JP4881850B2

JP4881850B2 - 血球抗原を遺伝子型特定する方法及び血球抗原を遺伝子型特定するために適したキット

Info

Publication number: JP4881850B2
Application number: JP2007506094A
Authority: JP
Inventors: ベイボエル，ジグリド，へルマ，ウィルマ; ウィエリンガ−ジェルスマ，ヘンドリカ; ダンネン，ヨハンネス，テオドルスデン; ハース，マシェンカデ
Original assignee: シュティヒティングサンクインブロエドフォールツィーニング
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2025-03-31
Also published as: ATE481503T1; DE602005023588D1; EP1730311A1; CN101027408A; WO2005095650A1; AU2005228297B2; EP1591534A1; EP1730311B1; CA2561353A1; PL1730311T3; AU2005228297A1; CN101027408B; ES2353022T3; US20080050727A1; JP2007530073A

Description

本発明は、血球抗原、より詳細には赤血球に対する抗原（血液グループ抗原）、血小板に対する抗原（血小板抗原）及び白血球に対する抗原（白血球抗原）を遺伝子型特定することの分野である。

本発明は、血球抗原を遺伝子型特定する方法及び血球抗原を遺伝子型特定するために適したキットを提供し、及び血球抗原を遺伝子型特定するために有用なプライマー及びプローブのセットを提供する。

ドナーから得られた血液又は血液画分（例えば、赤血球（red blood cells、erythrocytes又はred cells）、血小板（platelets、thrombocytes）及び白血球（white blood cells、leukocytes）が他のヒトに（又はより一般的に他の哺乳動物個体に）投与される場合において、該ドナー血液又は血液画分が受取者の血液と適切に一致しない場合、重篤な拒絶反応が生じうる。例えば血液グループＡのドナーからの血液が血液グループＢのヒトに与えられた場合に、輸血反応（凝集）が生じることは周知である（血液グループ抗原Ａ及びＢはＡＢＯシステムに属する）。リーサス（rhesus）Ｄ（ＲｈＤ）陽性ドナーの血液がＲｈＤ陰性患者に与えられる場合、同種異系抗体形成が生じる高い可能性がある。ＲｈＤ抗体は、ＲｈＤ陽性赤血球の迅速な破壊及び輸血反応をもたらすだろう。その上、赤血球抗体又は血小板抗体を有する女性が妊娠する場合、それらの抗体は、胎盤と交差することができ、そして胎児の赤血球又は血小板を破壊しうる。これは、貧血、黄疸（誕生後）をもたらす重篤な溶血をもたらすることができ、そして治療されない場合、それは致命的でありうり又は脳障害をもたらしうる。従って、輸血反応を避けるために、現在の輸血方針は、ＡＢＯ及びＲｈＤ一致した赤血球のみを輸血することである。妊娠可能年齢における女性について、妊娠の間にありうる合併症を有する同種異系抗体を避けるために、ＡＢＯ、ＲｈＤ及びＫ１一致した赤血球のみが輸血される。今後、恐らく、Ｒｈｃ及びＲｈＥ一致した赤血球がまた、妊娠可能年齢における女性に与えられるだろう。

しかしながら、様々な他の血液グループ抗原（赤血球抗原）が存在し、そしてこれらはまた、一致しないドナー血液が同種異系抗体を有する受取者に与えられる場合に重篤な問題を生じうる。異なる同種免疫血小板減少症候群が生じうる故に、血小板特異的抗原を型特定することは、患者の診断及び治療のために重要である。女性が、抗血小板抗体（ほとんどの場合、ヒト血小板抗原（ＨＰＡ）１ａ型抗体）を進展し、そして妊娠の間にほとんど進展した場合、これら抗体は、胎児において、増加した出血傾向を有する致命的な血小板破壊をもたらしうるだろう。多くの場合、これは頭蓋内出血をもたらすだろう。出血を防ぐために、ＨＰＡ−１ａ陰性血小板が輸血される必要がある。

血小板は、ドナー及び受取者の血小板抗原［ヒトにおけるヒト血小板抗原（ＨＰＡ）］の前もっての型特定なしに通常輸血される。一致しない血液又は血液画分の輸液は、特に頻繁の又は反復の赤血球又は血小板（又は白血球）輸血を必要とする患者において、同種異系抗体の生成を生じうる。複数の同種異系抗体が形成された場合、又は同種異系抗体が高頻度抗原に対して方向付けられる場合、それは相容性の赤血球又は血小板を見つけるための問題でありうる。公表された研究(Seltsam等、2003年)によれば、輸液支援は、高頻度抗原への抗体を有する入院患者のおよそ３分の１において不十分だった。

血液グループ抗原及び抗体について試験するための古典的な方法は、血球凝集試験による表現型特定である。この血清試験の技術は簡単且つ安価であるが、その費用及び困難性は、多重アッセイが完全な型特定のために行われる必要があり且つそれが多くの特定の抗血清の有用性を要求する場合に増加する。オランダ単独では、血液ドナーの総数は、ほぼ500,000人程度の大きさであり、それは、ドナーの数が約60,000の新規ドナーで毎年増加すると見積もられている。赤血球について、少なくとも２９の血液グループ抗原システムがある（それぞれは、多くの異なる対立遺伝子を有する）。その上、それは高頻度抗原及び低頻度抗原のための型特定をすることに関連するだろう。臨床的に関連する血球抗原システムの数は、約６０である。それ故に、全ての血液ドナーの完全な表現型特定は高価であり、骨の折れることであり、時間の掛かることであり、そして十分な型特定試薬の欠如によって実現可能でない。

ほとんどの血球抗原システムについての分子的機序は知られている。ほとんどの血球グループ抗原、血小板抗原及び好中級抗原は、２対立遺伝子（bi-alleic）であり且つ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の結果である。これらＳＮＰは、遺伝子型特定をするために使用されうる。無数のＤＮＡに基づくアッセイは、血液グループ抗原及び血小板抗原の遺伝子型特定のための科学的文献に記載されている。これらは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、単一又は多重アッセイとして配列特異的ＰＣＲ、実時間量的ＰＣＲ（real-time quantitative PCR）、単一ヌクレオチドダイターミネーター伸張方法（a single-nucleotide dye terminator extension method）及び高スループットビーズ技術を含む（Reidによって概説された、2003年）。質量スペクトロフォトメーター又はピロシークエンサー（pyrosequencer）を使用する半自動方法がまた、遺伝子型特定のために使用されうる。

例えばRanden等（2003年）は最近、LightCycler技術を使用して融解曲線分析（melting curve analysis）によってヒト血小板抗原1、2、3、4、5及びGov（最近、ＨＰＡ−１５と呼ばれる、Metcalfe等、2003年）の遺伝子型特定を開示した。２対立遺伝子（biallelic）システムＨＰＡ−１〜５及びGovは、疾病に最頻に関与するものであり（Berry等、2000年）、それらを遺伝子型特定のための重要なターゲットとする。LightCycler技術は、上記血小板抗原の各々のための特定のプライマー対を使用してＰＣＲによってドナーＤＮＡの、関連したフラグメントの増幅を含む。蛍光ハイブリダイゼーションプローブ及び融解曲線分析を使用することによって、初期の遺伝子型特定方法論の骨の折れる且つ時間を消費するゲル電気泳動の必要なしに、同じキャピラリー内の血小板抗原の両方の対立遺伝子の同時検出を達成することが可能だった。

しかしながら、血球抗原遺伝子型特定方法を記載した全ての他と同様に、またLightCycler技術は血液ドナーの完全な遺伝子型特定の巨大な仕事を実行できず、それは高スループットスクリーニングに適している方法論を要求するだろう。６０個の血液グループ抗原及び血小板抗原についての２つの異なる寄贈後に毎年60,000人のドナーを型特定することは、１年当たり７００万を超える型特定又は１週間当たり約140,000の型特定試験を含むだろう。迅速且つ信頼できる適切な高スループット方法は、この仕事のために極めて望ましい。

