CN110734966B - 一种用于检测sav1基因启动子区甲基化位点的检测体系及试剂盒 - Google Patents
一种用于检测sav1基因启动子区甲基化位点的检测体系及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110734966B CN110734966B CN201910885231.8A CN201910885231A CN110734966B CN 110734966 B CN110734966 B CN 110734966B CN 201910885231 A CN201910885231 A CN 201910885231A CN 110734966 B CN110734966 B CN 110734966B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fragment
- primer
- amplification
- reaction system
- sequencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 101001092982 Homo sapiens Protein salvador homolog 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 126
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 claims abstract description 66
- SOCTUWSJJQCPFX-UHFFFAOYSA-N dichromate(2-) Chemical compound [O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O SOCTUWSJJQCPFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims abstract 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 125
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 89
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 89
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 76
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 46
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 25
- 238000013461 design Methods 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 102100036193 Protein salvador homolog 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 4
- 101000759453 Homo sapiens YY1-associated protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102100023267 YY1-associated protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 3
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001047642 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase LATS1 Proteins 0.000 description 2
- 102100024031 Serine/threonine-protein kinase LATS1 Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 230000017945 hippo signaling cascade Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101000880431 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101150042012 SEPTIN9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012060 Septin 9 Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037629 Serine/threonine-protein kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点及状态的检测体系，所述检测体系包括重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛检测体系a和重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛检测体系b。本发明还提供了一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点及状态的试剂盒。本发明具有可进行适宜检测人群评估、可检测CpG区域甲基化位点和甲基化程度且灵敏性高、特异性高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点的检测体系及试剂盒。
背景技术
Hippo信号通路由一系列保守激酶组成，是一条抑制细胞生长的通路，其主要通过调控细胞增殖和凋亡来控制器官的大小，除此之外其在肿瘤发生、干细胞等方面也发挥了重要的调控作用。YAP蛋白是Hippo信号通路下游主要效应分子，其作为一个转录调控因子，入核后与多种转录因子结合共同调控靶基因的转录表达来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡及维持肿瘤干细胞特性。经典Hippo信号通路激活的核心是SAV1结合激酶MST1/2促进下游激酶LATS1/2的磷酸化，激活的LATS1/2可对YAP蛋白127位的丝氨酸(S127)磷酸化，磷酸化的YAP一方面可与14-3-3蛋白结合被锚定在细胞质中，另一方面可被泛素化降解，YAP的入核受阻和降解增加则导致了细胞增殖降低和凋亡增加。SAV1蛋白在Hippo信号通路的激活中扮演了重要的作用，当其表达降低时Hippo信号通路激活受抑，细胞增殖增加凋亡减少。近来研究结果显示SAV1在多种肿瘤中表达下调，如肺癌、肾癌等。本课题组前期研究发现SAV1在肿瘤中的表达下调与SAV1基因启动子区甲基化增高相关。因此检测SAV1基因启动子区甲基化状态对于肿瘤的辅助诊断和预后评估具有积极作用。
