ES2353022T3 - Método para la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre y kit adecuado para la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre. - Google Patents

Abstract

Método de determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre que comprende someter al ADN de un individuo de una especie de mamífero a una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) múltiple para amplificar y marcar de forma detectable una región del locus de, como mínimo, dos antígenos diferentes de células de la sangre que contiene el sitio de polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de células de la sangre y utilizar los fragmentos de ADN amplificados y marcados de esta manera para determinar el genotipo de cada uno de dichos antígenos de células de la sangre, comprendiendo dicha PCR múltiple el uso de, como mínimo, un par de cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre para que sea determinado el genotipo de cada antígeno de células de la sangre y, como mínimo, un cebador universal marcado de forma detectable, en el que dicho, como mínimo, un cebador universal tiene una secuencia única que no aparece en el ADN de dicha especie de mamíferos, y en el que cada par de cebadores quiméricos comprende un cebador quimérico de la izquierda y un cebador quimérico de la derecha, cada uno de ellos comprende una parte específica del antígeno de célula de la sangre en el extremo 3' y una parte universal en el extremo 5', en el que la secuencia de bases de la parte universal de los cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de bases de dicho, como mínimo, un cebador universal, y en el que dichas partes específicas del antígeno de células de la sangre del par de cebadores quiméricos comprende una región del locus del antígeno de célula de la sangre que contiene el sitio del polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de células de la sangre.

Description

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra en el sector de la determinación del genotipo de los antígenos de células de la sangre, más en particular de los antígenos de los glóbulos rojos (antígenos de grupo sanguíneo), de plaquetas de la sangre (antígenos de plaquetas) y de leucocitos (antígenos de leucocitos).

La presente invención da a conocer un método de determinar el genotipo de antígenos de las células sanguíneas y un kit adecuado para determinar el genotipo de los antígenos de las células sanguíneas, y da a conocer los conjuntos de los cebadores y de las sondas útiles para la determinación de los antígenos de las células sanguíneas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Cuando la sangre, o una fracción de la sangre, tal como glóbulos rojos (los eritrocitos o las células rojas), las plaquetas (trombocitos) y los glóbulos blancos (leucocitos), derivados de un donante se administran a otra persona (o de forma más general, a otro individuo mamífero), pueden ocurrir reacciones adversas serias cuando la sangre o una fracción de la sangre del donante no coincide correctamente con la sangre del receptor. Se conocen bien las reacciones de transfusión (aglutinación) que ocurren cuando por ejemplo la sangre de un donante del grupo sanguíneo A se da a una persona del grupo sanguíneo B (los antígenos A y B del grupo sanguíneo pertenecen al sistema ABO). Cuando la sangre de un donante Rhesus D (RhD) positivo se da a un paciente de RhD negativo hay una alta probabilidad de formación del aloanticuerpos. Los anticuerpos de RhD llevan a la destrucción rápida de glóbulos rojos RhD-positivos y a las reacciones de transfusión. Además, cuando una mujer con anticuerpos de glóbulos rojos o plaquetas se queda embarazada, estos anticuerpos pueden atravesar la placenta y destruir los glóbulos rojos o las plaquetas del feto. Esto puede llevar a una hemólisis severa resultando en anemia, ictericia (después del nacimiento) y si no se trata puede ser fatal o conducir a daño cerebral. Así, para evitar las reacciones de transfusión, la política actual de transfusión consiste en transfundir sólo los glóbulos rojos que coincidan en ABO y RhD. Para evitar la formación de aloanticuerpos en las mujeres en edad fértil con las posibles complicaciones durante el embarazo, sólo se transfunden glóbulos rojos que coinciden en el tipo ABO, RhD y K1.

Posiblemente, en el futuro, también se den glóbulos rojos que coincidan en RhC y RhE a mujeres en edad fértil.

Existen sin embargo otros antígenos de grupo sanguíneo (antígenos de glóbulos rojos) y estos pueden causar también serios problemas cuando la sangre del donante no coincidente se da a receptores con aloanticuerpos. La determinación del tipo de antígenos específicos de plaquetas es importante para el diagnóstico y la terapia de los pacientes, ya que pueden ocurrir diferentes síndromes de trombocitopenia aloinmune. Si una mujer ha desarrollado anticuerpos de antígeno antiplaquetas (en la mayoría de los casos anticuerpos de Antígeno de Plaqueta Humana (HPA) de tipo 1a), desarrollados principalmente durante la gestación, estos anticuerpos pueden conducir a la destrucción de las plaquetas del feto con una tendencia creciente de la hemorragia en el feto. En un número de casos, esto llevará a una hemorragia intracraneal. Para prevenir la hemorragia, es necesario transfundir plaquetas HPA-1anegativas.

Las plaquetas se transfunden habitualmente sin determinar previamente el tipo de antígeno de plaqueta [antígenos de plaqueta humana (HPA) en humanos] del donante y el receptor. Las transfusiones de sangre o fracciones de sangre no coincidentes pueden provocar la generación de aloanticuerpos, especialmente en pacientes que necesitan transfusiones frecuentes o recurrentes de glóbulos rojos o plaquetas (o leucocitos). Si se forman aloanticuerpos múltiples, o si los aloanticuerpos están dirigidos contra antígenos de alta frecuencia, puede ser un problema encontrar glóbulos rojos o plaquetas compatibles. De acuerdo con un estudio publicado (Seltsam y otros, 2003), el apoyo de transfusión no fue satisfactorio en aproximadamente un tercio de los pacientes hospitalizados con anticuerpos a antígenos de alta frecuencia.

El método clásico de prueba de los antígenos y anticuerpos del grupo sanguíneo es la determinación del fenotipo por la prueba de hemoaglutinación. La técnica de esta prueba serológica es simple y barata, pero sus costes y dificultades se incrementan cuando se necesita realizar múltiples ensayos para una determinación completa del tipo y requiere de la disponibilidad de un gran número de antisueros específicos. Sólo en los Países Bajos, el número total de donantes de sangre está en el orden de magnitud de 500.000 personas y se estima que el número de donantes se incrementa cada año en unos 60.000 nuevos donantes. Para los glóbulos rojos, existen, como mínimo, 29 sistemas de atígenos de grupo sanguíneo (cada uno con un número de alelos diferentes). Además, será relevante determinar los antígenos de alta frecuencia y los antígenos de baja frecuencia. El número de sistemas de antígeno de células de la sangre clínicamente relevantes es de aproximadamente 60. La determinación completa de fenotipos de todos los donantes de sangre es por tanto cara, laboriosa, lenta y no factible debido a la falta de suficientes reactivos de determinación de tipos.

La base molecular de la mayoría de los sistemas de antígenos de células de sangre es conocida. La mayoría de los antígenos de grupos sanguíneos, antígenos de plaquetas y antígenos de neutrófilos son bialélicos y son el resultado de un polimorfismo de nucleótido simple (SNP). Estos SNP se pueden utilizar para la determinación del genotipo. En la literatura científica se han descrito innumerables ensayos basados en ADN para la determinación del genotipo de antígenos de grupos sanguíneos y de plaquetas. Estos incluyen PCR-RFLP, PCR específicas de alelos, PCR específicas de secuencias en forma de ensayos simples o múltiples, PCR cuantitativa en tiempo real, el método de extensión de terminadores fluorescentes de nucleótido único y tecnología de perlas de alto rendimiento (revisado por Reid, 2003). Métodos semiautomatizados que utilizan un espectrofotómetro de masas o un pirosecuenciador se pueden utilizar también para la determinación del genotipo.

Por ejemplo, Randen y otros (2003) dieron a conocer recientemente la determinación del genotipo de los antígenos de plaquetas humanas 1, 2, 3, 4, 5 y Gov (llamado recientemente HPA15, Metcalfe y otros, 2003) a través del análisis de la curva de fusión usando la tecnología de LightCycler. Los sistemas bialélicos HPA-1 a 5 y Gov son los más frecuentemente involucrados en la enfermedad (Berry y otros, 2000), haciéndolos dianas importantes para la determinación del genotipo. La tecnología de LightCycler involucra una amplificación de fragmentos relevantes de fragmentos de ADN del donante por PCR usando un par de cebadores específicos para cada uno de los antígenos de plaquetas mencionados anteriormente. Utilizando sondas de hibridación fluorescentes y el análisis de curvas de fusión fue posible lograr la detección simultánea de ambos alelos de un antígeno de plaqueta en el mismo capilar, sin necesidad de la laboriosa y lenta electroforesis en gel de la anterior metodología de determinación de genotipo.

Sin embargo, tal como en otros sistemas descritos de determinación de genotipos de antígenos de células de la sangre, la tecnología LightCycler no es capaz de realizar la enorme tarea de determinación completa del genotipo de los donantes de sangre, lo que requeriría una metodología que no es apropiada para el cribado de alto rendimiento. La determinación del tipo de 60.000 donantes cada año después de dos donaciones diferentes por 60 antígenos de grupos sanguíneos y de plaquetas implicaría más de 7 millones de ensayos de determinación de tipo por año o aproximadamente 140.000 ensayos de determinación de tipo por semana. Un método apropiado de alto rendimiento, que es rápido y fiable, es altamente deseable para esta prueba. Reacción en cadena de la polimerasa múltiple

La técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se ha desarrollado mucho desde que se introdujo en los años

80. Chamberlain y otros (1988) dieron a conocer la PCR múltiple como una técnica general para la amplificación de múltiples locus en el ADN (genómico). Aquí, en vez de un par de cebadores para la amplificación de un locus, se adicionan más pares de cebadores en una mezcla de reacción. Sin embargo, el desarrollo de tales PCR múltiples está limitado por la complejidad de la reacción de amplificación. Los componentes de la reacción y las condiciones de los ciclos tienen que ajustarse para cada par adicional de cebadores. Shuber y otros (1995) introdujeron los cebadores “quiméricos” específicos de secuencia para evitar este problema. Estos cebadores son complementarios al ADN molde y contienen una marca de 20 nucleótidos no relacionados en el extremo 5’ (secuencia universal). Aunque los cebadores se diseñaron de tal manera que sus temperaturas de fusión predichas son similares a las de los otros

cebadores y tienen una ΔG calculada para la duplicación de los cebadores por debajo de -10 kcal/mol, la concentración de los cebadores aún necesita ajustarse para obtener rendimientos similares del producto de PCR. Para evitar este problema y reducir además la formación de dímeros de cebadores más adelante, Belgrader y otros (1996) aplicaron sólo una cantidad limitada de cebador quimérico (2 pmol) y adicionaron una sobrecarga de cebador universal después de 15 ciclos de PCR. Los ciclos térmicos siguieron entonces durante otros 25 ciclos a una temperatura de alineamiento (“annealing”) más baja. Brownie y otros (1997) ya incluyeron el cebador universal en la mezcla de reacción por PCR desde el inicio. Después de 4 ciclos de PCR la temperatura de alineamiento se eleva desde 60°C hasta 74°C y se realizan otros 35 ciclos de PCR. Más adelante, una PCR anidada se dio a conocer por Heath y otros (2000), quienes aplican en la segunda PCR dos cebadores universales (complementarios), uno de ellos portando una marca fluorescente unida a su extremo 5’.

Hasta el momento, la PCR múltiple se ha utilizado sólo con grupos relativamente pequeños de pares de cebadores para la amplificación específica de alelos. Ni la viabilidad de utilizar una PCR múltiple en un método de determinación de genotipo de un gran número de antígenos de células de la sangre, ni la naturaleza de las condiciones de PCR y de las mezclas de cebadores que son apropiadas para tal determinación de genotipo de antígenos de células de la sangre, ni un método práctico, rápido y fiable para

analizar

los productos de la amplificación para asignar los

genotipos

de antígenos de células de la sangre clínicamente

relevantes ha sido descrito en la técnica anterior.

Microarreglos de ADN

Se conocen varias estrategias usando la tecnología de microarreglos de ADN en el campo general de la determinación del genotipo. Una de estas estrategias es el denominado método de minisecuenciación, que incluye una extensión específica de alelo en el microarreglo o bien en la solución (Pastinen y otros, 1997; Fan y otros, 2000). Una dificultad en esta estrategia es la ocurrencia de extensiones no específicas de cebadores y es necesaria la optimización posterior de los cebadores o el método de extensión en sí mismo (Pastinen y otros, 2000; Lindroos y otros, 2002). Además, este método requiere etapas laboriosas de tratamiento enzimático y purificación.

Otra estrategia se denomina hibridación de oligonucléotidos específicos de alelo (ASO) sobre microarreglos. Esta estrategia se basa en la estabilidad térmica de la diana y las sondas cortas de oligonucleótidos para la determinación del genotipo (Hacia y otros, 1996; Wang y otros, 1998). Los primeros arreglos de oligonucleótidos generados por luz se desarrollaron en 1991 (Fodor y otros). El método se ha utilizado para la determinación de nuevos SNP o para re-secuenciación. Se ha utilizado también para la determinación del genotipo (Evans y otros, 2002) por goteo de los productos de amplificación de PCR derivados de muestras de pacientes en un arreglo y haciendo contactar el arreglo con oligos específicos de alelo para discriminar los alelos del paciente. Se han descrito muchas variaciones, usando diferentes tipos de herramientas, tales como enzimas, sondas de nanopartículas, nucleótidos artificiales, gradientes térmicos, arreglos de flujo continuo, oligonucleótidos de bloqueo, para mejorar la sensibilidad o especificidad (Lu y otros, 2002; Park y otros, 2002; Prix y otros, 2002; Kajiyama y otros, 2003; Jobs y otros, 2003; Van Beuningen y otros, 2001; Iwasaki y otros, 2002). Wen y otros, 2000, hicieron una comparación de la sensibilidad y especificidad de un análisis de arreglo de oligonucleótidos de las mutaciones TP53 con análisis de secuencia de ADN convencional. El arreglo de oligonucleótidos utilizado contenía una serie de sondas para SNP. Para inmovilizar los oligos al soporte de la matriz, habitualmente un portaobjetos, las sondas pueden estar provistas de un espaciador y un grupo amina (Guo y otros, 2001; Wen y otros, 2003). Se han descrito varios formatos de microarreglos, por ejemplo láminas con un formato de 96 microarreglos, que contienen 250 gotas por arreglo para mejorar el rendimiento (Huang y otros, 2001). Se han descrito sistemas de flujo continuo con el fin de reducir el tiempo de hibridación y por tanto incrementar el rendimiento (Cheek y otros, 2001; Van Beuningen y otros, 2001).

Hasta el momento, los métodos de microarreglos de ADN no se han aplicado a la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre, ni se han descrito en la técnica anterior la viabilidad de utilizar el arreglo de ADN en un método de determinar el genotipo de una gran cantidad de antígenos de células de la sangre, ni la naturaleza de las sondas de oligonucleótidos y los formatos de microarreglos adecuados para tal determinación del genotipo, ni un método práctico, rápido y fiable para analizar los resultados de hibridación para asignar los genotipos de células de la sangre clínicamente relevantes. CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención es dar a conocer métodos y medios que permitan una determinación del genotipo práctica, rápida y fiable de un gran número de antígenos de células de la sangre.

Otro objetivo de la presente invención es desarrollar una técnica de alto rendimiento que permite determinar el genotipo de todo el conjunto de donantes existente y/o un incremento en el número de antígenos de células de la sangre en un orden de magnitud de 20 y en última instancia aún de unos 60 sistemas de antígenos de células de la sangre, para facilitar de esta forma la selección del donante de sangre correcto y mejorar la seguridad de la transfusión de la sangre.

Nuevamente, otro objetivo de la presente invención es alcanzar una determinación del genotipo esencialmente completa y fiable, cubriendo, como mínimo, la mayoría de los sistemas de antígenos de células de la sangre clínicamente relevantes, usando aparatos sencillos, en un tiempo corto, tal como menos de 30 horas,

o de 24 horas, preferentemente menos de 6 horas y más preferentemente menos de 2 horas o incluso menos de 1 hora, sobre una sola muestra de ADN sometida a una reacción de PCR en un solo tubo para amplificar y marcar de forma detectable fragmentos relevantes de ADN, simultáneamente.

Estos objetos se alcanzan por la presente invención que da a conocer, en un aspecto, un método de determinación de genotipo de antígenos de células de la sangre, que comprende someter el ADN de un individuo de una especie de mamífero a una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) múltiple para amplificar y marcar de forma detectable una región del locus, como mínimo, de dos antígenos diferentes de células de la sangre que contiene el sitio del polimorfismo de nucleótidos de dicho antígeno de células de la sangre y usando dichos fragmentos de ADN amplificados y marcados para determinar el genotipo de cada uno de dichos antígenos de células de la sangre, donde dicha PCR múltiple comprende el uso, como mínimo, de un par de cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre para cada antígeno de células de la sangre a determinar su genotipo y, como mínimo, un cebador universal marcado de forma detectable, donde dicho, como mínimo, un cebador universal tiene una secuencia única que no existe en el ADN de dicha especie de mamífero, y donde cada par de cebadores quiméricos comprende un cebador quimérico izquierdo y un cebador quimérico derecho, cada uno de ellos comprendiendo una parte de específica de un antígeno de célula de la sangre en el extremo 3' y una parte universal en el extremo 5', donde la secuencia de bases de la parte universal de los cebadores quiméricos corresponde a la secuencia de bases de dicho, como mínimo, un cebador universal, y donde dichas partes específicas de antígeno de células de la sangre del par de cebadores quiméricos encierran una región del locus del antígeno de célula de la sangre que contiene el sitio del polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de célula de la sangre.

En el método de la presente invención, es preferente utilizar un par de cebadores universales con marcado detectable con una secuencia única que no existe en la secuencia de ADN de dicha especie de mamífero y que por cada par de cebadores quiméricos la secuencia de bases de la parte universal de un miembro del par de cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de bases de un miembro del par de cebadores universales y la secuencia de bases de la parte universal del otro miembro del par quimérico se corresponde con la secuencia de bases del otro miembro del par de cebadores universales.

Además, en la presente invención es claramente preferente que el genotipo de cada uno de dichos antígenos de células de la sangre se determine hibridando los productos de la amplificación por PCR múltiple, después de la desnaturalización, a sondas de oligonucleótidos específicos de alelo de antígenos de células de la sangre contenidos en un arreglo de ADN o presentados en cualquier otra forma, tal como soportada sobre perlas, y analizando el patrón de hibridación.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un kit para la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre por un método tal como se define en el presente documento, que comprende, como mínimo, un par de cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre para cada antígeno de células de la sangre a ser determinado su genotipo y otro par de cebadores universales marcados de forma detectable, ambos tal como se define en el presente documento.

La presente invención da a conocer además un conjunto de pares de cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre útiles en una PCR múltiple, y un conjunto de sondas de oligonucleótidos específicos de alelos de antígenos de células de la sangre útiles para la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre. DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 representa los resultados de una PCR múltiple de 19 antígenos de grupos sanguíneos con o sin la presencia de cebadores universales MAPH. Durante los primeros ciclos de amplificación se amplifica una cantidad muy pequeña de producto de PCR (carril 2), pero suficiente para ser utilizado como molde por los cebadores universales MAPH en los ciclos siguientes. Los cebadores MAPH llevan a cabo la amplificación real (carril 3), por lo que difícilmente son necesarios ajustes en la concentración de cebadores y se obtienen rendimientos similares de productos de PCR.

La figura 2 representa el patrón obtenido con el secuenciador capilar ABI a partir por PCR múltiple de 19 antígenos de grupos sanguíneos, tal como se describe en la presente invención.

La figura 3 representa los resultados de la exploración de la hibridación de 6 muestras de donantes, cada una comprendiendo los 6 productos de PCR de los antígenos de plaquetas humanas del 1 al 5 y Gov. Los productos de PCR de una muestra fueron hibridados a dos arreglos, es decir, 4 bloques. Las exploraciones originales tienen manchas rojas y fondo negro. Para una mejor visualización, esto se cambia a escala de grises e invertido. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención da a conocer un método para la determinación del genotipo de antígenos de las células de la sangre, que comprende someter el ADN de un individuo de una especie de mamífero a una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) múltiple para amplificar y marcar de manera detectable una región del locus de, como mínimo, dos antígenos de células de la sangre diferentes que contiene el sitio de polimorfismo de nucleótidos de dicho antígeno de célula de la sangre y utilizar los fragmentos de ADN amplificados de este modo y marcados para determinar el genotipo de cada uno de dichos antígenos de células de la sangre, comprendiendo dichas PCR múltiples el uso de, como mínimo, un par de cebadores quiméricos específicos por un antígeno de células de la sangre para cada antígeno de células de la sangre a determinar el genotipo y, como mínimo, un cebador universal marcado de manera detectable, donde dicho, como mínimo, un cebador universal tiene una secuencia única que no existe en el ADN de dicha especie de mamífero, y donde cada par de cebadores quiméricos comprende un cebador quimérico izquierdo y un cebador quimérico derecho, cada uno de ellos comprendiendo una parte específica por un antígeno de célula de la sangre en el extremo 3' y una parte universal en el extremo 5', donde la secuencia de bases de la parte universal de los cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de bases de dicho, como mínimo, un cebador universal, y donde dichas partes específicas de antígenos de células de la sangre del par de cebadores quiméricos comprenden una región del locus del antígeno de célula de la sangre que contiene el sitio de polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de célula de la sangre.

Más en particular, la presente invención da a conocer un método para determinar el genotipo de antígenos de células de la sangre que comprende someter el ADN de un individuo de una especie de mamífero a una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) múltiple para amplificar y marcar de manera detectable una región del locus de, como mínimo, dos antígenos diferentes de células de la sangre que contiene el sitio de polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de célula de la sangre y que utiliza los fragmentos de ADN amplificados de este modo y marcados para determinar el genotipo de cada uno de dichos antígenos de células de la sangre, comprendiendo dicha PCR múltiple el uso de, como mínimo, un par de cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre para cada antígeno de células de la sangre a ser determinado su genotipo y un par de cebadores universales marcados de manera detectable, donde dicho par de cebadores universales comprende un cebador universal directo y un cebador universal inverso, donde cada uno tiene una secuencia única que no existe en el ADN de dicha especie de mamífero, y donde cada par de cebadores quiméricos comprende un cebador quimérico izquierdo y un cebador quimérico derecho, donde cada uno de ellos comprende una parte específica del antígeno de células de la sangre en el extremo 3' y una parte universal en el extremo 5', donde la secuencia de bases de la parte universal de uno de estos cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de bases de uno de los cebadores universales y la secuencia de bases de la parte universal del otro cebador quimérico se corresponde con la secuencia de bases del otro de los cebadores universales, y donde dichas partes específicas por los antígenos de células de la sangre del par de cebadores quiméricos comprende una región del locus del antígeno de células de la sangre que contiene el sitio del polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de células de la sangre.