多重ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術は、それが１９８０年代に導入された以来、非常に開発されてきた。Chamberlain等（1988年）は、（ゲノム）ＤＮＡ内の多重遺伝子座の増幅のための一般的な技術として多重ＰＣＲを教えた。本明細書では、１つの遺伝子座の増幅のための１つのプライマー対の代わりに、より多くのプライマー対が１つの反応混合物中に追加される。しかしながら、そのような多重ＰＣＲの開発は、増幅反応の複雑さによって制限される。反応成分及びサイクル条件は、プライマーの各追加の対のために調節されなければならない。Shuber等（1995年）は、この問題を避けるために、「キメラ」配列特異的プライマーを導入した。これらプライマーは、テンプレートＤＮＡに相補的であり且つ５’末端に、関係ない２０個のヌクレオチドタグ（ユニバーサル配列）を含む。プライマーの予測された融解温度が他のプライマーのそれと同様であり且つ−１０ｋｃａｌ／モルより低いプライマー２重化（primer duplexing）のために計算されたΔＧを有するような様式で該プライマーが設計されたけれども、該プライマーの濃度はＰＣＲ生成物の同様の収率を得るためになお調節される必要がある。この問題を避けるために及びまたプライマーダイマー形成をさらに避けるために、Belgrade等（1996年）は、キメラプライマーの制限された量（2 pmol）のみ適用され、そして１５回のＰＣＲサイクル後にユニバーサルプライマーの過負荷を追加した。次に、熱サイクルは、より低いアニール温度でさらに２５サイクルで進められた。Brownie等（1997年）は、最初に該ＰＣＲ反応混合物中に既にユニバーサルプライマーを含んでいた。４サイクルのＰＣＲ後に、アニール温度は６０℃〜７４℃に上昇され、そしてされに３５サイクルのＰＣＲが実行される。さらに、入れ子ＰＣＲ（nested PCR）がHeath等（2000年）によって教えられ、彼は、第２のＰＣＲにおいて、２つの（相補的な）ユニバーサルプラマー（それらのうちの１つは５’末端に付けられた蛍光タグを運ぶ）を適用した。

これまで、多重ＰＣＲは、対立遺伝子特異的増幅のために、比較的小さなセットのプライマー対を用いて使用されているのみである。多くの血球抗原を遺伝子型特定する方法において多重ＰＣＲを使用することの実現可能性だけでなく、そのような血球抗原遺伝子型特定のために適しているＰＣＲ条件及びプライマー混合物の性質もまた、臨床的に関連する血球抗原遺伝子型特定を割り当てるための増幅の生成物を解析するための実務的な、迅速な及び信頼できる方法もまた、従来技術に記載されていない。

ＤＮＡマイクロアレイ
マイクロアレイ技術を使用する幾つかのアプローチが、遺伝子型特定の一般的な分野において知られている。これらアプローチのうちの１つは、所謂最小配列方法であり、それはマクロアレイ上に又は溶液中のいずれかで対立遺伝子特異的伸張を含む(Pastinen等、1997年；Fan等、2000年)。このアプローチにおける困難は非特異的プライマー伸張の発生であり、及びプライマーの更なる最適化又は伸張方法それ自身が必要である(Pastinen等、2000年；Lindroos等、2002年)。その上、この方法は、酵素的処理及び精製の骨のおれる工程を必要とする。

別のアプローチはマイクロアレイ上での対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハブリダイゼーション(ASO、allele-specific oligonucleotide hybridization)と呼ばれる。このアプローチは、ターゲットの熱安定性及び遺伝子型決定のための短いオリゴヌクレオチドプローブに依存する(Hacia等、1996年；Wang等、1998年)。第１の光生成されたオリゴヌクレオチドアレイ（light-generated oligonucleotide arrays）は、1991年に開発された(Fodor等)。該方法は、新規なＳＮＰの決定のために又は再配列決定のために使用された。それはまた、患者サンプルから得られたＰＣＲ増幅生成物をアレイ内にスポットし、そして該アレイをアレイ特異的オリゴに接触して、患者の対立遺伝子を見分けることによって遺伝子型特定するために使用された(Evans等、2002年)。多くの変形が、感受性又は特異性を改善するために、酵素、ナノ粒子プローブ、人工ヌクレオチド、温度勾配、フロースルーアレイ、ブロッキングオリゴヌクレオチドの様な種々の種類のツールを使用して記述された(Lu等、2002年；Park等、2002年；Prix等、2002年；Kajiyama等、2003年；Jobs等、2003年；Van Beuningen等、2001年；Iwasaki等、2002年)。Wen等(2000年)は、慣用のＤＮＡ配列分析を用いてＴＰ５３変位のオリゴヌクレオチドアレイ分析の感受性及び特異性の比較をした。使用されるオリゴヌクレオチドアレイは、ＳＮＰ当たり複数のプローブを含んでいた。マトリックス支持体（通常、ガラススライド）へオリゴを固定化するために、該プローブはスペーサー及びアミン基を用意されうる(Guo等、2001年；Wen等、2003年)。様々なマイクロアレイフォーマットが、スループットを改善するために、例えばアレイ当たり２５０個のスポットを含む９６個のマイクロアレイフォーマットを有するスライドで記述された(Huang等、2001年)。フロースルーシステムは、ハイブリダイゼーションタイムを減少するために記述され、それによってスループットを増加する(Cheek等、2001年；Van Beuningen等、2001年)。

これまでは、ＤＮＡマイクロアレイ方法は、血球抗原を遺伝型特定するために適用されていず、及び多くの血球抗原を遺伝子型特定する方法においてＤＮＡマイクロアレイを使用することの実現可能性だけでなく、そのような血球抗原遺伝子型特定に適しているオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイフォーマットの性質も、臨床的に関連する血球抗原遺伝子型特定を割り当てるためにハイブリダイゼーション結果を分析するための実用的な、迅速な且つ信頼できる方法も先行技術文献に記載されていない。

本発明の目的は、多くの血球抗原の実用的な、迅速な且つ信頼できる遺伝子型特定を可能にする方法及び手段を提供することである。

本発明の別の目的は高スループット技術を開発することであり、それは、全体の既存のドナー集団の遺伝子型特定及び／又はほぼ２０の大きさ程度、最終的にさらにおよそ６０個の血球抗原システムにおける多くの血球抗原のためのドナー集団増加を可能にし、それによって正確なドナー血液の選択を容易にし、且つ輸血の安全性を改善する。

さらに、本発明の別の目的は、関連するＤＮＡフラグメントを同時に増幅し且つ検出可能にラベル付けするために、単一反応チューブ内で１つのＰＣＲ反応に付された単一ＤＮＡサンプル上に、短い時間、例えば３０分未満、又は２４時間未満、好ましくは６時間未満及びより好ましくは２時間未満、またはさらに好ましくは１時間未満で簡単な装置を使用して、臨床的に関連する血球抗原の大多数を少なくともカバーする。

これら目的は本発明によって達成され、それは、１つの観点では、血球抗原を遺伝子型特定する方法であって、哺乳動物種の個体からのＤＮＡを多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付して、前記血球抗原のヌクレオチド多型の部位を含む少なくとも２つの異なる血球抗原の遺伝子座の領域を増幅し且つ検出可能にラベル付けすること、そしてこのようにして増幅され且つラベル付けされたＤＮＡフラグメントを使用して前記血球抗原のそれぞれについて遺伝子型を決定することを含み、前記多重ＰＣＲは、遺伝子型特定されるべき各血球抗原のための少なくとも１つの対の血球抗原特異的キメラプライマーと、少なくとも１つの検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーとの使用を含み、前記少なくとも１つのユニバーサルプライマーは前記哺乳動物種のＤＮＡにおいて生じないユニーク配列を有し、各キメラプライマー対は左キメラプライマーと右キメラプライマーとを含み、それらの夫々は３’末端に血球抗原特異的部分及び５’末端にユニバーサル部分を含み、前記キメラプライマーの前記ユニバーサル部分の塩基配列は前記少なくとも１つのユニバーサルプライマーの塩基配列に対応し、前記キメラプライマー対の前記血球抗原特異的部分は前記血球抗原のヌクレオチド多型の部位を含む血球抗原の遺伝子座の領域を囲むところの方法を提供する。

本発明の方法において、前記哺乳動物種の前記ＤＮＡにおいて生じないユニーク配列を有する検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーの対が使用され、各キメラプライマー対について前記キメラプライマー対の一つのメンバーの前記ユニバーサル部分の前記塩基配列が前記ユニバーサルプライマー対の一つのメンバーの前記塩基配列に対応し、前記キメラプライマー対の他のメンバーの前記ユニバーサル部分の前記塩基配列が前記ユニバーサルプライマーの前記他のメンバーの前記塩基配列に対応することが好ましい。

さらに、多重ＰＣＲ増幅の生成物を変性後、ＤＮＡアレイに含まれる又は任意の他の形状（例えば、ビーズ上に支持される）で存在する血球抗原対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし、そしてハイブリダイゼーションパターンを解析することによって、前記血球抗原の夫々についての遺伝子型が決定されることが本発明において強く好ましい。

本明細書で定義される方法によって血球抗原を遺伝子型特定するためのキットであって、遺伝子型特定されるべき各血球抗原のための血球抗原特異的キメラプライマーの少なくとも１つの対、及び検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーの１つの対（両方が本明細書において定義される）を含むキットを提供する。