DNA甲基化是一种重要的具有转录调节作用的表观遗传修饰方式，其能够在不改变DNA序列的前提下改变相应的遗传表现。所谓DNA甲基化是指甲基化转移酶在CpG二核苷酸的胞嘧啶C-5位上共价结合一个甲基将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶(5mC)的过程，DNA甲基化具有可逆性。在真核生物中，CpG双核苷酸以分散和高度集中两种形式存在于DNA序列中，以分散形式存在的CpG双核苷酸约70％～80％处于甲基化状态，而非甲基化CpG双核苷酸常以高度集中方式存在，称为CpG岛。CpG岛多位于基因的转录调控区域，有时也横跨至第一号外显子区域，其高甲基化状态会导致被调控基因的转录表达下调。1989年，Gardiner-Garden和Frommer首次提出了CpG岛的量化评估条件：长度大于200bp、GC含量高于50％和观测CpG与期望CpG的比率不低于0.6，目前已有多个网站可以进行在线CpG岛预测。启动子区CpG岛甲基化导致的抑癌基因沉默是多种肿瘤发生过程中的重要分子事件，因此抑癌基因启动子区甲基化检测在肿瘤辅助诊断和预后评估中的应用已经逐步开展，如结直肠癌中抑癌基因Septin9的甲基化检测。
目前的DNA甲基化检测技术包括了高效液相色谱检测技术、基于抗5mC抗体的免疫学检测技术、甲基化敏感的限制性内切酶-southern印记杂交技术、甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化测序检测技术、甲基化特异性寡核苷酸芯片检测技术等。然而由于成本高、技术复杂、标准化程度低等原因，在临床DNA甲基化检测中应用最多的技术还是MSP和甲基化测序检测技术两项，但MSP只能针对少数确定的甲基化位点进行检测而甲基化测序技术则可以检测一段DNA片段上的甲基化位点并做甲基化谱分析。因此在做个别基因启动子区CpG岛甲基化状态检测时，甲基化测序技术更为适用。
然而在建立针对具体基因启动子区CpG岛甲基化测序检测体系时往往存在以下困难：1、序列的变异性：由于不同种族间的基因组DNA差异，在目标检测区可能存在明显的序列差异性，因此仅根据NCBI参考序列设计的扩增引物体系可能存在适用性的问题从而影响扩增检出效率。2、PCR扩增困难：由于目标扩增区域为CpG岛区域，因此存在GC比例过高的问题，而过高的GC含量会导致目标DNA区域二级结构增加影响扩增成功率，同时过高的GC比例降低了序列的碱基平衡性，从而导致序列特异性下降，而针对此类序列设计的PCR引物其特异性也会下降，不但难于成功完成PCR扩增，而且即使扩增成功也可能扩增的片段并非所需扩增的目标片段。3、重亚硫酸盐处理后DNA序列特异性进一步下降且片段化：当高GC含量的CpG岛区域DNA经重亚硫酸盐转化处理后，CpG二核苷酸中的未甲基化的G均转化成了T，因此序列中的碱基构成进一步向T集中且重复序列和连续T的序列大大增加，这进一步加大了转化后的PCR扩增引物设计难度。除此之外因为CpG二核苷酸均为潜在的甲基化检测位点，因此在引物设计时也需要尽量避免涉及包含CpG二核苷酸的位置，如此可供引物设计的DNA区域十分有限，这为引物设计和优选带来很大障碍。重亚硫酸盐处理后DNA的片段化是另外一个问题，其不仅提升了PCR引物的设计难度而且还限制了目标扩增片段的大小，而其后扩增片段的Sanger测序其对PCR扩增片段的大小有一些基本要求，因为Sanger测序方法的特点测序引物后的50bp～100bp片段范围是不能有效测序的，所以如扩增片段过小则很难实现对重亚硫酸盐处理后DNA序列扩增产物的有效测序。
发明内容
发明目的：本发明目的在于针对以上SAV1基因启动子区甲基化检测需求、SAV1基因启动子区序列特征和甲基化测序方法建立存在的困难，提供一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点及状态的引物及检测体系及试剂盒。
技术方案：本发明提供一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点的引物，所述引物包括重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛一段式扩增引物a与测序引物a和重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛四段式扩增引物b与测序引物b。
所述扩增引物a包括第一加尾体系或第二加尾体系，所述第一加尾体系的上游引物为5'-CGCTATGTTACTCGGGACCACCATCTTGCATTCTTCCGTTT-3'，所述第一加尾体系的下游引物为5'-AGCGGCACGACTGACATCACTCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；所述第二加尾体系的上游引物为5'-CGCTATGTTACTCGGGACGACTTTGGTGTAGCACTTGCCT-3'，所述第二加尾体系的下游引物为5'-AGCGGCACGACTGACATCACTCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'。
所述测序引物a包括对应第一加尾体系的第三体系或对应第二加尾体系的第四体系，所述第三体系的上游引物为5'-TCTTGCATTCTTCCGTTT-3'，所述第三体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；所述第四体系的上游引物为5'-CTTTGGTGTAGCACTTGCCT-3'，所述第四体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'。
所述的扩增引物a与测序引物a可以完整扩增整个CpG岛区域并对其进行全覆盖测序，第二加尾体系及第四体系分别是第一加尾体系和第三体系的补充检测体系，当第一加尾体系和第三体系可能因序列异质性或其他原因不能成功扩增与测序时，可使用第二加尾体系及第四体系作为备用检测体系。
所述扩增引物b包括第一片段、第二片段、第三片段和第四片段，所述第一片段的上游引物为5'-AGGAAATATTAGGAAGAA-3'，所述第一片段的下游引物为5'-CAAATCCTACCGACTAA-3'和5'-CAAATCCTACCAACTAA-3'；所述第二片段的上游引物为5'-GAGGATGAGTGAGGATA-3'，所述第二片段的下游引物为5'-CACCAAACCAAAACCATAA-3'；所述第三片段的上游引物为5'-TGAGTAGTGTTGTAGA-3'，所述第三片段的下游引物为5'-CTAAACTACCTCCCTAAA-3'；所述第四片段的上游引物为5'-GAGTTTTAGGGAGGTAGTT-3'，所述第四片段的下游引物为5'-AACGAATACCACTTCAAACA-3'。