La presente invención implica una secuencia particular de pasos que en combinación permite alcanzar los objetivos mencionados anteriormente. Esta secuencia de pasos comprende el aislamiento de ADN a partir de una muestra la cual ha de ser sometida al análisis de determinación de genotipo de la presente invención, seguida por uno de los aspectos clave de la presente invención, una PCR múltiple de los fragmentos de genes que portan los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) que son responsables de las diferencias en los antígenos de células de la sangre. Esta PCR múltiple se aplica a una mezcla de diferentes cebadores, que incluye dos o más pares de cebadores quiméricos y que incluye adicionalmente un cebador universal marcado o un par de cebadores universales marcados. A continuación, los fragmentos de ADN amplificados de este modo y marcados se desnaturalizan (tal como por calentamiento) y se ponen en contacto con un conjunto de sondas, preferentemente contenidas en un microarreglo que comprende una multitud de sondas específicas de alelo, bajo condiciones que soportan la hibridación entre secuencias coincidentes. En el paso siguiente, la presencia de fragmentos marcados se mide para cada mancha en el microarreglo, y finalmente las señales medidas se interpretan para determinar el tipo de la muestra. Las sondas se pueden presentar también en otros formatos, por ejemplo, como sondas soportadas sobre perlas (perlas de vidrio, perlas de poliestireno, etc.) o sondas unidas a la pared de un contenedor adecuado, etc. Un formato de arreglo es, sin embargo, la realización más preferente. ESPECIES

La presente invención permite determinar el genotipo de antígenos de células de la sangre no sólo de humanos, sino de todos los animales con un sistema de antígenos de células de la sangre. Para todos los propósitos prácticos, la determinación del genotipo estará relacionada con los antígenos de células de la sangre de mamíferos, incluyendo, por ejemplo, animales de granja y mascotas, animales de vida silvestre y generalmente todos los animales de valor económico, emocional o de preservación de vida silvestre. Más preferentemente, sin embargo, la presente invención está relacionada con la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre humana. ANTÍGENOS DE CÉLULAS DE LA SANGRE

Los antígenos de células de la sangre a los que se puede determinar el genotipo mediante la presente invención incluyen los antígenos típicos de grupos sanguíneos, tales como Kidd, Duffy, Kell y Rhesus. Así, se puede determinar el genotipo de los antígenos de grupo sanguíneo del sistema ABO por medio de la presente invención, aunque puede ser necesario, debido a su importancia extrema, realizar el ensayo serológico existente y bien aceptado. Otros antígenos de grupos sanguíneos a los que se puede determinar el genotipo por la presente invención, comprenden variantes de antígenos y/o variantes de genes que llevan al silenciamiento génico de los sistemas de grupos sanguíneos MNS, Rhesus (Rh), Kell, Kidd, Duffy, Colton, Diego, Dombrock, Lutheran, Lewis, Cartwright, Landsteiner Wiener (LW), Cromer, Knops, Kx, Indian, Gerbich, Hh, Chido/Rodgers, GIL, I, JMH, OK, P-related, RAPH-MER2, Scianna, Xg, YT, etc.

Además de los antígenos de grupo sanguíneo, se pueden determinar los genotipos de los antígenos de plaquetas y leucocitos (especialmente los de neutrófilos) por el método de la presente invención. Los antígenos de plaquetas clínicamente más relevantes, como mínimo, en el mundo occidental, comprenden HPA-1, HPA-2, HPA3, HPA-4, HPA-5 y Gov (o HPA-15). Otros antígenos de plaquetas a los que se puede determinar el genotipo por la presente invención, aunque éstos son considerados de menor importancia, comprenden, por ejemplo los antígenos de plaquetas humanas de 6 a 14 y 16. Los ejemplos de Antígenos de Neutrófilos Humanos típicos a los que se puede determinar el genotipo por el método de la presente invención incluyen el HNA-1, 4 y 5. El genotipo de otros, tales como el HNA-2 y 3, se puede determinar tan pronto como se elucide su base molecular.

Se concibe que la presente invención es útil incluso cuando sólo se determine el genotipo de un número limitado de antígenos de células sanguíneas. Para algunos propósitos puede ser suficiente que se determine sólo el genotipo de los antígenos de los glóbulos rojos, o sólo de los antígenos de las plaquetas, o sólo un grupo seleccionado de antígenos que es relevante en cierto contexto. El número mínimo de antígenos de células de la sangre a los que se les determine el genotipo por la presente invención es el de dos antígenos de células de la sangre, por ejemplo, el antígeno de células de la sangre RhD y la variante RhDψ del gen RHD, o el antígeno de células de la sangre JK1/2 (Jk3/Jkb) y el antígeno de células de la sangre FY1/2 (Fya/Fyb). Es claramente preferente la determinación del genotipo de un número mayor de antígenos de células de la sangre, por ejemplo tres, cuatro, cinco, y especialmente seis o más. Sin embargo, para la mayoría de los propósitos es preferente una determinación del genotipo más o menos completa, cubriendo, como mínimo, la mayoría de los antígenos relevantes de las células de la sangre. Más preferentemente, la presente invención incluye, como mínimo, seis pares de cebadores quiméricos diferentes específicos de HPA 1 a 5 y HPA-15, y, como mínimo, 10 u 11 ó 12 pares de cebadores quiméricos específicos de antígenos de glóbulos rojos, tales como varios antígenos de Kidd, Duffy, Kell y Rhesus. ADN

El ADN sometido a PCR múltiple será habitualmente ADN genómico del individuo a cuyos antígenos de células de la sangre se deba determinar el genotipo.

El ADN donante se puede obtener de cualquier fuente adecuada, por ejemplo a partir de muestras de sangre tratadas con EDTA, heparina o citrato o capas leucocitarias, utilizando procedimientos de aislamiento y medios bien conocidos para el especialista en la materia, tal como por ejemplo el “Qiagen Blood DNA extraction kit” disponible comercialmente, el uso de un método de precipitación por adición de sales (“salting-out”), tal como mediante el protocolo estándar de Miller y otros (1988), o el uso de Magnapure de Roche. CEBADORES UNIVERSALES

El método de la presente invención usa, como mínimo, un cebador universal que porta una marca detectable, preferentemente un par de cebadores universales ambos portando una marca detectable. La secuencia del cebador o cebadores universales se corresponde con la secuencia de la parte universal del extremo 5' de los cebadores quiméricos. Es posible utilizar sólo un cebador universal. En ese caso, todos los cebadores quiméricos tienen una secuencia de bases idéntica en su extremo 5', es decir, la parte universal del extremo 5' de los cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de dicho cebador universal único. Sin embargo, en la práctica se encontró preferente utilizar dos cebadores universales diferentes (es decir, un par de cebadores universales). En ese caso, cada par de cebadores quiméricos contiene un cebador con una parte universal que corresponde a uno de los cebadores universales y un cebador con una parte universal que corresponde al otro cebador universal.

Es importante que el cebador o cebadores universales no hibriden con el ADN al cual se le determinará el genotipo. Asumiendo que el ADN al que se le determinará el genotipo es ADN genómico humano, el cebador o cebadores universales (y las partes correspondientes de los cebadores quiméricos) no deben hibridar con ADN genómico humano y, por lo tanto, tienen una secuencia única que no existe en dicho ADN. Preferentemente, la secuencia del cebador o cebadores universales difiere significativamente de cualquier secuencia que existe en el genoma humano. Además, es marcadamente preferente que el cebador o cebadores universales se diseñen de tal forma que el valor de Tm sea similar al valor de Tm de la parte de los cebadores quiméricos específica del antígeno de célula de la sangre. Preferentemente, el valor de Tm del cebador o cebadores universales se encuentra entre 50 y 70°C, más preferentemente entre 56 y 65°C. Es también preferente que el cebador o cebadores universales tengan una longitud entre 12 y 30 bases, más preferentemente entre 15 y 25 bases o aún entre 16 y 20 bases.

Se obtuvieron resultados muy buenos con cebadores universales dados a conocer en White y otros, 2002, con las secuencias ggccgcgggaattcgatt (SEQ ID No: 1, MAPH directo), con una Tm de 67,55°C, y gccgcgaattcactagtg (SEQ ID No: 2, MAPH reverso) con una Tm de 57,94°C. MARCADORES DETECTABLES

El cebador o cebadores universales portan un marcador detectable. El marcador puede ser cualquier marcador adecuado para el propósito, tal como un átomo o grupo radioactivo, una enzima, tal como una enzima que cataliza una conversión medible de un sustrato en éste, un colorante, una sustancia fluorescente, una sustancia quimioluminiscente, biotina, etc. Más preferentemente, el marcador es un grupo fluorescente, muchos de los cuales son conocidos por el especialista en la técnica. Ejemplos de éstos son Cy3, Cy5, Fluoresceína (FITC), Ficoeritrina (PE), Rodamina, Hex, Tet, Fam, etc.

De la forma más preferente, la presente invención utiliza el grupo fluorescente Cy5, que es un colorante de sulfoindocianina (Mujumdar y otros, 1993).

Comúnmente, en particular cuando el marcador es una entidad unida al oligonucleótido, estará unido al extremo 5’ de la secuencia de oligonucleótido del cebador o cebadores universales.

Debido a que el cebador o cebadores universales están marcados, mientras que los cebadores quiméricos no están marcados, la presente invención consigue un marcado muy eficiente simultáneamente con la amplificación, mientras que los diversos cebadores quiméricos se pueden utilizar sin marcado previo. CEBADORES QUIMÉRICOS

Los cebadores quiméricos utilizados en la presente invención tienen una parte universal en su extremo 5’ y una parte específica por un antígeno de células de la sangre en su extremo 3’. La secuencia de oligonucleótido de la parte universal se corresponde con la secuencia del cebador o cebadores universales y no requiere de mayor elucidación en el presente documento.

Como ocurre con la parte de los cebadores quiméricos específica del antígeno de las células de la sangre, es más preferente que estas partes tengan valores de Tm similares, tanto en comparación con las partes específicas del antígeno de células de la sangre de otros cebadores quiméricos en la mezcla, como en comparación con los cebadores universales utilizados. Por lo tanto, es preferente que estas partes de los cebadores quiméricos específicas de antígenos de células de la sangre tengan valores de Tm entre 50 y 70°C, más preferentemente entre 55 y 65°C, y de la forma más preferente entre 56 y 62°C. Es preferente también que las partes de los cebadores quiméricos específicas por los antígenos de las células de la sangre tengan una longitud de entre 12 y 35 bases, más preferentemente entre 15 y 30 o incluso entre 16 y 25 bases.

Es preferente además que las partes de los cebadores quiméricos específicas de antígenos de células de la sangre se seleccionen de tal forma que la amplificación por PCR resulte en productos de oligonucleótidos con una longitud de entre 50 y 800, preferentemente entre 80 y 500, de la forma más preferente entre 100 y 400 ó 300 nucleótidos. Una longitud del producto de entre 100 y 200 nucleótidos sería ideal.

Hay disponibles varios productos de software que se pueden utilizar para diseñar partes adecuadas de los cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre. Sobre la base de secuencias de ADN disponibles públicamente de genes que codifican antígenos de células de la sangre, el producto de software Primer3 (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3 www.cgi) permite diseñar los cebadores. Para verificar cualquier unión inespecífica de ADN genómico se puede utilizar la base de datos CELERA y para verificar cualquier formación de dímeros de cebadores se puede utilizar el software Oligo6 (Medprobe). Es

preferente seleccionar cebadores con una ΔG calculada inferior a

10 kcal/mol.

Una lista de los cebadores quiméricos preferentes RhDVI-izquierdo (dir) ggccgcgggaattcgattctttgaattaagcacttcacaga

incluye los siguientes:

HPA1-izquierdo

gccgcgaattcactagtgcttcaggtcacagcgaggt SEQ ID

No: 3

HPA1-derecho

ggccgcgggaattcgattgctccaatgtacggggtaaa SEQ ID

No: 4

HPA2-izquierdo

gccgcgaattcactagtgtgaaaggcaatgagctgaag SEQ ID

No: 5

HPA2-derecho

ggccgcgggaattcgattagccagactgagcttctcca SEQ ID

No: 6

HPA3-izquierdo

gccgcgaattcactagtggcctgaccactcctttgc SEQ ID

No: 7

HPA3-derecho

ggccgcgggaattcgattggaagatctgtctgcgatcc SEQ ID

No: 8

HPA4-izquierdo

gccgcgaattcactagtgatccgcaggttactggtgag SEQ ID

No: 9

HPA4-derecho

ggccgcgggaattcgattccatgaaggatgatctgtgg SEQ ID

No:

10

HPA5-izquierdo

gccgcgaattcactagtgtccaaatgcaagttaaattaccag

SEQ ID No: 11

HPA5-derecho

ggccgcgggaattcgattacagacgtgctcttggtaggt SEQ ID

No: 12

HPA15-izquierdo

gccgcgaattcactagtgtgtatcagttcttggttttgtgatg

SEQ ID No: 13

HPA15-derecho

ggccgcgggaattcgattaaaaccagtagccacccaag SEQ ID

No: 14

JK1/2-izquierdo

gccgcgaattcactagtggtctttcagccccatttgag SEQ ID

No: 15

JK1/2-derecho

ggccgcgggaattcgattgttgaaaccccagagtccaa SEQ ID

No: 16

FY1/2-izquierdo

gccgcgaattcactagtggaattcttcctatggtgtgaatga

SEQ ID No: 17

FY1/2-derecho

ggccgcgggaattcgattaagaagggcagtgcagagtc SEQ ID

No: 18

GATAbox-izquierdo gccgcgaattcactagtgggccctcattagtccttgg

SEQ ID

No: 19

GATAbox-derecho

ggccgcgggaattcgattgaaatgaggggcatagggata SEQ ID

No: 20

Fyx-izquierdo

gccgcgaattcactagtgtcatgcttttcagacctctcttcSEQ ID

No: 175

Fyx-derecho ggccgcgggaattcgattcaagacgggcaccacaat

SEQ ID

No: 176

KEL1/2-izquierdo gccgcgaattcactagtgaagggaaatggccatactga

SEQ ID

No: 21

KEL1/2-derecho ggccgcgggaattcgattagctgtgtaagagccgatcc

SEQ ID

No: 22

KEL3/4-izquierdo gccgcgaattcactagtggcctcagaaactggaacagc

SEQ ID

No: 23

KEL3/4-derecho ggccgcgggaattcgattagcaaggtgcaagaacactct

SEQ ID

No: 24

KEL6/7-izquierdo gccgcgaattcactagtggcagcaccaaccctatgttc

SEQ ID

No: 177

KEL6/7-derecho ggccgcgggaattcgatttcaggcacaggtgagcttc

SEQ ID

No: 178

RHCEex2for gccgcgaattcactagtgcgtctgcttccccctcc

SEQ ID

No: 25

RHex2rev ggccgcgggaattcgattctgaacagtgtgatgaccacc

SEQ ID

No: 26

RHDex3-izquierdo gccgcgaattcactagtgtcctggctctccctctct

SEQ ID

No: 179

RHCEex3-derecho ggccgcgggaattcgatttttttcaaaaccccggaag

SEQ ID

No: 180

RHCEex5-izquierdo gccgcgaattcactagtgggatgttctggccaagtg

SEQ ID

No: 27

RHex5rev ggccgcgggaattcgattggctgtcaccacactgactg

SEQ ID

No: 28

RHDψ-izquierdo ggccgcgggaattcgattgtagtgagctggcccatca

SEQ ID

No: 29

RHDψ-derecho gccgcgaattcactagtgtgtctagtttcttaccggcaagtSEQ

ID

No: 30

RHD-izquierdoB gccgcgaattcactagtgttataataacacttgtccacaggg

SEQ ID No: 31

RHD-derechoC ggccgcgggaattcgattcggctccgacggtatc

SEQ ID

No: 32

BigC-izquierdo gccgcgaattcactagtgggccaccaccatttgaa

SEQ ID

No: 33

BigC-intrónderecho2 ggccgcgggaattcgattccatgaacatgccacttcac

SEQ ID No: 34

SEQ ID No: 181

RhDVI-derecho (inv)

gccgcgaattcactagtggccagaatcacactcctgct

SEQ ID No: 182

MN-izquierdo

gccgcgaattcactagtgtgagggaatttgtcttttgca SEQ ID

No: 35

MN-derecho

ggccgcgggaattcgattcagaggcaagaattcctcca SEQ ID

No: 36

Ss-izquierdo

gccgcgaattcactagtgtttttctttgcacatgtcttt SEQ ID

No: 183

Ss-derecho

ggccgcgggaattcgatttctttgtctttacaatttcgtgtg

SEQ ID No: 184

U-izquierdo

gccgcgaattcactagtgcgctgatgttatctgtcttatttttc

SEQ ID No: 37

U-derecho

ggccgcgggaattcgattgatcgttccaataataccagcc SEQ ID

No: 38

DO-izquierdo

ggccgcgggaattcgatttgatccctccctatgagctg SEQ ID

No: 185

DO-derecho

gccgcgaattcactagtgttatatgtgctcaggttcccagtSEQ ID

No: 186

JO-izquierdo

gccgcgaattcactagtgcctggcttaaccaaggaaaa SEQ ID

No: 39

JO-derecho

ggccgcgggaattcgatttcatactgctgtggagtcctg SEQ ID

No: 40

Colton-izquierdo

gccgcgaattcactagtggccacgaccctctttgtct SEQ ID

No: 187

Colton-derecho

ggccgcgggaattcgatttacatgagggcacggaagat SEQ ID

No: 188

Diego-izquierdo

gccgcgaattcactagtgacttattcacgggcatccag SEQ ID

No: 189

Diego-derecho

ggccgcgggaattcgattaagctccacgttcctgaaga SEQ ID

No: 190

Wr-izquierdo

gccgcgaattcactagtgggcttcaaggtgtccaactc SEQ ID

No: 636

Wr-derecho

ggccgcgggaattcgattaggatgaagaccagcagagc SEQ ID

No: 637

Yt-izquierdo

ggccgcgggaattcgattccttcgtgcctgtggtagat SEQ ID

No: 638

Yt-derecho

gccgcgaattcactagtgttctgggacttctgggaatg SEQ ID

No: 639

Lu-izquierdo

gccgcgaattcactagtgggacccagagagagagagactg SEQ ID

No: 640 Lu-derecho ggccgcgggaattcgattgggagtccagctggtatgg SEQ ID No: 641.

Los más preferentes son los cebadores quiméricos con SEQ ID No:3 a 40.

Los productos de software mencionados anteriormente permitirían al especialista en la técnica diseñar cebadores adicionales para otros antígenos de células de la sangre. La presente invención comprende el uso de un conjunto de cebadores quiméricos similares que tienen la misma parte específica de antígenos de células de la sangre pero una parte universal diferente. PROPORCIONES DE LOS CEBADORES

Para alcanzar los objetivos de la presente invención, y en particular evitar la ocurrencia de dímeros de cebadores tanto como sea posible, es importante que sólo se use una proporción mínima de los cebadores quiméricos y la amplificación se deba en mayor medida a la elongación de los cebadores universales. En la práctica, es preferente que los cebadores universales se usen en una cantidad molar que en, como mínimo, 10 veces, más preferentemente, como mínimo, 40 veces la cantidad molar de cada cebador quimérico. En la reacción de amplificación es preferente 5 nM de cada cebador quimérico y 0,2 µM de cada cebador universal por par de cebadores quiméricos. Por microlitro de volumen de reacción sería preferente una cantidad de 5 femtomol (5*10-15 mol) de cada cebador quimérico, mientras que se usa aproximadamente 0,2 pmol (0,2*10-12 mol) de cada cebador universal por par de cebadores quiméricos. CONDICIONES DE PCR MÚLTIPLE

La PCR múltiple en el método de la presente invención utiliza una mezcla de cebadores universales y quiméricos, que están presentes desde el principio de la reacción. La PCR tal como se usa en la presente invención, no distingue entre una primera parte separada, en la que sólo se extienden los cebadores quiméricos, y una segunda parte en la cual sólo se extienden los cebadores universales. La presente invención aplica una temperatura de alineamiento o de extensión del cebador en los ciclos posteriores por PCR que es la misma que la temperatura de alineamiento o de extensión de los cebadores usada en los primeros ciclos por PCR. Los presentes inventores encontraron que no es necesario un cambio en las condiciones de reacción con el fin de cambiar de la extensión del cebador quimérico a la extensión del cebador universal.

La ADN polimerasa usada en la PCR múltiple es preferentemente una ADN polimerasa resistente al calor, tal como la Taq ADN polimerasa. Otras polimerasas resistentes al calor son útiles también, e incluso las ADN polimerasas sensibles al calor, aunque esto puede requerir de la adición de una cantidad fresca de ADN polimerasa. Las polimerasas adecuadas están disponibles comercialmente, por ejemplo como componente de los kits de PCR múltiple, como el Qiagen múltiple kit. Tales kits contienen también otros componentes necesarios, como los dNTP y un sistema de tampón adecuado.

El aparato para llevar a cabo el termociclado de PCR está disponible comercialmente también, por ejemplo, el termociclador MWG AG Biotech PrimusHT.

La amplificación de la presente invención comienza habitualmente con un tratamiento térmico para activar la ADN polimerasa, por ejemplo, 15 min a 95°C. A continuación, comienza el ciclado térmico. Cada ciclo incluye un paso de desnaturalización por calor, un paso de alineamiento (para unir el cebador por hibridación a su molde) y una extensión de cebador o paso de elongación. En la presente invención, es preferente que el paso de desnaturalización térmica incluya el calentamiento a una temperatura de 90 a 98°C, más preferentemente a aproximadamente 94 ó 95°C, y dure un tiempo de entre 15 y 60 segundos (se admiten tiempos más cortos y especialmente más largos), más preferentemente unos 30 segundos. En la presente invención, es preferente además que el paso de alineamiento implique el calentamiento a una temperatura de 54 a 60°C, más preferentemente de aproximadamente 57°C, y dure un tiempo de 60 a 120 segundos (se admiten tiempos más cortos y especialmente más largos), más preferentemente de aproximadamente 90 segundos. En la presente invención, es preferente además que el paso de extensión del cebador implique un calentamiento a una temperatura de 68 a 76°C, más preferentemente de aproximadamente 72°C, y dure un tiempo de 60 a 120 segundos (se admiten tiempos más cortos y especialmente más largos), más preferentemente aproximadamente 90 segundos. Un tratamiento final a la temperatura del paso de extensión del cebador por un tiempo mucho más largo, por ejemplo 10 minutos, puede concluir el ciclado térmico.

El número total de ciclos se puede elegir a voluntad, en dependencia del tiempo disponible y la precisión buscada. Un total de 30 ciclos puede ser suficiente, pero 40 ó 45 ó 50 ciclos o más es preferente. DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO

El resultado por PCR múltiple es una mezcla de productos de amplificación marcados, en la que idealmente cada producto comprende esencialmente una región del locus de diferentes antígenos de células de la sangre, que contiene el sitio de polimorfismo de nucléotido de dicho antígeno de células de la sangre. En la mayoría de los casos del polimorfismo de antígenos de células de la sangre conocidos actualmente, el polimorfismo de nucleótido es un polimorfismo de nucléotido simple (SNP), pero los

sitios

de polimorfismo que cubren más de un nucleótido están

incluidos también.

Para

analizar los SNP presentes en la mezcla de

productos marcados de la amplificación hay disponibles varias estrategias, incluyendo la secuenciación de los productos, pero muchas de estas no son adecuadas para una determinación del genotipo de alto rendimiento rápida y fiable. La presente invención aplica, por lo tanto, preferentemente el paso especial de poner en contacto los productos por PCR múltiple con un arreglo de ADN que contiene las sondas de oligonucleótidos específicos de alelo de antígenos de células de la sangre. Dicho contacto se realiza después de la desnaturalización, por ejemplo por calentamiento, de los productos oligonucleotídicos de la amplificación y bajo condiciones adecuadas para la hibridación de estos productos a las sondas correspondientes en el arreglo. La purificación de los productos de la amplificación no es necesaria antes de ponerlos en contacto con las sondas y habitualmente será omitida. SONDAS

Las sondas son oligonucleótidos que incluyen el sitio de polimorfismo de nucleótido. Por lo tanto, éstos son específicos de alelo. Aunque su longitud puede variar desde sólo 8 ó 10 nucleótidos hasta varios cientos de nucleótidos, en la presente invención es preferente utilizar sondas con una longitud de 15 a 40 nucleótidos, más preferentemente de 16 ó 17 a 29 ó 30 nucleótidos. Preferentemente, todas las sondas tienen valores de Tm similares, en particular en un intervalo de 55 a 75°C, más preferentemente en el intervalo de 60 a 70°C o especialmente en el intervalo de 60 a 65°C.