本発明はさらに、多重ＰＣＲにおいて有用な血球抗原特異的キメラプライマー対のセット、及び血球抗原を遺伝子型特定するために有用な血球抗原対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのセットを提供する。

図面の簡単な説明
図１は、ユニバーサルＭＡＰＨプライマーの存在ある又はなしの、１９個の血液グループ抗原の多重ＰＣＲの結果を示す。非常に少量のＰＣＲ生成物が最初の増幅サイクルの間に増幅されるが（レーン２）、次のサイクルにおいてユニバーサルＭＡＰＨプライマーによってテンプレートとして使用されるに十分である。該ＭＡＰＨプライマーは実際の増幅を実行し（レーン３）、従って、プライマー濃度の調製がほとんど必要なく、及びＰＣＲ生成物の同様の収率が得られる。

図２は、本発明において記載される１９個の血液グループ抗原の多重ＰＣＲからの、ＡＢＩ毛細管シーケンサーを用いて得られたパターンを示す。

図３は、６個のドナーサンプルのハイブリダイゼーションのスキャン結果を示し、夫々は６個のヒト血小板抗原１〜５及びGovＰＣＲ生成物を含む。１つのサンプルのＰＣＲ生成物は、２つのアレイ（４個のブロックである）にハイブリダイゼーションされた。オリジナルスキャンは、赤いスポット及び黒いバックグラウンドを有する。よりよい視覚化のために、これはグレースケールに変更されて、反転される。

本発明は、血球抗原を遺伝子型特定する方法であって、哺乳動物種の個体からのＤＮＡを多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付して、前記血球抗原のヌクレオチド多型の部位を含む少なくとも２つの異なる血球抗原の遺伝子座の領域を増幅し且つ検出可能にラベル付けすること、そしてこのようにして増幅され且つラベル付けされたＤＮＡフラグメントを使用して前記血球抗原のそれぞれについて遺伝子型を決定することを含み、前記多重ＰＣＲは、遺伝子型特定されるべき各血球抗原のための少なくとも１つの対の血球抗原特異的キメラプライマーと、少なくとも１つの検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーとの使用を含み、前記少なくとも１つのユニバーサルプライマーは前記哺乳動物種のＤＮＡにおいて生じないユニーク配列を有し、各キメラプライマー対は左キメラプライマーと右キメラプライマーとを含み、それらの夫々は３’末端に血球抗原特異的部分及び５’末端にユニバーサル部分を含み、前記キメラプライマーの前記ユニバーサル部分の塩基配列は前記少なくとも１つのユニバーサルプライマーの塩基配列に対応し、前記キメラプライマー対の前記血球抗原特異的部分は前記血球抗原のヌクレオチド多型の部位を含む血球抗原の遺伝子座の領域を囲むところの方法を提供する。

より詳細には、本発明は、血球抗原を遺伝子型特定する方法であって、哺乳動物種の個体からのＤＮＡを多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付して、前記血球抗原のヌクレオチド多型の部位を含む少なくとも２つの異なる血球抗原の遺伝子座の領域を増幅し且つ検出可能にラベル付けすること、そしてこのようにして増幅され且つラベル付けされたＤＮＡフラグメントを使用して前記血球抗原のそれぞれについて遺伝子型を決定することを含み、前記多重ＰＣＲは、遺伝子型特定されるべき各血球抗原のための少なくとも１つの対の血球抗原特異的キメラプライマーと、検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーの１つの対との使用を含み、前記対のユニバーサルプライマーは、夫々が前記哺乳動物種のＤＮＡにおいて生じないユニーク配列を有するところのフォワードユニバーサルプライマーとリバーサルユニバーサルプライマーとを含み、各キメラプライマー対は左キメラプライマーと右キメラプライマーとを含み、それらの夫々は３’末端に血球抗原特異的部分及び５’末端にユニバーサル部分を含み、これらキメラプライマーの１つのうちのユニバーサル部分の塩基配列は１つのユニバーサルプライマーの塩基配列に対応し且つ他のキメラプライマーの前記ユニバーサル部分の塩基配列は前記他のユニバーサルプライマーの塩基配列に対応し、及び前記キメラプライマー対の前記血球抗原特異的部分は前記血球抗原のヌクレオチド多型の部位を含む血球抗原の遺伝子座の領域を囲むところの方法を提供する。

本発明は、前記目的を達成することを一緒に可能にする工程の特定の順序を含む。工程のこの順序は、本発明の遺伝子型特定分析に付されるべきサンプルからのＤＮＡの単離、引き続き本発明の主要な観点、血球抗原相違を担う単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を運ぶ遺伝子フラグメントの多重ＰＣＲを含む。この多重ＰＣＲは、２以上の対のキメラプライマーを含み且つさらにラベル付けされたユニバーサルプライマー又は１つの対のラベル付けされたユニバーサルプライマーを含む、種々のプライマーの混合物を適用する。次に、このようにして増幅され且つラベル付けされたＤＮＡフラグメントは（例えば熱によって）変性され、そして一致する配列間でハイブリダイゼーションを支援する条件下で、好ましくは多数の対立遺伝子特異的プローブを含むマイクロアレイ中に含まれている一組のプローブに接触される。次の工程では、ラベル付けされたフラグメントの存在がマイクロアレイ中の各スポットについて測定され、そして最終的に測定されるシグナルがサンプルを型特定するために解釈される。該プローブは、他の形式（例えば、ビーズ上に支持されたプローブ（ガラスビーズ、ポリスチレンビーズなど）又は適切な容器の壁に付着されたプローブなど）でまた表されうる。しかしながら、アレイ形式は最も好ましい実施態様である。

種
本発明は、ヒトだけでなく、血球抗原システムを有する全ての動物の血球抗原の遺伝子型特定を可能にする。全ての実用的な目的のために、遺伝子型特定は、例えば家畜及びペット、野生動物、並びに経済的、感情的又は野生的保存価値の一般的な全ての動物を含む、哺乳動物の血球抗原に関連するだろう。しかしながら、より好ましくは、本発明は、ヒト血球抗原の遺伝子型特定に関する。

血球抗原
本発明によって遺伝子型特定されうる血球抗原は、典型的な血球グループ抗原、例えばキッド（Kidd）、ダッフィ（Duffy）、ケル（Kell）及びリーサス（Rhesus）を含む。ＡＢＯシステムの血球グループ抗原は、本発明によって同様に遺伝子型特定されうる。しかしながら、それは、それらの極端な重要性のために、既存の且つ十分に受け入れられた血清学試験を実行するために必要でありうる。本発明によって遺伝子型特定されうる他の血球抗原は、血球グループシステム、MNS、リーサス（Rhesus）(Rh)、ケル（Kell）、キッド（Kidd）、ダッフィ（Duffy）、コルトン（Colton）、ディエゴ（Diego）、ドンブロック（Dombrock）、ルテラン（Lutheran）、ルイス（Lewis）、カートライト（Cartwright）、ランドシュタイナーウィーナ（LandsteinerWiener）(LW)、クローマー（Cromer）、ノップ（Knops）、Kx、インディアン（Indian）、ジェルビッチ（Gerbich）、Hh、シド／ロジャーズ（Chido/Rodgers）、GIL、I、JMH、OK、P-related、RAPH-MER2、シエナ（Scianna）、Xg、YTなどの遺伝子サイレンシングをもたらす抗原変異体及び／又は遺伝子変異体を含む。

血液グループ抗原に加えて、また血小板抗原及び白血球（特に好中球）抗原は、本発明の方法によって遺伝子型特定されうる。少なくとも西洋世界において、臨床的に、最も関連した血小板抗原は、HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5及びGov（すなわちHPA-15）を含む。本発明によって遺伝子型特定されうる他の血小板抗原は（それらがより重要でないと思われるけれども）、例えばヒト血小板抗原６〜１４及び１６を含む。本発明の方法によって遺伝子型特定されうる典型的なヒト好中球抗原の例は、HNA-1、4及び5を含む。他のもの、例えばHNA-2及び3は、それらの分子的機序が解明されると直ちに、遺伝子型特定されうる。