所述测序引物b包括对应第一片段的第五片段、对应第二片段的第六片段、对应第三片段的第七片段和对应第四片段的第八片段，所述第五片段的上游引物为5'-AGGAAATATTAGGAAGAATA-3'，所述第五片段的下游引物为5'-CAAATCCTACCGACTAAAA-3'和5'-CAAATCCTACCAACTAAAA-3'；所述第六片段的上游引物为5'-GAGGATGAGTGAGGATAGT-3'，所述第六片段的下游引物为5'-CACCAAACCAAAACCATAATC-3'；所述第七片段的上游引物为5'-TGAGTAGTGTTGTAGAG-3'，所述第七片段的下游引物为5'-TAAACTACCTCCCTAAAACTCC-3'；所述第八片段的上游引物为5'-GAGTTTTAGGGAGGTAGTTTAG-3'，所述第八片段的下游引物为5'-AACGAATACCACTTCAAACACAA-3'。
所述的扩增引物b和测序引物b可以分段扩增整个CpG岛区域并对其进行全覆盖测序。
所述的扩增引物b原则设计于CpG二核苷酸间隔区并避开变异区，而难以避开CpG二核苷酸的位点则采取兼并引物设计并实施了多对引物实验优选策略，同时对于个别难于避开的变异位点则依据位点实测变异结果及频率进行引物修订以提高检测成功率。为提高测序结果特异性，所述的测序引物b均采取内移错位式设计。针对转化后序列进行GC含量分析发现序列已转后为低GC含量序列，而对于此类序列也存在有复杂二级结构的可能性，经过对比使用常规PCR扩增体系的效果更好，使用无尾引物比使用加尾引物更好。
本发明还提供了一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点的检测体系，所述检测体系包括重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛检测体系a和重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛检测体系b。
所述检测体系a包括扩增反应体系a和测序反应体系a，所述扩增反应体系a的反应物体系为：Green Mix 10μl，权利要求1所述扩增引物a上、下游引物各1μl，样品DNA 30ng，DMSO 0.6μl，补水至20μl；所述测序反应体系a的反应物体系为：消化后的扩增反应体系a产物3μl，Bigdye 3.1为1μl，正向或反向权利要求1所述测序引物a 1μl、纯水2μl。
所述的扩增反应体系a的扩增引物a采取了加尾提高PCR扩增特异性的设计模式,而在保证了PCR反应特异性的前提下，测序引物a未采取内移错位式设计；同时该体系还使用了额外添加3％DMSO的特殊PCR扩增体系，该体系可有效解聚DNA区域的二级结构实现高GC区域的有效扩增。
所述检测体系b包括扩增反应体系b和测序反应体系b，所述扩增反应体系b的反应物体系为：Green Mix 10μl，权利要求1所述扩增引物b上、下游引物各1μl，样品DNA 30ng，补水至20μl；所述测序反应体系b的反应物体系为：消化后的扩增反应体系b产物3μl，Bigdye 3.1为1μl，正向或反向权利要求1所述测序引物b 1μl、纯水2μl。
优选地，所述扩增反应体系a的反应条件为：98℃，2min；98℃，10s；60℃，5s；72℃，90s；40个循环；72℃，7min。
优选地，所述测序反应体系a反应条件为：96℃，1min；96℃，10s；50℃，5s；60℃，4min；25个循环；12℃保温。
优选地，所述扩增反应体系a产物的消化处理方法为：扩增反应体系a扩增成功并经琼脂糖电泳鉴定后，取PCR产物5μl加入5μl SAP酶混合物中混匀，置37℃下1h，80℃下保温15min即可。
优选地，所述扩增反应体系b的反应条件为：针对第一片段和第三片段：98℃，2min；98℃，10s；51℃，5s；72℃，90s；45个循环；72℃，7min；针对第二片段和第四片段：98℃，2min；98℃，10s；57℃，5s；72℃，90s；45个循环；72℃，7min。
优选地，所述测序反应体系b的反应条件为：96℃，1min；96℃，10s；50℃，5s；60℃，4min；25个循环；12℃保温。
优选地，所述扩增反应体系b产物的消化处理方法为：扩增反应体系b扩增成功并经琼脂糖电泳鉴定后，取PCR产物5μl加入5μl SAP酶混合物中混匀，置37℃下1h，80℃下保温15min即可。
本发明还提供了一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点的试剂盒，所述试剂盒以细胞或组织样本DNA为模板，包括所述的检测体系。
本发明中，所述测序反应体系a的反应完成后利用醋酸钠乙醇纯化测序反应产物，将测序反应产物转移至96孔板上上机测序，测序所得序列与标准序列对比做序列差异性分析。通过该检测体系，可获得每个检测样品的标准对比序列，其相较于利用NCBI参考序列作为对比序列可有效避免个体间参考序列差异对结果分析带来的影响，同时利用该体系批量检测不同人群的SAV1基因启动子区CpG区域序列信息可分析该段DNA区域在不同人群中的变异度，并可评估所述试剂盒是否适用于相应人群，因为该发明涉及的重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛四段式扩增引物b与测序引物b设计是有意回避了该区段的变异区域的，但由于先前检测的人群和样本数量有限，所以该回避设计并非一定就避开了所有的高变区域，故所述试剂盒在首次应用于不同人群SAV1基因启动子区甲基化检测前可先利用重铬酸盐转化前检测体系a检测相应人群的目标DNA区域变异度以评估所述试剂盒的适用性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明具有可进行适宜检测人群评估、可检测CpG区域甲基化位点和甲基化程度且灵敏性高、特异性高的特点。
附图说明
图1为本发明实施例1步骤1中SAV1基因启动子区CpG岛预测示意图。
图2为本发明实施例1步骤1中SAV1基因启动子区CpG岛序列熔解温度分析图。
图3为本发明实施例1步骤3中重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR扩增与测序体系的建立示意图；其中，M为Novoprotein的DNA Ladder 2000Plus；NTC为阴性对照；1至6分别代表退火温度分别为51℃、54℃、57℃、60℃、63℃和66℃。
图4为本发明实施例1步骤4中SAV1基因启动子区CpG岛区域序列变异位点分布图；其中，浅灰色填充部分为CpG岛区域，深灰色填充部分为具体变异位点。
图5为本发明实施例1步骤6中重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛序列预测与特征分析图。
图6为本发明实施例1步骤8中转化后SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR与测序体系的建立示意图；其中，M为Novoprotein的DNA Ladder 2000Plus；M1为天根DNA Marker I；NTC为阴性对照；针对片段1和片段3标记1至6分别代表退火温度分别为39℃、42℃、45℃、48℃、51℃和54℃，针对片段2和片段4标记1至6分别代表退火温度分别为51℃、54℃、57℃、60℃、63℃和66℃。