Aunque en principio es posible utilizar sólo una sonda por cada alelo de cada antígeno de células de la sangre, la presente invención aplica varias sondas por cada alelo de cada antígeno de células de la sangre, incrementando de esta forma la fiabilidad del método. De acuerdo con esta invención, el arreglo contiene, como mínimo, dos, preferentemente, como mínimo, cinco sondas directas diferentes por cada alelo de cada antígeno de células de la sangre y, como mínimo, dos, preferentemente, como mínimo, cinco sondas inversas, donde cada una de éstas cubre el sitio de polimorfismo de nucleótido pero en posiciones que varían. Estas posiciones se encuentran preferentemente en el centro de los oligos o cerca del mismo.

Hay varios productos de software disponibles, tal como se mencionó anteriormente para las partes de los cebadores específicas de antígenos de células de la sangre, que se pueden utilizar para diseñar sondas adecuadas específicas de alelo de antígenos de células de la sangre (en particular, el producto de software Primer3).

Una lista de las sondas preferentes incluye las siguientes (los SNP están resaltados):

Alelo HPA1 a: HPA-1aa tacaggccctgcctctggg SEQ ID No: 41 HPA-1ab aggccctgcctctgggct SEQ ID No: 42 HPA-1ac ccctgcctctgggctcacc SEQ ID No: 43 HPA-1ad tgcctctgggctcacctcg SEQ ID No: 44 HPA-1ae ctctgggctcacctcgctg SEQ ID No: 45 HPA-1aa CR cagcgaggtgagcccagag SEQ ID No: 46 HPA-1ab CR cgaggtgagcccagaggca SEQ ID No: 47 HPA-1ac CR ggtgagcccagaggcaggg SEQ ID No: 48 HPA-1ad CR agcccagaggcagggcct SEQ ID No: 49 HPA-1ae CR cccagaggcagggcctgta SEQ ID No: 50

Alelo HPA1 b: HPA-1ba tacaggccctgcctccggg SEQ ID No: 51 HPA-1bb aggccctgcctccgggct SEQ ID No: 52 HPA-1bc ccctgcctccgggctcac SEQ ID No: 53 HPA-1bd ctgcctccgggctcacct SEQ ID No: 54 HPA-1be ctccgggctcacctcgct SEQ ID No: 55 HPA-1ba CR agcgaggtgagcccggag SEQ ID No: 56 HPA-1bb CR aggtgagcccggaggcag SEQ ID No: 57 HPA-1bc CR gtgagcccggaggcaggg SEQ ID No: 58 HPA-1bd CR agcccggaggcagggcct SEQ ID No: 59 HPA-1be CR cccggaggcagggcctgta SEQ ID No: 60

Alelo HPA2 a: HPA-2aa ctgacgcccacacccaag SEQ ID No: 61 HPA-2ab ctcctgacgcccacaccc SEQ ID No: 62 HPA-2ac ggctcctgacgcccacac SEQ ID No: 63 HPA-2ad agggctcctgacgcccac SEQ ID No: 64 HPA-2ae ccagggctcctgacgccc SEQ ID No: 65 HPA-2aa CR cttgggtgtgggcgtcag SEQ ID No: 66 HPA-2ab CR gggtgtgggcgtcaggag SEQ ID No: 67 HPA-2ac CR gtgtgggcgtcaggagcc SEQ ID No: 68 HPA-2ad CR gtgggcgtcaggagccct SEQ ID No: 69 HPA-2ae CR gggcgtcaggagccctgg SEQ ID No: 70

Alelo HPA2 b: HPA-2ba cctgatgcccacacccaag SEQ ID No: 71 HPA-2bb ctcctgatgcccacaccca SEQ ID No: 72 HPA-2bc ggctcctgatgcccacacc SEQ ID No: 73 HPA-2bd agggctcctgatgcccaca SEQ ID No: 74 HPA-2be ccagggctcctgatgccc SEQ ID No: 75 HPA-2ba CR cttgggtgtgggcatcagg SEQ ID No: 76 HPA-2bb CR tgggtgtgggcatcaggag SEQ ID No: 77 HPA-2bc CR ggtgtgggcatcaggagcc SEQ ID No: 78 HPA-2bd CR tgtgggcatcaggagccct SEQ ID No: 79 HPA-2be CR gggcatcaggagccctgg SEQ ID No: 80

Alelo HPA3 a: HPA-3 aa ccatccccagcccctccc SEQ ID No: 81 HPA-3ab gcccatccccagcccctc SEQ ID No: 82 HPA-3ac ctgcccatccccagcccc SEQ ID No: 83 HPA-3ad1 gctgcccatccccagccc SEQ ID No: 84 HPA-3 ad ggctgcccatccccagcc SEQ ID No: 85 HPA-3ad2 gggctgcccatccccagc SEQ ID No: 86 HPA-3ae ggggctgcccatcccca SEQ ID No: 87 HPA-3 aa CR gggaggggctggggatgg SEQ ID No: 88 HPA-3ab CR gaggggctggggatgggc SEQ ID No: 89 HPA-3ac CR ggggctggggatgggcag SEQ ID No: 90 HPA-3ad1 CR gggctggggatgggcagc SEQ ID No: 91 HPA-3ad CR ggctggggatgggcagcc SEQ ID No: 92 HPA-3ad2 CR gctggggatgggcagccc SEQ ID No: 93 HPA-3ae CR tggggatgggcagcccc SEQ ID No: 94

Alelo HPA3 b: HPA-3ba ccagccccagcccctcc SEQ ID No: 95 HPA-3bb gcccagccccagcccct SEQ ID No: 96 HPA-3bc ctgcccagccccagccc SEQ ID No: 97 HPA-3bd1 gctgcccagccccagcc SEQ ID No: 98 HPA-3bd ggctgcccagccccagc SEQ ID No: 99 HPA-3bd2 gggctgcccagccccag SEQ ID No: 100 HPA-3be ggggctgcccagcccca SEQ ID No: 101 HPA-3ba CR ggaggggctggggctgg SEQ ID No: 102 HPA-3bb CR aggggctggggctgggc SEQ ID No: 103 HPA-3bc CR gggctggggctgggcag SEQ ID No: 104 HPA-3bd1 CR ggctggggctgggcagc SEQ ID No: 105 HPA-3bd CR gctggggctgggcagcc SEQ ID No: 106 HPA-3bd2 CR ctggggctgggcagccc SEQ ID No: 107 HPA-3be CR tggggctgggcagcccc SEQ ID No: 108

Alelo HPA4 a: HPA-4aa gccacccagatgcgaaag SEQ ID No: 109 HPA-4ab cacccagatgcgaaagct SEQ ID No: 110 HPA-4ac cccagatgcgaaagctca SEQ ID No: 111 HPA-4ad cagatgcgaaagctcacc SEQ ID No: 112 HPA-4ae gatgcgaaagctcaccag SEQ ID No: 113 HPA-4aa CR ctggtgagctttcgcatc SEQ ID No: 114 HPA-4ab CR ggtgagctttcgcatctg SEQ ID No: 115 HPA-4ac CR tgagctttcgcatctggg SEQ ID No: 116 HPA-4ad CR agctttcgcatctgggtg SEQ ID No: 117 HPA-4ae CR ctttcgcatctgggtggc SEQ ID No: 118

Alelo HPA4 b: HPA-4ba gccacccagatgcaaaag SEQ ID No: 119 HPA-4bb ccacccagatgcaaaagct SEQ ID No: 120 HPA-4bc acccagatgcaaaagctcac SEQ ID No: 121 HPA-4bd cagatgcaaaagctcacca SEQ ID No: 122 HPA-4be gatgcaaaagctcaccagtaa SEQ ID No: 123 HPA-4ba CR ttactggtgagcttttgcatc SEQ ID No: 124 HPA-4bb CR tggtgagcttttgcatctg SEQ ID No: 125 HPA-4bc CR gtgagcttttgcatctgggt SEQ ID No: 126 HPA-4bd CR agcttttgcatctgggtgg SEQ ID No: 127 HPA-4be CR cttttgcatctgggtggc SEQ ID No: 128

Alelo HPA5 a:

HPA-5aa gagtctacctgtttactatcaaagagg SEQ ID No: 129

HPA-5ab agtctacctgtttactatcaaagaggta SEQ ID No: 130 HPA-5ac gtctacctgtttactatcaaagaggtaa SEQ ID No: 131 HPA-5ad ctacctgtttactatcaaagaggtaaaa SEQ ID No: 132 HPA-5ae acctgtttactatcaaagaggtaaaaa SEQ ID No: 133 HPA-5aa CR tttttacctctttgatagtaaacaggt SEQ ID No: 134 HPA-5ab CR ttttacctctttgatagtaaacaggtag SEQ ID No: 135 HPA-5ac CR ttacctctttgatagtaaacaggtagac SEQ ID No: 136 HPA-5ad CR tacctctttgatagtaaacaggtagact SEQ ID No: 137 HPA-5ae CR cctctttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID No: 138

Alelo HPA5 b: HPA-5ba gagtctacctgtttactatcaaaaagg SEQ ID No: 139 BPA-5bb agtctacctgtttactatcaaaaaggta SEQ ID No: 140 HPA-5bc gtctacctgtttactatcaaaaaggtaa SEQ ID No: 141 HPA-5ad ctacctgtttactatcaaaaaggtaaaa SEQ ID No: 142 HPA-5be acctgtttactatcaaaaaggtaaaaa SEQ ID No: 143 HPA-5ba CR tttttacctttttgatagtaaacaggt SEQ ID No: 144 HPA-5bb CR ttttacctttttgatagtaaacaggtag SEQ ID No: 145 HPA-5bc CR ttacctttttgatagtaaacaggtagac SEQ ID No: 146 HPA-5bd CR tacctttttgatagtaaacaggtagact SEQ ID No: 147 HPA-5be CR cctttttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID No: 148

Alelo HPA15 a: Gov-aa ttattatcttgacttcagttacaggattt SEQ ID No: 149 Gov-ab tcttgacttcagttacaggatttacc SEQ ID No: 150 Gov-ac tgacttcagttacaggatttaccaa SEQ ID No: 151 Gov-ad cttcagttacaggatttaccaagaat SEQ ID No: 152 Gov-ae cagttacaggatttaccaagaatttg SEQ ID No: 153 Gov-aa CR caaattcttggtaaatcctgtaactg SEQ ID No: 154 Gov-ab CR attcttggtaaatcctgtaactgaag SEQ ID No: 155 Gov-ac CR tggtaaatcctgtaactgaagtcaa SEQ ID No: 156 Gov-ad CR ggtaaatcctgtaactgaagtcaaga SEQ ID No: 157 Gov-ae CR aaatcctgtaactgaagtcaagataataa SEQ ID No: 158

Alelo HPA15 b: Gov-ba tatcttgacttcagttccaggatt SEQ ID No: 159 Gov-bb cttgacttcagttccaggatttac SEQ ID No: 160 Gov-bc gacttcagttccaggatttacca SEQ ID No: 161 Gov-bd ttcagttccaggatttaccaag SEQ ID No: 162 Gov-be cagttccaggatttaccaagaatt SEQ ID No: 163 Gov-ba CR aattcttggtaaatcctggaactg SEQ ID No: 164 Gov-bb CR cttggtaaatcctggaactgaa SEQ ID No: 165 Gov-bc CR ggtaaatcctggaactgaagtca SEQ ID No: 166

Gov-bd CR gtaaatcctggaactgaagtcaag SEQ ID No: 167 Gov-be CR aatcctggaactgaagtcaagata SEQ ID No: 168

Alelo Colton a: Co.a.1 aacaaccagacggcggt SEQ ID No: 191 Co.a.2 accagacggcggtccag SEQ ID No: 192 Co.a.3 cagacggcggtccagga SEQ ID No: 193 Co.a.4 gacggcggtccaggacaa SEQ ID No: 194 Co.a.5 cggcggtccaggacaac SEQ ID No: 195 Co.a.1.cr gttgtcctggaccgccgt SEQ ID No: 196 Co.a.2.cr tcctggaccgccgtctg SEQ ID No: 197 Co.a.3.cr ctggaccgccgtctggt SEQ ID No: 198 Co.a.4.cr ggaccgccgtctggttg SEQ ID No: 199 Co.a.5.cr accgccgtctggttgtt SEQ ID No: 200

Alelo Colton b: Co.b.1 ggaacaaccagacggtggt SEQ ID No: 201 Co.b.2 acaaccagacggtggtccag SEQ ID No: 202 Co.b.3 accagacggtggtccagga SEQ ID No: 203 Co.b.4 gacggtggtccaggacaacg SEQ ID No: 204 Co.b.5 cggtggtccaggacaacg SEQ ID No: 205 Co.b.1.cr cgttgtcctggaccaccgt SEQ ID No: 206 Co.b.2.cr ttgtcctggaccaccgtctg SEQ ID No: 207 Co.b.3.cr ctggaccaccgtctggttgt SEQ ID No: 208 Co.b.4.cr ggaccaccgtctggttgttc SEQ ID No: 209 Co.b.5.cr accaccgtctggttgttcc SEQ ID No: 210

Alelo Diego a: Di.a.1 gtgaagtccacgccggc SEQ ID No: 211 Di.a.2 gaagtccacgccggcct SEQ ID No: 212 Di.a.3 agtccacgccggcctcc SEQ ID No: 213 Di.a.4 tccacgccggcctccct SEQ ID No: 214 Di.a.5 acgccggcctccctggcc SEQ ID No: 215 Di.a.1.cr gccagggaggccggcgt SEQ ID No: 216 Di.a.2.cr agggaggccggcgtgga SEQ ID No: 217 Di.a.3.cr ggaggccggcgtggact SEQ ID No: 218 Di.a.4.cr aggccggcgtggacttc SEQ ID No: 219 Di.a.5.cr ggccggcgtggacttca SEQ ID No: 220

Alelo Diego b: Di.b.1 ggtgaagtccacgctggc SEQ ID No: 221 Di.b.2 gtgaagtccacgctggcct SEQ ID No: 222 Di.b.3 tgaagtccacgctggcctcc SEQ ID No: 223 Di.b.4 gaagtccacgctggcctccct SEQ ID No: 224 Di.b.5 acgctggcctccctggccc SEQ ID No: 225 Di.b.1.cr ggccagggaggccagcgt SEQ ID No: 226 Di.b.2.cr cagggaggccagcgtgga SEQ ID No: 227 Di.b.3.cr agggaggccagcgtggact SEQ ID No: 228 Di.b.4.cr ggaggccagcgtggacttc SEQ ID No: 229 Di.b.5.cr ggccagcgtggacttcacc SEQ ID No: 230

Alelo Diego Wr a: Wr.a.1 tgggcttgcgttccaagt SEQ ID No: 231 Wr.a.2 ggcttgcgttccaagtttc SEQ ID No: 232 Wr.a.3 ttgcgttccaagtttccca SEQ ID No: 233 Wr.a.4 cgttccaagtttcccatct SEQ ID No: 234 Wr.a.5 tccaagtttcccatctgga SEQ ID No: 235 Wr.a.1 CR tccagatgggaaacttgga SEQ ID No: 236 Wr.a.2 CR agatgggaaacttggaacg SEQ ID No: 237 Wr.a.3 CR tgggaaacttggaacgcaa SEQ ID No: 238 Wr.a.4 CR gaaacttggaacgcaagcc SEQ ID No: 239 Wr.a.5 CR acttggaacgcaagccca SEQ ID No: 240

Alelo Diego Wr b: Wr.b.1 gggcttgcgttccgagtt SEQ ID No: 241 Wr.b.2 gcttgcgttccgagtttc SEQ ID No: 242 Wr.b.3 ttgcgttccgagtttccc SEQ ID No: 243 Wr.b.4 cgttccgagtttcccatc SEQ ID No: 244 Wr.b.5 tccgagtttcccatctgg SEQ ID No: 245 Wr.b.1 CR ccagatgggaaactcgga SEQ ID No: 246 Wr.b.2 CR gatgggaaactcggaacg SEQ ID No: 247 Wr.b.3 CR gggaaactcggaacgcaa SEQ ID No: 248 Wr.b.4 CR gaaactcggaacgcaagc SEQ ID No: 249 Wr.b.5 CR aactcggaacgcaagccc SEQ ID No: 250

Alelo Dombrock a: Do.a.1 taccacccaagaggaaact SEQ ID No: 251 Do.a.2 ccacccaagaggaaactgg SEQ ID No: 252 Do.a.3 acccaagaggaaactggttg SEQ ID No: 253 Do.a.4 caagaggaaactggttgca SEQ ID No: 254 Do.a.5 aggaaactggttgcagttga SEQ ID No: 255 Do a 6 cr ctcaactgcaaccagtttcc SEQ ID No: 256 Do a 7 cr caactgcaaccagtttcctc SEQ ID No: 257 Do a 8 cr tgcaaccagtttcctcttgg SEQ ID No: 258 Do a 9 cr accagtttcctcttgggtgg SEQ ID No: 259 Do a 10 cr cagtttcctcttgggtggta SEQ ID No: 260

Alelo Dombrock b: Do.b.1 taccacccaagaggagact SEQ ID No: 261 Do.b.2 ccacccaagaggagactgg SEQ ID No: 262 Do.b.3 acccaagaggagactggttg SEQ ID No: 263 Do.b.4 caagaggagactggttgca SEQ ID No: 264 Do.b.5 aggagactggttgcagttga SEQ ID No: 265 Do b 6 cr ctcaactgcaaccagtctcc SEQ ID No: 266 Do b 7 cr caactgcaaccagtctcctc SEQ ID No: 267 Do b 8 cr tgcaaccagtctcctcttgg SEQ ID No: 268 Do b 9 cr accagtctcctcttgggtgg SEQ ID No: 269 Do b 10 cr cagtctcctcttgggtggt SEQ ID No: 270 Alelo Dombrock-Joseph(a) positivo: Jo.a.pos.1 ccccagaacatgactaccac SEQ ID No: 271 Jo.a.pos.2 ccagaacatgactaccacaca SEQ ID No: 272 Jo.a.pos.3 agaacatgactaccacacacgc SEQ ID No: 273 Jo.a.pos.4 catgactaccacacacgctgt SEQ ID No: 274 Jo.a.pos.5 actaccacacacgctgtgg SEQ ID No: 275 Jo.a.pos.1.cr gccacagcgtgtgtggtagt SEQ ID No: 276 Jo.a.pos.2.cr acagcgtgtgtggtagtcatg SEQ ID No: 277 Jo.a.pos.3.cr agcgtgtgtggtagtcatgtt SEQ ID No: 278 Jo.a.pos.4.cr cgtgtgtggtagtcatgttctg SEQ ID No: 279 Jo.a.pos.5.cr gtggtagtcatgttctgggg SEQ ID No: 280 Alelo Dombrock-Joseph(a) negativo: Jo.a.neg.1 ctaccccagaacatgactatcac SEQ ID No: 281 Jo.a.neg.2 cccagaacatgactatcacaca SEQ ID No: 282 Jo.a.neg.3 cagaacatgactatcacacacgc SEQ ID No: 283 Jo.a.neg.4 catgactatcacacacgctgtg SEQ ID No: 284 Jo.a.neg.5 actatcacacacgctgtggc SEQ ID No: 285 Jo.a.neg.1.cr aatagccacagcgtgtgtgatagt SEQ ID No:

Jo.a.neg.2.cr cacagcgtgtgtgatagtcatg SEQ ID No: 287 Jo.a.neg.3.cr cagcgtgtgtgatagtcatgtt SEQ ID No: 288 Jo.a.neg.4.cr cgtgtgtgatagtcatgttctgg SEQ ID No: 289 Jo.a.neg.5.cr gtgatagtcatgttctggggtag SEQ ID No: 290 Alelo Duffy a: Fy.A.1 ccagatggagactatggtgcc SEQ ID No: 291 Fy.A.2 atggagactatggtgccaac SEQ ID No: 292 Fy.A.3 ggagactatggtgccaacctg SEQ ID No: 293 Fy.A.4 gactatggtgccaacctgga SEQ ID No: 294 Fy.A.5 tatggtgccaacctggaag SEQ ID No: 295

Fy.A.1.cr cttccaggttggcaccata SEQ ID No: 296 Fy.A.2.cr tccaggttggcaccatagtc SEQ ID No: 297 Fy.A.3.cr aggttggcaccatagtctcc SEQ ID No: 298 Fy.A.4.cr gttggcaccatagtctccat SEQ ID No: 299 Fy.A.5.cr gcaccatagtctccatctgg SEQ ID No: 300 Alelo Duffy b: Fy.B.1 cccagatggagactatgatgcc SEQ ID No: 301 Fy.B.2 gatggagactatgatgccaac SEQ ID No: 302 Fy.B.3 tggagactatgatgccaacctg SEQ ID No: 303 Fy.B.4 gactatgatgccaacctggaa SEQ ID No: 304 Fy.B.5 tatgatgccaacctggaagc SEQ ID No: 305 Fy.B.1.cr gcttccaggttggcatcata SEQ ID No: 306 Fy.B.2.cr ttccaggttggcatcatagtc SEQ ID No: 307 Fy.B.3.cr caggttggcatcatagtctcc SEQ ID No: 308 Fy.B.4.cr gttggcatcatagtctccatc SEQ ID No: 309 Fy.B.5.cr gcatcatagtctccatctggg SEQ ID No: 310 Alelo Duffy GATAbox normal: Fy.GATA.normal.1 agtccttggctcttatcttg SEQ ID No: 311 Fy.GATA.normal.2 agtccttggctcttatcttgga SEQ ID No: 312 Fy.GATA.normal.3 cttggctcttatcttggaagc SEQ ID No: 313 Fy.GATA.normal.4 gctcttatcttggaagcacagg SEQ ID No: 314 Fy.GATA.normal.5 cttatcttggaagcacaggcgc SEQ ID No: 315 Fy.GATA.normal.1.cr gcctgtgcttccaagataag SEQ ID No: 316 Fy.GATA.normal.2.cr tgtgcttccaagataagagc SEQ ID No: 317 Fy.GATA.normal.3.cr tgcttccaagataagagcca SEQ ID No: 318 Fy.GATA.normal.4.cr ttccaagataagagccaagga SEQ ID No: 319 Fy.GATA.normal.5.cr caagataagagccaaggact SEQ ID No: 320 Alelo de mutación Duffy GATAbox: Fy.GATA.mut.1 tccttggctcttaccttg SEQ ID No: 321 Fy.GATA.mut.2 tccttggctcttaccttgga SEQ ID No: 322 Fy.GATA.mut.3 tggctcttaccttggaagc SEQ ID No: 323 Fy.GATA.mut.4 gctcttaccttggaagcacag SEQ ID No: 324 Fy.GATA.mut.5 cttaccttggaagcacaggcg SEQ ID No: 325 Fy.GATA.mut.1.cr cctgtgcttccaaggtaag SEQ ID No: 326 Fy.GATA.mut.2.cr gtgcttccaaggtaagagc SEQ ID No: 327