制限された数の血球抗原が遺伝子型特定される場合のみでさえ、本発明は有用であることが考えられる。赤血球抗原のみ、又は血小板抗原のみ、若しくはある文脈に関連する選択されたグループの抗原のみが遺伝子型特定されることが幾つかの目的のために十分でありうる。本発明によって遺伝子型特定されるべき血球抗原の最小値は、２個の血球抗原、例えば血球抗原RhD及びRHD遺伝子変異体RhDΨ、又は血球抗原JK1/2(Jk^a/Jk^b)及び血球抗原FY1/2 (Fy^a/Fy^b)である。多くの血球抗原の遺伝子型特定が明らかに好ましく、例えば３、４、５及び特に６以上である。しかしながら、ほとんどの目的のために、臨床的に関連する血球抗原の殆どを少なくともカバーする多かれ少なかれ完全な遺伝子型特定が好ましい。しかしながら、ほとんどの目的のために、臨床的に関連する血球抗原のほとんどを少なくともカバーする多かれ少なかれ完全な遺伝子型特定が好ましい。最も好ましくは、本発明は、HPA1〜5及びHPA-15に特異的な少なくとも６個の異なるキメラプライマー対、及び赤血球抗原、例えば様々なキッド（Kidd）、ダッフィ（Duffy）、ケル（Kell）及びリーサス（Rhesus）抗原に特異的な少なくとも１０又は１１又は１２個のキメラプライマー対を含む。

ＤＮＡ
多重ＰＣＲに付されるＤＮＡは、その赤血球抗原が遺伝子型特定されるところの個々のゲノムＤＮＡで通常あるだろう。

ドナーＤＮＡは、単離手法及び当業者に良く知られた手段、例えば商業的に入手可能なQiagen Blood DNA抽出キットを使用して、例えば、Miller等（1988年）の標準プロトコルによる塩析方法を使用して、又はRoche Magnapureを使用して、何らかの適切な起源から（例えば、EDTA、ヘパリン若しくはシトレート処理された血液サンプル又は軟膜から）得られうる。

ユニバーサルプライマー
本発明の方法は、検知可能なラベルを運ぶ少なくとも１つのユニバーサルプライマー、好ましくは検出可能なラベルを運ぶ１つの対の両方のユニバーサルプライマーを使用する。ユニバーサルプライマーの配列は、キメラプライマーの５’末端でのユニバーサル部分の配列と一致する。１個のみのユニバーサルプライマーを使用することが可能である。その場合では、全てのキメラプライマーがそれらの５’末端に同一の塩基配列を有し、すなわちキメラプライマーの５’末端でのユニバーサルプライマーは前記単一のユニバーサルプライマーの配列と一致する。しかしながら、実際に、２個の異なるプライマー（すなわち、１つの対のユニバーサルプライマー）を使用することが好ましいことがわかった。その場合、各対のキメラプライマーは、１つのユニバーサルプライマーと一致するユニバーサル部分を有するプライマー及び他のユニバーサルプライマーと一致するユニバーサル部分を有するプライマーを含む。

ユニバーサルプライマーは、遺伝子型特定されるべきＤＮＡにハイブリダイゼーションしないことが重要である。遺伝子型特定されるべきＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡであると仮定して、ユニバーサルプライマー（及びキメラプライマーの対応する部分）はヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションすべきでなく、それ故に該ＤＮＡにおいて生じないユニーク配列を有する。好ましくは、ユニバーサルプライマーの配列は、ヒトゲノムにおいて生じない任意の配列と有意に異なる。さらに、ユニバーサルプライマーがそのＴｍ値がキメラプライマーの血球抗原特異的部分のＴｍ値と同様であるように設計されることが強く好ましい。好ましくは、ユニバーサルプライマーのＴｍ値は、５０〜７０℃の間、より好ましくは５６℃〜６８℃の間である。ユニバーサルプライマーが、１２〜３０塩基の間、より好ましくは１５〜２５塩基の間、又はさらにより好ましくは１６〜２０塩基の間の長さを有することがまた好ましい。

非常に良い結果が、White等(2002年)において開示され、67.55℃のＴｍを有する配列ggccgcgggaattcgatt (SEQ ID NO:1、フォワードMAPH)及び57.94℃のＴｍを有する配列gccgcgaattcactagtg (SEQ ID NO:2、リバースMAPH)を有するユニバーサルプライマーで得られた。

検出可能なラベル
ユニバーサルプライマーは、検出可能なラベルを運ぶ。該ラベルは、目的のために適した何らかのラベル、例えば放射性原子又は基、酵素（例えば、それらの基質の測定可能な転化を触媒する酵素）、染料、蛍光物質、化学発光物質、ビオチンなどでありうる。最も好ましくは、該ラベルは蛍光基であり、それらの多くは当業者に知られている。それらの例は、Cy3、Cy5、フルオレセイン(FITC)、フィコエリトリン(PE)、ローダミン、Hex、Tet、Famなどである。

最も好ましくは、本発明は、蛍光基Cy5を使用し、それはスルフォインドシアニン染料である(Mujumdar等、1993年)。

通常、特に、該ラベルがオリゴヌクレオチドに付けられた残基である場合、それは、ユニバーサルプライマーのオリゴヌクレオチド配列の５’末端に付けられるだろう。

ユニバーサルプライマーがラベル付けされ、一方キメラプライマーがラベル付けされないので、本発明は増幅と同時にラベル付けすることを非常に効率的に達成し、一方様々なキメラプライマーが事前のラベル付けなしに使用されうる。

キメラプライマー
本発明で使用されるキメラプライマーは、それらの５’末端にユニバーサルプライマー及びそれらの３’末端に血球抗原特異的部分を有する。ユニバーサル部分のオリゴヌクレオチド配列は、ユニバーサルプライマーの配列と一致し、そして本明細書ではさらなる説明を必要としない。

キメラプライマーの血球抗原特異的部分に関して、これら部分は、混合物における他のキメラプライマーの血球抗原特異的部分と比較して及び使用されるユニバーサルプライマーと比較しての両方で、類似のＴｍ値を有することが最も好ましい。従って、キメラプライマーのこれら血球抗原特異的部分は５０〜７０℃の間、より好ましくは５５〜６５℃の間、そして最も好ましくは５６〜６２℃の間のＴｍ値を有することが好ましい。キメラプライマーの血球抗原特異的部分は、１２〜３５塩基の間、より好ましくは１５〜３０塩基の間、またはさらに好ましくは１６〜２５塩基の間の長さを有することがまた好ましい。

キメラプライマーの血球抗原特異的部分は、ＰＣＲ増幅が５０〜８００の間、好ましくは８０〜５００の間、最も好ましくは１００〜４００又は〜３００ヌクレオチドの間の長さを有するオリゴヌクレオチド生成物を生じるような方法で選択されることがさらに好ましい。１００〜２００ヌクレオチドの製品長が理想的だろう。

キメラプライマーの適切な血球抗原特異的部分を設計するために使用されうる様々なソフトウェア製品が入手可能である。血球抗原をコードする遺伝子の公に入手可能なＤＮＡ配列に基づいて、ソフトウェア製品Primer3 (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgi)が、プライマーを設計することを可能にする。任意の非特異的なゲノムＤＮＡ結合をチェックするために、CELERAデータベースが使用されることができ、及び任意のプライマーダイマー形成をチェックするために、Oligo6ソフトウェア(Medprobe)が使用されることができる。−１０ｋｃａｌ／モルより下の計算されたΔＧを有するプライマーを選択することが好ましい。

好ましいキメラプライマーのリストは以下を含む：

最も好ましくは、SEQ ID No.3〜40を有するキメラプライマーである。

上記されたソフトウェア製品は、当業者が他の血球抗原のための更なるプラマーを設計することを可能にするだろう。本発明は、同じ血球抗原特異的部分を有するが異なるユニバーサル部分を含む一組の類似のキメラプライマーの使用を含む。

プライマーの割合
本発明の目的を達成するために、そして特にプライマー２量体の発生をできる限り避けるために、キメラプライマーの最小割合のみが使用されること及び増幅がユニバーサルプライマーの延長に大体拠ることが重要である。実際的に、ユニバーサルプライマーは、各キメラプライマーのモル量あたり少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも４０倍あるモル量で使用されることが好ましい。増幅反応あたり、各キメラプライマーの5 nM及びキメラプライマー対当たり各ユニバーサルプライマーの0.2μMが好ましい。マイクロリットル反応容積当たり、各キメラプライマーの５フェムトモル（5×10^-15モル）の量が好ましく、一方各ユニバーサルプライマーの約0.2 pmol（0.2×10^-15モル）がキメラプライマー対当たり使用される。

多重ＰＣＲ条件
本発明の方法における多重ＰＣＲは、反応の始めから存在するユニバーサルプライマー及びキメラプライマーの混合物を使用する。本発明において使用される場合、ＰＣＲは、キメラプライマーのみがその中で伸張されるところの個々の第１の部分と、ユニバーサルプライマーのみがその中で伸張されるところの第２の部分との間を識別しない。本発明は、ＰＣＲの後半のサイクルにおいて、ＰＣＲの最初の数サイクルおいて使用されるアニーリング又はプライマー伸張温度と同じであるところのアニーリング又はプライマー伸張温度を適用する。本発明者等は、キメラプライマー伸張からユニバーサルプライマー伸張へスイッチするために反応条件の変化が要求されないことを見つけた。