图7为本发明实施例1步骤9中肺癌患者SAV1基因启动子区CpG岛区域检出的甲基化位点结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1
步骤1：SAV1基因启动子区CpG岛预测与序列特征分析
鉴于CpG岛一般位于基因启动子区和一号外显子区域，故在UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)搜索获得SAV1基因上游1000bp启动子区、第一号外显子和紧邻一号外显子的300bp第一号内含子区域序列，将三段序列拼合后获得全长为1758bp的待分析目标序列。利用http://www.urogene.org/、https://www.ebi.ac.uk/和http://www.softberry.com/网站在待分析目标序列上以默认分析条件(长度大于100bp或200bp、GC含量高于50％和观测CpG与期望CpG的比率大于0.6)预测CpG岛，三个网站给出的预测结果分别为673～1581(909bp)、673～1581(909bp)和746～1569(824bp)为CpG岛，综合分析后确定以673～1581(909bp)做为SAV1基因启动子区CpG岛，也即甲基化目标检测区域(如图1中A、B、C所示)。利用Oligo7软件分析发现CpG岛区域GC含量为70％，其平均熔解温度在60℃以上(如图2中A所示)，因此针对该段序列的PCR扩增具有特殊性。在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/和http://genome.ucsc.edu/网站分析该段序列变异情况时可见存在多种变异情况(如图2中B、C所示)，提示有必要检测此类变异在目标检测人群中的分布情况以利于试剂盒引物设计和适用人群评估。
步骤2：重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR与测序引物设计
鉴于SAV1基因启动子区CpG岛位置为高GC难扩增片段，因此在引物设计时采取了骑跨式设计，将上下游引物分别置于CpG岛难扩增片段两端，另使用引物加尾策略以提高PCR的特异性，同时利用在体系中添加助DNA解聚物的策略来实现有效的PCR扩增。依据以上设计原则和思路，利用Primer5.0软件设计了重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛区扩增引物a与测序引物a，鉴于扩增引物a已使用了加尾提高PCR扩增特异性的设计，因此配套测序引物a未采取内置错位设计。利用NCBI网站对引物进行Blast分析显示引物特异性良好。
其中，所述扩增引物a包括第一加尾体系或第二加尾体系，所述第一加尾体系的上游引物为5'-CGCTATGTTACTCGGGACCACCATCTTGCATTCTTCCGTTT-3'，所述第一加尾体系的下游引物为5'-AGCGGCACGACTGACATCACTCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；所述第二加尾体系的上游引物为5'-CGCTATGTTACTCGGGACGACTTTGGTGTAGCACTTGCCT-3'，所述第二加尾体系的下游引物为5'-AGCGGCACGACTGACATCACTCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'。
其中，所述测序引物a包括对应第一加尾体系的第三体系或对应第二加尾体系的第四体系，所述第三体系的上游引物为5'-TCTTGCATTCTTCCGTTT-3'，所述第三体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；所述第四体系的上游引物为5'-CTTTGGTGTAGCACTTGCCT-3'，所述第四体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'。
步骤3：重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR扩增与测序体系的建立
提取人293T细胞样品DNA，微量分光光度计测定核酸浓度，取30ng样品DNA为样品。首先利用所述的扩增引物a和无尾PCR引物同时对样品进行PCR扩增，扩增时扩增体系添加3％DMSO，同时扩增时利用梯度PCR仪比较不同退火温度对扩增的影响以筛选最优退火温度。具体扩增反应体系a：Green Mix 10μl，所述扩增引物a上下游引物各1μl(10μM)，样品DNA 30ng，DMSO 0.6μl，补水至20μl。具体反应条件：98℃，2min；98℃，10s，(51、54、57、60、63、66)℃，5s，72℃，90s，共40循环；72℃，7min。其中，所述无尾PCR引物包括第一无尾体系和第二无尾体系，所述第一无尾体系的上游引物为5'-TCTTGCATTCTTCCGTTT-3'，所述第一无尾体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'，所述第二无尾体系的上游引物为5'-CTTTGGTGTAGCACTTGCCT-3'，所述第二无尾体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'。
其中，产物电泳结果可见第一无尾体系在57℃-60℃范围内可见1206bp明亮扩增条带，其扩增效果最好，但其前后可见弱的非特异性条带；对应的第一无尾体系在51℃-63℃范围内可见1246bp清晰扩增条带且所有条带前后均未见非特异性扩增条带；第二无尾体系在51℃-63℃范围内可见1092bp明亮扩增条带，但所有温度梯度均可见多条明显非特异性扩增条带；对应的第二无尾体系在51℃-66℃范围内可见1132bp清晰扩增条带且所有条带前后均未见非特异性扩增条带(如图3中A所示)；该结果表明在以上两检测体系中，只有加尾体系可有效保证PCR扩增特异性片段的效率。其次，利用所述加尾扩增引物a对样品进行扩增，PCR反应系统分别使用添加3％DMSO的PCR反应体系a和常规PCR反应体系(DMSO由水取代，其他同PCR反应体系a，反应条件也同PCR反应体系a)。产物电泳结果显示第一加尾体系在添加3％DMSO的PCR反应体系a中可有效实现对样品的特异性扩增，而在常规PCR反应体系中加尾引物同样也不能实现有效扩增；第二加尾体系在添加3％DMSO的PCR反应体系a中同样可有效实现对样品的特异性扩增，但在常规PCR反应体系中则有明显的非特异性条带出现(如图3中B所示)。
