ITMI20070504A1 - Metodo per la tipizzazione genomica di sistemi eritrocitari, sonde oligonucleotidiche e kit diagnostici relativi - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: "Metodo per la tipizzazione genomica di sistemi eritrocitari, sonde oligonucleotidiche e kit diagnostici relativi"

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la tipizzazione genomica di sistemi eritrocitari, sonde oligonucleotidiche e kit diagnostici relativi .

Tradizionalmente la tipizzazione dei sistemi antigenici eritrocitari viene effettuata con metodi di agglutinazione utilizzando varie metodiche quali provetta, microcolonna e fase solida mediante l'utilizzo di antisieri commerciali sia policlonali sia monoclonali .

Le diverse tecniche di agglutinazione applicabili in tutti i laboratori competenti hanno una sensibilità ed una specificità appropriata nell'uso clinico per la maggioranza dei casi.

Tuttavia è ormai di uso corrente nei laboratori di riferimento utilizzare anche procedure di tipizzazione eritrocitaria mediante l'utilizzo di tecniche molecolari.

Tali metodiche sono state introdotte nella medicina trasfusionale a completamento e supporto delle tecniche classiche sierologiche e in molti casi come sola metodica alternativa in grado di risolvere problematiche complesse.

Le applicazioni nella pratica della medicina trasfusionale sono varie.

Le maggiori applicazioni cliniche rispondono in maniera appropriata all'esigenza di disporre in breve tempo di una corretta tipizzazione del paziente e riguardano i soggetti pluriimmunizzati con patologia autoimmune e i pazienti recentemente trasfusi e/o trasfusioni dipendenti quali pazienti talassemici (ref.1 Castilho L. et al. 2002; ref.2 Montalvo L. et al. 2004). In entrambi i casi la tipizzazione con tecniche classiche risulterebbe di difficile applicazione. Per la prima categoria di pazienti la difficoltà della tipizzazione è dovuta alla presenza di anticorpi adesi alle emazie che comporterebbero indagini e metodiche aggiuntive da parte del Laboratorio per le indagini immunoematologiche, allungando notevolmente il tempo di indagine prezioso in situazioni di urgenza. Nella seconda categoria dei pazienti trasfusi di recente il problema è dovuto alla presenza di massive quantità di emazie trasfuse del donatore nel circolo del paziente con chiara impossibilità di applicare le metodiche classiche. In questi casi dunque, una corretta tipizzazione del fenotipo del paziente e di routine anche degli antigeni eritrocitari comuni clinicamente significativi (es.K/k;Fya/Fyb;Jka/Jkb;S/s) contro i quali lo sviluppo di anticorpi ha un rilevante significato clinico, è estremamente utile per confermare la natura degli anticorpi identificati sia nel siero, sia adesi alle emazie e di conseguenza gestire in modo ottimale il futuro supporto trasfusionale del paziente.

Esistono altre interessanti applicazioni della tipizzazione molecolare dei sistemi eritrocitari e riguardano ad esempio la conferma e talvolta la sola fonte di risoluzione nei casi di espressioni deboli degli antigeni eritrocitari quali ad esempio l'antigene D (sistema RH) o l'antigene FyX (sistema Duffy); la caratterizzazione di forme nuli; la determinazione della zigosità RHD non altrimenti eseguibile e la risoluzione nei casi di varianti ABO.

Altra importante applicazione inoltre riguarda la possibilità di confermare con tecniche molecolari pazienti o donatori di sangue ad assetto raro che risultano negativi per antigeni ad alta incidenza. Un individuo a fenotipo raro può immunizzarsi contro l'antigene mancante sulle proprie emazie in seguito ad eventi trasfusionali, gravidanze e in misura minore da trapianto d'organo. L'immunizzazione contro un antigene ad alta incidenza può complicare inoltre notevolmente l'identificazione di eventuali altri anticorpi contro altri antigeni eritrocitari. Le miscele di anticorpi a diverse specificità rende molto laborioso e complicato il processo di identificazione e veramente problematico il reperimento di unità compatibili .

Il poter disporre di unità tipizzate congelate e idonee nel momento del bisogno facilita notevolmente la gestione del paziente senza dover ricorrere alla tipizzazione random di un elevato numero di donatori in regime di urgenza con il rischio anche di non trovare l'unità compatibile. Le unità di sangue raro verranno congelate ed isolate per i pazienti a rischio. Inoltre bisogna anche considerare che le differenze etniche tra donatore e ricevente creano maggior problemi, specialmente se il paziente necessita di un regime trasfusionale a lungo termine.

A questo scopo l'utilizzo di tecniche molecolari permette di risolvere il problema dei costi elevati dei sieri tipizzanti rari e talvolta, per alcune specificità, anche di superare il problema sia della carenza sia della debole reattività di tali antisieri facilmente deperibili quali ad esempio gli antisieri specifici per il sistema Dombrock (ref.3 Reid et al.

2002).

Il vantaggio comune consiste nella possibilità di ottenere una quantità di DNA utile per le indagini sia da sangue periferico, anche da minime quantità, sia da DNA ottenuto da altre fonti biologiche. I campioni di DNA inoltre se opportunamente conservati, sono stabili nel tempo. Lavorare con il DNA nella medicina trasfusionale comporta inoltre il notevole vantaggio di non dover essere vincolati in regime ordinario al processamento del campione in tempi brevi come esige la sierologia classica.

Per tutte queste potenziali applicazioni sono state sviluppate diverse tecniche applicate nel campo della medicina trasfusionale.In particolare, per la genotipizzazione dei sistemi antigenici eritrocitari le tecniche più comuni utilizzate nei laboratori di immunoematologia sono la PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e la PCR-SSP (Sequence-Specific Primers).