多重ＰＣＲにおいて使用されるＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばTaq ＤＮＡポリメラーゼである。他の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ、さらに熱敏感なＤＮＡポリメラーゼでさえ同様に有用であるけれども、これはＤＮＡポリメラーゼの新鮮な量の繰り返し追加を要求しうる。適切なＤＮＡポリメラーゼは、例えばQiagen多重キットのような多重ＰＣＲのキットの成分として商業的に入手可能である。そのようなキットはまた、他の必要な成分、例えば要求されるdNTP及び適切な緩衝剤系を含む。

ＰＣＲ熱サイクリングを実行するための装置は、同様に商業的に入手可能であり、例えば、MWG AG Biotech PrimusHT thermal cyclerである。

本発明の増幅は通常、ＤＮＡポリメラーゼを活性化するための熱処理で、例えば９５℃で１５分間で始まる。引き続き、熱サイクリングが始まる。各サイクルは、熱変性工程、（ハイブリダイゼーションによってプライマーをそのテンプレートに結合するための）アニーリング工程、そしてプライマー伸張又は延長工程を含む。本発明では、熱変性工程は、９０〜９８℃の温度で、より好ましくは約９４〜９５℃で加熱することを含み、そして１５〜６０秒（より短い及び特により長い時間が許容可能である）、より好ましくは約３０秒の時間を要することが好ましい。本発明では、アニーリング工程は５４〜６０℃、より好ましくは約５７℃の温度で加熱することを含み、そして６０〜１２０秒（より短い及び特により長い時間が許容可能である）、より好ましくは約９０秒の時間を要することがさらに好ましい。本発明では、プライマー伸張工程は、６８〜７６℃、より好ましくは約７２℃の温度で加熱することを含み、そして６０〜１２０秒（より短い及び特により長い時間が許容可能である）、より好ましくは約９０秒の時間を要することがさらに好ましい。より長い時間、例えば１０分の間、プライマー伸張工程の温度での最終処理が、熱サイクリングを終了しうる。

サイクルの総数は、利用可能時間及び求められる正確さに依存して、任意に選択されうる。合計３０サイクルが十分かもしれないが、４０又は４５又は５０サイクル又はそれ以上が好ましい。

遺伝子型特定
多重ＰＣＲの結果は、ラベル付けされた増幅生成物の混合物であり、その中において理想的に各生成物は基本的に、前記血球抗原のヌクレオチド多型の部位を含む種々の血球抗原の遺伝子座の領域を含む。現在知られている血球抗原多型のほとんどの場合、ヌクレオチド多型は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であるが、１つより多いヌクレオチドをカバーする多型部位が、同様に包含される。

ラベル付けされた増幅生成物の混合物中に存在するＳＮＰを解析するために、該生成物を配列決定することを含む様々な方策が利用可能であるが、これらの多くは迅速な且つ信頼できる高スループット遺伝子型特定に適していない。それ故に、本発明は好ましくは、血球抗原対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むＤＮＡアレイに多重ＰＣＲの生成物を接触することの特別の工程を適用する。前記接触することは、前記増幅のオリゴヌクレオチド生成物の変性後（例えば熱によって）、及びアレイにおける対応するプローブへのこれらの生成物のハイブリダイゼーションに適した条件下で行われる。それらを該プローブに接触する前に、該増幅の生成物の精製は必要でなく、そして通常省略されるだろう。

プローブ
プローブはヌクレオチド多型の部位を含むオリゴヌクレオチドである。それによって、それらは対立遺伝子特異的である。それらの長さは、たった８又は１０ヌクレオチドから数百のヌクレオチドまで変化しうるけれども、１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１６又は１７〜２９又は３０ヌクレオチドの長さを有するプローブを使用することが本発明において好ましい。好ましくは、全てのプローブは、類似のＴｍ値、特に５５〜７５℃の範囲で、より好ましくは６０〜７０℃の範囲で、又は特に６０〜６５℃の範囲を有する。

原則的に、各血球抗原の各対立遺伝子のためのたった１つのプローブを使用することができるけれども、本発明は各血球抗原の各対立遺伝子のための幾つかのプローブを適用し、それによって該方法の信頼性を増加させる。本発明に従うと、該アレイは、各血球抗原の各対立遺伝子について、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも５つの異なるセンスプローブと、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも５つのアンチセンスプローブとを含み、それらの各々はヌクレオチド多型の部位をカバーするが、種々の位置でカバーする。好ましくは、これらの位置は、オリゴの中心内又は近くである。

プライマーの血球抗原特異的部分について上記されたように、適切な血球抗原対立遺伝子特異的プローブを設計するための様々なソフトウェア製品が入手可能である（特に、ソフトウェア製品Primer3）。

好ましいプローブのリストは下記を含む（ＳＮＰが強調されている）：

Rhesus BigC−イントロン2-特異的−挿入（insert）−ネガティブ−対立遺伝子：
BigC-イントロン2-特異的−挿入が存在する場合、該ＰＣＲの設定は、ＰＣＲ生成物が形成のみされるだろう方法で選択される。（バックグラウンド差し引きのために使用される）アンチタグが、遺伝子型特定のための割合を計算するために使用される。

Rhesus RHD−ネガティブ−対立遺伝子：
RHD遺伝子が存在する場合、該ＰＣＲの設定は、ＰＣＲ生成物が形成のみされるだろう方法で選択される。（バックグラウンド差し引きのために使用される）アンチタグが、遺伝子型特定のための割合を計算するために使用される。

Rhesusr’s−ネガティブ−対立遺伝子：
r’s遺伝子が存在する場合、該ＰＣＲの設定は、ＰＣＲ生成物が形成のみされるだろう方法で選択される。（バックグラウンド差し引きのために使用される）アンチタグが、遺伝子型特定のための割合を計算するために使用される。

Rhesus DVI−対立遺伝子：
通常のRHD遺伝子が存在する場合、該ＰＣＲの設定は、ＰＣＲ生成物が形成のみされるだろう方法で選択される。（バックグラウンド差し引きのために使用される）アンチタグが、遺伝子型特定のための割合を計算するために使用される。

入手可能なソフトウェアプログラムを使用して、当業者は他の血球抗原対立遺伝子のためのプローブを設計することは可能だろう。

該ＤＮＡアレイは、例えばたった７２個の異なるプローブを含む制限されたアレイであってもよいが、好ましくは、それは、上記リストに示された全てのプローブを実質的に含む。

アレイ支持体へのプローブの結合を容易にし、そして増幅生成物への十分なアクセスを可能にするために、該プローブオリゴは通常、該支持体へ結合するために、好ましくはオリゴの５’末端に、リンカー分子及び反応性基を用意される。これの全ては当業者に周知であり、そして実施例によってのみ、適切なリンカーがＣ６（ヘキサメチレン、すなわち-(CH₂)₆-）であり及び適切な反応性基がアミノであることが述べられている。

アレイ支持体
プローブは、それらが化学的手段によってそれらに通常付けられるところの適切な支持体上に配置される。該支持体は、ガラススライド又は何らかの他の適切な支持体、例えばプラスチック、シリコン又は多孔質金属酸化物でありうる。通常、該支持体は、オリゴの結合を改善するために事前処理されるだろう（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、アミノシラン、アルデヒド又はエポキシでコーティングすることによって事前処理される）。該プローブの結合を達成するために、様々な技術、例えばＵＶ照射、非特異的静電気吸収、カルボジイミド（EDC）化学などを使用して５’アミノ基又はフォスフェート基を介した共有付着が使用されうる。

非特異的ハイブリダイゼーションを避けるために、当業者に周知であるようにアレイ支持体上でプローブを運ぶ該アレイ支持体をハイブリダイゼーション溶液とインキュベーションすることが通常好ましいだろう。そして、ハイブリダイゼーションのためのプローブを用意するために、それらを、例えば約８０℃以上で加熱することによって変性することが好ましいだろう。

対照
バックグラウンドについて修正を可能にするために、ドナーのＤＮＡに生じない配列を有し且つハイブリダイゼーションによって増幅生成物に結合しないと予想されうる幾つかのプローブを含むことが好ましい。対立遺伝子特異的プローブスポットについて測定された信号は、これらバックグラウンド対照スポットについて測定された信号を差し引くことによって修正されうる。そのようなバックグラウンド修正プローブ又はアンチタグの適切な例は、下記プローブa3、a9、al7、a23、a27、a33、a35、a38、a42およびa43である：

さらに、少なくとも１つのポジティブ対照プローブを含むことが賢明でありうる。このプローブは、該増幅の生成物に追加された、ラベル付けされたポジティブオリゴマーの相補体であるべきである。例えば、ポジティブ対照プローブは、下記オリゴCS05：