分别取退火温度为60℃的第一加尾体系和第二加尾体系的PCR产物5μl加入5μlSAP酶混合物中混匀，置37℃下1h，80℃下保温15min。配制测序反应体系a：消化后的扩增反应体系a产物3μl、Bigdye 3.1为1μl、正向或反向测序引物a 1μl(10μM)、纯水2μl。测序反应条件：96℃，1min；96℃，10s；50℃，5s；60℃，4min；25个循环；12℃保温。测序反应完成后利用醋酸钠乙醇纯化测序反应产物，将测序反应产物转移至96孔板上上机测序。测序后将测序所得序列与UCSC获得的标准参考序列进行对比序列相符(如图3中C所示)，可见该SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR扩增与产物测序体系及备用体系已成功建立。综上所述，为保证扩增测序体系的覆盖性，最终确认选择第一加尾体系为重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR扩增与测序首选检测体系，第二加尾体系为备选检测体系。两检测体系的PCR扩增体系均确定为添加3％DMSO的PCR体系，PCR扩增条件确定为：98℃，2min；98℃，10s；60℃，5s；72℃，90s；共40循环；72℃，7min。PCR产物纯化体系与条件、测序反应体系与条件均统一为上文所述条件。
步骤4：华南地区人群中SAV1基因启动子区CpG岛区域序列变异性检测与分析
收集人肺正常上皮细胞BEAS-2B、人肺癌细胞H1299和广州医科大学附属肿瘤医院确诊的华南地区肺癌患者癌旁与癌组织样品38例，提取样品DNA后，利用该发明建立的SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR扩增与测序体系a成功完成对所有样品的检测分析。检测结果显示以UCSC的标准参考序列为标准，正常上皮细胞BEAS-2B、人肺癌细胞H1299和华南地区肺癌患者间的SAV1基因启动子区CpG岛区域存在明显的序列变异状态，共计发现变异位点8个，变异形式16种，变异主要集中在序列的664-1073区域范围(如图4，表1所示)，且BEAS-2B细胞、H1299细胞和华南地区肺癌患者间的序列变异模式间存在差别(如表1所示)。该结果提示，其一在进行该段序列分段检测时应充分考虑序列的变异性问题并应通过相应检测设计避免序列变异对检测成功率和检测结果造成影响，其二在对该区域进行检测时应考虑不同人群中该段DNA区域的变异性，并应进行检测试剂的适用性评估。
表1 SAV1基因启动子区CpG岛区域序列变异性检测结果
注：“-”表示无此变异位点或未检测到该变异类型；“√”表示某变异类型位于某个变异位点或某样品存在该变异类型；“/”表示无信息。
步骤5：样品DNA的重铬酸盐转化
样品DNA重铬酸盐转化试剂盒采用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Goldkit试剂盒。试剂准备：取6ml M-Wash Buffer加入24ml无水乙醇后混匀备用；在CTConversion管中依次加入900μl水、300μl M-Dilution Buffer和50μl M-DissolvingBuffer，震荡混匀10分钟待充分溶解后备用，尽量新鲜配置，使用前37℃孵育。样品DNA转化：将样品DNA稀释至100ng/μl浓度后，取20μl样品DNA加入130μl CT Conversion试剂应用液；将试剂样品混合液置98℃10min、64℃2.5h、4℃保温；先在IC Colum管中加入600μl M-binding Buffer后放入Collection Tube中，然后将上一步处理后的样品加入IC Colum管中，盖上管盖后颠倒混匀数次；1000g离心30s后倒掉Collection Tube中废液；加入100μlM-Wash Buffer后全速离心30s，倒掉Collection Tube中废液；加入200μlM-Desulphonation Buffer室温静置20min，全速离心30s，倒掉Collection Tube中废液；加入200μl M-Wash Buffer后全速离心30s，倒掉Collection Tube中废液，重复洗涤一次；另取一个洁净1.5ml离心管，将IC Colum管放入1.5ml离心管中，在IC Colum管中央加入10μl M-Elution Buffer，全速离心30s后弃IC Colum管，洁净1.5ml离心管中液体即为重铬酸盐转化后样品DNA，紫外分光光度计测转化后样品DNA浓度；所得样品DNA立即进行后续扩增或置-80℃储存备用。
步骤6：重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛序列特征分析
利用http://www.urogene.org/网站预测重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛序列(如图5中A所示)，并根据此预测序列进行转化后引物的设计。同时利用Oligo7软件分析预测的转化后序列发现在CpG岛区域的平均熔解温度仍然明显高于其他区域(如图5中B所示)，但整个序列的碱基构成则由转化前的高GC序列转变为了转化后的高AT序列，且其中T碱基的构成比例高达39.7％而C碱基构成比例则降至7.2％(如图5中C所示)。鉴于转化后序列4种碱基构成呈明显的偏态分布且平均熔解温度也较高，提示该段序列存在影响PCR扩增的二级结构和引物错误结合的可能性大，这为后续的PCR和扩增引物设计以及PCR反应体系的优化提出了新的挑战。
步骤7：重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR与测序引物设计
鉴于不同受检者的SAV1基因启动子区域CpG二核苷酸的甲基化状态是不确定的(也即未知的)，而用于重铬酸盐转化引物设计的序列仅是通过预测所得，同时重铬酸盐转化前在该区域检测到的序列变异在转化后也同样存在，因此在进行转后化PCR引物设计时选择了避开CpG二核苷酸和序列变异区域的基本设计方案，而在部分引物实在无法避开CpG二核苷酸序列时则另外使用了简并引物方案等以保证不引入检测误差，同时对于个别难于避开的变异位点则依据位点实测变异结果及频率进行引物修订以提高检测成功率。另因为重铬酸盐处理后会导致DNA链断裂，为了保证PCR能成功扩增、扩增范围能包含整个CpG岛区域和扩增产物有利于后续测序，转化后PCR引物在设计时采取了4段式设计且每段扩增片段的大小均在200bp～300bp范围之间，同时为了尽量减少数据遗漏，4个扩增片段的头尾尽量设计为了头尾部分重叠模式，但由于可用于引物设计DNA片段的局限，仅部分片段实现了头尾部分重叠。另鉴于转化后序列特征分析发现A\T\C\G四种核苷酸呈明显的偏态分布，这提示转化后序列的特异性明显下降，PCR扩增的特异性也受到影响，鉴于此该发明设计的转化后测序引物均采取了内置错位设计，该设计可保证即使出现部分PCR扩增特异性不好的情况，而最终还可以得到特异性的测序结果。