Fy.GATA.mut.3.cr Fy.GATA.mut.4.cr Fy.GATA.mut.5.cr

Alelo normal Duffy Fyx: Fy.X.(b).1 Fy.X.(b).2 Fy.X.(b).3 Fy.X.(b).4 Fy.X.(b).5 Fy.X.(b).1.cr Fy.X.(b).2.cr Fy.X.(b).3.cr Fy.X.(b).4.cr Fy.X.(b).5.cr

gcttccaaggtaagagcca ttccaaggtaagagccaagg caaggtaagagccaagga

ttttcagacctctcttccgct agacctctcttccgctggc ctctcttccgctggcagc ctcttccgctggcagctc cttccgctggcagctctg cagagctgccagcggaa agctgccagcggaagag ctgccagcggaagagagg gccagcggaagagaggtc cagcggaagagaggtctg SEQ ID No: 328 SEQ ID No: 329 SEQ ID No: 330

SEQ ID No: 331 SEQ ID No: 332 SEQ ID No: 333 SEQ ID No: 334 SEQ ID No: 335 SEQ ID No: 336 SEQ ID No: 337 SEQ ID No: 338 SEQ ID No: 339 SEQ ID No: 340

Alelo de mutación Duffy Fyx:

Fy.X.1 Fy.X.2 Fy.X.3 Fy.X.4 Fy.X.5 Fy.X.1.cr Fy.X.2.cr Fy.X.3.cr Fy.X.4.cr Fy.X.5.cr

Alelo Kidd a: Jk.a.1 Jk.a.2 Jk.a.3 Jk.a.4 Jk.a.5 Jk.a.1.cr Jk.a.2.cr Jk.a.3.cr Jk.a.4.cr Jk.a.5.cr

Alelo Kidd b: Jk.b.1 Jk.b.2 Jk.b.3

gcttttcagacctctcttctgct SEQ ID No: 341

tcagacctctcttctgctggc acctctcttctgctggcagc ctcttctgctggcagctctg cttctgctggcagctctgc gcagagctgccagcagaa gagctgccagcagaagagag agctgccagcagaagagagg gccagcagaagagaggtctg cagcagaagagaggtctgaaa

cagccccatttgaggaca gccccatttgaggacatcta SEQ ID No: 342 SEQ ID No: 343 SEQ ID No: 344 SEQ ID No: 345 SEQ ID No: 346 SEQ ID No: 347 SEQ ID No: 348 SEQ ID No: 349 SEQ ID No: 350

SEQ ID No: 351 SEQ ID No: 352

ccatttgaggacatctactttg SEQ ID No: 353 atttgaggacatctactttgga SEQ ID No: 354 gaggacatctactttggactct SEQ ID No: 355 cagagtccaaagtagatgtcctc SEQ ID No: 356 agtccaaagtagatgtcctcaaa SEQ ID No: 357 aaagtagatgtcctcaaatggg SEQ ID No: 358 tagatgtcctcaaatggggc SEQ ID No: 359 atgtcctcaaatggggctg SEQ ID No: 360

tcagccccatttgagaaca SEQ ID No: 361 gccccatttgagaacatcta SEQ ID No: 362 cccatttgagaacatctactttg SEQ ID No: 363 Jk.b.4 atttgagaacatctactttggac SEQ ID No: 364 Jk.b.5 gagaacatctactttggactctg SEQ ID No: 365 Jk.b.1.cr ccagagtccaaagtagatgttctcSEQ ID No:

Jk.b.2.cr agagtccaaagtagatgttctcaaa SEQ ID No: 367 Jk.b.3.cr ccaaagtagatgttctcaaatgg SEQ ID No: 368 Jk.b.4.cr agtagatgttctcaaatggggc SEQ ID No: 369 Jk.b.5.cr atgttctcaaatggggctga SEQ ID No: 370 Alelo Kell K1: KEL.1.1 tccttaaactttaaccgaatgct SEQ ID No: 371 KEL.1.2 ttaaactttaaccgaatgctgaga SEQ ID No: 372 KEL.1.3 aactttaaccgaatgctgagactt SEQ ID No: 373 KEL.1.4 aaccgaatgctgagacttctg SEQ ID No: 374 KEL.1.5 cgaatgctgagacttctgatgag SEQ ID No: 375 KEL 1.6 CR actcatcagaagtctcagcattc SEQ ID No: 376 KEL 1.7 CR tcagaagtctcagcattcggt SEQ ID No: 377 KEL 1.8 CR aagtctcagcattcggttaaag SEQ ID No: 378 KEL 1.9 CR tctcagcattcggttaaagtttaa SEQ ID No: 379 KEL 1.10 CR agcattcggttaaagtttaagga SEQ ID No: 380 Alelo Kell K2: KEL.2.1 ccttaaactttaaccgaacgct SEQ ID No: 381 KEL.2.2 aactttaaccgaacgctgaga SEQ ID No: 382 KEL.2.3 ctttaaccgaacgctgagactt SEQ ID No: 383 KEL.2.4 aaccgaacgctgagacttct SEQ ID No: 384 KEL.2.5 cgaacgctgagacttctgatg SEQ ID No: 385 KEL 2.6 CR tcatcagaagtctcagcgttc SEQ ID No: 386 KEL 2.7 CR cagaagtctcagcgttcggt SEQ ID No: 387 KEL 2.8 CR agtctcagcgttcggttaaag SEQ ID No: 388 KEL 2.9 CR tctcagcgttcggttaaagtt SEQ ID No: 389 KEL 2.10 CR agcgttcggttaaagtttaagg SEQ ID No: 390 Alelo Kell K3: KEL.3.1 aatctccatcacttcatggct SEQ ID No: 391 KEL.3.2 tccatcacttcatggctgtt SEQ ID No: 392 KEL.3.3 atcacttcatggctgttcca SEQ ID No: 393 KEL.3.4 acttcatggctgttccagtt SEQ ID No: 394 KEL.3.5 tcatggctgttccagtttc SEQ ID No: 395

KEL.3.1.cr agaaactggaacagccatgaa SEQ ID No: 396 KEL.3.2.cr aactggaacagccatgaagtg SEQ ID No: 397 KEL.3.3.cr tggaacagccatgaagtgatg SEQ ID No: 398 KEL.3.4.cr acagccatgaagtgatggag SEQ ID No: 399 KEL.3.5.cr gccatgaagtgatggagatt SEQ ID No: 400

Alelo Kell K4: KEL.4.1 tctccatcacttcacggct SEQ ID No: 401 KEL.4.2 ccatcacttcacggctgtt SEQ ID No: 402 KEL.4.3 cacttcacggctgttcca SEQ ID No: 403 KEL.4.4 acttcacggctgttccag SEQ ID No: 404 KEL.4.5 tcacggctgttccagttt SEQ ID No: 405 KEL.4.1.cr aaactggaacagccgtgaa SEQ ID No: 406 KEL.4.2.cr ctggaacagccgtgaagtg SEQ ID No: 407 KEL.4.3.cr ggaacagccgtgaagtgatg SEQ ID No: 408 KEL.4.4.cr acagccgtgaagtgatgg SEQ ID No: 409 KEL.4.S.cr gccgtgaagtgatggaga SEQ ID No: 410

Alelo Kell K6: KEL.6.1 tactgcctgggggctgccccgcc SEQ ID No: 411 KEL.6.2 tgggggctgccccgcctgt SEQ ID No: 412 KEL.6.3 gctgccccgcctgtgac SEQ ID No: 413 KEL.6.4 ctgccccgcctgtgacaa SEQ ID No: 414 KEL.6.5 gccccgcctgtgacaac SEQ ID No: 415 KEL.6.1.cr gttgtcacaggcggggc SEQ ID No: 416 KEL.6.2.cr ttgtcacaggcggggcag SEQ ID No: 417 KEL.6.3.cr tcacaggcggggcagccc SEQ ID No: 418 KEL.6.4.cr acaggcggggcagccccca SEQ ID No: 419 KEL.6.5.cr aggcggggcagccccca SEQ ID No: 420

Alelo Kell K7: KEL.7.1 actgcctgggggctgcctcgcc SEQ ID No: 421 KEL.7.2 cctgggggctgcctcgcctgt SEQ ID No: 422 KEL.7.3 ggctgcctcgcctgtgac SEQ ID No: 423 KEL.7.4 ctgcctcgcctgtgacaacc SEQ ID No: 424 KEL.7.5 gcctcgcctgtgacaacc SEQ ID No: 425 KEL.7.1.cr ggttgtcacaggcgaggc SEQ ID No: 426 KEL.7.2.cr ggttgtcacaggcgaggcag SEQ ID No: 427 KEL.7.3.cr ttgtcacaggcgaggcagccc SEQ ID No: 428 KEL.7.4.cr acaggcgaggcagcccccagg SEQ ID No: 429 KEL.7.5.cr aggcgaggcagcccccagg SEQ ID No: 430

Alelo Lutheran a: Lu.a.1 ggagctcgcccccgcct SEQ ID No: 431 Lu.a.2 gctcgcccccgcctagc SEQ ID No: 432 Lu.a.3 cgcccccgcctagcctc SEQ ID No: 433 Lu.a.4 cccccgcctagcctcgg SEQ ID No: 434 Lu.a.5 cccgcctagcctcggct SEQ ID No: 435 Lu.a.1 CR agccgaggctaggcggg SEQ ID No: 436 Lu.a.2 CR ccgaggctaggcggggg SEQ ID No: 437 Lu.a.3 CR gaggctaggcgggggcg SEQ ID No: 438 Lu.a.4 CR gctaggcgggggcgagc SEQ ID No: 439 Lu.a.5 CR aggcgggggcgagctcc SEQ ID No: 440

Alelo Lutheran b: Lu.b.1 gggagctcgcccccacct SEQ ID No: 441 Lu.b.2 gagctcgcccccacctagc SEQ ID No: 442 Lu.b.3 ctcgcccccacctagcctc SEQ ID No: 443 Lu.b.4 cccccacctagcctcggct SEQ ID No: 444 Lu.b.5 cccacctagcctcggctga SEQ ID No: 445 Lu.b.1 CR tcagccgaggctaggtggg SEQ ID No: 446 Lu.b.2 CR agccgaggctaggtggggg SEQ ID No: 447 Lu.b.3 CR gaggctaggtgggggcgag SEQ ID No: 448 Lu.b.4 CR gctaggtgggggcgagctc SEQ ID No: 449 Lu.b.5 CR aggtgggggcgagctccc SEQ ID No: 450

Alelo MNS M:

M.1 gtgagcatatcagcatcaag SEQ ID No: 451

M.2 atcagcatcaagtaccactgg SEQ ID No: 452

M.3 catcaagtaccactggtgtg SEQ ID No: 453

M.4 taccactggtgtggcaatgc SEQ ID No: 454

M.5 ctggtgtggcaatgcaca SEQ ID No: 455 M.1.cr tgtgcattgccacaccagt SEQ ID No: 456 M.2.cr gcattgccacaccagtggta SEQ ID No: 457 M.3.cr ccacaccagtggtacttgatg SEQ ID No: 458 M.4.cr accagtggtacttgatgct SEQ ID No: 459 M.5.cr cttgatgctgatatgctcac SEQ ID No: 460 Alelo MNS N:

N.1

tgtgagcatatcagcattaag SEQ ID No: 461

N.2

atcagcattaagtaccactgagg SEQ ID No: 462

N.3

cattaagtaccactgaggtgg SEQ ID No: 463

N.4

accactgaggtggcaatgc SEQ ID No: 464

N.5

ctgaggtggcaatgcacact SEQ ID No: 465 N.1.cr gtgtgcattgccacctcagt SEQ ID No: 466 N.2.cr gcattgccacctcagtggta SEQ ID No: 467 N.3.cr ccacctcagtggtacttaatgc SEQ ID No: 468

N.4.cr cctcagtggtacttaatgct SEQ ID No: 469 N.5.cr cttaatgctgatatgctcaca SEQ ID No: 470 Alelo MNS S: big.S.1 tttgctttataggagaaatggga SEQ ID No: 471 big.S.2 ctttataggagaaatgggaca SEQ ID No: 472 big.S.3 ttataggagaaatgggacaacttg SEQ ID No: 473 big.S.4 gagaaatgggacaacttgtcc SEQ ID No: 474 big.S.5 aaatgggacaacttgtccatc SEQ ID No: 475 big.S.1.cr gatggacaagttgtcccattt SEQ ID No: 476 big.S.2.cr gacaagttgtcccatttctcc SEQ ID No: 477 big.S.3.cr aagttgtcccatttctcctata SEQ ID No: 478 big.S.4.cr tgtcccatttctcctataaagca SEQ ID No: 479 big.S.5.cr cccatttctcctataaagcaaaa SEQ ID No: 480 Alelo MNS s: little.s.1 tgctttataggagaaacggga SEQ ID No: 481 little.s.2 tttataggagaaacgggaca SEQ ID No: 482 little.s.3 ggagaaacgggacaacttg SEQ ID No: 483 little.s.4 gagaaacgggacaacttgtc SEQ ID No: 484 little.s.5 aaacgggacaacttgtccat SEQ ID No: 485 little.s.1.cr tggacaagttgtcccgttt SEQ ID No: 486 little.s.2.cr acaagttgtcccgtttctcc SEQ ID No: 487 little.s.3.cr agttgtcccgtttctcctata SEQ ID No: 488 little.s.4.cr tgtcccgtttctcctataaagc SEQ ID No: 489 little.s.5.cr ccgtttctcctataaagca SEQ ID No: 490 Alelo MNS U-positivo: U.pos.1 ttgctgctctctttagctcc SEQ ID No: 491 U.pos.2 ctctctttagctcctgtagtgat SEQ ID No: 492 U.pos.3 agctcctgtagtgataatactca SEQ ID No: 493 U.pos.4 gtagtgataatactcattatttttg SEQ ID No: 494 U.pos.5 taatactcattatttttggggtg SEQ ID No: 495 U.pos.1.cr caccccaaaaataatgagtatta SEQ ID No: 496 U.pos.2.cr caaaaataatgagtattatcactaca SEQ ID No: 497 U.pos.3.cr agtattatcactacaggagctaaa SEQ ID No: 498 U.pos.4.cr atcactacaggagctaaagag SEQ ID No: 499 U.pos.5.cr gagctaaagagagcagcaaa SEQ ID No: 500

Alelo MNS U-negativo: U.neg.1 U.neg.2

No: 502 U.neg.3

No: 503 U.neg.4

No: 504 U.neg.5 U.neg.1.cr U.neg.2.cr

No: 507 U.neg.3.cr

No: 508 U.neg.4.cr U.neg.5.cr

No: 510 Alelo Rhesus C(307T): Rh.big.C.1 Rh.big.C.2 Rh.big.C.3 Rh.big.C.4 Rh.big.C.5 Rh.big.C.1.cr Rh.big.C.2.cr Rh.big.C.3.cr Rh.big.C.4.cr Rh.big.C.5.cr Alelo Rhesus c(307C): Rh.little.c.1 Rh.little.c.2 Rh.little.c.3 Rh.little.c.4 Rh.little.c.5 Rh.little.c.1.cr Rh.little.c.2.cr Rh.little.c.3.cr Rh.little.c.4.cr

-35

ttttgctgctctctttatctcc SEQ ID No: 501 gctctctttatctcctgtagagat SEQ ID

tatctcctgtagagataacactca SEQ ID

gtagagataacactcattattttt SEQ ID

taacactcattatttttggggt SEQ ID No: 505 accccaaaaataatgagtgtta SEQ ID No: 506 aaaaataatgagtgttatctctaca SEQ ID

agtgttatctctacaggagataaa SEQ ID

atctctacaggagataaagagag SEQ ID No: 509 gagataaagagagcagcaaaatta SEQ ID

tgagccagttcccttctgg SEQ ID No: 511 gagccagttcccttctgg SEQ ID No: 512 ctgagccagttcccttctg SEQ ID No: 513 ccttctgggaaggtggtc SEQ ID No: 514 ccttctgggaaggtggtca SEQ ID No: 515 tgaccaccttcccagaagg SEQ ID No: 516 gaccaccttcccagaagg SEQ ID No: 517 ccagaagggaactggctc SEQ ID No: 518 ccagaagggaactggctca SEQ ID No: 519 cagaagggaactggctcag SEQ ID No: 520

gagccagttccctcctgg SEQ ID No: 521 agccagttccctcctgg SEQ ID No: 522 tgagccagttccctcctg SEQ ID No: 523 cctcctgggaaggtggt SEQ ID No: 524 cctcctgggaaggtggtc SEQ ID No: 525 gaccaccttcccaggagg SEQ ID No: 526 accaccttcccaggagg SEQ ID No: 527 ccaggagggaactggct SEQ ID No: 528 ccaggagggaactggctc SEQ ID No: 529

Rh.little.c.5.cr caggagggaactggctca SEQ ID No: 530 Alelo de inserto específico de intrón2 BigC de Rhesus:

RhC.intron.2.1 agggtgccctttgtcacttc SEQ ID No: 531 RhC.intron.2.2 gccctttgtcacttcccagt SEQ ID No: 532 RhC.intron.2.3 cctttgtcacttcccagtgg SEQ ID No: 533 RhC.intron.2.4 ttgtcacttcccagtggtacaa SEQ ID No: 534 RhC.intron.2.5 tcacttcccagtggtacaatca SEQ ID No: 535 RhC.intron.2.1.cr gaagtgacaaagggcaccct SEQ ID No: 536 RhC.intron.2.2.cr actgggaagtgacaaagggc SEQ ID No: 537 RhC.intron.2.3.cr ccactgggaagtgacaaagg SEQ ID No: 538 RhC.intron.2.4.cr tgtaccactgggaagtgacaaa SEQ ID No: 539 RhC.intron.2.5.cr tgattgtaccactgggaagtga SEQ ID No: 540 Alelo negativo de inserto específico de intrón2 BigC de Rhesus: La disposición por PCR se selecciona de tal manera que se formará un solo producto de PCR cuando esté presente el inserto específico de intrón2 bigC. Los anticuerpos anti-tag (utilizados para la sustracción del fondo) se utilizan para calcular la relación para determinar el genotipo. Alelo de Rhesus E: Rh.big.E.1 gccaagtgtcaactctcctct SEQ ID No: 541 Rh.big.E.2 caagtgtcaactctcctctgct SEQ ID No: 542 Rh.big.E.3 gtgtcaactctcctctgctgag SEQ ID No: 543 Rh.big.E.4 caactctcctctgctgagaagtc SEQ ID No: 544 Rh.big.E.5 tctcctctgctgagaagtcc SEQ ID No: 545 Rh.big.E.1.cr ggacttctcagcagaggagag SEQ ID No: 546 Rh.big.E.2.cr cttctcagcagaggagagttga SEQ ID No: 547 Rh.big.E.3.cr ctcagcagaggagagttgacac SEQ ID No: 548 Rh.big.E.4.cr gcagaggagagttgacacttg SEQ ID No: 549 Rh.big.E.5.cr gaggagagttgacacttggc SEQ ID No: 550 Alelo de Rhesus e: Rh.little.e.1 gccaagtgtcaactctgctct SEQ ID No: 551 Rh.little.e.2 caagtgtcaactctgctctgct SEQ ID No: 552 Rh.little.e.3 tgtcaactctgctctgctgag SEQ ID No: 553 Rh.little.e.4 caactctgctctgctgagaag SEQ ID No: 554 Rh.little.e.5 tctgctctgctgagaagtcc SEQ ID No: 555 Rh.little.e.1.cr ggacttctcagcagagcagag SEQ ID No: 556 Rh.little.e.2.cr ttctcagcagagcagagttga SEQ ID No: 557 Rh.little.e.3.cr tcagcagagcagagttgacac SEQ ID No: 558 Rh.little.e.4.cr gcagagcagagttgacacttg SEQ ID No: 559 Rh.little.e.5.cr gagcagagttgacacttggc SEQ ID No: 560

Alelo de Rhesus RHD: RhD 1 ttccccacagctccatcat SEQ ID No: 561 RhD 2 acagctccatcatgggctac SEQ ID No: 562 RhD 3 tccatcatgggctacaacttc SEQ ID No: 563 RhD 4 tcatgggctacaacttcagct SEQ ID No: 564 RhD 5 gggctacaacttcagcttgct SEQ ID No: 565 RhD cr 1 agcaagctgaagttgtagccc SEQ ID No: 566 RhD cr 2 agctgaagttgtagcccatga SEQ ID No: 567 RhD cr 3 gaagttgtagcccatgatgg SEQ ID No: 568 RhD cr 4 gcccatgatggagctgt SEQ ID No: 569 RhD cr 5 tgatggagctgtggggaa SEQ ID No: 570

Alelo Rhesus RHD negativo:

El establecimiento por PCR se elige de manera que se forma solamente un producto de PCR, cuando el gen RHD está presente. Los anticuerpos anti-tag (utilizados para la sustracción del fondo) se utilizan para calcular la relación para determinar el genotipo.

Alelo r’s de Rhesus: r´s.T.l ggaaggtcaacttggtgca SEQ ID No: 571 r´s.T.2 ggaaggtcaacttggtgcagt SEQ ID No: 572 r´s.T.3 caacttggtgcagttggtg SEQ ID No: 573 r´s.T.4 acttggtgcagttggtggt SEQ ID No: 574 r´s.T.5 ttggtgcagttggtggtgat SEQ ID No: 575 r´s.T.l.cr catcaccaccaactgcacca SEQ ID No: 576 r´s.T.2.cr caccaccaactgcaccaagt SEQ ID No: 577 r´s.T.3.cr accaactgcaccaagttgac SEQ ID No: 578 r´s.T.4.cr actgcaccaagttgaccttcc SEQ ID No: 579 r´s.T.5.cr tgcaccaagttgaccttcc SEQ ID No: 580

Alelo negativo r´s de Rhesus:

El establecimiento por PCR se elige de manera que se forma solamente un producto de PCR, cuando el gen r´s está presente. Los anticuerpos anti-tag (utilizados para la sustracción del fondo) se utilizan para calcular la relación para determinar el genotipo. Alelo DVI de Rhesus:

El establecimiento por PCR se elige de manera que se forma solamente un producto de PCR, cuando un gen RHD normal está presente. Los anticuerpos anti-tag (utilizados para la sustracción del fondo) se utilizan para calcular la relación para determinar el genotipo.

Sondas DVI para determinar la presencia del alelo RHD

normal:

Rh.DVI.l atttcaaccctcttggcctt SEQ ID No: 581

Rh.DVI.2 aaccctcttggcctttgttt SEQ ID No: 582

Rh.DVI.3 tcttggcctttgtttccttg SEQ ID No: 583

Rh.DVI.4 ggtatcagcttgagagctcg SEQ ID No: 584

Rh.DVI.5 atcagcttgagagctcggag SEQ ID No: 585

Rh.DVI.l.cr aaggccaagagggttgaaat SEQ ID No: 586

Rh.DVI.2.cr aaacaaaggccaagagggtt SEQ ID No: 587

Rh.DVI.3.cr caaggaaacaaaggccaaga SEQ ID No: 588

Rh.DVI.4.cr cgagctctcaagctgatacc SEQ ID No: 589

Rh.DVI.5.cr ctccgagctctcaagctgat SEQ ID No: 590 Alelo con mutación del pseudogén RHD de Rhesus:

RhD Y 1 tttctttgcagacttaggtgc SEQ ID No: 591

RhD Y 2 ctttgcagacttaggtgcaca SEQ ID No: 592

RhD Y 3 tttgcagacttaggtgcacagt SEQ ID No: 593

RhD Y 4 acttaggtgcacagtgcgg SEQ ID No: 594

RhD Y 5 cttaggtgcacagtgcggt SEQ ID No: 595

RhD Y cr 1 caccgcactgtgcacctaa SEQ ID No: 596

RhD Y cr 2 ccgcactgtgcacctaagtc SEQ ID No: 597

RhD Y cr 3 gcactgtgcacctaagtctgc SEQ ID No: 598

RhD Y cr 4 tgcacctaagtctgcaaaga SEQ ID No: 599

RhD Y cr 5 cacctaagtctgcaaagaaatagcg SEQ ID No: 600 Alelo normal del pseudogén RHD de Rhesus:

RhD non Y 1 ctatttctttgcagacttatgtgc SEQ ID No: 601

RhD non Y 2 tctttgcagacttatgtgcaca SEQ ID No: 602

RhD non Y 3 ttgcagacttatgtgcacagtg SEQ ID No: 603

RhD non Y 4 acttatgtgcacagtgcggt SEQ ID No: 604

RhD non Y 5 cttatgtgcacagtgcggtg SEQ ID No: 605

RhD non Y cr 1 acaccgcactgtgcacataa SEQ ID No: 606

RhD non Y cr 2 accgcactgtgcacataagtc SEQ ID No: 607

RhD non Y cr 3 gcactgtgcacataagtctgc SEQ ID No: 608

RhD non Y cr 4 tgtgcacataagtctgcaaag SEQ ID No: 609

RhD non Y cr 5 cacataagtctgcaaagaaatagcg SEQ ID No: 610 Alelo Yt-a:

Yt.a.1 gcgggagacttccacgg SEQ ID No: 611

Yt.a.2 gggagacttccacggcct SEQ ID No: 612

Yt.a.3 gagacttccacggcctgc SEQ ID No: 613

Yt.a.4 gacttccacggcctgca SEQ ID No: 614

Yt.a.5 ttccacggcctgcaggta SEQ ID No: 615 podría ser posible para una persona experta diseñar sondas para otros alelos de antígenos de células de la sangre.

Yt.a.1 CR

tacctgcaggccgtggaa SEQ ID No: 616

Yt.a.2 CR

tgcaggccgtggaagtc SEQ ID No: 617

Yt.a.3 CR

gcaggccgtggaagtctc SEQ ID No: 618

Yt.a.4 CR

aggccgtggaagtctccc SEQ ID No: 619

Yt.a.5 CR

ccgtggaagtctcccgc SEQ ID No: 620

Alelo Yt-b:

Yt.b.1

gcgggagacttcaacggc SEQ ID No: 621

Yt.b.2

gggagacttcaacggcctg SEQ ID No: 622

Yt.b.3

gagacttcaacggcctgca SEQ ID No: 623

Yt.b.4

gacttcaacggcctgcag SEQ ID No: 624

Yt.b.5

ttcaacggcctgcaggtaa SEQ ID No: 625

Yt.b.1 CR

ttacctgcaggccgttgaa SEQ ID No: 626

Yt.b.2 CR

ctgcaggccgttgaagtc SEQ ID No: 627

Yt.b.3 CR

tgcaggccgttgaagtctc SEQ ID No: 628

Yt.b.4 CR

caggccgttgaagtctccc SEQ ID No: 629

Yt.b.5 CR

gccgttgaagtctcccgc SEQ ID No: 630

Utilizando

los programas de ordenador disponibles,

El arreglo de ADN puede ser un arreglo limitado que comprende, por ejemplo solamente 72 sondas diferentes, pero comprende de forma preferente substancialmente todas las sondas mostradas en la lista anterior.

Para facilitar la unión de las sondas al soporte del arreglo y permitir el acceso suficiente a los productos de amplificación, normalmente la sonda de oligos estará provista de una molécula enlazadora y un grupo reactivo, preferentemente en el extremo 5' del oligo, para unirse al soporte del arreglo. Todo esto es bien conocido por la persona experta y solamente se menciona a modo de ejemplo que un enlazador adecuado es C6 (hexametileno, es decir, -(CH2)6-) y un grupo reactivo adecuado es amino. SOPORTE DEL ARREGLO

Las sondas están situadas en un soporte adecuado al que éstas se unen generalmente por medios químicos. El soporte puede ser un portaobjetos o cualquier otro soporte adecuado, tal como plástico, silicio u óxido metálico poroso. Generalmente, el soporte será tratado con anterioridad para mejorar la unión de los oligos, por ejemplo pretratado mediante el recubrimiento con poli-L-lisina, aminosilano, aldehído o epóxido. Para lograr la unión de las sondas, se pueden utilizar diferentes técnicas, tales como irradiación UV, absorción electrostática no específica, unión covalente a través del grupo 5'amino o fosfato utilizando la química de la carbodiimida (EDC), etc.

Para evitar la hibridación no específica, generalmente será preferente incubar el soporte del arreglo que porta las sondas sobre el mismo con solución de prehibridización, tal como es conocido por una persona experta, y para preparar las sondas para la hibridación será preferente desnaturalizarlas, por ejemplo, por calentamiento a aproximadamente 80°C o más. CONTROLES

A efectos de permitir la corrección para el fondo es preferente incluir algunas sondas con una secuencia que no aparece en el ADN del donante y que se puede esperar que no se unan por hibridación a los productos de amplificación. La señal medida para los puntos de sondas específicas de alelo puede ser corregida restando la señal medida para estos puntos de control de fondo. Ejemplos adecuados de dichas sondas de corrección de fondo o “antitags” son las siguientes sondas a3, a9, al7, a23, a27, a33, a35, a38, a42 y a43:

a3 cagaccataagcacaggcgt SEQ ID No: 631, a9 gctcgtccacagtgcgttat SEQ ID No: 632, a17 cggcgttcaagcaaaccgaa SEQ ID No: 633, a23 gacctatagctccactcaga SEQ ID No: 634, a27 tagggtactgatgagcactc SEQ ID No: 635, a33 tcagccctatcgcaggatgt SEQ ID No: 169, a35 gagacacttgacagtagcca SEQ ID No: 170, a38 ggcagggcacctcagtttat SEQ ID No: 171, a42 tcaccagccagactgtgtag SEQ ID No: 172, a43 cttcacgcaagttgtccaga SEQ ID No: 173.

Además, puede ser aconsejable incluir, como mínimo, una sonda de control positivo. Esta sonda debe ser el complemento de un oligómero de control positivo marcado añadido a los productos de amplificación. Por ejemplo, la sonda del control positivo puede ser el siguiente oligo CS05:

CS05 gtcctgacttctagctcatg SEQ ID No: 174 que es capaz de hibridar a su complemento marcado catgagctagaagtcaggac que se añade a la mezcla de productos de amplificación antes de que la mezcla se aplique sobre el arreglo de ADN.

CONDICIONES DE HIBRIDACIÓN

La hibridación de los productos de la amplificación a las sondas en el arreglo de ADN generalmente se lleva a cabo a una temperatura de entre 50 y 65°C, preferentemente a aproximadamente 56°C, durante un tiempo suficiente, tal como durante 15 minutos hasta 10 horas, más preferentemente durante 30 minutos hasta 4 horas. CONFIGURACIÓN DEL ARREGLO

La configuración del arreglo es completamente arbitraria. Generalmente, un soporte de arreglo portará una gran cantidad de puntos presentes en varios bloques que pueden ser idénticos (preferente) o diferentes entre sí. Cada punto contiene una sonda y es preferente que sondas similares sean punteadas tan distantes entre sí como sea posible. Es preferente que cada bloque contenga un punto de cada una de las sondas específicas de alelo y además algunos puntos de control. De esta manera, un bloque puede comprender 128 puntos específicos de alelo, 5 controles de fondo y un control positivo, en total 134 puntos. MEDICIÓN DE LA SEÑAL DE FLUORESCENCIA

La unión de los productos de amplificación marcados a ciertos puntos se determina sobre la base de la señal de fluorescencia emitida por estos puntos. La señal se puede medir con un tubo fotomultiplicador, sistemas de barrido láser, o cualquier otro aparato y técnica conocida por la persona experta. EVALUACIÓN DE LOS DATOS RESULTANTES

Para evaluar los datos resultantes en cuanto al genotipo del antígeno de la célula de sangre del donante del ADN, las intensidades de la señal de fluorescencia se pueden convertir utilizando Genepix Pro 5.0 (Axon Instruments Inc.) a valores de señal que pueden ser analizados posteriormente, por ejemplo en Excel. EJEMPLOS

En los ejemplos a continuación, que sirven solamente para ilustrar la presente invención sin limitarla en cualquier modo, el concepto de determinar el genotipo de antígenos de células de sangre mediante la presente combinación de una PCR múltiple en concreto y un microarreglo de ADN de sondas específicas de alelo se ensaya en el ejemplo 1 en los sistemas bialélicos Antígeno de Plaqueta Humana HPA-1 a 5 y Gov. Se determinó el genotipo de un panel ciego de 58 muestras donanteas para estos 6 sistemas HPA y solamente se encontró una discrepancia en un sistema HPA. La discrepancia se puede superar ajustando los criterios de puntuación y validando el nuevo formato. A continuación, en el ejemplo 2, se muestra que la PCR múltiple de la presente invención funciona correctamente junto con todos los cebadores de la tabla II. EJEMPLO 1

Las secuencias y los valores de Tm de las sondas punteadas sobre un portaobjetos recubierto con poli-Lisina se muestran en la tabla I. Los SNP de HPA-3 y -5 se localizan en un área rica y pobre en GC, respectivamente. Por lo tanto, estas sondas son más cortas o más largas que los otros oligonucleótidos y tienen una Tm fuera del intervalo de 60-65°C. Las sondas, disueltas a una concentración de 50 µM en NaHCO3 0,4 M (pH 9,4), se puntearon sobre el portaobjetos revestido de poli-L-lisina mediante el Omnigrid 100® microarrayer (Genemachines) suministrado con 16 pasadores SMP 3 Microspotting (Telechem). Cada portaobjetos contiene 48 bloques de 134 puntos correspondientes a las 128 sondas específicas de alelo, los 5 controles de fondo y al control positivo CS05. Se puntearon sondas similares tan distantes entre sí como fue posible. El ADN fue reticulado mediante irradiación UV a 250 mJ/cm2 (Stratalinker modelo 1800 Iluminador de UV, Stratagene). Para evitar la hibridación no específica, los portaobjetos fueron incubados con 100 µL de solución de prehibridación [400 ng/µL de ARNt de levadura (Roche), 400 ng/µL de ADN de esperma de arenques (Gibco BRL), solución de Denhardt 5x, SSC 3,2x y 0,4% de SDS] a 65°C durante 30 min. Antes de la hibridación, los portaobjetos que contenían la mezcla de prehibridación se incubaron durante 2 minutos a 80°C para desnaturalizar el ADN punteado. Después de la prehibridación, los portaobjetos se lavaron dos veces en SSC 2x durante 5 minutos a temperatura ambiente y se deshidrataron con una serie de etanol 70 (dos veces), 90 y 100%, durante 5 minutos cada una, respectivamente.

Se realizó una PCR múltiple solamente para los seis antígenos de plaqueta usando 5 nM de cada cebador HPA y gov (7,5 nM de cada cebador HPA-3) y 1,2 µM de cada cebador universal marcado con Cy5. Además, la PCR múltiple se realizó tal como se describe para la PCR múltiple en el ejemplo 2. Para la hibridación, las cámaras de reacción se hicieron tal como se describe en Pastinen y otros (2000). Una rejilla de goma de silicona se utilizó para dividir los portaobjetos en 24 compartimientos diferentes. Mientras se precalentó el portaobjetos (65°C durante 75 minutos), se desnaturalizaron 40 µL de los productos por PCR múltiple a 95°C durante 5 minutos, se pusieron en hielo y se añadieron 120 µL de solución de hibridación enfriada en hielo [2 ng de complemento marcado con Cy5 de CS05 (5'-catgagctagaagtcaggac-3') y SSC 4x]. Para la hibridación, se añadieron 80 µL de esta mezcla por arreglo y se incubaron durante 3½ horas a 56°C. A continuación, se tomaron los portaobjetos del soporte de hibridación en 600 mL de SSC 3x y se lavaron dos veces con SSC 2x/SDS al 0,1% a 50°C y dos veces con SSC 0,2x a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada uno, respectivamente. Los portaobjetos se secaron por centrifugación a 800 rpm durante 5 minutos y se exploraron en un escáner de microarreglos Agilent G2565BA a una resolución de 10 µm. La tensión del tubo fotomultiplicador se ajustó siempre al 100%. Se analizaron los productos de PCR de seis donantes diferentes por cada portaobjetos, tal como se muestra en la figura 3. Después del análisis de Genepix, los datos obtenidos se convirtieron a Excel. Se utilizó un panel de 12 muestras de donantes con tipo de HPA conocido para definir los criterios de puntuación de HPA. En la tabla III se enumeran los criterios de puntuación. Las intensidades de señal medias Fmed de los controles negativos (C) se promediaron y este valor de fondo más tres veces su desviación estándar fue restado de la intensidad media Fmed de cada oligo, dando un valor umbral, Fth, mostrado en la tercera columna de la tabla III. Si el Fth mostró un valor negativo para la sonda emparejada (alelo a) y no emparejada (alelo b), la pareja de cebadores fue excluida del resultado de determinación del genotipo. Para la determinación del genotipo, se calculó la relación de las intensidades de dos oligonucleótidos (uno del alelo a y otro del alelo b) en un conjunto. Se calcularon las relaciones de las intensidades Fmed-Fbg para el alelo a con respecto a la suma de las intensidades de Fmed -Fbg para ambos alelos en la sexta columna. Esta formula a/(a+b) también ha sido descrita por Hinds y otros (2004). En principio, estas relaciones deben tomar valores próximos a 1,0, 0,5 ó 0,0 para los genotipos aa, ab o bb. Solamente se utilizaron los valores positivos Fmed-Fbg y, por lo tanto, los valores negativos se ajustaron a 1 en la quinta columna. A continuación, las relaciones se convirtieron a genotipos en la séptima columna. Valores de relación HPA-1, -2, -4 y –5 por encima de 0,75 fueron considerados del tipo aa, por debajo de 0,25 bb y entre 0,35 y 0,65 ab. Debido a una elevada unión de los fragmentos de PCR a las sondas que representaban el alelo a, los criterios para HPA-3 y Gov se ajustaron a 0,95 y 0,8 para aa, 0,45 y 0,35 para bb y para ab entre 0,55 y 0,85 y entre 0,45 y 0,7, respectivamente. El genotipo más frecuente se coloreó de anaranjado en la séptima columna. Esto se realizó para cada grupo sanguíneo, cada bloque y cada muestra. Las muestras de los 12 donantes se utilizaron para aceptar los conjuntos de sondas que predijeron el genotipo correctamente. Como criterios utilizados para la puntuación final: el 50% de los conjuntos de sondas utilizados deben predecir un genotipo si se predice genotipo homocigótico y el 40% si se predice un genotipo heterocigótico (30% para HPA-3). Utilizando estos criterios se determinó el genotipo a un panel a ciegas de 58 muestras. Los resultados de nueve de ellos se muestran en la tabla IV. Los genotipos de todas las 58 muestras se enumeran en la tabla V. Los genotipos de 56 muestras podían ser puntuados con los criterios establecidos con anterioridad. Solamente se obtuvo en una muestra un resultado discrepante con su genotipo conocido. En este caso, el 33,3% de los conjuntos de sondas indicaron un genotipo HPA-3 bb y el 37,5% indicaron un genotipo HPA-3 ab, tal como se muestra en la tabla VI. El ajuste de los criterios de puntuación conduce a la completa concordancia de los resultados del tipo. EJEMPLO 2

Se construyó una mezcla de cebadores con los cebadores enumerados en la tabla II. La concentración de los cebadores en la mezcla de PCR también se enumera en la tabla II. Se utilizó el kit Qiagen multiplex para la PCR múltiple. En la PCR múltiple, la temperatura de alineamiento (“annealing”) no se cambió durante la PCR y se utilizaron dos cebadores universales marcados fluorescentes. Más detalladamente, al inicio la mezcla de PCR contiene una cantidad muy baja de cebadores quiméricos (5 nM) y un exceso de cebadores universales marcados fluorescentes (0,2 µM de cada cebador universal por cebador quimérico). El perfil de temperatura por PCR comenzó con 15 minutos a 95°C, seguido de 45 ciclos de 94°C durante 30 s, 57°C durante 90 s, 72°C durante 90 s y el protocolo finalizó con una etapa de polimerización final a 72°C durante 10 min. Se amplificó muy poca cantidad de producto de PCR durante los primeros ciclos de amplificación, pero suficiente para ser utilizada como plantilla por los cebadores universales MAPH en los siguientes ciclos tal como se puede observar en el gel

de acrilamida al 8% en la figura 1. Marcando los cebadores MAPH en sus extremos 5' con el marcador fluorescente Cy5, solamente son necesarios dos cebadores marcados fluorescentes para marcar el producto de PCR de forma eficiente. Tal como describe White y otros (2002), se puede observar una mejor discriminación de los productos por PCR múltiple en un secuenciador capilar ABI 3700 (Applied Biossystems), en este caso solamente MAPH-rev está marcado (FAM) fluorescente. La PCR múltiple con todos los cebadores de PCR diseñados produjo el patrón esperado de picos, tal como se muestra en el cromatograma de la figura 2. Esto significa que todos los fragmentos de genes fueron amplificados con rendimientos similares. Tabla I. Secuencias y temperaturas de fusión de las sondas.

Sonda Tm Secuencia (5’-3’)

HPA-1aa 65,86 HPA-1ab 66,92 HPA-1ac 67,79 HPA-1ad 67,35 HPA-1ae 64,65 HPA-1aa CR 64,65 HPA-1ab CR 67,35 HPA-1ac CR 67,79 HPA-1ad CR 66,92 HPA-1ae CR 65,86 HPA-1ba 69,93 HPA-1bb 70,94 HPA-1bc 68,84 HPA-1bd 66,21 HPA-1be 66,33 HPA-1ba CR 66,33 HPA-1bb CR 66,21 HPA-1bc CR 68,84 HPA-1bd CR 70,94 HPA-1be CR 69,93 HPA-2aa 63,81 HPA-2ab 65,21 HPA-2ac 65,37 HPA-2ad 66,12 HPA-2ae 68,84 HPA-2aa CR 63,81 HPA-2ab CR 65,21 HPA-2ac CR 65,37 HPA-2ad CR 66,12 HPA-2ae CR 68,84 HPA-2ba 64,88 HPA-2bb 65,57 HPA-2bc 66,37 HPA-2bd 66,45 tacaggccctgcctctggg aggccctgcctctgggct ccctgcctctgggctcacc tgcctctgggctcacctcg ctctgggctcacctcgctg cagcgaggtgagcccagag cgaggtgagcccagaggca ggtgagcccagaggcaggg agcccagaggcagggcct cccagaggcagggcctgta tacaggccctgcctccggg aggccctgcctccgggct ccctgcctccgggctcac ctgcctccgggctcacct ctccgggctcacctcgct agcgaggtgagcccggag aggtgagcccggaggcag gtgagcccggaggcaggg agcccggaggcagggcct cccggaggcagggcctgta ctgacgcccacacccaag ctcctgacgcccacaccc ggctcctgacgcccacac agggctcctgacgcccac ccagggctcctgacgccc cttgggtgtgggcgtcag gggtgtgggcgtcaggag gtgtgggcgtcaggagcc gtgggcgtcaggagccct gggcgtcaggagccctgg cctgatgcccacacccaag ctcctgatgcccacaccca ggctcctgatgcccacacc agggctcctgatgcccaca

Sonda

Tm Secuencia (5’-3’)

HPA-2be

66,45 ccagggctcctgatgccc

HPA-2ba CR

64,88 cttgggtgtgggcatcagg

HPA-2bb CR

65,57 tgggtgtgggcatcaggag

HPA-2bc CR

66,37 ggtgtgggcatcaggagcc

HPA-2bd CR

66,45 tgtgggcatcaggagccct

HPA-2be CR

66,45 gggcatcaggagccctgg

HPA-3aa

69,45 ccatccccagcccctccc

HPA-3ab

69,60 gcccatccccagcccctc

HPA-3ac

70,57 ctgcccatccccagcccc

HPA-3ad1

70,72 gctgcccatccccagccc

HPA-3ad

70,72 ggctgcccatccccagcc

HPA-3ad2

70,72 gggctgcccatccccagc

HPA-3ae

70,08 ggggctgcccatcccca

HPA-3aa CR

69,45 gggaggggctggggatgg

HPA-3ab CR

69,60 gaggggctggggatgggc

HPA-3ac CR

70,57 ggggctggggatgggcag

HPA-3ad1 CR

70,72 gggctggggatgggcagc

HPA-3ad CR

70,72 ggctggggatgggcagcc

HPA-3ad2 CR

70,72 gctggggatgggcagccc

HPA-3ae CR

70,08 tggggatgggcagcccc

HPA-3ba

68,75 ccagccccagcccctcc

HPA-3bb

70,39 gcccagccccagcccct

HPA-3bc

69,91 ctgcccagccccagccc

HPA-3bd1

70,07 gctgcccagccccagcc

HPA-3bd

70,07 ggctgcccagccccagc

HPA-3bd2

69,91 gggctgcccagccccag

HPA-3be

72,50 ggggctgcccagcccca

HPA-3ba CR

68,75 ggaggggctggggctgg

HPA-3bb CR

70,39 aggggctggggctgggc

HPA-3bc CR

69,91 gggctggggctgggcag

HPA-3bd1 CR

70,07 ggctggggctgggcagc

HPA-3bd CR

70,07 gctggggctgggcagcc

HPA-3bd2 CR

69,91 ctggggctgggcagccc

HPA-3be CR

72,50 tggggctgggcagcccc

HPA-4aa

62,77 gccacccagatgcgaaag

HPA-4ab

59,94 cacccagatgcgaaagct

HPA-4ac

61,08 cccagatgcgaaagctca

HPA-4ad

57,99 cagatgcgaaagctcacc

HPA-4ae

57,99 gatgcgaaagctcaccag

HPA-4aa CR

57,99 ctggtgagctttcgcatc

HPA-4ab CR

57,99 ggtgagctttcgcatctg

HPA-4ac CR

61,08 tgagctttcgcatctggg

HPA-4ad CR

59,94 agctttcgcatctgggtg

HPA-4ae CR

62,77 ctttcgcatctgggtggc

HPA-4ba

60,20 gccacccagatgcaaaag

HPA-4bb

61,19 ccacccagatgcaaaagct

HPA-4bc

60,26 acccagatgcaaaagctcac

HPA-4bd

58,50 cagatgcaaaagctcacca

HPA-4be

58,04 gatgcaaaagctcaccagtaa

Sonda

Tm Secuencia (5’-3’)

HPA-4ba CR

58,04 ttactggtgagcttttgcatc

HPA-4bb CR

58,50 tggtgagcttttgcatctg

HPA-4bc CR

60,26 gtgagcttttgcatctgggt

HPA-4bd CR

61,19 agcttttgcatctgggtgg

HPA-4be CR

60,20 cttttgcatctgggtggc

HPA-5aa

57,46 gagtctacctgtttactatcaaagagg

HPA-5ab

56,77 agtctacctgtttactatcaaagaggta

HPA-5ac

57,08 gtctacctgtttactatcaaagaggtaa

HPA-5ad

57,16 ctacctgtttactatcaaagaggtaaaa

HPA-5ae

57,38 acctgtttactatcaaagaggtaaaaa

HPA-5aa CR

57,38 tttttacctctttgatagtaaacaggt

HPA-5ab CR

57,16 ttttacctctttgatagtaaacaggtag

HPA-5ac CR

57,08 ttacctctttgatagtaaacaggtagac

HPA-5ad CR

56,77 tacctctttgatagtaaacaggtagact

HPA-5ae CR

57,46 cctctttgatagtaaacaggtagactc

HPA-5ba

57,42 gagtctacctgtttactatcaaaaagg

HPA-5bb

56,75 agtctacctgtttactatcaaaaaggta

HPA-5bc

57,05 gtctacctgtttactatcaaaaaggtaa

HPA-5ad

57,13 ctacctgtttactatcaaaaaggtaaaa

HPA-5be

57,34 acctgtttactatcaaaaaggtaaaaa

HPA-5ba CR

57,34 tttttacctttttgatagtaaacaggt

HPA-5bb CR

57,13 ttttacctttttgatagtaaacaggtag

HPA-5bc CR

57,05 ttacctttttgatagtaaacaggtagac

HPA-5bd CR

56,75 tacctttttgatagtaaacaggtagact

HPA-5be CR

57,42 cctttttgatagtaaacaggtagactc

Gov-aa

58,44 ttattatcttgacttcagttacaggattt

Gov-ab

59,20 tcttgacttcagttacaggatttacc

Gov-ac

59,15 tgacttcagttacaggatttaccaa

Gov-ad

58,36 cttcagttacaggatttaccaagaat

Gov-ae

59,44 cagttacaggatttaccaagaatttg

Gov-aa CR

59,44 caaattcttggtaaatcctgtaactg

Gov-ab CR

58,36 attcttggtaaatcctgtaactgaag

Gov-ac CR

59,15 tggtaaatcctgtaactgaagtcaa

Gov-ad CR

59,20 ggtaaatcctgtaactgaagtcaaga

Gov-ae CR

58,44 aaatcctgtaactgaagtcaagataataa

Gov-ba

58,35 tatcttgacttcagttccaggatt

Gov-bb

58,39 cttgacttcagttccaggatttac

Gov-bc

59,51 gacttcagttccaggatttacca

Gov-bd

58,24 ttcagttccaggatttaccaag

Gov-be

59,79 cagttccaggatttaccaagaatt

Gov-ba CR

59,79 aattcttggtaaatcctggaactg

Gov-bb CR

58,24 cttggtaaatcctggaactgaa

Gov-bc CR

59,51 ggtaaatcctggaactgaac

Gov-bd CR

58,39 gtaaatcctggaactgaagtcaag

Gov-be CR

58,35 aatcctggaactgaagtcaagata

a33

63,03 tcagccctatcgcaggatgt

a35

53,75 gagacacttgacagtagcca

a38

61,40 ggcagggcacctcagtttat

a42

57,37 tcaccagccagactgtgtag

Sonda Tm Secuencia (5’-3’)

a43 60,02 cttcacgcaagttgtccaga CS05 52,41 gtcctgacttctagctcatg Cada sonda de oligonucleótidos tiene un grupo amino y un

espaciador C6. Se resaltan los sitios polimórficos en las sondas específicas de alelo.

imagen1

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Tabla VII. Cebadores ensayados adicionalmente para la PCR múltiple Estos cebadores han sido ensayado junto con los cebadores del ID SEQ No.: 15 a 40 en una PCR múltiple. Se obtuvieron productos de PCR de tamaños de producto correctos.

Sistema Cebador de PCR Secuencia Tm* Tamaño del Ag MAPH producto (pb)

Duffy

Fyx-izquierdo (MAPH) gccgcgaattcactagtgTCATGCTTTTCAGACCTCTCTTC 60,01

Duffy

Fyx-derecho (MAPH2) ggccgcgggaattcgattCAAGACGGGCACCACAAT 60,53 143

Kell

KEL6/7-izquierdo (MAPH) gccgcgaattcactagtgGCAGCACCAACCCTATGTTC 60,53

Kell

KEL6/7-derecho (MAPH) ggccgcgggaattcgattTCAGGCACAGGTGAGCTTC 60,13 154

Rhesus

RHDex3-izquierdo (MAPH) gccgcgaattcactagtgTCCTGGCTCTCCCTCTCT 57,48

Rhesus

RHCEex3-derecho (MAPH) ggccgcgggaattcgattTTTTTCAAAACCCCGGAAG 59,90 294

Rhesus

RhDVI-izq. (MAPH)(dir) ggccgcgggaattcgattCTTTGAATTAAGCACTTCACAGA 56,48

Rhesus

RhDVI-derecho (MAPH)(inv) gccgcgaattcactagtgGCCAGAATCACACTCCTGCT 60,42 277

MNS

Ss-izquierdo (MAPH3) gccgcgaattcactagtgTTTTTCTTTGCACATGTCTTT 55,20

MNS

Ss-derecho (MAPH2) ggccgcgggaattcgattTCTTTGTCTTTACAATTTCGTGTG 58,42 276

Dombrock DO-izquierdo (MAPH)

ggccgcgggaattcgattTGATCCCTCCCTATGAGCTG 60,17

Dombrock DO-derecho (MAPH)

gccgcgaattcactagtgTTATATGTGCTCAGGTTCCCAGT 59,91 136

Colton

Colton-izquierdo (MAPH) gccgcgaattcactagtgGCCACGACCCTCTTTGTCT 60,25

Colton

Colton-derecho (MAPH) ggccgcgggaattcgattTACATGAGGGCACGGAAGAT 60,48 269

Diego

Diego-izquierdo (MAPH) gccgcgaattcactagtgACTTATTCACGGGCATCCAG 59,96

Diego

Diego-derecho (MAPH) ggccgcgggaattcgattAAGCTCCACGTTCCTGAAGA 59,99 185

Diego

Wr-izquierdo (MAPH) gccgcgaattcactagtgGGCTTCAAGGTGTCCAACTC 59,70

Diego

Wr-derecho (MAPH) ggccgcgggaattcgattAGGATGAAGACCAGCAGAGC 59,56 158

Yt

Yt-izquierdo (MAPH) ggccgcgggaattcgattCCTTCGTGCCTGTGGTAGAT 60,13

Yt

Yt-derecho (MAPH) gccgcgaattcactagtgTTCTGGGACTTCTGGGAATG 60,04 235

Lutheran Lu-izquierdo (MAPH)

gccgcgaattcactagtgGGACCCAGAGAGAGAGAGACTG 59,61

Lutheran Lu-derecho (MAPH)

ggccgcgggaattcgattGGGAGTCCAGCTGGTATGG 60,48 220

*Los valores de Tm de los cebadores quiméricos son sin marcadores MAPH.

Referencias

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Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método de determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre que comprende someter al ADN de un individuo de una especie de mamífero a una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) múltiple para amplificar y marcar de forma detectable una región del locus de, como mínimo, dos antígenos diferentes de células de la sangre que contiene el sitio de polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de células de la sangre y utilizar los fragmentos de ADN amplificados y marcados de esta manera para determinar el genotipo de cada uno de dichos antígenos de células de la sangre, comprendiendo dicha PCR múltiple el uso de, como mínimo, un par de cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre para que sea determinado el genotipo de cada antígeno de células de la sangre y, como mínimo, un cebador universal marcado de forma detectable, en el que dicho, como mínimo, un cebador universal tiene una secuencia única que no aparece en el ADN de dicha especie de mamíferos, y en el que cada par de cebadores quiméricos comprende un cebador quimérico de la izquierda y un cebador quimérico de la derecha, cada uno de ellos comprende una parte específica del antígeno de célula de la sangre en el extremo 3' y una parte universal en el extremo 5', en el que la secuencia de bases de la parte universal de los cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de bases de dicho, como mínimo, un cebador universal, y en el que dichas partes específicas del antígeno de células de la sangre del par de cebadores quiméricos comprende una región del locus del antígeno de célula de la sangre que contiene el sitio del polimorfismo de nucleótido de dicho antígeno de células de la sangre.

2. 2.

   Método, según la reivindicación 1, en el que dicho, como mínimo, un cebador universal marcado de forma detectable se utiliza en una cantidad molar que es, como mínimo, 100 veces, más preferentemente, como mínimo, 200 veces la cantidad molar de cada cebador quimérico.

3. 3.

   Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que se utiliza un par de cebadores universales marcados de forma detectable con una secuencia única que no aparece en el ADN de dicha especie de mamíferos y en el que para cada par de cebadores quiméricos la secuencia de bases de la parte universal de un miembro del par de

   cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de bases de un miembro del par de cebadores universales y la secuencia de bases de la parte universal del otro miembro del par de cebadores quiméricos se corresponde con la secuencia de bases del otro miembro del par de cebadores universales.

4. 4.

   Método, según la reivindicación 3, en el que uno de dichos cebadores universales tiene la secuencia de bases gccgcgaattcactagtg (SEQ ID No:: 2) y el otro cebador universal tiene la secuencia de bases ggccgcgggaattcgatt (SEQ ID No:: 1).

5. 5.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 14, en el que cada cebador universal porta un marcador fluorescente, preferentemente Cy5, en su extremo 5’.

6. 6.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 15, en el que dicha especie de mamíferos es humana, dicho ADN es ADN genómico, y dichos antígenos de células de la sangre comprenden, como mínimo, dos, preferentemente todos, los miembros seleccionados del grupo que comprende HPA1, HPA2, HPA3, HPA4, HPA5, Gov, JK1/2, FY1/2, GATAbox, KEL1/2, KEL3/4, RHCEex2/RHex2, RHCEex5/RHex5, RHDψ, RHD, BigC, MN, U y JO.

7. 7.

   Método, según la reivindicación 6, en el que dichos cebadores quiméricos comprenden, como mínimo, dos, preferentemente substancialmente todos, los pares seleccionados del grupo que comprende:

   HPA1-izquierdo gccgcgaattcactagtgcttcaggtcacagcgaggt SEQ ID No: 3 HPA1-derecho ggccgcgggaattcgattgctccaatgtacggggtaaa SEQ ID No: 4 HPA2-izquierdo gccgcgaattcactagtgtgaaaggcaatgagctgaag SEQ ID No: 5 HPA2-derecho ggccgcgggaattcgattagccagactgagcttctcca SEQ ID No: 6 HPA3-izquierdo gccgcgaattcactagtggcctgaccactcctttgc SEQ ID No: 7 HPA3-derecho ggccgcgggaattcgattggaagatctgtctgcgatcc SEQ ID No: 8 HPA4-izquierdo gccgcgaattcactagtgatccgcaggttactggtgag SEQ ID No: 9

   HPA4-derecho

   ggccgcgggaattcgattccatgaaggatgatctgtgg SEQ

   ID No:

   10

   HPA5-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgtccaaatgcaagttaaattaccag

   SEQ ID No: 11

   HPA5-derecho

   ggccgcgggaattcgattacagacgtgctcttggtaggt SEQ

   ID No: 12

   HPA15-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgtgtatcagttcttggttttgtgatg

   SEQ ID No: 13

   HPA15-derecho

   ggccgcgggaattcgattaaaaccagtagccacccaag SEQ

   ID No: 14

   JK1/2-izquierdo

   gccgcgaattcactagtggtctttcagccccatttgag SEQ

   ID No: 15

   JK1/2-derecho

   ggccgcgggaattcgattgttgaaaccccagagtccaa SEQ

   ID No: 16

   FY1/2-izquierdo

   gccgcgaattcactagtggaattcttcctatggtgtgaatga

   SEQ ID No: 17

   FY1/2-derecho

   ggccgcgggaattcgattaagaagggcagtgcagagtc SEQ

   ID No: 18

   GATAbox-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgggccctcattagtccttgg SEQ

   ID No: 19

   GATAbox-derecho

   ggccgcgggaattcgattgaaatgaggggcatagggata SEQ

   ID No: 20

   Fyx-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgtcatgcttttcagacctctcttc

   SEQ ID No: 175

   Fyx-derecho

   ggccgcgggaattcgattcaagacgggcaccacaat SEQ

   ID No: 176

   KEL1/2-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgaagggaaatggccatactga SEQ

   ID No: 21

   KEL1/2-derecho

   ggccgcgggaattcgattagctgtgtaagagccgatcc SEQ

   ID No: 22

   KEL3/4-izquierdo

   gccgcgaattcactagtggcctcagaaactggaacagc SEQ

   ID No: 23

   KEL3/4-derecho

   ggccgcgggaattcgattagcaaggtgcaagaacactct SEQ

   ID No: 24

   KEL6/7-izquierdo

   gccgcgaattcactagtggcagcaccaaccctatgttc SEQ

   ID No: 177

   KEL6/7-derecho

   ggccgcgggaattcgatttcaggcacaggtgagcttc SEQ

   ID No: 178

   RHCEex2for

   gccgcgaattcactagtgcgtctgcttccccctcc SEQ

   ID No: 25

   RHex2rev

   ggccgcgggaattcgattctgaacagtgtgatgaccacc SEQ

   ID No: 26

   RHDex3-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgtcctggctctccctctct SEQ

   ID No: 179

   RHCEex3-derecho

   ggccgcgggaattcgatttttttcaaaaccccggaag SEQ

   ID No: 180

   RHCEex5-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgggatgttctggccaagtg SEQ

   ID No: 27

   RHex5rev

   ggccgcgggaattcgattggctgtcaccacactgactg SEQ

   ID No: 28

   RHDψ-izquierdo

   ggccgcgggaattcgattgtagtgagctggcccatca SEQ

   ID No: 29

   RHDψ-derecho gccgcgaattcactagtgtgtctagtttcttaccggcaagtSEQ ID No: 30 RHD-izquierdoB gccgcgaattcactagtgttataataacacttgtccacaggg

   SEQ ID No: 31 RHD-derechoC ggccgcgggaattcgattcggctccgacggtatc SEQ ID No: 32 BigC-izquierdo gccgcgaattcactagtgggccaccaccatttgaa SEQ ID No: 33 BigC-intrónderecho2 ggccgcgggaattcgattccatgaacatgccacttcac SEQ ID No: 34 RhDVI-izquierdo (dir)

   ggccgcgggaattcgattctttgaattaagcacttcacagaSEQ ID No: 181 RhDVI-derecho (inv) gccgcgaattcactagtggccagaatcacactcctgct SEQ ID No: 182 MN-izquierdo gccgcgaattcactagtgtgagggaatttgtcttttgca SEQ ID No: 35 MN-derecho ggccgcgggaattcgattcagaggcaagaattcctcca SEQ ID No: 36 Ss-izquierdo gccgcgaattcactagtgtttttctttgcacatgtcttt SEQ ID No: 183 Ss-derecho ggccgcgggaattcgatttctttgtctttacaatttcgtgtg

   SEQ ID No: 184 U-izquierdo gccgcgaattcactagtgcgctgatgttatctgtcttatttttc

   SEQ ID No: 37 U-derecho ggccgcgggaattcgattgatcgttccaataataccagcc SEQ ID No: 38 DO-izquierdo ggccgcgggaattcgatttgatccctccctatgagctg SEQ ID No: 185 DO-derecho gccgcgaattcactagtgttatatgtgctcaggttcccagtSEQ

   ID No: 186

   JO-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgcctggcttaaccaaggaaaa SEQ

   ID No: 39

   JO-derecho

   ggccgcgggaattcgatttcatactgctgtggagtcctg SEQ

   ID No: 40

   Colton-izquierdo

   gccgcgaattcactagtggccacgaccctctttgtct SEQ

   ID No: 187

   Colton-derecho

   ggccgcgggaattcgatttacatgagggcacggaagat SEQ

   ID No: 188

   Diego-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgacttattcacgggcatccag SEQ

   ID No: 189

   Diego-derecho

   ggccgcgggaattcgattaagctccacgttcctgaaga SEQ

   ID No: 190

   Wr-izquierdo

   gccgcgaattcactagtgggcttcaaggtgtccaactc SEQ

   ID No: 636

   Wr-derecho

   ggccgcgggaattcgattaggatgaagaccagcagagc SEQ

   ID No: 637

   Yt-izquierdo

   ggccgcgggaattcgattccttcgtgcctgtggtagat SEQ

   ID No: 638

   Yt-derecho

   gccgcgaattcactagtgttctgggacttctgggaatg SEQ

   ID No: 639

   Lu-izquierdo gccgcgaattcactagtgggacccagagagagagagactg SEQ ID No: 640 Lu-derecho ggccgcgggaattcgattgggagtccagctggtatgg SEQ ID No: 641.

8. 8.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 17, en el que la polimerasa de ADN utilizada en la PCR múltiple es polimerasa Taq o una polimerasa similar resistente al calor y cada ciclo por PCR múltiple comprende una etapa de desnaturalización por calor de 15 a 60 segundos a una temperatura de 90 a 98°C

   (preferentemente aproximadamente de 30 segundos a aproximadamente 94°C), una etapa de alineamiento de 60 a 120 segundos a una temperatura de 54 a 60°C (preferentemente aproximadamente de 90 segundos a aproximadamente 57°C), y una etapa de extensión del cebador de 60 a 120 segundos a una temperatura de 68 a 76°C (preferentemente aproximadamente de 90 segundos a aproximadamente 72°C).

9. 9.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 18, en el que dicha PCR múltiple utiliza, sobre la base de un volumen de reacción de 50 µL, aproximadamente 100 ng de ADN genómico de dicho individuo, aproximadamente 5 nM de cada cebador quimérico, por par de cebadores quiméricos aproximadamente 0,2 µM de cada cebador universal marcado de forma detectable y aproximadamente 25 µL de tampón que contiene MasterMix 2x, dNTP y ADN polimerasa.

10. 10.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 19, en el que el genotipo para cada uno de dichos antígenos de células de la sangre se determina por hibridación de los productos de la amplificación por PCR múltiple, después de la desnaturalización, con las sondas de oligonucleótidos específicas de alelo del antígeno de células de la sangre contenidas en un arreglo de ADN o presentadas en cualquier otra forma, tal como soportadas en perlas, y analizado el patrón de hibridación.

11. 11.

    Método, según la reivindicación 10, en el que las sondas específicas de alelo tienen una longitud de 15 a 40 nucleótidos, preferentemente de 17 a 30 nucleótidos.

12. 12.

    Método, según la reivindicación 10 u 11, en el que el arreglo comprende para cada alelo de un antígeno de células de la sangre, como mínimo, dos, preferentemente, como mínimo, cinco, sondas sentido diferentes, y, como mínimo, dos, preferentemente, como mínimo cinco, sondas antisentido diferentes, cada una de las cuales cubre el sitio del polimorfismo de nucleótidos pero en varias posiciones.

13. 13.

    Método, según la reivindicación 11, en el que el arreglo comprende, como mínimo, 72 sondas diferentes, preferentemente substancialmente todas las sondas, seleccionadas del grupo que comprende:

    Alelo HPA1 a: HPA-1aa tacaggccctgcctctggg SEQ ID No: 41 HPA-1ab aggccctgcctctgggct SEQ ID No: 42 HPA-1ac ccctgcctctgggctcacc SEQ ID No: 43 HPA-1ad tgcctctgggctcacctcg SEQ ID No: 44 HPA-1ae ctctgggctcacctcgctg SEQ ID No: 45 HPA-1aa CR cagcgaggtgagcccagag SEQ ID No: 46 HPA-1ab CR cgaggtgagcccagaggca SEQ ID No: 47 HPA-1ac CR ggtgagcccagaggcaggg SEQ ID No: 48 HPA-1ad CR agcccagaggcagggcct SEQ ID No: 49 HPA-1ae CR cccagaggcagggcctgta SEQ ID No: 50

    Alelo HPA1 b: HPA-1ba tacaggccctgcctccggg SEQ ID No: 51 HPA-1bb aggccctgcctccgggct SEQ ID No: 52 HPA-1bc ccctgcctccgggctcac SEQ ID No: 53 HPA-1bd ctgcctccgggctcacct SEQ ID No: 54 HPA-1be ctccgggctcacctcgct SEQ ID No: 55 HPA-1ba CR agcgaggtgagcccggag SEQ ID No: 56 HPA-1bb CR aggtgagcccggaggcag SEQ ID No: 57 HPA-1bc CR gtgagcccggaggcaggg SEQ ID No: 58 HPA-1bd CR agcccggaggcagggcct SEQ ID No: 59 HPA-1be CR cccggaggcagggcctgta SEQ ID No: 60

    Alelo HPA2 a: HPA-2aa ctgacgcccacacccaag SEQ ID No: 61 HPA-2ab ctcctgacgcccacaccc SEQ ID No: 62 HPA-2ac ggctcctgacgcccacac SEQ ID No: 63 HPA-2ad agggctcctgacgcccac SEQ ID No: 64 HPA-2ae ccagggctcctgacgccc SEQ ID No: 65 HPA-2aa CR cttgggtgtgggcgtcag SEQ ID No: 66 HPA-2ab CR gggtgtgggcgtcaggag SEQ ID No: 67 HPA-2ac CR gtgtgggcgtcaggagcc SEQ ID No: 68 HPA-2ad CR gtgggcgtcaggagccct SEQ ID No: 69 HPA-2ae CR gggcgtcaggagccctgg SEQ ID No: 70

    Alelo HPA2 b: HPA-2ba cctgatgcccacacccaag SEQ ID No: 71 HPA-2bb ctcctgatgcccacaccca SEQ ID No: 72 HPA-2bc ggctcctgatgcccacacc SEQ ID No: 73 HPA-2bd agggctcctgatgcccaca SEQ ID No: 74 HPA-2be ccagggctcctgatgccc SEQ ID No: 75 HPA-2ba CR cttgggtgtgggcatcagg SEQ ID No: 76 HPA-2bb CR tgggtgtgggcatcaggag SEQ ID No: 77 HPA-2bc CR ggtgtgggcatcaggagcc SEQ ID No: 78 HPA-2bd CR tgtgggcatcaggagccct SEQ ID No: 79 HPA-2be CR gggcatcaggagccctgg SEQ ID No: 80

    Alelo HPA3 a: HPA-3 aa ccatccccagcccctccc SEQ ID No: 81 HPA-3ab gcccatccccagcccctc SEQ ID No: 82 HPA-3ac ctgcccatccccagcccc SEQ ID No: 83 HPA-3ad1 gctgcccatccccagccc SEQ ID No: 84 HPA-3 ad ggctgcccatccccagcc SEQ ID No: 85 HPA-3ad2 gggctgcccatccccagc SEQ ID No: 86 HPA-3ae ggggctgcccatcccca SEQ ID No: 87 HPA-3 aa CR gggaggggctggggatgg SEQ ID No: 88 HPA-3ab CR gaggggctggggatgggc SEQ ID No: 89 HPA-3ac CR ggggctggggatgggcag SEQ ID No: 90 HPA-3ad1 CR gggctggggatgggcagc SEQ ID No: 91 HPA-3ad CR ggctggggatgggcagcc SEQ ID No: 92 HPA-3ad2 CR gctggggatgggcagccc SEQ ID No: 93 HPA-3ae CR tggggatgggcagcccc SEQ ID No: 94

    Alelo HPA3 b: HPA-3ba ccagccccagcccctcc SEQ ID No: 95 HPA-3bb gcccagccccagcccct SEQ ID No: 96 HPA-3bc ctgcccagccccagccc SEQ ID No: 97 HPA-3bd1 gctgcccagccccagcc SEQ ID No: 98 HPA-3bd ggctgcccagccccagc SEQ ID No: 99 HPA-3bd2 gggctgcccagccccag SEQ ID No: 100 HPA-3be ggggctgcccagcccca SEQ ID No: 101 HPA-3ba CR ggaggggctggggctgg SEQ ID No: 102 HPA-3bb CR aggggctggggctgggc SEQ ID No: 103 HPA-3bc CR gggctggggctgggcag SEQ ID No: 104 HPA-3bd1 CR ggctggggctgggcagc SEQ ID No: 105 HPA-3bd CR gctggggctgggcagcc SEQ ID No: 106 HPA-3bd2 CR ctggggctgggcagccc SEQ ID No: 107 HPA-3be CR tggggctgggcagcccc SEQ ID No: 108

    Alelo HPA4 a: HPA-4aa gccacccagatgcgaaag SEQ ID No: 109 HPA-4ab cacccagatgcgaaagct SEQ ID No: 110

    HPA-4ac cccagatgcgaaagctca SEQ ID No: 111 HPA-4ad cagatgcgaaagctcacc SEQ ID No: 112 HPA-4ae gatgcgaaagctcaccag SEQ ID No: 113 HPA-4aa CR ctggtgagctttcgcatc SEQ ID No: 114 HPA-4ab CR ggtgagctttcgcatctg SEQ ID No: 115 HPA-4ac CR tgagctttcgcatctggg SEQ ID No: 116 HPA-4ad CR agctttcgcatctgggtg SEQ ID No: 117 HPA-4ae CR ctttcgcatctgggtggc SEQ ID No: 118 Alelo HPA4 b: HPA-4ba gccacccagatgcaaaag SEQ ID No: 119 HPA-4bb ccacccagatgcaaaagct SEQ ID No: 120 HPA-4bc acccagatgcaaaagctcac SEQ ID No: 121 HPA-4bd cagatgcaaaagctcacca SEQ ID No: 122 HPA-4be gatgcaaaagctcaccagtaa SEQ ID No: 123 HPA-4ba CR ttactggtgagcttttgcatc SEQ ID No: 124 HPA-4bb CR tggtgagcttttgcatctg SEQ ID No: 125 HPA-4bc CR gtgagcttttgcatctgggt SEQ ID No: 126 HPA-4bd CR agcttttgcatctgggtgg SEQ ID No: 127 HPA-4be CR cttttgcatctgggtggc SEQ ID No: 128 Alelo HPA5 a: HPA-5aa gagtctacctgtttactatcaaagagg SEQ ID No: 129 HPA-5ab agtctacctgtttactatcaaagaggta SEQ ID No: 130 HPA-5ac gtctacctgtttactatcaaagaggtaa SEQ ID No: 131 HPA-5ad ctacctgtttactatcaaagaggtaaaa SEQ ID No: 132 HPA-5ae acctgtttactatcaaagaggtaaaaa SEQ ID No: 133 HPA-5aa CR tttttacctctttgatagtaaacaggt SEQ ID No: 134 HPA-5ab CR ttttacctctttgatagtaaacaggtag SEQ ID No: 135 HPA-5ac CR ttacctctttgatagtaaacaggtagac SEQ ID No: 136 HPA-5ad CR tacctctttgatagtaaacaggtagact SEQ ID No: 137 HPA-5ae CR cctctttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID No: 138 Alelo HPA5 b: HPA-5ba gagtctacctgtttactatcaaaaagg SEQ ID No: 139 BPA-5bb agtctacctgtttactatcaaaaaggta SEQ ID No: 140 HPA-5bc gtctacctgtttactatcaaaaaggtaa SEQ ID No: 141 HPA-5ad ctacctgtttactatcaaaaaggtaaaa SEQ ID No: 142 HPA-5be acctgtttactatcaaaaaggtaaaaa SEQ ID No: 143 HPA-5ba CR tttttacctttttgatagtaaacaggt SEQ ID No: 144

    HPA-5bb CR ttttacctttttgatagtaaacaggtag SEQ ID No: 145 HPA-5bc CR ttacctttttgatagtaaacaggtagac SEQ ID No: 146 HPA-5bd CR tacctttttgatagtaaacaggtagact SEQ ID No: 147 HPA-5be CR cctttttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID No: 148

    Alelo HPA15 a: Gov-aa ttattatcttgacttcagttacaggattt SEQ ID No: 149 Gov-ab tcttgacttcagttacaggatttacc SEQ ID No: 150 Gov-ac tgacttcagttacaggatttaccaa SEQ ID No: 151 Gov-ad cttcagttacaggatttaccaagaat SEQ ID No: 152 Gov-ae cagttacaggatttaccaagaatttg SEQ ID No: 153 Gov-aa CR caaattcttggtaaatcctgtaactg SEQ ID No: 154 Gov-ab CR attcttggtaaatcctgtaactgaag SEQ ID No: 155 Gov-ac CR tggtaaatcctgtaactgaagtcaa SEQ ID No: 156 Gov-ad CR ggtaaatcctgtaactgaagtcaaga SEQ ID No: 157 Gov-ae CR aaatcctgtaactgaagtcaagataataa SEQ ID No: 158

    Alelo HPA15 b: Gov-ba tatcttgacttcagttccaggatt SEQ ID No: 159 Gov-bb cttgacttcagttccaggatttac SEQ ID No: 160 Gov-bc gacttcagttccaggatttacca SEQ ID No: 161 Gov-bd ttcagttccaggatttaccaag SEQ ID No: 162 Gov-be cagttccaggatttaccaagaatt SEQ ID No: 163 Gov-ba CR aattcttggtaaatcctggaactg SEQ ID No: 164 Gov-bb CR cttggtaaatcctggaactgaa SEQ ID No: 165 Gov-bc CR ggtaaatcctggaactgaagtca SEQ ID No: 166 Gov-bd CR gtaaatcctggaactgaagtcaag SEQ ID No: 167 Gov-be CR aatcctggaactgaagtcaagata SEQ ID No: 168

    Alelo Colton a: Co.a.1 aacaaccagacggcggt SEQ ID No: 191 Co.a.2 accagacggcggtccag SEQ ID No: 192 Co.a.3 cagacggcggtccagga SEQ ID No: 193 Co.a.4 gacggcggtccaggacaa SEQ ID No: 194 Co.a.5 cggcggtccaggacaac SEQ ID No: 195 Co.a.1.cr gttgtcctggaccgccgt SEQ ID No: 196 Co.a.2.cr tcctggaccgccgtctg SEQ ID No: 197 Co.a.3.cr ctggaccgccgtctggt SEQ ID No: 198 Co.a.4.cr ggaccgccgtctggttg SEQ ID No: 199 Co.a.5.cr accgccgtctggttgtt SEQ ID No: 200

    Alelo Colton b: Co.b.1 ggaacaaccagacggtggt SEQ ID No: 201 Co.b.2 acaaccagacggtggtccag SEQ ID No: 202 Co.b.3 accagacggtggtccagga SEQ ID No: 203 Co.b.4 gacggtggtccaggacaacg SEQ ID No: 204 Co.b.5 cggtggtccaggacaacg SEQ ID No: 205 Co.b.1.cr cgttgtcctggaccaccgt SEQ ID No: 206 Co.b.2.cr ttgtcctggaccaccgtctg SEQ ID No: 207 Co.b.3.cr ctggaccaccgtctggttgt SEQ ID No: 208 Co.b.4.cr ggaccaccgtctggttgttc SEQ ID No: 209 Co.b.5.cr accaccgtctggttgttcc SEQ ID No: 210

    Alelo Diego a: Di.a.1 gtgaagtccacgccggc SEQ ID No: 211 Di.a.2 gaagtccacgccggcct SEQ ID No: 212 Di.a.3 agtccacgccggcctcc SEQ ID No: 213 Di.a.4 tccacgccggcctccct SEQ ID No: 214 Di.a.5 acgccggcctccctggcc SEQ ID No: 215 Di.a.1.cr gccagggaggccggcgt SEQ ID No: 216 Di.a.2.cr agggaggccggcgtgga SEQ ID No: 217 Di.a.3.cr ggaggccggcgtggact SEQ ID No: 218 Di.a.4.cr aggccggcgtggacttc SEQ ID No: 219 Di.a.5.cr ggccggcgtggacttca SEQ ID No: 220

    Alelo Diego b: Di.b.1 ggtgaagtccacgctggc SEQ ID No: 221 Di.b.2 gtgaagtccacgctggcct SEQ ID No: 222 Di.b.3 tgaagtccacgctggcctcc SEQ ID No: 223 Di.b.4 gaagtccacgctggcctccct SEQ ID No: 224 Di.b.5 acgctggcctccctggccc SEQ ID No: 225 Di.b.1.cr ggccagggaggccagcgt SEQ ID No: 226 Di.b.2.cr cagggaggccagcgtgga SEQ ID No: 227 Di.b.3.cr agggaggccagcgtggact SEQ ID No: 228 Di.b.4.cr ggaggccagcgtggacttc SEQ ID No: 229 Di.b.5.cr ggccagcgtggacttcacc SEQ ID No: 230

    Alelo Diego Wr a: Wr.a.1 tgggcttgcgttccaagt SEQ ID No: 231 Wr.a.2 ggcttgcgttccaagtttc SEQ ID No: 232 Wr.a.3 ttgcgttccaagtttccca SEQ ID No: 233 Wr.a.4 cgttccaagtttcccatct SEQ ID No: 234 Wr.a.5 tccaagtttcccatctgga SEQ ID No: 235 Wr.a.1 CR tccagatgggaaacttgga SEQ ID No: 236 Wr.a.2 CR agatgggaaacttggaacg SEQ ID No: 237 Wr.a.3 CR tgggaaacttggaacgcaa SEQ ID No: 238 Wr.a.4 CR gaaacttggaacgcaagcc SEQ ID No: 239 Wr.a.5 CR acttggaacgcaagccca SEQ ID No: 240

    Alelo Diego Wr b: Wr.b.1 gggcttgcgttccgagtt SEQ ID No: 241 Wr.b.2 gcttgcgttccgagtttc SEQ ID No: 242 Wr.b.3 ttgcgttccgagtttccc SEQ ID No: 243 Wr.b.4 cgttccgagtttcccatc SEQ ID No: 244 Wr.b.5 tccgagtttcccatctgg SEQ ID No: 245 Wr.b.1 CR ccagatgggaaactcgga SEQ ID No: 246 Wr.b.2 CR gatgggaaactcggaacg SEQ ID No: 247 Wr.b.3 CR gggaaactcggaacgcaa SEQ ID No: 248 Wr.b.4 CR gaaactcggaacgcaagc SEQ ID No: 249 Wr.b.5 CR aactcggaacgcaagccc SEQ ID No: 250

    Alelo Dombrock a: Do.a.1 taccacccaagaggaaact SEQ ID No: 251 Do.a.2 ccacccaagaggaaactgg SEQ ID No: 252 Do.a.3 acccaagaggaaactggttg SEQ ID No: 253 Do.a.4 caagaggaaactggttgca SEQ ID No: 254 Do.a.5 aggaaactggttgcagttga SEQ ID No: 255 Do a 6 cr ctcaactgcaaccagtttcc SEQ ID No: 256 Do a 7 cr caactgcaaccagtttcctc SEQ ID No: 257 Do a 8 cr tgcaaccagtttcctcttgg SEQ ID No: 258 Do a 9 cr accagtttcctcttgggtgg SEQ ID No: 259 Do a 10 cr cagtttcctcttgggtggta SEQ ID No: 260

    Alelo Dombrock b: Do.b.1 taccacccaagaggagact SEQ ID No: 261 Do.b.2 ccacccaagaggagactgg SEQ ID No: 262 Do.b.3 acccaagaggagactggttg SEQ ID No: 263 Do.b.4 caagaggagactggttgca SEQ ID No: 264 Do.b.5 aggagactggttgcagttga SEQ ID No: 265 Do b 6 cr ctcaactgcaaccagtctcc SEQ ID No: 266 Do b 7 cr caactgcaaccagtctcctc SEQ ID No: 267

    Do b 8 cr tgcaaccagtctcctcttgg SEQ ID No: 268 Do b 9 cr accagtctcctcttgggtgg SEQ ID No: 269 Do b 10 cr cagtctcctcttgggtggt SEQ ID No: 270 Alelo Dombrock-Joseph(a) positivo: Jo.a.pos.1 ccccagaacatgactaccac SEQ ID No: 271 Jo.a.pos.2 ccagaacatgactaccacaca SEQ ID No: 272 Jo.a.pos.3 agaacatgactaccacacacgc SEQ ID No: 273 Jo.a.pos.4 catgactaccacacacgctgt SEQ ID No: 274 Jo.a.pos.5 actaccacacacgctgtgg SEQ ID No: 275 Jo.a.pos.1.cr gccacagcgtgtgtggtagt SEQ ID No: 276 Jo.a.pos.2.cr acagcgtgtgtggtagtcatg SEQ ID No: 277 Jo.a.pos.3.cr agcgtgtgtggtagtcatgtt SEQ ID No: 278 Jo.a.pos.4.cr cgtgtgtggtagtcatgttctg SEQ ID No: 279 Jo.a.pos.5.cr gtggtagtcatgttctgggg SEQ ID No: 280 Alelo Dombrock-Joseph(a) negativo: Jo.a.neg.1 ctaccccagaacatgactatcac SEQ ID No: 281 Jo.a.neg.2 cccagaacatgactatcacaca SEQ ID No: 282 Jo.a.neg.3 cagaacatgactatcacacacgc SEQ ID No: 283 Jo.a.neg.4 catgactatcacacacgctgtg SEQ ID No: 284 Jo.a.neg.5 actatcacacacgctgtggc SEQ ID No: 285 Jo.a.neg.1.cr aatagccacagcgtgtgtgatagt SEQ ID No: 286 Jo.a.neg.2.cr cacagcgtgtgtgatagtcatg SEQ ID No: 287 Jo.a.neg.3.cr cagcgtgtgtgatagtcatgtt SEQ ID No: 288 Jo.a.neg.4.cr cgtgtgtgatagtcatgttctgg SEQ ID No: 289 Jo.a.neg.5.cr gtgatagtcatgttctggggtag SEQ ID No: 290 Alelo Duffy a: Fy.A.1 ccagatggagactatggtgcc SEQ ID No: 291 Fy.A.2 atggagactatggtgccaac SEQ ID No: 292 Fy.A.3 ggagactatggtgccaacctg SEQ ID No: 293 Fy.A.4 gactatggtgccaacctgga SEQ ID No: 294 Fy.A.5 tatggtgccaacctggaag SEQ ID No: 295 Fy.A.1.cr cttccaggttggcaccata SEQ ID No: 296 Fy.A.2.cr tccaggttggcaccatagtc SEQ ID No: 297 Fy.A.3.cr aggttggcaccatagtctcc SEQ ID No: 298 Fy.A.4.cr gttggcaccatagtctccat SEQ ID No: 299 Fy.A.5.cr gcaccatagtctccatctgg SEQ ID No: 300

    Alelo Duffy b: Fy.B.1 cccagatggagactatgatgcc SEQ ID No: 301 Fy.B.2 gatggagactatgatgccaac SEQ ID No: 302 Fy.B.3 tggagactatgatgccaacctg SEQ ID No: 303 Fy.B.4 gactatgatgccaacctggaa SEQ ID No: 304 Fy.B.5 tatgatgccaacctggaagc SEQ ID No: 305 Fy.B.1.cr gcttccaggttggcatcata SEQ ID No: 306 Fy.B.2.cr ttccaggttggcatcatagtc SEQ ID No: 307 Fy.B.3.cr caggttggcatcatagtctcc SEQ ID No: 308 Fy.B.4.cr gttggcatcatagtctccatc SEQ ID No: 309 Fy.B.5.cr gcatcatagtctccatctggg SEQ ID No: 310 Alelo Duffy GATAbox normal: Fy.GATA.normal.1 agtccttggctcttatcttg SEQ ID No: 311 Fy.GATA.normal.2 agtccttggctcttatcttgga SEQ ID No: 312 Fy.GATA.normal.3 cttggctcttatcttggaagc SEQ ID No: 313 Fy.GATA.normal.4 gctcttatcttggaagcacagg SEQ ID No: 314 Fy.GATA.normal.5 cttatcttggaagcacaggcgc SEQ ID No: 315 Fy.GATA.normal.1.cr gcctgtgcttccaagataag SEQ ID No: 316 Fy.GATA.normal.2.cr tgtgcttccaagataagagc SEQ ID No: 317 Fy.GATA.normal.3.cr tgcttccaagataagagcca SEQ ID No: 318 Fy.GATA.normal.4.cr ttccaagataagagccaagga SEQ ID No: 319 Fy.GATA.normal.5.cr caagataagagccaaggact SEQ ID No: 320 Alelo de mutación Duffy GATAbox: Fy.GATA.mut.1 tccttggctcttaccttg SEQ ID No: 321 Fy.GATA.mut.2 tccttggctcttaccttgga SEQ ID No: 322 Fy.GATA.mut.3 tggctcttaccttggaagc SEQ ID No: 323 Fy.GATA.mut.4 gctcttaccttggaagcacag SEQ ID No: 324 Fy.GATA.mut.5 cttaccttggaagcacaggcg SEQ ID No: 325 Fy.GATA.mut.1.cr cctgtgcttccaaggtaag SEQ ID No: 326 Fy.GATA.mut.2.cr gtgcttccaaggtaagagc SEQ ID No: 327 Fy.GATA.mut.3.cr gcttccaaggtaagagcca SEQ ID No: 328 Fy.GATA.mut.4.cr ttccaaggtaagagccaagg SEQ ID No: 329

    Fy.GATA.mut.5.cr

    Alelo normal Duffy Fyx: Fy.X.(b).1 Fy.X.(b).2 Fy.X.(b).3 Fy.X.(b).4 Fy.X.(b).5 Fy.X.(b).1.cr Fy.X.(b).2.cr Fy.X.(b).3.cr Fy.X.(b).4.cr Fy.X.(b).5.cr

    caaggtaagagccaagga

    ttttcagacctctcttccgct agacctctcttccgctggc ctctcttccgctggcagc ctcttccgctggcagctc cttccgctggcagctctg cagagctgccagcggaa agctgccagcggaagag ctgccagcggaagagagg gccagcggaagagaggtc cagcggaagagaggtctg SEQ ID No: 330

    SEQ ID No: 331 SEQ ID No: 332 SEQ ID No: 333 SEQ ID No: 334 SEQ ID No: 335 SEQ ID No: 336 SEQ ID No: 337 SEQ ID No: 338 SEQ ID No: 339 SEQ ID No: 340

    Alelo de mutación Duffy Fyx:

    Fy.X.1 Fy.X.2 Fy.X.3 Fy.X.4 Fy.X.5 Fy.X.1.cr Fy.X.2.cr Fy.X.3.cr Fy.X.4.cr Fy.X.5.cr

    Alelo Kidd a: Jk.a.1 Jk.a.2 Jk.a.3 Jk.a.4 Jk.a.5 Jk.a.1.cr Jk.a.2.cr Jk.a.3.cr Jk.a.4.cr Jk.a.5.cr

    Alelo Kidd b: Jk.b.1 Jk.b.2

    gcttttcagacctctcttctgct SEQ ID No: 341

    tcagacctctcttctgctggc acctctcttctgctggcagc ctcttctgctggcagctctg cttctgctggcagctctgc gcagagctgccagcagaa gagctgccagcagaagagag agctgccagcagaagagagg gccagcagaagagaggtctg cagcagaagagaggtctgaaa

    cagccccatttgaggaca gccccatttgaggacatcta SEQ ID No: 342 SEQ ID No: 343 SEQ ID No: 344 SEQ ID No: 345 SEQ ID No: 346 SEQ ID No: 347 SEQ ID No: 348 SEQ ID No: 349 SEQ ID No: 350

    SEQ ID No: 351 SEQ ID No: 352

    ccatttgaggacatctactttg SEQ ID No: 353 atttgaggacatctactttgga SEQ ID No: 354 gaggacatctactttggactct SEQ ID No: 355 cagagtccaaagtagatgtcctc SEQ ID No: 356 agtccaaagtagatgtcctcaaa SEQ ID No: 357 aaagtagatgtcctcaaatggg SEQ ID No: 358 tagatgtcctcaaatggggc SEQ ID No: 359 atgtcctcaaatggggctg SEQ ID No: 360

    tcagccccatttgagaaca SEQ ID No: 361 gccccatttgagaacatcta SEQ ID No: 362 Jk.b.3 cccatttgagaacatctactttg SEQ ID No: 363 Jk.b.4 atttgagaacatctactttggac SEQ ID No: 364 Jk.b.5 gagaacatctactttggactctg SEQ ID No: 365 Jk.b.1.cr ccagagtccaaagtagatgttctcSEQ ID No: 366 Jk.b.2.cr agagtccaaagtagatgttctcaaa SEQ ID No:

    367 Jk.b.3.cr ccaaagtagatgttctcaaatgg SEQ ID No: 368 Jk.b.4.cr agtagatgttctcaaatggggc SEQ ID No: 369 Jk.b.5.cr atgttctcaaatggggctga SEQ ID No: 370 Alelo Kell K1: KEL.1.1 tccttaaactttaaccgaatgct SEQ ID No: 371 KEL.1.2 ttaaactttaaccgaatgctgaga SEQ ID No:

    372 KEL.1.3 aactttaaccgaatgctgagactt SEQ ID No:

    373 KEL.1.4 aaccgaatgctgagacttctg SEQ ID No: 374 KEL.1.5 cgaatgctgagacttctgatgag SEQ ID No: 375 KEL 1.6 CR actcatcagaagtctcagcattc SEQ ID No: 376 KEL 1.7 CR tcagaagtctcagcattcggt SEQ ID No: 377 KEL 1.8 CR aagtctcagcattcggttaaag SEQ ID No: 378 KEL 1.9 CR tctcagcattcggttaaagtttaa SEQ ID No:

    379 KEL 1.10 CR agcattcggttaaagtttaagga SEQ ID No: 380 Alelo Kell K2: KEL.2.1 ccttaaactttaaccgaacgct SEQ ID No: 381 KEL.2.2 aactttaaccgaacgctgaga SEQ ID No: 382 KEL.2.3 ctttaaccgaacgctgagactt SEQ ID No: 383 KEL.2.4 aaccgaacgctgagacttct SEQ ID No: 384 KEL.2.5 cgaacgctgagacttctgatg SEQ ID No: 385 KEL 2.6 CR tcatcagaagtctcagcgttc SEQ ID No: 386 KEL 2.7 CR cagaagtctcagcgttcggt SEQ ID No: 387 KEL 2.8 CR agtctcagcgttcggttaaag SEQ ID No: 388 KEL 2.9 CR tctcagcgttcggttaaagtt SEQ ID No: 389 KEL 2.10 CR agcgttcggttaaagtttaagg SEQ ID No: 390 Alelo Kell K3: KEL.3.1 aatctccatcacttcatggct SEQ ID No: 391 KEL.3.2 tccatcacttcatggctgtt SEQ ID No: 392

    KEL.3.3 atcacttcatggctgttcca SEQ ID No: 393 KEL.3.4 acttcatggctgttccagtt SEQ ID No: 394 KEL.3.5 tcatggctgttccagtttc SEQ ID No: 395 KEL.3.1.cr agaaactggaacagccatgaa SEQ ID No: 396 KEL.3.2.cr aactggaacagccatgaagtg SEQ ID No: 397 KEL.3.3.cr tggaacagccatgaagtgatg SEQ ID No: 398 KEL.3.4.cr acagccatgaagtgatggag SEQ ID No: 399 KEL.3.5.cr gccatgaagtgatggagatt SEQ ID No: 400

    Alelo Kell K4: KEL.4.1 tctccatcacttcacggct SEQ ID No: 401 KEL.4.2 ccatcacttcacggctgtt SEQ ID No: 402 KEL.4.3 cacttcacggctgttcca SEQ ID No: 403 KEL.4.4 acttcacggctgttccag SEQ ID No: 404 KEL.4.5 tcacggctgttccagttt SEQ ID No: 405 KEL.4.1.cr aaactggaacagccgtgaa SEQ ID No: 406 KEL.4.2.cr ctggaacagccgtgaagtg SEQ ID No: 407 KEL.4.3.cr ggaacagccgtgaagtgatg SEQ ID No: 408 KEL.4.4.cr acagccgtgaagtgatgg SEQ ID No: 409 KEL.4.5.cr gccgtgaagtgatggaga SEQ ID No: 410

    Alelo Kell K6: KEL.6.1 tactgcctgggggctgccccgcc SEQ ID No: 411 KEL.6.2 tgggggctgccccgcctgt SEQ ID No: 412 KEL.6.3 gctgccccgcctgtgac SEQ ID No: 413 KEL.6.4 ctgccccgcctgtgacaa SEQ ID No: 414 KEL.6.5 gccccgcctgtgacaac SEQ ID No: 415 KEL.6.1.cr gttgtcacaggcggggc SEQ ID No: 416 KEL.6.2.cr ttgtcacaggcggggcag SEQ ID No: 417 KEL.6.3.cr tcacaggcggggcagccc SEQ ID No: 418 KEL.6.4.cr acaggcggggcagccccca SEQ ID No: 419 KEL.6.5.cr aggcggggcagccccca SEQ ID No: 420

    Alelo Kell K7: KEL.7.1 actgcctgggggctgcctcgcc SEQ ID No: 421 KEL.7.2 cctgggggctgcctcgcctgt SEQ ID No: 422 KEL.7.3 ggctgcctcgcctgtgac SEQ ID No: 423 KEL.7.4 ctgcctcgcctgtgacaacc SEQ ID No: 424 KEL.7.5 gcctcgcctgtgacaacc SEQ ID No: 425 KEL.7.1.cr ggttgtcacaggcgaggc SEQ ID No: 426 KEL.7.2.cr ggttgtcacaggcgaggcag SEQ ID No: 427 KEL.7.3.cr ttgtcacaggcgaggcagccc SEQ ID No: 428 KEL.7.4.cr acaggcgaggcagcccccagg SEQ ID No: 429 KEL.7.5.cr aggcgaggcagcccccagg SEQ ID No: 430

    Alelo Lutheran a: Lu.a.1 ggagctcgcccccgcct SEQ ID No: 431 Lu.a.2 gctcgcccccgcctagc SEQ ID No: 432 Lu.a.3 cgcccccgcctagcctc SEQ ID No: 433 Lu.a.4 cccccgcctagcctcgg SEQ ID No: 434 Lu.a.5 cccgcctagcctcggct SEQ ID No: 435 Lu.a.1 CR agccgaggctaggcggg SEQ ID No: 436 Lu.a.2 CR ccgaggctaggcggggg SEQ ID No: 437 Lu.a.3 CR gaggctaggcgggggcg SEQ ID No: 438 Lu.a.4 CR gctaggcgggggcgagc SEQ ID No: 439 Lu.a.5 CR aggcgggggcgagctcc SEQ ID No: 440

    Alelo Lutheran b: Lu.b.1 gggagctcgcccccacct SEQ ID No: 441 Lu.b.2 gagctcgcccccacctagc SEQ ID No: 442 Lu.b.3 ctcgcccccacctagcctc SEQ ID No: 443 Lu.b.4 cccccacctagcctcggct SEQ ID No: 444 Lu.b.5 cccacctagcctcggctga SEQ ID No: 445 Lu.b.1 CR tcagccgaggctaggtggg SEQ ID No: 446 Lu.b.2 CR agccgaggctaggtggggg SEQ ID No: 447 Lu.b.3 CR gaggctaggtgggggcgag SEQ ID No: 448 Lu.b.4 CR gctaggtgggggcgagctc SEQ ID No: 449 Lu.b.5 CR aggtgggggcgagctccc SEQ ID No: 450

    Alelo MNS M:

    M.1 gtgagcatatcagcatcaag SEQ ID No: 451

    M.2 atcagcatcaagtaccactgg SEQ ID No: 452

    M.3 catcaagtaccactggtgtg SEQ ID No: 453

    M.4 taccactggtgtggcaatgc SEQ ID No: 454

    M.5

    ctggtgtggcaatgcaca SEQ ID No: 455 M.1.cr tgtgcattgccacaccagt SEQ ID No: 456 M.2.cr gcattgccacaccagtggta SEQ ID No: 457 M.3.cr ccacaccagtggtacttgatg SEQ ID No: 458 M.4.cr accagtggtacttgatgct SEQ ID No: 459 M.5.cr cttgatgctgatatgctcac SEQ ID No: 460 Alelo MNS N:

    N.1 tgtgagcatatcagcattaag SEQ ID No: 461

    N.2 atcagcattaagtaccactgagg SEQ ID No: 462

    N.3 cattaagtaccactgaggtgg SEQ ID No: 463

    N.4 accactgaggtggcaatgc SEQ ID No: 464

    N.5 ctgaggtggcaatgcacact SEQ ID No: 465 N.1.cr gtgtgcattgccacctcagt SEQ ID No: 466 N.2.cr gcattgccacctcagtggta SEQ ID No: 467 N.3.cr ccacctcagtggtacttaatgc SEQ ID No: 468 N.4.cr cctcagtggtacttaatgct SEQ ID No: 469 N.5.cr cttaatgctgatatgctcaca SEQ ID No: 470 Alelo MNS S: big.S.1 tttgctttataggagaaatggga SEQ ID No: 471 big.S.2 ctttataggagaaatgggaca SEQ ID No: 472 big.S.3 ttataggagaaatgggacaacttg SEQ ID No:

    big.S.4 gagaaatgggacaacttgtcc SEQ ID No: 474 big.S.5 aaatgggacaacttgtccatc SEQ ID No: 475 big.S.1.cr gatggacaagttgtcccattt SEQ ID No: 476 big.S.2.cr gacaagttgtcccatttctcc SEQ ID No: 477 big.S.3.cr aagttgtcccatttctcctata SEQ ID No: 478 big.S.4.cr tgtcccatttctcctataaagca SEQ ID No: 479 big.S.5.cr cccatttctcctataaagcaaaa SEQ ID No: 480

    Alelo MNS s: little.s.1 tgctttataggagaaacggga SEQ ID No: 481 little.s.2 tttataggagaaacgggaca SEQ ID No: 482 little.s.3 ggagaaacgggacaacttg SEQ ID No: 483 little.s.4 gagaaacgggacaacttgtc SEQ ID No: 484 little.s.5 aaacgggacaacttgtccat SEQ ID No: 485 little.s.1.cr tggacaagttgtcccgttt SEQ ID No: 486 little.s.2.cr acaagttgtcccgtttctcc SEQ ID No: 487 little.s.3.cr agttgtcccgtttctcctata SEQ ID No: 488 little.s.4.cr tgtcccgtttctcctataaagc SEQ ID No: 489 little.s.5.cr ccgtttctcctataaagca SEQ ID No: 490

    Alelo MNS U-positivo: U.pos.1 ttgctgctctctttagctcc SEQ ID No: 491 U.pos.2 ctctctttagctcctgtagtgat SEQ ID No: 492

    U.pos.3 U.pos.4 494 U.pos.5 U.pos.1.cr U.pos.2.cr 497 U.pos.3.cr 498 U.pos.4.cr U.pos.5.cr Alelo MNS U-negativo: U.neg.1 U.neg.2 502 U.neg.3 503 U.neg.4 504 U.neg.5 U.neg.1.cr U.neg.2.cr 507 U.neg.3.cr 508 U.neg.4.cr U.neg.5.cr 510

    Alelo de Rhesus C(307T):

    Rh.big.C.1 Rh.big.C.2 Rh.big.C.3 Rh.big.C.4 Rh.big.C.5 Rh.big.C.1.cr Rh.big.C.2.cr Rh.big.C.3.cr

    agctcctgtagtgataatactca SEQ ID No: 493 gtagtgataatactcattatttttg SEQ ID No: taatactcattatttttggggtg SEQ ID No: 495 caccccaaaaataatgagtatta SEQ ID No: 496 caaaaataatgagtattatcactaca SEQ ID No: agtattatcactacaggagctaaa SEQ ID No: atcactacaggagctaaagag SEQ ID No: 499 gagctaaagagagcagcaaa SEQ ID No: 500 ttttgctgctctctttatctcc SEQ ID No: 501 gctctctttatctcctgtagagat SEQ ID No: tatctcctgtagagataacactca SEQ ID No: gtagagataacactcattattttt SEQ ID No: taacactcattatttttggggt SEQ ID No: 505 accccaaaaataatgagtgtta SEQ ID No: 506 aaaaataatgagtgttatctctaca SEQ ID No: agtgttatctctacaggagataaa SEQ ID No: atctctacaggagataaagagag SEQ ID No: 509 gagataaagagagcagcaaaatta SEQ ID No:

    tgagccagttcccttctgg gagccagttcccttctgg ctgagccagttcccttctg ccttctgggaaggtggtc ccttctgggaaggtggtca tgaccaccttcccagaagg gaccaccttcccagaagg ccagaagggaactggctc SEQ ID No: 511 SEQ ID No: 512 SEQ ID No: 513 SEQ ID No: 514 SEQ ID No: 515 SEQ ID No: 516 SEQ ID No: 517 SEQ ID No: 518

    Rh.big.C.4.cr ccagaagggaactggctca Rh.big.C.5.cr cagaagggaactggctcag Alelo de Rhesus c(307C):

    Rh.little.c.1 Rh.little.c.2 Rh.little.c.3 Rh.little.c.4 Rh.little.c.5 Rh.little.c.1.cr Rh.little.c.2.cr Rh.little.c.3.cr Rh.little.c.4.cr Rh.little.c.5.cr

    gagccagttccctcctgg agccagttccctcctgg tgagccagttccctcctg cctcctgggaaggtggt cctcctgggaaggtggtc gaccaccttcccaggagg accaccttcccaggagg ccaggagggaactggct ccaggagggaactggctc caggagggaactggctca

    SEQ ID No: 519 SEQ ID No: 520

    SEQ ID No: 521 SEQ ID No: 522 SEQ ID No: 523 SEQ ID No: 524 SEQ ID No: 525 SEQ ID No: 526 SEQ ID No: 527 SEQ ID No: 528 SEQ ID No: 529 SEQ ID No: 530

    Alelo de inserto específico de intrón2 BigC de Rhesus:

    RhC.intron.2.1 RhC.intron.2.2 RhC.intron.2.3 RhC.intron.2.4 RhC.intron.2.5

    agggtgccctttgtcacttc SEQ ID No: 531 gccctttgtcacttcccagt SEQ ID No: 532 cctttgtcacttcccagtgg SEQ ID No: 533 ttgtcacttcccagtggtacaa SEQ ID No: 534 tcacttcccagtggtacaatca SEQ ID No: 535

    RhC.intron.2.1.cr gaagtgacaaagggcaccct SEQ ID No: 536 RhC.intron.2.2.cr actgggaagtgacaaagggc SEQ ID No: 537 RhC.intron.2.3.cr ccactgggaagtgacaaagg SEQ ID No: 538 RhC.intron.2.4.cr tgtaccactgggaagtgacaaa SEQ ID No: 539 RhC.intron.2.5.cr tgattgtaccactgggaagtga SEQ ID No: 540

    Alelo de Rhesus E: Rh.big.E.1 Rh.big.E.2 Rh.big.E.3 Rh.big.E.4 Rh.big.E.5 Rh.big.E.1.cr Rh.big.E.2.cr Rh.big.E.3.cr Rh.big.E.4.cr Rh.big.E.5.cr

    Alelo de Rhesus e: Rh.little.e.1

    gccaagtgtcaactctcctct SEQ ID No: 541 caagtgtcaactctcctctgct SEQ ID No: 542 gtgtcaactctcctctgctgag SEQ ID No: 543 caactctcctctgctgagaagtc SEQ ID No: 544 tctcctctgctgagaagtcc SEQ ID No: 545 ggacttctcagcagaggagag SEQ ID No: 546 cttctcagcagaggagagttga SEQ ID No: 547 ctcagcagaggagagttgacac SEQ ID No: 548 gcagaggagagttgacacttg SEQ ID No: 549 gaggagagttgacacttggc SEQ ID No: 550

    gccaagtgtcaactctgctct SEQ ID No: 551 Rh.little.e.2 Rh.little.e.3 Rh.little.e.4 Rh.little.e.5 Rh.little.e.1.cr Rh.little.e.2.cr Rh.little.e.3.cr Rh.little.e.4.cr Rh.little.e.5.cr

    Alelo de Rhesus RHD: RhD 1 RhD 2 RhD 3 RhD 4 RhD 5 RhD cr 1 RhD cr 2 RhD cr 3 RhD cr 4 RhD cr 5

    Alelo r’s de Rhesus: r´s.T.l r´s.T.2 r´s.T.3 r´s.T.4 r´s.T.5 r´s.T.l.cr r´s.T.2.cr r´s.T.3.cr r´s.T.4.cr r´s.T.5.cr

    Alelo DVI de Rhesus: Rh.DVI.l Rh.DVI.2 Rh.DVI.3 Rh.DVI.4 Rh.DVI.5

    -83

    caagtgtcaactctgctctgct SEQ ID No: 552

    tgtcaactctgctctgctgag caactctgctctgctgagaag tctgctctgctgagaagtcc ggacttctcagcagagcagag ttctcagcagagcagagttga tcagcagagcagagttgacac gcagagcagagttgacacttg gagcagagttgacacttggc

    ttccccacagctccatcat acagctccatcatgggctac tccatcatgggctacaacttc tcatgggctacaacttcagct gggctacaacttcagcttgct agcaagctgaagttgtagccc agctgaagttgtagcccatga gaagttgtagcccatgatgg gcccatgatggagctgt tgatggagctgtggggaa

    ggaaggtcaacttggtgca ggaaggtcaacttggtgcagt caacttggtgcagttggtg acttggtgcagttggtggt ttggtgcagttggtggtgat catcaccaccaactgcacca caccaccaactgcaccaagt accaactgcaccaagttgac actgcaccaagttgaccttcc tgcaccaagttgaccttcc

    atttcaaccctcttggcctt aaccctcttggcctttgttt tcttggcctttgtttccttg ggtatcagcttgagagctcg atcagcttgagagctcggag SEQ ID No: 553 SEQ ID No: 554 SEQ ID No: 555 SEQ ID No: 556 SEQ ID No: 557 SEQ ID No: 558 SEQ ID No: 559 SEQ ID No: 560

    SEQ ID No: 561 SEQ ID No: 562 SEQ ID No: 563 SEQ ID No: 564 SEQ ID No: 565 SEQ ID No: 566 SEQ ID No: 567 SEQ ID No: 568 SEQ ID No: 569 SEQ ID No: 570

    SEQ ID No: 571 SEQ ID No: 572 SEQ ID No: 573 SEQ ID No: 574 SEQ ID No: 575 SEQ ID No: 576 SEQ ID No: 577 SEQ ID No: 578 SEQ ID No: 579 SEQ ID No: 580

    SEQ ID No: 581 SEQ ID No: 582 SEQ ID No: 583 SEQ ID No: 584 SEQ ID No: 585

    Rh.DVI.l.cr aaggccaagagggttgaaat SEQ ID No: 586 Rh.DVI.2.cr aaacaaaggccaagagggtt SEQ ID No: 587 Rh.DVI.3.cr caaggaaacaaaggccaaga SEQ ID No: 588 Rh.DVI.4.cr cgagctctcaagctgatacc SEQ ID No: 589 Rh.DVI.5.cr ctccgagctctcaagctgat SEQ ID No: 590 Alelo con mutación del pseudogén RHD de Rhesus: RhD Y 1 tttctttgcagacttaggtgc SEQ ID No: 591 RhD Y 2 ctttgcagacttaggtgcaca SEQ ID No: 592 RhD Y 3 tttgcagacttaggtgcacagt SEQ ID No: 593 RhD Y 4 acttaggtgcacagtgcgg SEQ ID No: 594 RhD Y 5 cttaggtgcacagtgcggt SEQ ID No: 595 RhD Y cr 1 caccgcactgtgcacctaa SEQ ID No: 596 RhD Y cr 2 ccgcactgtgcacctaagtc SEQ ID No: 597 RhD Y cr 3 gcactgtgcacctaagtctgc SEQ ID No: 598 RhD Y cr 4 tgcacctaagtctgcaaaga SEQ ID No: 599 RhD Y cr 5 cacctaagtctgcaaagaaatagcg SEQ ID No: 600 Alelo normal del pseudogén RHD de Rhesus: RhD non Y 1 ctatttctttgcagacttatgtgc SEQ ID No: 601 RhD non Y 2 tctttgcagacttatgtgcaca SEQ ID No: 602 RhD non Y 3 ttgcagacttatgtgcacagtg SEQ ID No: 603 RhD non Y 4 acttatgtgcacagtgcggt SEQ ID No: 604 RhD non Y 5 cttatgtgcacagtgcggtg SEQ ID No: 605 RhD non Y cr 1 acaccgcactgtgcacataa SEQ ID No: 606 RhD non Y cr 2 accgcactgtgcacataagtc SEQ ID No: 607 RhD non Y cr 3 gcactgtgcacataagtctgc SEQ ID No: 608 RhD non Y cr 4 tgtgcacataagtctgcaaag SEQ ID No: 609

    RhD non Y cr 5 cacataagtctgcaaagaaatagcg SEQ ID No:

    610

    Alelo Yt-a:

    Yt.a.1

    gcgggagacttccacgg SEQ ID No:

    611

    Yt.a.2

    gggagacttccacggcct SEQ ID No:

    612

    Yt.a.3

    gagacttccacggcctgc SEQ ID No:

    613

    Yt.a.4

    gacttccacggcctgca SEQ ID No:

    614

    Yt.a.5

    ttccacggcctgcaggta SEQ ID No:

    615

    Yt.a.1 CR

    tacctgcaggccgtggaa SEQ ID No:

    616

    Yt.a.2 CR

    tgcaggccgtggaagtc SEQ ID No:

    617

    Yt.a.3 CR

    gcaggccgtggaagtctc SEQ ID No:

    618

    Yt.a.4 CR

    aggccgtggaagtctccc SEQ ID No:

    619

    Yt.a.5 CR

    ccgtggaagtctcccgc SEQ ID No:

    620

    Alelo Yt-b:

    Yt.b.1

    gcgggagacttcaacggc SEQ ID No:

    621

    Yt.b.2

    gggagacttcaacggcctg SEQ ID No:

    622

    Yt.b.3

    gagacttcaacggcctgca SEQ ID No:

    623

    Yt.b.4

    gacttcaacggcctgcag SEQ ID No:

    624

    Yt.b.5

    ttcaacggcctgcaggtaa SEQ ID No:

    625

    Yt.b.1 CR

    ttacctgcaggccgttgaa SEQ ID No:

    626

    Yt.b.2 CR

    ctgcaggccgttgaagtc SEQ ID No:

    627

    Yt.b.3 CR tgcaggccgttgaagtctc SEQ ID No:

    628

    Yt.b.4 CR caggccgttgaagtctccc SEQ ID No: 629

    Yt.b.5 CR gccgttgaagtctcccgc SEQ ID No: 630

14. 14.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1013, en el que las sondas de oligonucleótidos comprenden en el extremo 5’ un enlazador, preferentemente una fracción -(CH2)6-, y un grupo reactivo, preferentemente un grupo amino, para la unión a un soporte de arreglo, preferentemente un portaobjetos recubierto con poli-Llisina.

15. 15.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1014, en el que el arreglo comprende uno o más oligonucleótidos con una secuencia que no aparece en el ADN de dicha especie de mamíferos para permitir la sustracción del fondo, seleccionados preferentemente del grupo que comprende:

    a3 cagaccataagcacaggcgt SEQ ID No: 631, a9 gctcgtccacagtgcgttat SEQ ID No: 632, a17 cggcgttcaagcaaaccgaa SEQ ID No: 633, a23 gacctatagctccactcaga SEQ ID No: 634, a27 tagggtactgatgagcactc SEQ ID No: 635, a33 tcagccctatcgcaggatgt SEQ ID No: 169, a35 gagacacttgacagtagcca SEQ ID No: 170, a38 ggcagggcacctcagtttat SEQ ID No: 171, a42 tcaccagccagactgtgtag SEQ ID No: 172, a43 cttcacgcaagttgtccaga SEQ ID No: 173.

16. 16.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1015, en el que el arreglo comprende uno o más controles positivos de hibridación, preferentemente

    CS05 gtcctgacttctagctcatg SEQ ID No: 174, y su complemento marcado de forma detectable se añade a los productos de la amplificación por PCR múltiple.

17. 17.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en el que las sondas, antes de añadir los productos de la amplificación por PCR múltiple, se someten a tratamientos de prehibridación y desnaturalización del ADN.

18. 18.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1017, en el que los productos desnaturalizados de la amplificación por PCR múltiple se aplican en el arreglo de ADN sin purificación previa.

19. 19.

    Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1018, en el que para cada antígeno de células de la sangre la relación de las intensidades de las señales para cada uno de los alelos se utiliza para asignar el genotipo.

20. 20.

    Kit para la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre mediante un método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que comprende un par de cebadores quiméricos específicos de antígeno de células de la sangre para que a cada antígeno de células de la sangre se determine el genotipo y, como mínimo, un cebador universal marcado de forma detectable, preferentemente un par de cebadores universales marcados de forma detectable, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

21. 21.

    Kit, según la reivindicación 20, que comprende además un arreglo de ADN, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10-15.

22. 22.

    Conjunto de pares de cebadores quiméricos específicos de antígenos de células de la sangre útiles en una PCR mútiple, que comprende, como mínimo, dos, preferentemente substancialmente todos, los pares de cebadores seleccionadas del grupo tal como se define en la reivindicación 7.

23. 23.

    Conjunto de sondas de oligonucleótidos específicas de alelos de antígenos de células de la sangre útiles para la determinación del genotipo de antígenos de células de la sangre, que comprende, como mínimo, 72 sondas diferentes, preferentemente substancialmente todas las sondas, seleccionadas del grupo tal como se define en la reivindicación 13.