でありうり、それは、混合物がＤＮＡアレイ上に施与される前に増幅生成物の混合物に添加されるそのラベル付けされた相補体catgagctagaagtcaggacにハイブリダイゼーションすることが可能である。

ハイブリダイゼーション対照
ＤＮＡアレイにおけるプローブへの増幅の生成物のハイブリダイゼーションは、５０〜６５℃の間、好ましくは約５６℃の温度で、十分な時間、例えば１５分〜１０時間、より好ましくは３０分〜４時間、通常実行される。

アレイ構成
アレイの構成は、完全に任意である。通常、１つのアレイ支持体は、同一でありうる（好ましい）又は互いに異なりうる幾つかのブロック中に存在する多くのスポットを運ぶだろう。各スポットは１つのプローブを含み、そして類似のプローブが出来るだけ互いに離れているようにスポットされることが好ましい。各ブロックが、夫々の対立遺伝子特異的プローブの１つのスポット、そしてさらに幾つかの対照スポットを含む。従って、１つのブロックは、合計１３４個のスポット中、１２８個のアレイ特異的スポット、５個のバックグラウンド対照及び１つのポジティブ対照を含みうる。

蛍光信号の測定
あるスポットへのラベル付けされた増幅生成物の結合は、これらスポットによって放射された蛍光信号に基づいて決定される。該信号は、光電子増倍管、スキャンニングレーザーシステム又は当業者に知られている任意の他の装置及び技術を用いて測定されうる。

生じたデータの評価
ＤＮＡのドナーの血球抗原遺伝子型に関して、生じたデータを評価するために、蛍光信号強度が、Genepix Pro 5.0(Axon Instruments Inc. )を使用して、例えばエクセルにおいてさらに解析されうる信号値に変換されうる。

実施例
下記実施例では、本発明を何らかの方法で制限することなしに本発明を説明するためにのみ供され、特定の多重ＰＣＲ及び対立遺伝子特異的プローブのＤＮＡマイクロアレイの該組み合わせによって血球抗原を遺伝子型特定する概念が、２対立遺伝子ヒト血小板抗原システムHPA-1〜5及びGovについて実施例１で試験される。ブラインドパネルの５８個のドナーサンプルがこれら６つのHPA系について遺伝子型特定され、そしてたった１個の不一致が１つのHPA系において見つかった。該不一致は、スコアリング評価基準を調節し、そして新規なフォーマットを有効にすることによって克服されうる。次に、実施例２において、本発明の多重ＰＣＲは、表２の全てのプライマーと一緒に十分作用したことが示された。

ポリリシンコーティングされたガラススライド上にスポットされたプローブの配列及びＴｍ値が、表１に示される。HPA-3及び-5のＳＮＰは、GCに富む領域及び貧弱な領域に夫々配置される。それ故に、これらプローブは、他のオリゴヌクレオチドよりもより短く又はより長く、且つ６０〜６５℃範囲外のＴｍ値を有する。0.4 M NaHCO₃ (pH 9.4)中に50μMの濃度で溶解された該プローブは、16 SMP 3 Microspotting pins（Telechem)を用いて供されるOmnigrid100（商標）microarrayer（Genemachines）によって、ポリ−Ｌ−リシンコーティングされたガラススライド上にスポットされた。各ガラススライドは、１２８個の対立遺伝子特異的プローブ、５個のバックグランド対照及びポジティブ対照CS05に対応する１３４個のスポットの４８ブロックを含む。類似のプローブが互いに出来るだけ離れるようにスポットされた。ＤＮＡは、250mJ/cm²でＵＶ照射によって架橋化された（Stratalinker model 1800 UV Illuminator、Stratagene）。非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐために、該スライドは、６５℃で、３０分間、100μlのプレハイブリダーゼーション溶液［400 ng/μ1酵母tRNA (Roche)、400ng/μlニシン精子ＤＮＡ (Gibco BRL)、5x Denhardt's溶液、3.2x SSC及び 0.4% SDS］を用いてインキュベーションされた。ハイブリダイゼーションの前に、プレハイブリダイゼーション混合物を含む該スライドは、スポットされたＤＮＡを変性するために、８０℃、２分間インキュベーションされた。プレハイブリダイゼーション後、該スライドは、室温で５分間、2x SSCで２回洗浄され、そして７０％（２回）、９０％及び１００％エタノールの順で夫々５分間脱水された。

たった６個の血小板抗原のための多重ＰＣＲが、5 nMの各HPA及びgovプライマー（7.5 nMの各HPA-3プライマー）及び1.2μMの各Cy5ラベル付けされたユニバーサルプライマーを使用して実行された。さらに、該多重ＰＣＲは、実施例２において多重ＰＣＲについて記載されているように実行された。ハイブリダイゼーション反応のために、チャンバーがPastinen等(2000年)によって記載されているように作られた。シリコンゴムグリッドが、ガラススライドを２４個の異なる区画に分割するために使用された。スライドが予熱（６５℃で７５分間）された間に、40μlの多重ＰＣＲ生成物が９５℃で５分間変性され、氷上におかれ、そして120μlの氷で冷やされたハイブリダイゼーション溶液［CS05のCy5ラベル付けされた2 ngの相補体(5'-catgagctagaagtcaggac-3')及び4x SSC］が添加された。ハイブリダイゼーションのために、この混合物の80μlがアレイ当たりに添加され、そして３時間半の間、５６℃でインキュベーションされた。次に、スライドが、600mlの3x SSC中のハイブリダイゼーションホルダーから持ち上げられ、そして５０℃で2x SSC/0.1% SDSを用いて２回、そして室温で0.2x SSCを用いて２回、夫々５分間洗浄された。ガラススライドは、５分間、800rpmで遠心分離によって乾かされ、そして１０μｍ解像度でAgilentG2565BAマイクロスキャナーアレイにおいてスキャンされた。光電子増倍管電圧は、100%に常に設定された。６個の異なるドナーのＰＣＲ生成物が、図３に示されるように、スライド当たり解析された。Genepix解析後、得られたデータはExcelに変換された。既知のHPA型を有する１２個のドナーサンプルのパネルが、HPAスコアリング基準を定義するために使用された。表３は、スコアリング基準をリストする。ネガティブ対照（C)の中央信号強度F_medが平均化され、そしてこのバックグランド値が３回プラスされ、その標準偏差が各オリゴの中央強度F_medから差し引かれ、表３の第３カラムに見られるように閾値F_thを与えた。F_thが、両方の一致した（対立遺伝子ａ）及び一致しない（対立遺伝子ｂ）プローブについてネガティブの値を示した場合、該プライマー対は、遺伝子型特定結果について除外された。遺伝子型特定のために、１つのセットにおける２つのオリゴヌクレオチド（１つは対立遺伝子ａから及び他は対立遺伝子ｂから）の強度の比が計算された。該比は、第６カラムにおける両方のアレイについてのF_med-F_bg強度の合計に対するａ−対立遺伝子についてのF_med-F_bg強度の計算だった。この式a/(a+b)はまた、Hinds等（2004年）によって記載されている。原則的に、これら比は、aa、ab又はbb遺伝子型について1.0、0.5又は0.0に近い値をとるべきである。ポジティブのF_med-F_bg値のみが使用され、それ故にネガティブ値が第５カラムにおいて１に設定された。次に、該比は、第７カラムにおいて遺伝子型に変換された。HPA-1、-2、-4及び-5について、約0.75より上の比値は、ａａと型特定され、0.25より下はｂｂと型特定され及び0.35〜0.65の間はabと型特定された。a-対立遺伝子を表すプローブへのＰＣＲフラグメントの高結合のために、HPA-3及びGovについての基準はそれぞれ、aaについて0.95及び0.8、bbについて0.45及び0.35、並びにabについて0.55〜0.85の間及び0.45〜0.7の間に調節された。最頻繁遺伝子型が第７カラムにオレンジに色づけされた。これは、すべての血液グループ、全てのブロック及び全てのサンプルについて行われた。１２個のドナーのサンプルが、遺伝子型を正確に予想したプローブセットを受け入れるために使用された。最終スコアリングのために使用された基準として：同型接合体遺伝子型が予想された場合、使用されたプローブセットの50％は遺伝子型を予想し、及び異型接合体遺伝子型が予想された場合(HPA-3について30％)、使用されたプローブセットの40％は遺伝子型を予想するべきである。これら基準を使用して、５８個のサンプルのブラインドパネルが遺伝子型特定された。それらのうちの９個の結果が、表４に示される。全５８個のサンプルの遺伝子型が、表５にリストされる。５６個のサンプルの遺伝子型が、現在の基準を用いてスコア付けされうる。１つのサンプルのみに、その既知の遺伝子型と異なる結果が得られた。この場合、表６に示されているように、プローブの33.3％がHPA-3bb遺伝子型を示し、及び37.5％がHPA-3ab遺伝子型を示した。スコアリング基準の調節は、型特定結果の完全な一致をもたらした。