具体的引物包括重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛四段式扩增引物b与测序引物b；所述扩增引物b包括第一片段、第二片段、第三片段和第四片段，所述第一片段的上游引物为5'-AGGAAATATTAGGAAGAA-3'，所述第一片段的下游引物为5'-CAAATCCTACCGACTAA-3'和5'-CAAATCCTACCAACTAA-3'；所述第二片段的上游引物为5'-GAGGATGAGTGAGGATA-3'，所述第二片段的下游引物为5'-CACCAAACCAAAACCATAA-3'；所述第三片段的上游引物为5'-TGAGTAGTGTTGTAGA-3'，所述第三片段的下游引物为5'-CTAAACTACCTCCCTAAA-3'；所述第四片段的上游引物为5'-GAGTTTTAGGGAGGTAGTT-3'，所述第四片段的下游引物为5'-AACGAATACCACTTCAAACA-3'；所述测序引物b包括对应第一片段的第五片段、对应第二片段的第六片段、对应第三片段的第七片段和对应第四片段的第八片段，所述第五片段的上游引物为5'-AGGAAATATTAGGAAGAATA-3'，所述第五片段的下游引物为5'-CAAATCCTACCGACTAAAA-3'和5'-CAAATCCTACCAACTAAAA-3'；所述第六片段的上游引物为5'-GAGGATGAGTGAGGATAGT-3'，所述第六片段的下游引物为5'-CACCAAACCAAAACCATAATC-3'；所述第七片段的上游引物为5'-TGAGTAGTGTTGTAGAG-3'，所述第七片段的下游引物为5'-TAAACTACCTCCCTAAAACTCC-3'；所述第八片段的上游引物为5'-GAGTTTTAGGGAGGTAGTTTAG-3'，所述第八片段的下游引物为5'-AACGAATACCACTTCAAACACAA-3'。
步骤8：重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR与测序体系的建立
结合转化后序列特异性降低且链内二级结构可能增加的情况，虽然转化后序列GC含量降低但也属于特殊难扩增序列，所以在引物设计的同时还考虑通过加尾PCR引物(如表2所示)和添加解聚剂3％DMSO来尝试增加PCR扩增的成功率。同时根据不同扩增引物和对应扩增序列特征，不同扩增片段采取了不同的PCR反应条件。具体扩增反应体系：Green Mix10μl，所述扩增引物b上下游引物各1μl(10μM)，样品DNA 30ng，DMSO 0.6μl，补水至20μl。具体的对应反应条件为：①针对片段1和片段3：98℃，2min；98℃，10s，(51、54、57、60、63、66)℃5s；72℃，90s；共45循环；72℃，7min。②针对片段2和片段4：98℃，2min；98℃，10s，(39、42、45、48、51、54)℃，5s，72℃，90s，共45循环；72℃，7min。2％琼脂糖凝胶电泳结果显示针对4个扩增片段利用了加尾引物和添加了3％DMSO PCR反应体系的PCR之产物均未检出任何扩增片段(如图6中A所示)，利用了加尾引物和常规PCR反应体系的PCR之产物也均检出未任何扩增片段(如图6中B所示)，以上两个结果表明使用加尾引物扩增转化后SAV1基因启动子区CpG岛区域不仅不能增加PCR特异性，而且还可能因为空间位阻等问题导致扩增失败。而针对4个扩增片段利用了未加尾引物和添加了3％DMSO PCR反应体系的PCR之产物也均未检出任何扩增片段(如图6中C所示)，该结果提示PCR反应体系中添加解聚剂DMSO在扩增转化后SAV1基因启动子区CpG岛区域时对于加尾引物和无尾引物均未起到提高PCR扩增成功率的作用。最终利用未加尾引物和常规PCR反应体系的PCR之产物电泳结果可见4个片段均实现了单一目的片段的扩增，片段1的最适退火温度范围为39℃-51℃，以42℃-51℃最佳；片段2的最适退火温度范围为51℃-57℃，以54℃-57℃最佳；片段3的最适退火温度范围为48℃-51℃，以51℃最佳；片段4的最适退火温度范围为54℃-60℃，以57℃最佳(如图6中D所示)。最终重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR扩增体系选择未加尾引物即扩增引物b作为适用引物，PCR反应体系选择常规PCR反应体系，PCR反应条件确定为：①针对第一片段和第三片段：98℃，2min；98℃，10s；51℃，5s；72℃，90s；共45循环；72℃，7min；②针对第二片段和第四片段：98℃，2min；98℃，10s，57℃，5s；72℃，90s；共45循环；72℃，7min。
分别取退火温度为60℃的第一片段、第二片段、第三片段和第四片段的PCR产物5μl加入5μlSAP酶混合物中混匀，置37℃下1h，80℃下保温15min。配制测序反应体系a：消化后的扩增反应体系b产物3μl、Bigdye 3.1为1μl、正向或反向测序引物b 1μl(10μM)、纯水2μl。测序反应条件：96℃，1min；96℃，10s；50℃，5s；60℃，4min；25个循环；12℃保温。测序反应完成后利用醋酸钠乙醇纯化测序反应产物，将测序反应产物转移至96孔板上上机测序。测序后将测序所得序列与UCSC获得的标准参考序列进行对比序列相符，测序引物b也实现了针对片段的有效测序(如图6中E所示)。以上结果表明重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛区域PCR扩增与测序体系已成功建立。
表2重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛相应加尾PCR扩增引物
步骤9：华南地非小细胞肺癌患者肿瘤组织样品SAV1基因启动子区CpG岛甲基化检测
收集广州医科大学附属肿瘤医院确诊的华南地区非小细胞肺癌患者肿瘤组织3例，提取DNA后利用该发明建立的SAV1基因启动子区CpG岛甲基化检测体系检测3例肺癌SAV1基因启动子区CpG岛甲基化情况，结果显示检出4个甲基化位点(如图7所示)，具体位点与检出频率分别为：866CpG(1/3)，871CpG(2/3)，901CpG(1/3)，913CpG(2/3)。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
Claims (8)
1.一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛检测体系a和重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛检测体系b；
所述检测体系a包括扩增反应体系a和测序反应体系a，所述扩增反应体系a的反应物体系为：Green Mix 10μl，重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛一段式扩增引物a上、下游引物各1μl，样品DNA 30ng，DMSO 0.6μl，补水至20μl；所述测序反应体系a的反应物体系为：消化后的扩增反应体系a产物3μl，Bigdye 3.1为1μl，正向或反向重铬酸盐转化前SAV1基因启动子区CpG岛一段式测序引物a 1μl、纯水2μl；
所述扩增引物a包括第一加尾体系或第二加尾体系，所述第一加尾体系的上游引物为5'-CGCTATGTTACTCGGGACCACCATCTTGCATTCTTCCGTTT-3'，所述第一加尾体系的下游引物为5'-AGCGGCACGACTGACATCACTCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；所述第二加尾体系的上游引物为5'-CGCTATGTTACTCGGGACGACTTTGGTGTAGCACTTGCCT-3'，所述第二加尾体系的下游引物为5'-AGCGGCACGACTGACATCACTCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；
所述测序引物a包括对应第一加尾体系的第三体系或对应第二加尾体系的第四体系，所述第三体系的上游引物为5'-TCTTGCATTCTTCCGTTT-3'，所述第三体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；所述第四体系的上游引物为5'-CTTTGGTGTAGCACTTGCCT-3'，所述第四体系的下游引物为5'-TCTTATGGGCTTTCAATCAACGA-3'；
所述检测体系b包括扩增反应体系b和测序反应体系b，所述扩增反应体系b的反应物体系为：Green Mix 10μl，重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛四段式扩增引物b上、下游引物各1μl，样品DNA 30ng，补水至20μl；所述测序反应体系b的反应物体系为：消化后的扩增反应体系b产物3μl，Bigdye 3.1为1μl，正向或反向重铬酸盐转化后SAV1基因启动子区CpG岛四段式测序引物b 1μl、纯水2μl；
所述扩增引物b包括第一片段、第二片段、第三片段和第四片段，所述第一片段的上游引物为5'-AGGAAATATTAGGAAGAA-3'，所述第一片段的下游引物为5'-CAAATCCTACCGACTAA-3'和5'-CAAATCCTACCAACTAA-3'；所述第二片段的上游引物为5'-GAGGATGAGTGAGGATA-3'，所述第二片段的下游引物为5'-CACCAAACCAAAACCATAA-3'；所述第三片段的上游引物为5'-TGAGTAGTGTTGTAGA-3'，所述第三片段的下游引物为5'-CTAAACTACCTCCCTAAA-3'；所述第四片段的上游引物为5'-GAGTTTTAGGGAGGTAGTT-3'，所述第四片段的下游引物为5'-AACGAATACCACTTCAAACA-3'；
所述测序引物b包括对应第一片段的第五片段、对应第二片段的第六片段、对应第三片段的第七片段和对应第四片段的第八片段，所述第五片段的上游引物为5'-AGGAAATATTAGGAAGAATA-3'，所述第五片段的下游引物为5'-CAAATCCTACCGACTAAAA-3'和5'-CAAATCCTACCAACTAAAA-3'；所述第六片段的上游引物为5'-GAGGATGAGTGAGGATAGT-3'，所述第六片段的下游引物为5'-CACCAAACCAAAACCATAATC-3'；所述第七片段的上游引物为5'-TGAGTAGTGTTGTAGAG-3'，所述第七片段的下游引物为5'-TAAACTACCTCCCTAAAACTCC-3'；所述第八片段的上游引物为5'-GAGTTTTAGGGAGGTAGTTTAG-3'，所述第八片段的下游引物为5'-AACGAATACCACTTCAAACACAA-3'。
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述扩增反应体系a的反应条件为：98℃，2min；98℃，10s；60℃，5s；72℃，90s；40个循环；72℃，7min。
3.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述测序反应体系a反应条件为：96℃，1min；96℃，10s；50℃，5s；60℃，4min；25个循环；12℃保温。
4.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述扩增反应体系a产物的消化处理方法为：扩增反应体系a扩增成功并经琼脂糖电泳鉴定后，取PCR产物5μl加入5μl SAP酶混合物中混匀，置37℃下1h，80℃下保温15min即可。
5.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述扩增反应体系b的反应条件为：针对第一片段和第三片段：98℃，2min；98℃，10s；51℃，5s；72℃，90s；45个循环；72℃，7min；针对第二片段和第四片段：98℃，2min；98℃，10s；57℃，5s；72℃，90s；45个循环；72℃，7min。
6.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述测序反应体系b的反应条件为：96℃，1min；96℃，10s；50℃，5s；60℃，4min；25个循环；12℃保温。
7.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述扩增反应体系b产物的消化处理方法为：扩增反应体系b扩增成功并经琼脂糖电泳鉴定后，取PCR产物5μl加入5μl SAP酶混合物中混匀，置37℃下1h，80℃下保温15min即可。
8.一种用于检测SAV1基因启动子区甲基化位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以细胞或组织样本DNA为模板，包括权利要求1所述的检测体系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910885231.8A CN110734966B (zh) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | 一种用于检测sav1基因启动子区甲基化位点的检测体系及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910885231.8A CN110734966B (zh) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | 一种用于检测sav1基因启动子区甲基化位点的检测体系及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110734966A CN110734966A (zh) | 2020-01-31 |
| CN110734966B true CN110734966B (zh) | 2021-06-25 |
Family