Recentemente, sono state sviluppate nuove metodologie quali ad esempio la PCR-ELISA, real time PCR, minisequencing analisi di SNP (ref.4 Ferri EG et al.

2006) e come ultima tecnica emergente la tecnologia dei microarray (ref.5 Denomme G. et al., 2005). Quest'ultima metodica in particolare è nata come esigenze di poter gestire un numero maggiore di campioni rispetto alle altre metodiche disponibili.

Il principio di tale tecnica non è certamente del tutto nuova. Ad esempio le tecniche di Southern blot, prevedevano l'analisi di un numero elevato di campioni tramite ibridazione di frammenti di DNA separati, però tramite elettroforesi. Il cambiamento evidente riguarda appunto il supporto utilizzato per analizzare i campioni; dall'ibridazione eseguita mediante supporto costituito da membrana porosa è stato introdotto un supporto di vetro o silicone e molecole fluorescenti per la rilevazione (ref 6. Petrik J.

2001) . Tali cambiamenti hanno permesso di ridurre notevolmente i volumi dei reagenti, migliorare la cinetica di ibridazione e miniaturizzare tutto il processo con possibilità di analizzare più campioni alla volta e per lo stesso campione piu'analiti contemporaneamente nella singola reazione. Tutti questi cambiamenti rivoluzionari riducono notevolmnente i tempi, il lavoro e i costi.

Esistono una varietà di applicazioni della tecnologia dei raicroarray potenziata negli ultimi anni. Tale metodica viene applicata sia al campo dell'analisi genetica, sia al campo della sierologia.

La tecnologia microarray, applicata nello specifico, prevede una prima fase di amplificazione della regione di interesse, seguita da una fase di denaturazione, ibridazione con sonde specifiche complementari al polimorfismo di interesse e rilevazione dei dati mediante analisi citofluorimetrica dopo opportuna marcatura con il sistema di rilevazione costituito da ficoeritrina-streptavidina. Ad oggi con la tecnologia dei microarray a supporto solido è possibile tipizzare i seguenti sistemi: sistema ABO, RH, antigeni clinicamente significativi ed antigeni ad alta incidenza. Recentemente è stata applicata tale tecnologia anche alla tipizzazione genomica degli antigeni piastrinici (ref.7 Beiboer S. et al. 2005). Inoltre, l'utilizzo di tecniche di agglutinazione comporta costi elevati nel caso di screening di massa per antigeni eritrocitari ad alta incidenza al fine di reperire donatori negativi, in quanto la disponibilità di reagenti commerciali tipizzanti è estremamente scarsa rendendo anche problematica per scarsa affidabilità la tipizzazione con antisieri.

Uno dei principali vantaggi delle tecniche basate sul DNA è l'indipendenza dai reagenti dato che i sieri tipizzanti vengono sostituiti da oligonucleotidi sintetici che possono essere sintetizzati chimicamente a basso costo.

Ad oggi le nuove tecnologie sembrano mirare all'automazione e alla semplificazione ed i nuovi strumenti vengono modificati in modo da accelerare il processo. Quest'ultimo concetto è descrittivo dei dosaggi di citometria a flusso in multiplex basati su microsfere. Mediante la coniugazione di diversi anticorpi purificati o sonde oligonucleotidiche a set distinti di microsfere fluorescenti si possono ottenere dei sistemi di analisi molto efficienti che consentono la cattura di numerosi analiti da un unico campione. La quantificazione sfrutta il potenziale risolutivo multiparametrico della citometria a flusso e la capacità dei sistemi di processazione dei segnali digitali che elaborano le migliaia di segnali fluorescenti generati dalle microsfere (ref.e Kellar KL et al., 2003; ref.9 Kettman JR et al., 1998).

In dettaglio le microsfere sono costituite da polimeri sintetici e sono caratterizzate da una diversa intensità di fluorescenza. Sono disponibili diverse fonti commerciali di microsfere fluorescenti come Bangs Laboratories (Fishers, IN), Duke Scientific (Palo Alto, CA), Luminex Corporation (Austin, TX), Polysciences (Warrington, PA), Seradyn (Indianapolis, IN) e Spherotech (Libertyville, IL) che offrono microsfere con diverse dimensioni e caratteristiche di fluorescenza. La Luminex Corporation produce ad esempio 100 microsfere differenti per intensità di fluorescenza create mediante l'incorporazione di diversi rapporti di due fluorocromi che emettono a diverse lunghezze d'onda e vengono misurati mediante diversi rivelatori (ref.io Fulton RJ et al., 1997). Per l'analisi viene utilizzato un citometro a flusso (Luminex 100) compatto con due sorgenti laser progettato per la rilevazione delle microsfere e la quantificazione della fluorescenza ed è stato prodotto un array di 100 microsfere con sostanze che emettono a 658 e 712 nm dopo eccitazione con un laser a diodo rosso da 635 nm per complementare il sistema laser del citometro (ref. Earley MC et al. 2002).Questo sistema di Multiple Analyte Profiling (LabMAP™) è stato impiegato per l'analisi in multiplex di alcuni polimorfismi nucleotidici singoli (SNPs)( ref.12 Colinas et al., 2000; ref.13 Dunbar SA et al., 2000). Gli SNPs sono la più abbondante fonte di variabilità nel genoma umano, importanti per l'identificazione dei loci specifici di particolari patologie o per chiarire la predisposizione di un individuo a sviluppare una particolare malattia o a rispondere ad un determinata terapia farmacologica (ref.8 Kellar KL, 2003). Inoltre gli SNP rappresentano la base molecolare dei polimorfismi di molti sistemi antigenici.

Gli autori hanno ora messo a punto un metodo di tipizzazione genomica eritrocitaria che si avvale di sonde oligonucleotidiche specifiche che opportunamente modificate, vengono coniugate ad un array di microsfere fluorescenti, che non presenta gli svantaggi delle tecniche di tipizzazione note.

Utilizzando il metodo secondo l'invenzione, per ciascuna determinazione si ha un risparmio notevole in termini di costi di reagenti e di tempo operativo.

Da un punto di vista applicativo la metodica è particolarmente vantaggiosa per la tipizzazione su larga scala di campioni di sangue e può facilitare l'identificazione di sangue ad assetto raro o poco comune per i pazienti alloimmunizzati e per i soggetti che appartengono a minoranze etniche. Più specificatamente nel corso del presente studio gli autori dopo aver individuato il polimorfismo Xa e Xb relativo ad ognuno dei sistemi in oggetto dello studio, hanno progettato sonde oligonucleotidiche in grado di ibridarsi, ad una determinata temperatura, in modo altamente specifico al sito polimorfico di interesse. Dette sonde hanno dato risultati ottimali in termini di specificità e di efficienza nel processo di ibridazione (scelta lunghezza sonde/posizione polimorfismo/temperatura di ibridazione).

Le caratteristiche vantaggiose della metodica e le fasi sperimentali messe a punto dagli autori della presente invenzione ed impiegate nel presente metodo di tipizzazione sono le seguenti:

- applicazione della metodologia Luminex suspension array alla tipizzazione dei sistemi eritrocitari.

- identificazione delle coppie di primer specifici per amplificare la regione genomica contenente il polimorfismo nucleotidico singolo di interesse (vedi Tabella 1}.

- identificazione condizioni di PCR: medesimi rapporti di quantità' e di concentrazione sia di primer sia di buffer utilizzati e medesimi cicli di amplificazione per tutti i sistemi studiati.

- disegno delle sonde oligonucleotidiche disegnate complementari alla sequenza del primer biotinilato, con localizzazione del polimorfismo di interesse sia in posizione centrale nella sequenza sia in posizione leggermente spostata (la posizione polimorfica è segnata in grassetto nella tabella 2). I cambiamenti rispetto alla posizione centrale sono determinati dall'aggiunta e/o rimozione dall'estremità 5' e/o 3' di nucleotidi alla sonda rispettivamente per aumentare l'efficienza di ibridazione ed ottenere un miglior target-match o per aumentare la specificità ( ref.14 Dunbar SA et al., 2005; ref.is Dunbar SA. et al., 2006) .

- ibridazione diretta delle sonde identificate con il prodotto di PCR, contenente il polimorfismo in oggetto di studio, ad una specifica temperatura definita per ogni sistema studiato (vedere tabella 2).

Tabella 1

ref.16 Lee, 1997 ref. Hashmi, 2005 ref.18 El Nemer, 1997 ref . 19 Irshaid, 1998.

Tabella 2

I sistemi eritrocitari analizzati dagli autori della presente invenzione e gli alleli relativi analizzati codificanti per antigeni comuni, poco comuni ed ad alta incidenza sono elencati nella tabella 1.

Quindi, gli autori hanno applicato e messo a punto il metodo Luminex Xmap technology mediante array di microsfere in sospensione per la determinazione dei polimorfismi relativi ad antigeni eritrocitari in modo da applicare, in questo campo di indagine, le potenzialità di una metodologia nuova e versatile che permette di avere uno strumento rapido, accurato ed efficiente soprattutto per la gestione di tipizzazioni su larga scala. Tale metodica si avvale del processo di ibridazione tra sonde oligonucleotidiche di cattura sintetiche coniugate a microsfere fluorescenti e il DNA bersaglio amplificato tramite PCR, mediante primer specifici che permettono di amplificare il locus genomico contenente il polimorfismo nucleotidico di interesse.

Il metodo, secondo la presente invenzione, è stato messo a punto e testato su campioni di DNA di soggetti a tipizzazione nota(assetto omozigote o eterozigote per gli antigeni eritrocitari di interesse; non per tutti i campioni testati era nota la tipizzazione per gli antigeni a bassa incidenza quali Kpa,Jsa,Lua e Cob) eseguita con tecniche sierologiche di agglutinazionee/o tecniche molecolari, quali PCR-SSP. Il metodo è robusto per la sua capacità di rivelare,a livello genomico, il polimorfismo per i sistemi eritrocitari in esame con accuratezza ed è tollerante rispetto alla quantità, qualità e alla fonte del materiale da tipizzare. Nelle tabelle 3-10 sono riportati i valori di rapporto allelico per ogni sistema studiato di tutti i campioni testati.

Dopo l'estrazione del DNA non è necessario leggere la concentrazione allo spettrofotometro, risparmiando notevolmente i tempi di esecuzione.

A differenza delle altre metodiche di microarray applicate alla tipizzazione dei sistemi eritrocitari o piastrinici il processo di ibridazione specifica avviene in sospensione.

Dallo studio della letteratura recente è emerso che la metodologia in oggetto specifica viene applicata in vari campi di indagine quale la genotipizzazione nel campo della microbiologia e virologia ( ref.20 Deregt D. et al.2006; ref.21 Schmitt et al.2006; ref.22 Diaz M. et al. 2005). Rispetto al format di microarray a supporto solido, il vantaggio della tecnologia array in sospensione è relativo alla rapidità di acquisizione dei dati, buona sensibilità e specificità e possibilità di multiplexing nella preparazione del set di analiti specifici.

Formano pertanto oggetto della presente invenzione set di sonde oligonucleotidiche amminomodificate all'estremità 5' caratterizzate dal fatto di avere una sequenza di lunghezza compresa tra 18 e 20 nucleotidi contenente in posizione centrale o limitrofa il SNP specifico per ognuno degli alleli bersaglio, appartenenti al sistema eritrocitario X, scelti tra K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb e Jka/Jkb, in grado di ibridarsi in modo specifico a ciascuno di detti alleli; dette sonde essendo caratterizzate dal fatto di essere coniugate ad una microparticella marcata con almeno una sostanza fluorescente e di comprendere o consistere almeno in un set di sequenze oligonucleotidiche riportate nella seguente tabella:

Preferibilmente, dette sonde sono coniugate con modificazione Amminolinker C12 all'estremità 5'.

L'invenzione concerne l'uso di almeno un set di sonde oligonucleotidiche come definiti nella precedente tabella, per l'identificazione e la tipizzazione genomica eritrocitaria di almeno un SNP della seguente coppia allelica X scelta tra K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb e Jka/Jkb. Secondo forme alternative di realizzazione dell'invenzione è possibile utilizzare più di uno dei set di sonde oligonucleotidiche secondo l'invenzione nella stessa miscela di ibridazione (i.e. i set di sonde oligonucleotidiche per gli alleii Kpa/Kpb e Jsa/Jsb) o tutti i set di sonde insieme.

In una forma preferita di realizzazione l'uso dei set di sonde oligonucleotidiche viene effettuato alle temperature specifiche di ibridazione riportate nella seguente tabella:

L'invenzione concerne ulteriormente microparticelle marcate con almeno una sostanza fluorescente dotate di gruppi carbossilici in superficie, caratterizzate dal fatto di essere coniugate con almeno un set di sonde come sopra definiti.

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo per l'identificazione e la tipizzazione genomica eritrocitaria di almeno un polimorfismo nucleotidico singolo (SNP) del sistema eritrocitario X in individui eterozigoti ed omozigoti, comprendente le seguenti fasi:

a) estrazione del DNA da un campione biologico;

b) amplificazione mediante PCR del locus genomico comprendente il SNP del sistema eritrocitario di interesse mediante almeno una coppia di primer specifica per un allele bersaglio scelta tra:

in cui almeno un primer {Fw o Rw)è marcato in 5' con la biotina per ottenere dei prodotti PCR biotinilati; le sonde oligonucleotidiche sono complementari alla sequenza oligonucleotidica amplificata dal primer biotinilato.

c) ibridazione dei prodotti di PCR biotinilati ottenuti nella fase b) con almeno un set di sonde oligonucleotidiche come sopra descritti e marcatura con streptavidina-ficoeritrina alla temperatura specifica per ogni sistema come indicato nella seguente Tabella:

d) rilevazione della fluorescenza con citofluorimetro, mediante la rilevazione della fluorescenza emessa dalle specifiche microsfere preferibilmente usando la strumentazione Luminex 100. La Figura 1 riporta un esempio di videata dello strumento dopo 1'avvenuta lettura dei campioni.

La metodica impiegata predilige il sistema Luminex xMAP™ in quanto utilizza un array di microsfere fluorescenti coniugate covalentemente in laboratorio alle sonde specifiche complementari per l'analisi dei polimorfismi dei suddetti sistemi eritrocitari e il citofluorimetro Luminex 100 (Luminex Corporation). Preferibilmente, la fase b) di amplificazione nel caso dei polimorfismi degli alleli Kpa/Kpb e Jsa/Jsb del sistema KEL avviene mediante PCR multiplex (master mix unica).

L'invenzione si riferisce ad un kit diagnostico per l'identificazione e la tipizzazione genomica eritrocitaria di almeno un SNP dei sistemi eritrocitari in oggetto di studio per identificare l'assetto eterozigote ed omozigote di campioni, comprendente le seguenti componenti:

a) una o più coppie di primer per l'amplificazione mediante PCR del locus genomico comprendente il SNP della coppia X scelta tra K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb, detta coppia di primer essendo scelta tra:

b) almeno un set di sonde oligonucleotidiche come sopra definito, dette sonde essendo in grado di ibridarsi a detto SNP.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle tabelle e alla figura inclusa in cui:

la figura 1 mostra l'analisi del sistema Colton dove vengono lette le fluorescenze delle tre microsfere di interesse (microsfera n. 74, 78, 80); vengono inseriti i codici identificativi dei campioni (colonna "sample"); il valore che si ottiene per ogni microsfera è il valore di fluorescenza emessa dalla microsfera specifica coniugata a sua volta alle sonde secondo l'invenzione relative; la colonna "events" si riferisce al numero di sfere totali in modo tale che per ogni microsfera vengano analizzate un minimo di 100 eventi (sfere).

ESEMPIO: Tipizzazione genomica del sistema eritroci -tario X mediante sistema di microarray in sospensione che utilizza sonde oligonucleotidiche complementari al SNP specifico coniugate ad un array di microsfere fluorescenti .

MATERIALI E METODI

Campioni

7 mL di sangue periferico del campione da analizzare è stato raccolto in provette contenenti la soluzione di EDTA come anticoagulante. I campioni vengono conservati a -20°C fino al momento del trattamento. Aliquote di 200 pi di sangue intero sono state utilizzate per l'estrazione del DNA con un kit commerciale (QIAamp, Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada), secondo le istruzioni del produttore.

I campioni testati sono riportati nelle tabelle relative (Tabelle 3-10).

Reagenti

Le microsfere di polistirene COOH xMAP Multi-Analyte sono state acquistate dalla Luminex Corporation (Carboxylated Microspheres, L100-ClXX-01-Austin, TX, USA).

Le microsfere (5,6 μm in diametro) presentano dei gruppi funzionali carbossilici di superficie per il legame di tipo covalente con differenti analiti che allo scopo della presente invenzione, sono le sonde oligodesossiribonucleotidiche amminomodificate (AmC12) all'estremità 5'. Le microsfere di polistirene (disponibili in commercio) sono state classificate dalla ditta produttrice mediante citometria a flusso grazie al profilo di emissione nella lunghezza d'onda arancio/rosso di ciascun set di microsfere.

Esistono a disposizione 100 microsfere perché ciascuna regione specifica incorpora delle sostanze coloranti in un preciso rapporto tra di loro che emettono a differenti lunghezze d'onda (rosso e infrarosso) che consente la loro distinzione. Infatti ogni set distinto di microsfere ha caratteristiche esclusive di marcatura ed una propria distribuzione di intensità di fluorescenza che può essere analizzata dallo strumento adibito alla rivelazione. In questo studio sono state utilizzate varie regioni: vedere tabella 2. Tutti le differenti regioni di microsfere numerate da 1 a 100 derivano dallo stesso materiale di partenza e differiscono solo per le quantità di coloranti di marcatura presenti per la classificazione.

L'acido 2-N-morfolino etansolfonico (MES), l'I-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimide idrocloruro (EDC), il SAPE (100X stock 0,5 mg/ml Streptavidina-ficoeritrina) sono stati ottenuti rispettivamente dalla Sigma, dalla Pierce e dalla One Lambda, Inc. Per il tampone di lavaggio dopo la fase di ibridazione e per diluire la SAPE stock sono stati utilizzati rispettivamente i seguenti tamponi della Luminex Corporation (LABType wash buffer/ LABType sape buffer).

Disegno delle sonde

Tutti gli oligonucleotidi utilizzati per l'associazione covalente alle microsfere sono stati modificati all'estremità 5' durante la sintesi, mediante Amino-Modifier (AmC12-PRIMM) seguendo le indicazioni della metodica. Il polimorfismo dei vari sistemi studiati nel disegno delle sonde è stato localizzato preferibilmente al centro o altrimenti in altra posizione limitrofa lungo la sequenza delle sonde (posizione polimorfismo specifico - tabella 2).

La lunghezza delle sonde varia da 18 a 20 nucleotidi e costruite complementari alla sequenza amplificata dal primer biotinilato, sulla base delle sequenze genomiche depositate.

Per ogni sistema da analizzare viene utilizzato un set di sonde comprendente: due sonde sono specifiche per gli alleii del sistema oggetto di studio; una sonda non specifica viene utilizzata come controllo negativo (CN), in quanto è stata disegnata appositamente cambiando, rispetto alla sequenza della sonda specifica, sei nucleotidi in modo da mettersi nelle condizioni di non avere la possibilità di match al DNA bersaglio. Tale sonda viene utilizzata solo per valutare il segnale di fluorescenza basale, controllare che tutto il processo dei lavaggi durante la metodica sia stato eseguito correttamente e indirettamente validare il segnale positivo o negativo delle sonde specifiche:

- sonda Xa e sonda Xb: da 18 a 20 nucleotidi con modificazione AmC12 al 5': sono le sonde specifiche per il polimorfismo implicato;

- sonda di controllo negativo (CN): da 18 a 20 nt con modificazione AmC12 al 5': con sei modificazioni nucleotidiche in modo da ottenere una sonda che non si deve legare al polimorfismo specifico (ref.13 Dunbar et al., 2000}.

Durante il disegno di tali sonde sono state incontrate diverse problematiche che non tutte le combinazioni di temperatura di ibridazione/prodotto PCR/lunghezza della sonda e posizione polimorfismo riuscivano a superare.

In base al polimorfismo specifico degli alleli K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb del sistema Kell, caratterizzati ognuno da un singolo cambiamento nucleotidico, e dalla relativa sequenza genomica depositata, in esperimenti preliminari è stato possibile identificare delle sonde complementari di 18 nt con il polimorfismo specifico in posizione centrale e legarle alle microsfere fluorescenti (L100-CDEV1-01 (Luminex)). La temperatura di ibridazione utilizzata per gli esperimenti preliminari è stata 45°C.

Si sono ottenuti i seguenti risultati con i vari sistemi:

K/k: le sonde da 18 nt, polimorfismo centrale e prodotto di PCR ottenuto da una coppia di primer descritta dalla letteratura (Lee, 1997) hanno dato buoni risultati di specificità nella tipizzazione dei campioni testati a tipizzazione sierologia nota, condotti alla temperatura di 45°C.

Kpa/Kpb : le sonde da 18 nt, polimorfismo centrale e prodotto di PCR ottenuto da una coppia di primer descritta dalla letteratura ( ref.ie Lee et al., 1997) non hanno dato alcun segnale di avvenuta ibridazione alla temperatura di 45°C.

Quindi sono stati condotti ulteriori esperimenti di ibridazione cambiando solo la temperatura di ibridazione (tra 50°C e 54°C) e mantenendo le stesse sonde e lo stesso prodotto di PCR. Non sono stati ottenuti risultati. Anche la temperatura minima di 37°C non ha permesso di discriminare tra gli alleli specifici.

A questo punto si è proceduto modificando il prodotto di PCR disegnando, con i programmi disponibili (Primer Express, Applied Biosystems; OligoAnalyzer 3.0, Integrated DNA Technologies) delle nuove coppie di primer per accorciare il prodotto finale di amplificato favorendo in tal modo la fase di ibridazione (ref .14 Dunbar et al., 2005) e utilizzando sonde da 20 nt con il polimorfismo non più situato in posizione solo centrale.

I risultati evidenziano un segnale specifico ottenibile cambiando sia il prodotto di PCR sia la lunghezza delle sonde ad una determinata temperatura (54°C).

Trovata la combinazione idonea all'ottenimento di un'elevata specificità le sonde sono state coniugate alle microsfere definitive (L100-C1XX01 COOH). Sistema Duffy (Fya/Fyb) -Colton (Coa/Cob) : le sonde da 20nt, polimorfismo non solo in posizione centrale e prodotto di PCR ottenuto da una coppia di primer disegnati direttamente con l'aiuto dei programmi computerizzati non hanno dato buoni risultati in termini di specificità nella fase di ibridazione condotta a temperature tra 45°C e 54°C.

In questo caso è stato modificato il prodotto di PCR impiegando le coppie di primer secondo 1'invenzione .

Per discriminare l'allele Coa sono state utilizzate due sonde da 20nt con il polimorfismo di interesse situato in differente posizione. Dopo varie prove a differenti temperature abbiamo ottenuto risultati specifici con la sequenza riportata in Tabella 2.

Sistema MNS (S/s) : della coppia dei primer per l'amplificazione, solo la sequenza specifica del Forward primer (SsF) è stata ottenuta dalla letteratura (ref.17 Hashmi et.al 2005). Il Reverse primer è stato disegnato ex novo con l'aiuto dei programmi computerizzati, come descritto precedentemente. Sono state impiegate sonde da 20nt, con il polimorfismo centrale per le sonde specifiche; in aggiunta, per l'allele s, sono state provate anche sonde da 18nt, 19nt e da 21nt a varie temperature.

E'stato ottenuto un segnale specifico discriminante nella fase di ibridazione con le sonde da 20nt alla temperature di 54°C.

Sistema Lutheran (Lua/Lub) : E' stato utilizzato solo per il primer reverse la sequenza descritta in letteratura, per la fase dell'amplificazione specifica (Elnemer et al., 1997). Il Forward primer è stato deciso ex novo. Sono state impiegate sonde da 18nt e da 20nt con il polimorfismo centrale.

E'stato ottenuto un segnale specifico nella fase di ibridazione alla temperatura di 45°C con le sonde da 18nt.

Per ottenere una ibridazione specifica alla temperatura di 54°C abbiamo provato ad utilizzare anche sonde da 20 nt, ma senza risultati.

Coniugazione delle sonde oligonucleotidiche alle microsfere

Le diverse sonde oligonucleotidiche modificate al 5' sono state coniugate, in reazioni separate, a differenti classificazioni di microsfere carbossilate, secondo il protocollo di legame suggerito dalla Luminex Corporation (Oligonucleotide Coupling Protocol) .

Un'aliquota di ciascuna regione specifica contenente 5 x IO<6>microsfere è stata microcentrifugata a 10000 rpm per 2 minuti, prelevato il pellet e risospeso in 50 μΐ di tampone MES 0,1 M, a pH 4,5. Successivamente la miscela è stata addizionata con 0,2 nanomoli di sonde oligonucleotidiche amminomodificate.

Quindi è stata aggiunta una soluzione acquosa di l-etil-3-(3-dimetilaminopropil-carbodiimide HC1 {EDC; 10 mg/ml) alla miscela microsfere/oligonucleotidi e la miscela risultante è stata incubata a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. L'aggiunta di EDC e l'incubazione sono state ripetute un'altra volta. Dopo un'incubazione totale di 1 ora, le microsfere sono state lavate con 1 mi di Tween-20 allo 0,02%. La soluzione di lavaggio è stata rimossa mediante microcentrifugazione ed il lavaggio è stato ripetuto con 1 mi di SDS allo 0,1% e la miscela finale è stata risospesa in 100 μΐ di TE (Elution Buffer-QUIAGEN), a pH 8 e conservata al buio a 4°C. Prima dell'uso le sfere sono state portate a temperatura ambiente per 5 minuti. Le sfere coniugate alle sonde, cosi' ottenute, presentano una concentrazione teorica attesa di 50.000 microsfere/microlitro .

Amplificazione DNA bersaglio

La sequenza dei primer utilizzati per l'amplificazione di tutti i sistemi in oggetto sono stati descritti nella tabella 1. I seguenti primer sono stati usati per l'amplificazione del locus specifico in esame.

Uno dei due primer della coppia di amplificazione è stato sintetizzato con modificazione Biotina TEG all'estremità 5' del primer,per permettere di rivelare l'eventuale legame della sonda specifica al DNA bersaglio, secondo le indicazioni della Luminex Corporation (sintesi e purificazione e modificazione did primer e sonde ottenuta dalla ditta Primm).

La PCR è stata condotta con 0,5 μΜ di primer, 2-0,5μL di DNA genomico (25-100ng), 0,2 Mm dNTP, IMm MgCl2(da 25Mm Applied Biosystem),1XPCR Buffer (da 10X Applied Biosystem) e 0,5 U di Taq (GoTaq Promega) . Il volume di reazione finale è pari a 20 μΐ.

Sono stati utilizzati gli amplificatori Mastercycler (ditta Eppendorf) per i cicli termici alle seguenti condizioni operative per ciclo: 2 minuti di denaturazione iniziale del DNA a 94C°C, seguito da 35 cicli a 94°C per 20 secondi, 60°C per 20 secondi, 72°C per 30 secondi, con una fase finale di allungamento a 72°C per 5 minuti. I frammenti di amplifica zione ottenuti possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2%.

Ibridazione

Dopo l'amplificazione del DNA, 4 μΐ da ciascuna reazione di amplificazione sono stati trasferiti in piastre da microtitolazione a 96 pozzetti e diluiti con 13 μΐ di Buffer TE. Di seguito sigillati con pellicola adesiva e denaturati al calore a 99°C per 10 minuti mediante l'utilizzo di un thermal cycler preriscaldato.

L'ibridazione dei prodotti di PCR con le tre sonde per ogni sistema oggetto di studio (due sonde specifiche ed una di controllo negativo) viene eseguita diluendo le singole sonde, nel tampone di ibridazione fornito dalla Luminex (LABType hibridization buffer-distribuito da Lagitre), alla concentrazione finale di 150 microsfere per microlitro. Le sonde legate, come precedentemente descritto, hanno un recupero teorico di 50.000 microsfere per microlitro.

Dopo la denaturazione dei prodotti di PCR, a ciascun campione, vengono aggiunti 33 μΐ di microsfere diluite in soluzione di ibridazione preparata come precedentemente descritto.

I campioni sono stati miscelati e la piastra velocemente trasferita nell'amplificatore preriscaldato alla specifica temperatura di ibridazione ottimale per ogni sistema come riportato nella tabella 2.

L'ibridazione viene condotta per 15 minuti e i campioni immediatamente dopo diluiti a 150 μΐ aggiungendo 100 μΐ di tampone di lavaggio wash buffer (LA-BType wash buffer-Luminex).

Le fasi di lavaggio sono state condotte a temperatura ambiente mediante centrifugazione (2800 rpm per 5 minuti) con l'eliminazione del surnatante manualmente inversione della piastra. I campioni vengono lavati per un totale di tre volte.

I campioni in seguito vengono incubati per 5 minuti, alla medesima temperatura di ibridazione, con 50 μΐ di soluzione appena preparata di IX SAPE (0,5 mg/1 streptavidina-R-ficoeritrina) in tampone di diluizione fornito dalla Luminex (LABType SAPE-Buffer).

Terminata l'incubazione sono stati aggiunti rapidamente 100 μΐ di tampone di lavaggio LABType wash buffer a ciascun pozzetto (Luminex). Le sfere sono state ancora pellettate mediante centrifugazione ed il surnatante rimosso per inversione. Ciascun campione è stato in seguito risospeso in 80 μΐ di tampone Sheath Fluid fornito dalla Luminex. La piastra è pronta da leggere al citofluorimetro .

Nell'impossibilità di leggere subito i campioni è possibile conservare la piastra di analisi a 4°C al buio, fino ad un massimo di 24 ore.

Acquisizione dei dati ed analisi

I campioni sono stati analizzati utilizzando il LAB Scan™100 (Luminex Corporation, Austin, TX).

Lo strumento è dotato di due sorgenti laser di cui un laser a diodo da 635 nm per eccitare i fluorocromi classificati nel rosso e nell'infrarosso e a 532 nm per eccitare il fluorocromo reporter ficoeritrina (PE).

Ciascuna microsfera presenta un'unica distribuzione di intensità di fluorescenza che può essere letta dallo strumento.

Due parametri, la conta e l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) vengono monitorati per ciascuna acquisizione di dati.

La conta per ciascuna microsfera { singola regione specifica) dovrebbe essere superiore a 100. L'intensità mediana di fluorescenza (MFI) rappresenta un segnale rivelato all'interno delle sfere contate, come precedentemente mostrato.

Calcolo dei dati:

L'intensità di fluorescenza, generata dal software Luminex, rappresenta l'MFI di ogni microsfera (o sonda legata alla microsfera) per ciascun campione.

Per ogni sistema studiato è stato calcolato il valore di rapporto allelico ("ratio") in modo da ottenere un valore numerico che, analizzato in base al valore soglia di riferimento, sia in grado di discriminare tra campioni omozigoti per ciascun allele o eterozigoti come riportato dalle tabelle 3-10 (ref.7 Beiboer et al.2005).

Per definire i valori di rapporto allelico per ogni sistema, sono stati testati campioni a tipizzazione nota ottenuta con tecniche sierologiche e/o PCR-SSP .

Il valore di "ratio" viene ottenuto per ogni sistema dal rapporto tra l'intensità mediana di fluorescienza (MFI) della sonda Xa, inteso come allele più frequente nella popolazione caucasica, rispetto alla somma di MFI di entrambi gli alleli (Xa e Xb) del sistema implicato, come riportato dalla sequente formula :

(MFIa-MFIcN) / (MFIa-MFIcN+ MFIb-MFIcN)

Nella formula vengono utilizzati i valori di MFI sottratto del valore di MFI generato dalla sonda del controllo negativo per ciascun campione. In base ai campioni testati è stato possibile definire un rapporto allelico per ogni sistema. I dati ottenuti sono riportati nelle Tabelle 3-10 e nella Tabella 11 cumulativa nel seguito.

I dati preliminari di fluorescenza registrati dallo strumento vengono poi elaborati. Nello specifico, nella tabella di analisi creata, sono state impostate le dovute formule matematiche per ottenere automaticamente, per ogni sonda specifica (allele Xa e allele Xb), i valori di fluorescenza sottratta del valore del controllo negativo (es. MFI sonda Xa-MFI sonda cn). Tale valore di MFI corretto viene poi utilizzato per il calcolo del valore del rapporto allelico di ogni singolo campione come precedentemente descritto. E' di seguito riportato un form di tabella predisposta in excel per l'analisi dei dati.

1H 144588

Nell'impostazione della tabella è stata prevista la conclusione automatica della tipizzazione in base ai valori di ratio allelico di riferimento. La tipizzazione non è conciudibile automaticamente se i valori di ratio ottenuti non rientrano nei range stabiliti. In tal caso compare un flag automatico di ricontrollo.

I risultati ottenuti, per singolo campione, vengono inoltre validati solo se la fluorescenza prodotta dalla sonda del controllo negativo non supera il valore di 100 e se la somma dei valori di fluorescenza delle sonde specifiche risulta essere superiore a quattro volte del valore del controllo negativo del campione (MFIa+MFIb>4XMFI CN). Anche tali formule sono state impostate nel form in excel.

L'analisi dei dati e le conclusioni risulta facile,veloce e non richiede applicativi indaginosi.

Di seguito viene riportato l'elenco delle tabelle (3-10) dei valori dei singoli "ratio" ottenuti dai singoli campioni testati e nella tabella 11 vengono riportati i valori di rapporto allelico utilizzati come range di riferimento, ottenuti dalla media dei ratio dei singoli campioni più e/o meno due deviazioni standard.

I valori dei singoli campioni:

Tabella 3

Tabella 4

Tabella 5

Tabella 6

Tabella 7

Tabella 8

Tabella 9

Tabella 10

Tabella 11

★ range di riferimento ottenuti dalla media dei ratio dei singoli campioni più e/o meno due deviazioni standard * non disponibilità dei campioni noti Jsa/Jsa ;BIBLIOGRAFIA ;1) Castilho L. et al. Transfusion 2002;42(2):232-240 2) Montalvo L. et al. Transfusion 2004/44(5):694-702 3) Reid ME. Vox Sanguinis 2002;83(1):91-93 ;4) Ferri G. et al. Journal of Forensic Sciences 2006/51:357-360 ;5) Denomme G. et al. Transfusion 2005/45:660-666 6) Petrik J. Vox Sanguinis 2001/80:1-11 ;7) Beiboer S. et al. Transfusion 2005/45:667-679 8) Kellar KL. et al.J Immunol Methods 2003/279(1-2):277-285 ;9) Kettman JR.et al. Cytoraetry 1998/ 33(2):234-243 10)Fulton RJ et al. Clinical Cheraistry 1997/43(9):1749-1756 ;11)Earley MC et al. Cytometry 2002/ 50(5):239-242 12) Colinas RJ et al.Clinical Chemistry 2000/ 46 (7): 996-998 ;13) Dunbar SA et al.Clinical Chemistry 2000/ 461498-1500 ;14) Dunbar SA et al.2005/Methods Mol Med 114:147-71 15)Dunbar SA. et al.2006/ Clinica Chimica Acta (363) 71-82 ;16) Lee et al.1997/Vox Sanguinis 73(1):1-11 ;17) Hashmi et al.2005/Transfusion 45:680-688 ;18) El Nemer W. et al.1997/Blood 89(12):4608-4616 19) Irshaid et al.1998;British Journal of Haematology 102:1010-1014 ;20)Deregt D. et al. 2006; Journal of Virological Methods 136:7-23 ;21)Schmitt M. et al.2006; J Clin Microbiol (44)2:504-512 ;22) Diaz M. JCM August 2005;(43)3662-3672 *

Claims (5)

1. RIVENDICAZIONI 1. Set di sonde oligonucleotidiche amminomodificate all'estremità 5' caratterizzate dal fatto di avere una sequenza di lunghezza compresa tra 18 e 20 nucleotidi contenente in posizione centrale o limitrofa, il SNP specifico per ognuno degli alleli bersaglio appartenenti al locus genomico X, scelti tra K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb in grado di ibridarsi in modo specifico a ciascuno di detti alleli; dette sonde essendo caratterizzate dal fatto di essere coniugate ad una microparticella marcata con almeno una sostanza fluorescente e di comprendere o consistere almeno in un set di sequenze oligonucleotidiche riportate nella seguente tabella:
2. 2. Uso di almeno un set di sonde oligonucleotidiche come definiti secondo la rivendicazione 1, per l'identificazione e la tipizzazione genomica eritrocitaria di almeno un SNP della seguente coppia allelica X scelta tra K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb e Jka/Jkb.
3. 3. Uso secondo la rivendicazione 2, in cui detti set di sonde oligonucleotidiche vengono usati alle tempe rature specifiche di ibridazione riportate nella seguente tabella:
4. 4. Microparticelle marcate con almeno una sostanza fluorescente dotate di gruppi carbossilici in superficie, caratterizzate dal fatto di essere coniugate con almeno un set di sonde come definiti secondo la rivendicazione 1.
5. 5. Metodo per l'identificazione e la tipizzazione genomica eritrocitaria di almeno un polimorfismo nucleotidico singolo (SNP) del sistema eritrocitario X in individui eterozigoti ed omozigoti, comprendente le seguenti fasi: a) estrazione del DNA da campione biologico; b) amplificazione mediante PCR del locus genomico comprendente il SNP del sistema eritrocitario di interesse, mediante almeno una coppia di primer specifica per un allele bersaglio scelta tra:

   in cui almeno un primer è marcato in 5' con la biotina per ottenere dei prodotti di PCR biotinilati; c) ibridazione dei prodotti di PCR biotinilati ottenuti nella fase b) con almeno un set di sonde oligonucleotidiche secondo la rivendicazione 1 e marcatura con streptavidina-ficoeritrina alla temperatura specifica per ogni sistema come indicato nella seguente Tabella:

   e) rilevazione della fluorescenza con citofluorimetro. 5. Kit diagnostico per l'identificazione e la tipizzazione molecolare eritrocitaria di almeno un SNP del sistema eritrocitario X in individui eterozigoti ed omozigoti, comprendente le seguenti componenti: a) una o più coppie di primer per l'amplificazione mediante PCR del locus genomico comprendente il SNP della coppia X scelta tra K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb, detta coppia di primer essendo scelta tra:

   b) almeno un set di sonde oligonucleotidiche come definito nella rivendicazione 1, dette sonde essendo in grado di ibridarsi a detto SNP.