プライマー混合物は、表２にリスとされたプライマーを用いて構築された。該ＰＣＲ混合物におけるプライマー濃度がまた、表２にリストされる。Qiagen多重キットが、多重ＰＣＲのために使用された。多重ＰＣＲでは、アニール温度がＰＣＲの間変更されず、そして２つの蛍光ラベル付けされたユニバーサルプライマーが使用された。より詳細には、最初に、該ＰＣＲ混合物は非常に低い量のキメラプライマー(5 nM)及び蛍光ラベル受けされた過剰のユニバーサルプライマー（キメラプライマー当たり0.2μMの各ユニバーサルプライマー）を含む。該ＰＣＲの温度プロフィルは、９５℃、１５秒で開始され、引き続き９４℃で３０秒間、５７℃で９０秒間、７２℃で９０秒間の４５サイクル、そして該プロトコルは７２℃、１０分間での最終多重化工程で終了した。ＰＣＲ生成物の非常に少ない量が最初の増幅サイクルの間に増幅されるが、図１における８％アクリルアミドゲル上で見られうるような下記サイクル中のユニバーサルＭＡＰＨプライマーによってテンプレートとして使用されるために十分である。ＭＡＰＨプライマーの５’末端に蛍光ラベルCy5を該ＭＡＰＨプライマーにタグ付けることによって、たった２つの蛍光ラベル付けされたプライマーが、ＰＣＲ生成物を有効にラベル付けするために必要である。White等（2002年）によって記載されているように、多重ＰＣＲ生成物のより良い識別が、ABI 3700キャピラリー・シーケンサー(Applied Biossystems)上で可視化されうる（この場合、MAPH-revのみが蛍光（FAM）ラベル付けされる）。全ての設計されたＰＣＲプライマーを有する多重ＰＣＲは、図２におけるクロマトグラムに示されるようなピークの予想されたパターンを生じた。これは、全ての遺伝子フラグメントが同様の収率で増幅されたことを意味する。

参考文献

-Akane A, Mizukami H and Shiono H. 2000年. Classification of standard alleles of the MN blood group system. Vox Sang 第79巻, 第183-187頁.

-Belgrader P, Marino MM, Lubin M and Barany F. 1996年. A Multiplex PCR-Ligase Detection Reaction Assay for Human Identity Testing. Genome Sci. Technol.第1巻, 第77-87頁.

-Berry JE, Murphy CM, Smith GA, Ranasinghe E, Finberg R, Walton J, Brown J,Navarrete C, Metcalfe P and Ouwehand WH. 2000年. Detection of Gov system antibodies by MAIPA reveals an immunogenicity similar to the HPA-5 alloantigens. Br J Haematol. 第110巻, 第735-742頁.

-Beuningen R van, van Damme H, Boender P, Bastiaensen N, Chan A and Kievits T.2001年. Fast and specific hybridisation using flow-through microarrays on porous metal oxide. Clin. Chem. 第47巻, 第1931-1933頁.

- Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, Ferrie R, Newton C and Little S. 1997年. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucl. Acids Res.第25巻, 第3235-3241頁.

-Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, and Caskey CT. 1988年. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucl. Acids Res. 第16巻, 第11141-11156頁.

- Cheek BJ, Steel AB, Torres MP, Yu YY and Yang H. 2001年. Chemiluminescence detection for hybridization assays on the flow-thru chip, a three-dimensional microchannel biochip. Anal Chem. 第73巻, 第5777-5783頁.

- Evans JG and Lee-Tataseo C. 2002年. Determination of the factor V Leiden single-nucleotide polymorphism in a commercial clinical laboratory by use of NanoChip microelectronic array technology. Clin Chem. 第48巻, 第1406-1411頁.

- Fan JB, Chen X, Halushka MK, Berno A, Huang X, Ryder T, Lipshutz RJ, Lockhart DJ and Chakravarti A. 2000年. Parallel genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res. 第10巻, 第853-860頁.

- Fodor SP, Read JL,Pirrung MC, Stryer L, Lu AT and Solas D. 1991年.Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 第251巻, 第767-773頁.

- Guo Z, Gatterman MS, Hood L, Hansen JA and Petersdorf EW. 2001年. Oligonucleotide arrays for high-throughput SNPs detection in the MHC class I genes: HLA-B as amodel system. Genome Res. 第12巻, 第447-457頁.

-Hacia JG, Brody LC, Chee MS, Fodor SP and Collins FS. 1996年. Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis. Nat Genet. 第14巻, 第441-447頁.

-Heath KE, Day INM and Humphries SE. 2000年. Universal primer quantitative fluorescent multiplex (UPQFM) PCR: a method to detect major and minor rearrangements of the low density lipoprotein receptor gene. J. Med. Genet.第37巻, 第272-280頁.

-Hinds DA, Stokowski RP, Patil N, Konvicka K,Kershenobich D, Cox DR andBallinger DG. 2004年. Matching strategies for genetic association studies in structured populations. Am J Hum Genet. 第74巻, 第317-325頁.

- Huang JX, Mehrens D, Wiese R, Lee S, Tam SW, Daniel S,Gilmore J, Shi M andLashkari D. 2001年. High-throughput genomic and proteomic analysis using microarray technology. Clin Chem. 第47巻, 第1912-1916頁.

- Iwasaki H, Ezura Y, Ishida R, Kajita M, Kodaira M, Knight J, Daniel S, Shi Mand Emi M. 2002年. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by amicroarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 第9巻, 第59-62頁.

-Jobs M, Howell WM,Stromqvist L, Mayr T and Brookes AJ. 2003年. DASH-2: flexible,low-cost, and high-throughput SNP genotyping by dynamic allele-specific hybridization on membrane arrays. Genome Res. 第13巻, 第916-924頁.

-Kajiyama T, Miyahara Y, Kricka LJ, Wilding P, Graves DJ, Surrey S and FortinaP. 2003年. Genotyping on a thermal gradient DNA chip. Genome Res. 第13巻, 第467-475頁.

-Lindroos K, Sigurdsson S, Johansson K, Ronnblom L and Syvanen AC. 2002年.Multiplex SNP genotyping in pooled DNA samples by a four-colour microarray system. Nucleic Acids Res. 第30巻, e70.

-Lu M, Shortreed MR, Hall JG, Wang L, Berggren T, Stevens PW, Kelso DM, Lyamichev V, Neri B and Smith LM. 2002. A surface invasive cleavage assay for highly parallel SNP analysis. Hum. Mutat. 第19巻, 第416-422頁.

-Maaskant-van Wijk PA, Faas BH, de Ruijter JA, Overbeeke MA, von dem Borne AE,van Rhenen DJ and van der Schoot CE. 1999年. Genotyping of RHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specific exons. Transfusion 第39巻, 第546頁.

-Metcalfe P, Watkins NA, Ouwehand WH, Kaplan C, Newman P, Kekomaki R, De Haas M, Aster R, Shibata Y, Smith J, Kiefel V and Santoso S. 2003年. Nomenclature of human platelet antigens. Vox Sang. 第85巻, 第240-245頁.

-Miller SA, Dykes DD and Polesky HF.1988年. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl. Acids Res. 第16巻, 第1215頁.

-Mujumdar RB, Ernst LA, Mujumdar SR, Lewis CJ and Waggoner AS. 1993年. Cyanine dyelabeling reagents: sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjug. Chem.第4巻, 第105-111頁.

-Park SJ, Taton TA and Mirkin CA. 2002年. Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes. Science 第295巻, 第1503-1506頁.

-Pastinen T, Kurg A,Metspalu A, Peltonen L and Syvanen AC. 1997年. Minisequencing:a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays.Genome Res. 第7巻, 第606-614頁.

-Pastinen T, Raitio M, Lindroos K, Tainola P, Peltonen L and Syvanen AC. 2000年. Asystem for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer extension on microarrays. Genome Res. 第10巻, 第1031-1042頁.

-Prix L, Uciechowski P, Bockmann B, Giesing M and Schuetz AJ. 2002年. Diagnostic biochip array for fast and sensitive detection of K-ras mutations in stool. Clin. Chem. 第48巻, 第428-435頁.

-Randen I, Sorensen K, Killie MK and Kjeldsen-Kragh J. 2003年. Rapid and reliable genotyping of human platelet antigen (HPA)-1,-2,-3,-4, and -5 a/b and Gov a/b bymelting curve analysis. Transfusion 第43巻, 第445-450頁.

-Reid ME. 2003年. Applications of DNA-based assays in blood group antigen and antibody identification. Transfusion 第43巻, 第1748-1757頁.

-Seltsam A, Wagner FF, Salama A and Flegel WA. 2003年. Antibodies tohigh-frequency antigens may decrease the quality of transfusion support: an observational study. Transfusion 第43巻, 第1563-1566頁.

- Shuber AP, Grondin VJ and Klinger KW. 1995年. A simplified procedure for developing multiplex PCRs. Genome Research 第5巻, 第488-493頁.

-Tax MG, van der Schoot CE, van Doom R, Douglas-Berger L, van Rhenen DJ and Maaskant- van Wijk PA. 2002年. RHC and RHc genotyping in different ethnic groups.Transfusion 第42巻, 第634-444頁.

-Wang DG, Fan JB, Siao CJ, Berno A, Young P, Sapolsky R, Ghandour G, Perkins N,Winchester E, Spencer J, Kruglyak L, Stein L, Hsie L, Topaloglou T, Hubbell E,Robinson E, Mittmann M, Morris MS, Shen N, Kilburn D, Rioux J, Nusbaum C, Rozen S, Hudson TJ and Lander ES. 1998年. Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome. Science 第280巻, 第1077-1082頁.

-Wen WH, Bernstein L, Lescallett J, Beazer-Barclay Y, Sullivan-Halley J, White M and Press MF. 2000年. Comparison of TP53 mutations identified by oligonucleotide microarray and conventional DNA sequence analysis. Cancer Res.第60巻, 第2716-2722頁.

-Wen SY, Wang H, Sun OJ, Wang SQ. 2003年. Rapid detection of the known SNPs of CYP2C9 using oligonucleotide microarray. World J Gastroenterol. 第9巻, 第1342-1346頁.

-White S, Kalf M, Liu Q, Villerius M, Engelsma D,Kriek M, Vollebregt E, Bakker B, van Ommen GJ, Breuning MH and den Dunnen JT. 2002年. Comprehensive detection of genomic duplications and deletions in the DMD gene, by use of multiplex amplifiable probe hybridisation. Am. J. Hum. Genet. 第71巻, 第365-374頁.

１９個の血液グループ抗原の多重ＰＣＲの結果を示す図である。１９個の血液グループ抗原の多重ＰＣＲからの、ＡＢＩ毛細管シーケンサーを用いて得られたパターンを示す図である。６個のドナーサンプルのハイブリダイゼーションのスキャン結果を示す図である。

Claims

血球抗原を遺伝子型特定する方法であって、哺乳動物種の個体からのＤＮＡを多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付して、前記血球抗原のヌクレオチド多型を含む少なくとも２つの異なる血球抗原の遺伝子座の領域を増幅し且つ検出可能にラベル付けすること、そしてこのようにして増幅され且つラベル付けされたＤＮＡフラグメントを使用して前記血球抗原のそれぞれについて遺伝子型を決定することを含み、前記多重ＰＣＲは、遺伝子型特定されるべき各血球抗原のための少なくとも１つの対の血球抗原特異的キメラプライマーと、少なくとも１つの検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーとの使用を含み、前記少なくとも１つのユニバーサルプライマーのヌクレオチド配列は前記哺乳動物種のＤＮＡにおいて生じない配列からなり、各キメラプライマー対のプライマーは３’末端に血球抗原特異的部分及び５’末端にユニバーサル部分を含み、前記キメラプライマーの前記ユニバーサル部分の塩基配列は前記少なくとも１つのユニバーサルプライマーの塩基配列に対応し、前記キメラプライマー対の前記血球抗原特異的部分は前記血球抗原のヌクレオチド多型を含む血球抗原の遺伝子座の領域を囲む、前記方法。
前記少なくとも１つの検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーは、各キメラプライマーのモル量の少なくとも１００倍であるモル量で使用される、請求項１に記載の方法。
前記哺乳動物種の前記ＤＮＡにおいて生じない配列からなるヌクレオチド配列を有する検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーの対が使用され、各キメラプライマー対について前記キメラプライマー対の一つのメンバーの前記ユニバーサル部分の前記塩基配列が前記ユニバーサルプライマー対の一つのメンバーの前記塩基配列に対応し、前記キメラプライマー対の他のメンバーの前記ユニバーサル部分の前記塩基配列が前記ユニバーサルプライマーの前記他のメンバーの前記塩基配列に対応する、請求項１又は２に記載の方法。
前記ユニバーサルプライマーの一つのヌクレオチド配列が塩基配列

からなり、及び他のユニバーサルプライマーのヌクレオチド配列が塩基配列

からなる、請求項３に記載の方法。
各ユニバーサルプライマーが、その５’末端で、蛍光ラベルを保持する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物種がヒトであり、前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡであり、そして前記血球抗原は、

からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記血球抗原が、

からなる群から選択される全てのメンバーを含む、請求項６に記載の方法。
前記キメラプライマーは、

からなる群から選択される少なくとも２つの対を含む、請求項６又は７に記載の方法。
前記キメラプライマーが、請求項８に定義された全プライマー対を含む、請求項８に記載の方法。
前記多重ＰＣＲにおいて使用されるＤＮＡポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼ又は類似の熱耐性ポリメラーゼであり、前記多重ＰＣＲの各サイクルは９０〜９８℃の温度で１５〜６０秒の熱変性工程、５４〜６０℃の温度で６０〜１２０秒のアニーリング工程、そして６８〜７６℃の温度で６０〜１２０秒のプライマー伸張工程を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記多重ＰＣＲが、５０μｌの反応容積に基づき、前記個体からの１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、５ｎＭの各キメラプライマー、キメラプライマー対当たり０．２μＭの検出可能にラベル付けされた各ユニバーサルプライマー、及び２５μｌの２×ＭａｓｔｅｒＭｉｘを含むバッファー、ｄＮＴＰ並びにＤＮＡポリメラーゼを使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
多重ＰＣＲ増幅の生成物を変性後、支持体上に配置された血球抗原対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし、そしてハイブリダイゼーションパターンを解析することによって、前記血球抗原の夫々についての遺伝子型が決定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
対立遺伝子特異的プローブが１５〜４０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１２に記載の方法。
前記プローブは、血球抗原の各対立遺伝子について、少なくとも２個の異なるセンスプローブ及び少なくとも２個の異なるアンチセンスプローブを含み、それらの夫々はヌクレオチド多型を、しかし種々の位置で、カバーする、請求項１２又は１３に記載の方法。
前記プローブが、

からなる群から選択される少なくとも７２個の異なるプローブを含む、請求項１３に記載の方法。
前記プローブが、請求項１５に定義されたすべてのプローブを含む、請求項１５に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記支持体への付着のために、それらの５’末端にリンカー及び反応性基を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
前記支持体が、

からなる群から選択された１以上のオリゴヌクレオチドを有する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
前記支持体が１以上のポジティブハイブリダイゼーション対照を有する、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記支持体がポジティブハイブリダイゼーション対照、

を有し、及びその検出可能にラベル付けされた相補体catgagctagaagtcaggac、ＳＥＱＩＤＮＯ：６４２、が多重ＰＣＲ増幅の前記生成物に添加される、請求項１９に記載の方法。
前記プローブは、前記多重ＰＣＲ増幅の前記生成物を添加する前に、プレハイブリダイゼーション及びＤＮＡ変性処理に付される、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
前記多重ＰＣＲ増幅の前記変性された生成物は、予備精製なしに前記プローブと接触させられる、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
各血球抗原について、前記対立遺伝子の夫々のためのシグナル強度の比が遺伝子型を割り当てるために使用される、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法によって血球抗原を遺伝子型特定するためのキットであって、遺伝子型特定されるべき各血球抗原のための血球抗原特異的キメラプライマーの１つの対、及び少なくとも１つの検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーを含む、前記キット。
請求項１〜９のいずれか一項に定義された検出可能にラベル付けされたユニバーサルプライマーの１つの対を含む、請求項２４に記載のキット。
請求項１２〜１８のいずれか一項に定義された前記支持体上に配置された前記プローブをさらに含む、請求項２４又は２５に記載のキット。
多重ＰＣＲにおいて有用な血球抗原特異的キメラプライマー対のセットであって、請求項８に定義された群から選択される少なくとも２個のプライマー対を含む、前記セット。
請求項８に定義された全てのプライマー対を含む、請求項２７に記載の血球抗原特異的キメラプライマー対のセット。
血球抗原を遺伝子型特定するために有用な血球抗原対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのセットであって、請求項１５に定義された群から選択される少なくとも７２個の異なるプローブを含む、前記セット。
請求項１５に定義された全てのプローブを含む、請求項２９に記載の血球抗原対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブのセット。