgctcttccg atctcaccat gcctttccct accc 44
<210> 195
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon21-R
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon20-R
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<210> 197
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon19-R
<400> 197
ttcagacgtg tgctcttccg atcttcagct tgacaactgc ctctg 45
<210> 198
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon18-R
<400> 198
ttcagacgtg tgctcttccg atcttatgca gcatttgtgg ctacaga 47
<210> 199
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon17-R
<400> 199
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<210> 200
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon16-R
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ttcagacgtg tgctcttccg atctgcatct gtctgtctgt ctttctgg 48
<210> 201
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon15-R
<400> 201
ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcttt tggctttcat ggaggag 47
<210> 202
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ABCC8_exon14-R
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<210> 203
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon14;exon13-R
<400> 203
ttcagacgtg tgctcttccg atctagatcc gtgaggagca gtgt 44
<210> 204
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon13-R
<400> 204
ttcagacgtg tgctcttccg atctagatcc tgctcagagc tctctatc 48
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABCC8_exon12-2-R
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<213> 人工序列
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<223> FOXP3_exon10-R
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<213> 人工序列
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<223> FOXP3_exon7-R
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<210> 276
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3_exon6-R
<400> 276
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> FOXP3_exon2-2-R
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ttcagacgtg tgctcttccg atctcgagat caccttcatc gagtc 45
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<400> 285
ttcagacgtg tgctcttccg atctggaaac gctttggctg ggtg 44
<210> 286
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon8-R
<400> 286
ttcagacgtg tgctcttccg atctctcgtg cctgctgatg taatg 45
<210> 287
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon7-2-R
<400> 287
ttcagacgtg tgctcttccg atctcagaat gtggagctgg tggag 45
<210> 288
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon7-1-R
<400> 288
ttcagacgtg tgctcttccg atctagagcc gcctttccat tgt 43
<210> 289
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon5-R
<400> 289
ttcagacgtg tgctcttccg atctgccacg aggcctatct ctc 43
<210> 290
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon6-R
<400> 290
ttcagacgtg tgctcttccg atctttctcc ttggcttcca gcac 44
<210> 291
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon4-2-R
<400> 291
ttcagacgtg tgctcttccg atctcagtgt ccctgaggaa tagcttg 47
<210> 292
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon4-1-R
<400> 292
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgggct tcaccttctc ctttc 45
<210> 293
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon3-R
<400> 293
ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgag gctgacacac ttctc 45
<210> 294
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon2-3-R
<400> 294
ttcagacgtg tgctcttccg atctcagagt tccagctgca ggag 44
<210> 295
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon2-2-R
<400> 295
ttcagacgtg tgctcttccg atctctttcc agctggtttt acctgt 46
<210> 296
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon2-1-R
<400> 296
ttcagacgtg tgctcttccg atctctgcct gaccagctcc g 41
<210> 297
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon1-2-R
<400> 297
ttcagacgtg tgctcttccg atctgggcct tacgctccaa gg 42
<210> 298
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCK_exon1-1-R
<400> 298
ttcagacgtg tgctcttccg atctgagaag ccttggatat ttccacttca 50
<210> 299
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INS_exon3-R
<400> 299
ttcagacgtg tgctcttccg atctctgact gtgtcctcct gtgtc 45
<210> 300
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INS_exon2;exon1-R
<400> 300
ttcagacgtg tgctcttccg atctttgcgt caggtgggct caggatt 47
<210> 301
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INS_exon2-R
<400> 301
ttcagacgtg tgctcttccg atctccatgg ccctgtggat gc 42
<210> 302
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon2-4-R
<400> 302
ttcagacgtg tgctcttccg atctattgta gctgaggagg acgga 45
<210> 303
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon2-3-R
<400> 303
ttcagacgtg tgctcttccg atctccatgt cattgatgcc aacagc 46
<210> 304
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon2-2-R
<400> 304
ttcagacgtg tgctcttccg atctctctgc ttcatgctac gtgtg 45
<210> 305
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon2-1-R
<400> 305
ttcagacgtg tgctcttccg atctcgcatg gtgactgagg agt 43
<210> 306
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon2;exon1-R
<400> 306
ttcagacgtg tgctcttccg atctctcaag tggccacaca cattg 45
<210> 307
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon1-2-R
<400> 307
ttcagacgtg tgctcttccg atctcatcat ccccgaggaa tacgtg 46
<210> 308
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KCNJ11_exon1-1-R
<400> 308
ttcagacgtg tgctcttccg atctcagcac aggctgagtg cag 43
<210> 309
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon2-5-R
<400> 309
ttcagacgtg tgctcttccg atctgaagac caaggtgcgt accc 44
<210> 310
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon2-4-R
<400> 310
ttcagacgtg tgctcttccg atctcgccgt gctggtggac aagag 45
<210> 311
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon2-3-R
<400> 311
ttcagacgtg tgctcttccg atctcccttc accttccacg tca 43
<210> 312
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon2-2-R
<400> 312
ttcagacgtg tgctcttccg atctggtgga ggttgaggag gttattg 47
<210> 313
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon2-1-R
<400> 313
ttcagacgtg tgctcttccg atcttcgccc acatccgcct cct 43
<210> 314
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon1-3-R
<400> 314
ttcagacgtg tgctcttccg atctagtcgg accaggtgaa cg 42
<210> 315
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon1-2-R
<400> 315
ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcttc tctccgggtc tcc 43
<210> 316
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTRF_exon1-1-R
<400> 316
ttcagacgtg tgctcttccg atctctcaag cacagctgga ggag 44

Claims (5)

1.一种构建高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库的方法，所述致病基因由ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF组成，
所述方法包括以下步骤：
第一轮扩增：采用包括第一轮正向扩增引物以及第一轮反向扩增引物的第一轮扩增引物的组合对各样本的特定基因进行扩增，所述第一轮扩增引物的组合由SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:316组成，其中，
第一轮扩增PCR体系组成为：4.4μL 5ⅹPCR buffer，2.5μL混合引物，1.5μL Taq，2.5μL模板DNA，超纯水补足体系22μL，PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性95℃保持15min，PCR反应循环条件：
以下进行20个循环：
第1步：95℃进行30s；
第2步：60℃进行4min；
20个循环完成后，72℃保持10min，最后保持在4℃；
消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
第二轮扩增：以第一轮扩增的产物为模板，采用由与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成的第二轮扩增引物的组合进行扩增，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20中，其中，所述第二轮扩增引物的组合包括选自由SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:8中之一和SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分，其中，
第二轮扩增PCR体系组成为：HiFiHS kk2600 2x mix 12.5μL，0.75μL正向扩增引物，0.75μL反向扩增引物，1.5μL消化引物后的PCR产物，超纯水补足体系25μL，PCR反应按下述条件进行：模板DNA变性98℃保持45s，PCR反应循环条件：
以下进行8个循环：
第1步：98℃进行15s；
第2步：60℃进行30s；
第3步：72℃进行30s；
8个循环完成后，72℃保持1min，最后保持在4℃；
纯化回收所有DNA条带；
测序：回收的产物进行定量后，将不同标签的产物按照测序数据量要求混合后进行上机测序；
分析：基于每个样本的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
2.一种高通量检测新生儿糖尿病致病基因突变位点的测序文库的构建试剂盒，所述致病基因由ABCC8、KCNJ11、GCK、INS、EIF2AK3、FOXP3、SLC2A2、CAV1和PTRF组成，
所述试剂盒包括：
第一轮扩增引物的组合：由SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:316组成；
第二轮扩增引物的组合：由与选自所述D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20中，其中，所述第二轮扩增引物的组合包括选自由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中之一和SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括DNA聚合酶。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括单链消化酶。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述单链消化酶为核酸外切酶I。
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