ID=69268586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910885231.8A Expired - Fee Related CN110734966B (zh) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | 一种用于检测sav1基因启动子区甲基化位点的检测体系及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110734966B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113621691A (zh) * | 2021-09-27 | 2021-11-09 | 广东省妇幼保健院 | 基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的方法和试剂盒 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6927028B2 (en) * | 2001-08-31 | 2005-08-09 | Chinese University Of Hong Kong | Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA |
| CN106480169B (zh) * | 2015-09-01 | 2019-10-08 | 杨小丽 | 人aqp10和sox17基因甲基化位点的检测和应用 |
| CN108779487A (zh) * | 2015-11-16 | 2018-11-09 | 普罗格尼迪公司 | 用于检测甲基化状态的核酸和方法 |
| CN105483117B (zh) * | 2015-12-11 | 2019-04-30 | 广州医科大学附属肿瘤医院 | 一种提高聚合酶链式反应特异性的方法 |
| EP3443066B1 (en) * | 2016-04-14 | 2024-10-02 | Guardant Health, Inc. | Methods for early detection of cancer |
-
2019
- 2019-09-19 CN CN201910885231.8A patent/CN110734966B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110734966A (zh) | 2020-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yegnasubramanian et al. | Chromosome-wide mapping of DNA methylation patterns in normal and malignant prostate cells reveals pervasive methylation of gene-associated and conserved intergenic sequences | |
| EP3249051B1 (en) | Use of methylation sites in y chromosome as prostate cancer diagnosis marker | |
| JP2014505475A (ja) | ヒトの乳癌のエピジェネティックな肖像 | |
| SG175183A1 (en) | A method for screening cancer | |
| CN115516110A (zh) | 结直肠癌dna甲基化的检测方法及试剂 | |
| KR20230003560A (ko) | 대장암의 조기 발견, 치료 반응의 예측 및 예후 방법 | |
| CN107630093B (zh) | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 | |
| WO2020135861A1 (zh) | 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep4 | |
| Cao et al. | Genetic alterations in cfDNA of benign and malignant thyroid nodules based on amplicon-based next-generation sequencing | |
| CN110734966B (zh) | 一种用于检测sav1基因启动子区甲基化位点的检测体系及试剂盒 | |
| US20230175070A1 (en) | Tumor detection reagent and kit | |
| WO2009094312A2 (en) | Detection of gstp1 hypermethylation in prostate cancer | |
| WO2018211404A1 (en) | Composite epigenetic biomarkers for accurate screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
| CN106119361B (zh) | 用于胃癌早期诊断及预后评估的ndrg4基因甲基化检测的试剂盒及其应用 | |
| EP2550534B1 (en) | Prognosis of oesophageal and gastro-oesophageal junctional cancer | |
| EP2450455B1 (en) | Method for determining presence or absence of epithelial cancer-origin cell in biological sample, and kit therefor | |
| KR20210055281A (ko) | 대장암 검출 방법 | |
| Wu et al. | High-resolution genomic profiling of disseminated tumor cells in prostate cancer | |
| CN111440863A (zh) | Kazn基因甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用 | |
| Shi et al. | Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression | |
| CN110305961B (zh) | miR-1207及其靶基因在检测喉鳞癌中的应用 | |
| EP3775289A1 (en) | Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis | |
| KR102158726B1 (ko) | Itpr3 유전자 업스트림의 유전자간 영역을 포함하는 지연성 허혈 진단용 dna 메틸화 마커 조성물 | |
| KR102280363B1 (ko) | Sdc2 유전자의 메틸화 검출방법 | |
| WO2022188776A1 (zh) | 可用于胃癌her2伴随诊断的基因甲基化标记物或其组合和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210625 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |