EP1780290A2 - Vorrichtung zur Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren - Google Patents

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EP1780290A2
EP1780290A2 EP06022542A EP06022542A EP1780290A2 EP 1780290 A2 EP1780290 A2 EP 1780290A2 EP 06022542 A EP06022542 A EP 06022542A EP 06022542 A EP06022542 A EP 06022542A EP 1780290 A2 EP1780290 A2 EP 1780290A2
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EP
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modules
duplicating
nucleic acids
detection
extraction
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Withdrawn
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Stephan Dr.-Ing. Drost
Christof Dr. Strohhöfer
Leonhard Meixner
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Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
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    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples

Definitions

  • the present invention relates to a device or an array for the amplification and detection of target substances, in particular of nucleic acids from a biological material or a sample.
  • nucleic acids plays an important role, e.g. in forensic analysis, in cancer research or in food diagnostics.
  • the aim is to detect certain nucleic acids that make up e.g. a criminal culpability that implies disposition for a hereditary disease or the genetic modification of a food.
  • Conventional methods for the detection of certain nucleic acids are well known, e.g. Gel or capillary electrophoresis, Southern blot, immunoassays or hybridization with labeled nucleic acid probes.
  • cartridges, electrophoresis chambers o. ⁇ ., And the corresponding devices are used to read these devices.
  • each transfer step therefore leads to material and time losses and, on the other hand, entails the risk of contamination with foreign nucleic acids.
  • said functional units are miniaturized in the form of an array in such a way that they can fit on a small carrier ("lab on a chip").
  • the individual reaction chambers are connected via miniaturized channels, and the reaction fluids are transported from one chamber to the next by means of suitable micropumps and valves as well as via the capillary force (microfluidics).
  • micropumps and valves as well as via the capillary force (microfluidics).
  • microfluidics capillary force
  • Such chips or cartridges are arranged in special adapted equipment, which the necessary control and operating units, eg. As pumps and heating and cooling elements, etc., and the reactions, detections, etc. control and evaluate.
  • thermocyclers (Schnegaß & Köhler 2001, Rev. Mol. Biotechnol. 82; 101 ) are presented such "labs on a chip”.
  • PCR a method for PCR
  • the authors describe a chip having a meandering channel, under which heating elements of different temperature are arranged in an ordered arrangement. When the reaction liquid is pumped through the channel at a suitable rate, it passes through the temperature cycles required for the PCR to proceed, and the nucleic acids are amplified.
  • the multiplication factor depends exponentially on the number of thermocycles, the multiplication factor is already defined in such a "lab on a chip". Therefore, such chips are not very variable and therefore unusable for various uses.
  • these devices known from the prior art are usually designed for the parallel examination of many samples on one and the same nucleic acid.
  • 96 food samples of various origin can be examined simultaneously in parallel for the presence of a specific gene, eg. B. on an anti-biotic resistance gene, which suggests a genetic modification.
  • Object of the present invention is to provide an apparatus for amplification and detection of nucleic acids from a biological material or a sample that does not have the aforementioned disadvantages and with the particular by means of a trial order in one operation a plurality of different target substances, such.
  • B. nucleic acids, eg. B. can be detected by different infectious agents. This object is achieved with the features of present claim 1.
  • a device in the form of an array for duplicating and detecting target molecules from a biological material or a sample which has at least two duplicating modules and at least two detection modules, wherein the duplicating modules are respectively tempered via a temperature control unit to be controlled individually, and wherein the duplicating and detection modules are arranged on a component.
  • the component is integrally formed.
  • the device or chip according to the invention is expediently adapted to be accommodated in a control and / or operating unit (base unit), this unit having the control, in particular temperature control, pumping and detection elements necessary for the operation of the device. These elements can be controlled by means of a computer.
  • Such a device makes it possible to test a single sample simultaneously on a plurality of target substances, in particular nucleic acids. Associated with this is an enormous gain in speed over conventional methods, which makes it possible to increase the throughput of a laboratory and thus intensive screening work, such as. in epidemiology or cancer diagnostics are required to accelerate.
  • each amplification module associated with each individually controlled tempering can be performed in each duplicating module for the respective target reaction or the respective target material to be detected individually adjustable sequence of duration, temperature and number of cycles, and so for a target to be detected and each for this purpose Optimize the amplification enzymes and denaturing conditions used in each case without interfering with parallel processes.
  • Preferred targets are nucleic acids.
  • the control can be done in a simple manner via a programmable PC.
  • a corresponding multiplex reproduction can also be performed. These are typically limited to 3-4 target sequences.
  • the device may be designed to detect bacteria.
  • the device also has at least one module for extracting nucleic acids, which is arranged on the same common component.
  • the number of replication and detection modules is the same, and the number of extraction modules is less than or equal to the number of duplicating modules.
  • two or more modules for the extraction of nucleic acids are arranged on the common component.
  • a different extraction method can be chosen in each extraction module to exclude artifacts by a less suitable method, or different samples or materials can be simultaneously extracted and analyzed.
  • nucleic acids to be amplified may also be useful to separately extract them to be amplified and only then to introduce them into the device. This is e.g. the case when it is a very solid sample, for the extraction of mechanical force is required, or if the material to be examined contains very few nucleic acids, so that the extracted nucleic acid must first be enriched by using a large amount of material or sample.
  • the common component, the extraction module, the duplicating module and / or the detection module are predominantly or entirely made of a polymer material.
  • Suitable polymer materials are polyamides, polycarbonates, PMMA, polysulfones, polyether ketones, polyesters, polyethylene, PET, a cycloolefinic polymer (COC) such as. B. TOPAS, polyacetates, polymethanes.
  • the detection unit may consist of a second material which is particularly suitable for a detection radiation used.
  • thermocycles worked off during the amplification step in non-isothermal amplification processes
  • the component may be wholly or partially made of an inorganic material such. As metal, silicon, ceramic and / or glass.
  • the individual modules have reaction chambers, which via microchannels with a cross-sectional area of particularly ⁇ 1 mm 2 or with cross sections of about 0.005 or 0.007 mm 2 to about 1 mm 2 or 0.8 mm 2 , through which the biological material, the sample, the extracted nucleic acids or the amplification products are transported.
  • the chambers consist for example of depressions in the common component.
  • the channels may have any cross-section and be configured, for example, quadrangular, circular or U-shaped.
  • these channels have a diameter of 0.1 to 1 mm, in particular a diameter of 0.2 to 0.8 or 0.4 to 0.6 mm.
  • these values relate to the average diameter which corresponds approximately to the diameter of an equally large circular cross-section.
  • Such structures can be produced depending on the material used by injection molding, micro injection molding, molding, embossing, etching, photolithography, micro sandblasting, lasers or laminate of films with and without recesses.
  • the liquid is transported by suitable pumps and valves as well as by capillary forces from one module to the next or from one reaction chamber to the next.
  • the wetting properties of the channels are specifically influenced.
  • the surface at the exit of a chamber may be made hydrophobic in order to prevent leakage of reaction liquid during a reaction.
  • the channels are formed closed at the top. This feature is required to prevent excessive evaporation of the reaction liquid, but carries the risk of blistering, which would lead to interruption of the flow.
  • the channels are designed to be open at the top and covered with a liquid-impermeable, but gas-permeable structure. This may be e.g. to act a film that is made of PTFE, for example.
  • control unit and / or the device according to the invention has at least two temperature sensors. These are for example the Associated with duplicating modules and allow the control and control of the temperature control units.
  • the common component can be inserted into the control / operator unit (base unit), in which the temperature control units and / or temperature sensors are also arranged.
  • the base unit may moreover be e.g. have one or more ultrasonic sources, pumps for microfluidics, valves or optical detectors such as cameras or photomultipliers and photodiodes as a single detector or in array form.
  • This embodiment is particularly advantageous because it allows the use of inexpensive manufactured disposable components, in particular of polymer, since the mentioned functionalities such Temperleitersöen, temperature sensors, ultrasonic generating units or drives for stirrers, but also pumps for microfluidics or valves in the Base device remain.
  • the temperature control unit of the duplication module comprises a Peltier element.
  • Peltier elements are easy to control and allow fast and accurate generation of a desired temperature. Moreover, they are able to generate both heat and cold.
  • an extremely rapid tempering ie heating and / or cooling, can be achieved. In this way, a further acceleration of the respective investigation is made possible.
  • the Peltier elements are not integrated in the device or polymer cartridge.
  • a nucleic acid amplification reaction can be carried out in the amplification module.
  • This may be e.g. PCR (polymerase chain reaction), rtPCR (reverse transcription PCR), real-time PCR (real-time PCR), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), LCR (ligase chain reaction), RCA (rolling circle amplification), or SDA Act (beach displacement amplification).
  • the device according to the invention has a device for dispensing primers, mononucleotides and / or one or more polymerases. This can also be arranged both on the common component as well as on the base unit.
  • the invention therefore also relates to a reaction kit containing these Subs-dance together with inventive device.
  • the temperature sensors are thermocouples, thermoresistors, silicon sensors, PTC or NTC elements or platinum sensors (PT 100, PT 1000).
  • the temperature sensors may be elements of chromogenic polymers whose color changes as a function of the temperature.
  • a photodetector may include a photodiode or a camera. Such measurements can also be carried out as a reflection measurement or as a transmission measurement.
  • the temperature sensors may be particulate elements which are added to the reaction liquid and their optical properties, such as change their transmission, color, fluorescence or phosphorescence as a function of the temperature.
  • the extraction takes place in the extraction module by chemical means. This can e.g. done by enzymatic digestion and / or by conventional precipitation methods.
  • the extraction in the extraction module takes place by means of ultrasound. Using a suitable frequency and power cell walls and membranes are disrupted so that the nucleic acids can escape from the cell interior.
  • Ultrasound can also be used for mixing the reaction liquid in one of the modules. However, other frequencies and benefits may be considered.
  • the extraction in the extraction module and / or the mixing in one of the modules can be effected by stirring.
  • Decisive here are the shear forces that can be adjusted accordingly by selecting a suitable speed or a suitable stirrer.
  • a variant of this embodiment is the extraction or mixing by means of magnetic particles which are set in motion by an externally applied rotating magnetic field.
  • magnetic particles which are set in motion by an externally applied rotating magnetic field.
  • it can be e.g. to act the well-known stir-fry, but also to magnetic microparticles.
  • the magnetic drive is arranged in the base unit.
  • the outlet channel of the extraction module has a cross-section which is smaller than that of the magnetic particles, or the magnetic particles are used whose cross-section is greater than that of the outlet channel. In this way, the particles used for stirring or extraction are prevented from being transported further.
  • the chambers of the extraction and / or the duplicating modules are surrounded by recesses in the material of the component.
  • These recesses may be formed in particular in the form of channels closed at the top and on the one hand serve to thermally insulate the chambers and thus to accelerate the processing of the thermocycles. On the other hand, the thermal insulation stresses in Material reduced due to different temperatures. Finally, these recesses can also serve the acoustic insulation of the chambers. This, for example, increases the efficiency of using ultrasound to mix or extract the nucleic acids.
  • the recesses z. B. be closed by means of a cover to channels. They are usually filled with air, gas or a liquid or have a vacuum. But it can also be provided that the temperature of the chambers takes place via these channels. In this case, e.g. cold or warm liquids are led into the channels.
  • the base unit is configured to provide the cold and warm fluids.
  • a rapid temperature change of the duplicating modules can be achieved.
  • the detection module is integrated in the duplicating module. In this way it is possible to follow the progress of the duplication reaction in real time.
  • the corresponding methods are known as online PCR or real-time PCR.
  • the detection of the duplication products takes place, for example. by means of FRET (fluorescence resonance energy transfer) or by quenching of fluorescence molecules.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the detection can also be carried out by measuring an electrical current or voltage, which is generated by a suitable electrochemical reaction.
  • the detection of the amplified nucleic acids in the detection module by means of electrophoresis, Southern blot, immunoassay or hybridization with labeled nucleic acid probes.
  • electrochemical or mass-sensitive detectors such as a quartz crystal or a surface acoustic wave device are provided for detecting the amplified nucleic acids, which have a capture nucleic acid on their surface.
  • the biological material is preferably material selected from the group consisting of blood, serum, cerebrospinal fluid, urine, sputum, stool, plant material and tissue samples.
  • Areas of application are here e.g. forensics, medical diagnostics or genetic analysis.
  • the sample is preferably a sample from the group consisting of water, liquid foods, solid foods, baby food, soil samples, and air samples. Areas of application are here e.g. the environmental, the water or the food analysis, in particular the analysis of genetically modified food.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of the device according to the invention with order, duplication and detection units.
  • Fig. 2 shows a schematic representation of an analysis chip according to the invention with extraction and duplication unit.
  • Fig. 3 shows a cross section through such a device according to the invention.
  • FIG. 4 shows an exemplary representation of a device according to the invention.
  • the device according to the invention has one or more inlets or application devices (1) for different liquids obtained from a sample with already extracted targets to be detected, in particular nucleic acids. These are then directed to 4 different Nukleinvielvieltasktistshimen (4) in which they are multiplied under different conditions with respect to enzymes, temperature and cycle length and then detected in the detector (5). In this case, the nucleic acid extraction is performed outside the device according to the invention.
  • the chip polymer component additionally contains a disruption device (2), in particular nucleic acid extraction unit.
  • a disruption device (2) in particular nucleic acid extraction unit.
  • the extraction process itself can be carried out by means of stirring and / or ultrasound or by application by means of sudden pressure relief. Also chemically induced processes, eg. B. by pH change are possible.
  • tiny amounts of a single sample completely different conditions in the extraction units (2) treated and the extracts thus obtained on different duplicating units (4) are passed, where they individually and specifically in each unit at different temperature, cycle time and Enzyme be duplicated.
  • the device according to the invention comprises a polymer base member (9), which is one or more multi-storey.
  • a polymer base member (9) which is one or more multi-storey.
  • microchannels (8) are arranged, in which the respective extraction or amplification reactions are carried out.
  • the device is closed by means of a cover (11).
  • a temperature sensor (7) is arranged, on the opposite side of a temperature control unit (6), in particular Peltier element opposite.
  • an ultrasound head (not shown) or another component such as a stirrer may be arranged which mixes and / or dissolves the reaction medium present in the reaction space or channel (8) .
  • an insulating space (10) can be arranged, which isolates a lateral spread of the temperature to further reaction units (not shown).
  • the space can also be formed as a channel and serve by applying by means of a gas or fluid of the temperature.
  • the cover (11) as Liquid-tight and gas-permeable film may be formed.
  • FIG. 4 A further exemplary representation of a device according to the invention which serves for the duplication and detection of target substances is shown in FIG. 4.
  • the device comprises the polymer base member (9) and the cover (11).
  • the polymer basic component (9) has two inlets (1), three further inlets (3), three duplication units or modules (4), two separate detection modules (5) and three outlets (14).
  • the inlets (1) and the further inlets (3) are connected to the three replication modules (4) by means of microchannels (8).
  • the three duplicating modules (4) are connected to the three outlets (14) by means of microchannels (8).
  • two of the three replication modules (4) are each coupled to two of the three outlets (14) via a respective detection module (5).
  • Insulating spaces (10), which are formed as recesses, are arranged around one of the three replication modules (4).
  • a third of the three duplicating modules (4) already comprises the associated detection module (5).
  • Each of the three replication modules (4) is associated with a temperature control unit (6), each comprising a Peltier element. For reasons of clarity, only one temperature control unit (6) is shown.
  • each of the three replication modules (4) is also assigned a temperature sensor.
  • a not shown operating unit comprises the temperature sensors and the temperature control units (6). Both are arranged in an operating phase on the polymer base member (9) and the cover (11), in particular pressed.
  • the cover (11) is shown separately from the polymer base member (9) for ease of illustration. It is fixedly and durably arranged in the manufacture of the device on the polymer base member (9).
  • the cover (11) at least partially contains a polymer material that is transparent at the wavelength of the optical detection method used. If, for example, a fluorescence method is used as the detection method, the coverage at the excitation wavelength and at the wavelength of the fluorescence radiation emitted by the detection modules (5) is permeable.
  • the polymer base member (9) also comprises a polymer material.
  • the liquid extracted from a sample with extracted targets is supplied via the inlets (1) to the polymer base member (9).
  • the substances necessary for the duplication are supplied to the polymer basic component (9).
  • the liquids with the targets and the substances used for the duplication are fed to the three replication modules (4).
  • the nucleic acid to be amplified is multiplied by means of temperature cycles generated by the three temperature control units (6). In two of the three amplification modules (4), the nucleic acid produced is fed to two detection modules (5) and detected there by means of fluorescence methods.
  • the cover (11) serves to guide the liquids and prevents evaporation of the liquids. Next prevented it penetration of particles and other interfering substances during transport into the recesses of the polymer base member (9).
  • the cover (11) is designed so that it can be easily opened at the inlets (1), the other inlets (3) and the outlets (14). The opening can be done for example by piercing the cover (11).
  • a plurality of nucleic acids can be duplicated and detected simultaneously and in parallel from one sample.
  • the temperature cycles for the duplication in the three duplicating modules (4) may be different, since each duplicating module (4) is assigned its own tempering unit (6).
  • extraction modules are connected between the inlets 1 and the duplicating modules (4).
  • the detection modules (5) comprise electrochemical detectors.
  • the electrochemical detectors comprise an array of electrodes.

Abstract

Es wird eine Vorrichtung zur Vervielfältigung und Detektion von Targetsubstanzen, insbesondere von Nukleinsäuren, aus einer Probe beschrieben. Die Vorrichtung umfasst mindestens zwei Vervielfältigungsmodule (4) sowie mindestens zwei Detektionsmodule (5), die auf einem Bauteil angeordnet sind, wobei die Vervielfältigungsmodule (4) über eine jeweils individuell anzusteuernde Temperierungseinheit (6) temperierbar sind.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung bzw. ein Array zur Vervielfältigung und Detektion von Targetsubstanzen, insbesonders von Nukleinsäuren aus einem biologischen Material oder einer Probe.
  • Die Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren spielt eine wichtige Rolle z.B. in der Forensischen Analytik, in der Krebsforschung oder in der Lebensmitteldiagnostik.
  • Dabei geht es darum, bestimmte Nukleinsäuren zu detektieren, aus denen sich z.B. auf eine kriminelle Täterschaft, die Disposition für eine Erbkrankheit oder die gentechnische Modifikation eines Lebensmittels schließen lässt. Herkömmliche Methoden zur Detektion bestimmter Nukleinsäuren sind hinlänglich bekannt, so z.B. Gel- oder Kapillarelektrophorese, Southern Blot, Immunoassays oder Hybridisierung mit gelabelten Nukelinsäuresonden. Hierzu werden Reaktionschips, Kartuschen, Elektrophoresekammern o. ä., sowie die entsprechenden Geräte zum Auslesen dieser Vorrichtungen verwendet.
  • Da in den genannten sowie vielen anderen Fällen die interessierenden Nukleinsäuremoleküle häufig nur in sehr geringer Menge und noch dazu in unmittelbarer Nachbarschaft zu einer Vielzahl anderer Nukleinsäuremoleküle vorkommen, müssen erstere erst gezielt und spezifisch vervielfältigt werden. Hierzu sind aus dem Stand der Technik sogenannte Vervielfältigungs- oder Amplifikationsverfahren wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder SDA bekannt. Diese Verfahren werden in der Regel in sogenannten Thermocyclern durchgeführt.
  • Um beide Verfahren durchzuführen, ist folglich ein großer Maschinenpark erforderlich, der seinerseits ein gut ausgestattetes Labor erforderlich macht. Ein Einsatz außerhalb des Labors ist daher nicht ohne weiteres möglich. Dies erschwert z.B. die Arbeit bei epidemiologischen Untersuchungen im Feld, forensischen Untersuchungen am Tatort, Routineuntersuchungen in der Arztpraxis etc.
  • Überdies müssen die zu detektierenden Nukleinsäuren zunächst in die Vervielfältigungsvorrichtung gegeben werden, und anschließend die vervielfältigten Moleküle in die Detektionsvorrichtung. Jeder Transferschritt führt daher einerseits zu Material- und Zeitverlusten und birgt andererseits die Gefahr der Kontamination mit Fremd-Nukleinsäuren.
  • Ferner sind aus dem Stand der Technik Vorrichtungen bekannt, in denen Vervielfältigungsfunktion und Detektionsfunktion integriert sind. Diese Vorrichtungen vermeiden die oben genannten Probleme.
  • In einigen Fällen sind die genannten Funktionseinheiten in Form eines Arrays derart miniaturisiert, dass sie auf einem kleinen Träger Platz finden ("Lab on a Chip"). Dabei stehen die einzelnen Reaktionskammern über miniaturisierte Kanale in Verbindung, und die Reaktionsflüssigkeiten werden mittels geeigneter Mikropumpen und Ventile sowie über die Kapillarkraft von einer Kammer in die nächste transportiert (Mikrofluidik). Solche Chips oder auch Kartuschen werden dabei in spezielle angepasste Apparaturen angeordnet, welche die notwendigen Steuer- und Betriebseinheiten, z. B. Pumpen sowie Heiz- und Kühlelemente etc. aufweisen und die Reaktionen, Detektionen etc. steuern und auswerten.
  • In der Schrift "Flow-through polymerase chain reaction in chip thermocyclers" (Schnegaß & Köhler 2001, Rev. in Mol. Biotechnol. 82; 101) werden solche "Labs on a Chip" vorgestellt. Als Vervielfältigungsmethode wird dabei ausschließlich PCR erwähnt, bei der der Erfolg der Vervielfältigung auf die Abarbeitung von Thermocyclen angewiesen ist. Die Autoren beschreiben einen Chip, der einen mäanderförmigen Kanal aufweist, unter dem in geordneter Anordnung Heizelemente verschiedener Temperatur angeordnet sind. Wird die Reaktionsflüssigkeit mit geeigneter Geschwindigkeit durch den Kanal gepumpt, durchläuft sie die für den Ablauf der PCR erforderlichen Temperaturcyclen, und die Nukleinsäuren werden vervielfältigt.
  • Da der Vervielfältigungsfaktor exponentiell von der Anzahl der Thermocyclen abhängt, ist in einem solchen "Lab on a Chip" der Vervielfältigungsfaktor bereits festgelegt. Solche Chips sind daher nicht sehr variabel und folglich für verschiedene Verwendungszwecke nicht zu gebrauchen.
  • Allerdings sind diese aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen in der Regel für die parallele Untersuchung vieler Proben auf ein und dieselbe Nukleinsäure ausgelegt. So können z.B. in einigen Vorrichtungen 96 Lebensmittelproben verschiedenster Herkunft gleichzeitig parallel auf das Vorhandensein eines bestimmten Gens untersucht werden, z. B. auf ein Anti-biotikaresistenzgen, das auf eine gentechnische Modifikation schließen lässt.
  • Die gleichzeitige Untersuchung einer Probe auf das Vorhandensein einer Vielzahl von Nukleinsäuren (so, wie es z.B. für die Proteomik bzw. Genomik oder die schnelle Infektionsdiagnose wünschenswert wäre) ermöglichen diese Vorrichtungen hingegen nicht. Die oben genannte Schrift schlägt daher den seriellen Durchsatz mehrerer Proben nacheinander vor. Neben dem Zeitverlust birgt dieses Vorgehen jedoch auch die Gefahr der Kontamination einer Probe mit Produkten aus dem vorherigen Durchlauf.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren aus einem biologischen Material oder einer Probe bereitzustellen, die die vorgenannten Nachteile nicht aufweist und mit der insbesonders mittels einem Probeauftrag in einem Vorgang eine Mehrzahl verschiedener Targetsubstanzen, wie z. B. Nukleinsäuren, z. B. von unterschiedlichen Infektionserregern detektiert werden können. Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des vorliegenden Anspruchs 1 gelöst.
  • Demnach ist eine Vorrichtung in Form eines Arrays zur Vervielfältigung und Detektion von Targetmolekülen aus einem biologischen Material oder einer Probe vorgesehen, die mindestens zwei Vervielfältigungsmodule sowie mindestens zwei Detektionsmodule, aufweist, wobei die Vervielfältigungsmodule jeweils über eine individuell anzusteuernde Temperierungseinheit temperiert werden,
    und wobei die Vervielfältigungs- und Detektionsmodule auf einem Bauteil angeordnet sind. Abgesehen von einer Abdeckung sowie gegebenenfalls vorliegenden Sondermodulen bzw. -einheiten ist das Bauteil einstückig ausgebildet.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung oder Chip ist zweckmäßigerweise zur Aufnahme in einer Steuer- und/oder Bedienungseinheit (Basisgerät) angepasst, wobei diese Einheit, die zum Betrieb der Vorrichtung notwendigen Steuer-, insbesonders Temperier-, Pump-, und Detektionselemente aufweist. Diese Elemente können mittels eines Rechners steuerbar sein.
  • Eine solche Vorrichtung ermöglicht es, eine einzige Probe simultan auf mehrere Targetsubstanzen, insbesonders Nukleinsäuren zu testen. Damit verbunden ist ein enormer Geschwindigkeitsgewinn gegenüber herkömmlichen Verfahren, der es ermöglicht, den Durchsatz eines Labors zu erhöhen und so intensive Screeningarbeiten, wie sie z.B. in der Epidemiologie oder der Krebsdiagnostik erforderlich sind, zu beschleunigen.
  • Durch die jedem Vervielfältigungsmodul zugeordnete individuell anzusteuernde Temperierungseinheit kann in jedem Vervielfältigungsmodul eine für die jeweilige Targetreaktion bzw. das jeweilige zu detektierende Targetmaterial individuell einstellbare Abfolge von Dauer, Temperatur und Anzahl der Zyklen durchgeführt werden, und so die für ein zu detektierendes Target sowie den hierfür jeweils eingesetzten Amplifikationsenzymen und Denaturierungsbedingungen in jedem einzelnen Fall zu optimieren, ohne dabei parallel ablaufende Vorgänge zu stören. Bevorzugte Targets sind Nukleinsäuren. Die Ansteuerung kann dabei in einfacher Weise über einen programmierbaren PC erfolgen. In jedem individuell anzusteuernden Vervielfältigungsmodul kann auch eine entsprechende Multiplex-Vervielfältigungs durchgeführt werden. Diese sind typischerweise auf 3 - 4 Targetsequenzen beschränkt.
  • Da die einzelnen Module auf einem Bauteil angeordnet sind, entfällt ein Umpipettieren der jeweiligen Probe bzw. des Vervielfältigungsprodukts von einem Modul zum nächsten. Des weiteren erhöht sich die Durchsatzgeschwindigkeit, und es wird die Kontaminierungsgefahr reduziert und der Materialverlust minimiert. Da sämtliche Steuerelemente in der Steuer- und Bedienungseinheit angeordnet sind, ist es möglich, allein durch die Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Chip, insbesonders als Mikrochip oder als Kartusche ein variables und hoch portables System bereitzustellen, das lediglich eine größere Bedienereinheit und die für den jeweiligen Verwendungszweck geeigneten Chips umfasst. Für die Durchführung der Analysen ist daher kein eigenes Labor erforderlich, so dass auch eine Verwendung "im Feld", also z.B. am Ort eines Verbrechens oder bei einer epidemiologischen Studie in einem Entwicklungsland oder in einer Arztpraxis, ohne weiteres möglich ist.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann die Vorrichtung zum Nachweis von Bakterien ausgelegt sein.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Vorrichtung außerdem mindestens ein Modul zur Extraktion von Nukleinsäuren aufweist, das auf demselben gemeinsamen Bauteil angeordnet ist.
  • Auf diese Weise wird die Extraktion der Nukleinsäuren aus der Probe bzw. dem biologischen Material in die Vorrichtung integriert, was die oben genannten Vorteile noch erhöht.
  • Bevorzugt ist die Anzahl der Vervielfältigungs- und Detektionsmodule gleich, und die Anzahl der Extraktionsmodule ist kleiner oder gleich der Anzahl der Vervielfältigungsmodule.
  • Besonders bevorzugt sind sogar zwei oder mehr Module zur Extraktion von Nukleinsäuren auf dem gemeinsamen Bauteil angeordnet. Auf diese Weise kann in jedem Extraktionsmodul ein anderes Extraktionsverfahren gewählt werden, um Artefakte durch ein weniger geeignetes Verfahren auszuschließen, oder es können unterschiedliche Proben oder Materialien gleichzeitig extrahiert und einer Analyse zugeführt werden.
  • Es kann jedoch auch sinnvoll sein, die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren gesondert zu extrahieren und erst dann in die Vorrichtung einzubringen. Dies ist z.B. der Fall, wenn es sich um eine sehr feste Probe handelt, für deren Extraktion mechanische Kraft erforderlich ist, oder wenn das zu untersuchende Material sehr wenig Nukleinsäuren enthält, sodass die extrahierte Nukleinsäure durch Verwendung einer großen Material- oder Probenmenge erst noch angereichert werden muss.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass das gemeinsame Bauteil, das Extraktionsmodul, das Vervielfältigungsmodul und/oder das Detektionsmodul überwiegend oder ganz aus einem Polymermaterial gefertigt sind. Geeignete Polymermaterialien sind Polyamide, Polycarbonate, PMMA, Polysulfone, Polyetherketone, Polyester, Polyethylen, PET, ein cycloolefinisches Polymer (COC) wie z. B. TOPAS, Polyacetate, Polymethane. In einer weiteren bevorzugten Ausführung kann die Detektionseinheit aus einem für eine verwendete Detektionsstrahlung besonders geeigneten zweiten Material bestehen.
  • Auf diese Weise entsteht eine kostengünstig herzustellende, leichte, inerte und leicht zu entsorgende Vorrichtung, die üblicherweise eine geringe Wärmeaufnahme aufweist. Letzteres trägt dazu bei, die Geschwindigkeit des Verfahrens zu erhöhen, da die während des Vervielfältigungsschritts (bei nicht isothermen Vervielfältigungsverfahren) abgearbeiteten Thermocyclen schneller durchlaufen werden können.
  • Ebenso kann das Bauteil ganz oder teilweise auch aus einem anorganischen Material, wie z. B. Metall, Silicium, Keramik und/oder Glas bestehen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die einzelnen Module Reaktionskammern aufweisen, die über Mikrokanäle mit einer Querschnittsfläche von insbesonders < 1 mm2 bzw. mit Querschnitten von ca. 0,005 bzw. 0,007 mm2 bis ca. 1 mm2 bzw. 0,8 mm2 in Verbindung stehen, über die das bio-logische Material, die Probe, die extrahierten Nukleinsäuren oder die Vervielfältigungsprodukte weitertransportiert werden.
    Die Kammern bestehen zum Beispiel aus Vertiefungen in dem gemeinsamen Bauteil.
    Die Kanäle können einen beliebigen Querschnitt aufweisen und beispielsweise viereckig, kreisförmig oder U-förmig ausgestaltet sein.
  • Besonders bevorzugt weisen diese Kanäle einen Durchmesser von 0,1 - 1 mm, insbesonders einen Durchmesser von 0,2 - 0,8 bzw. 0,4 - 0,6 mm auf. Bei einem U-förmigen bzw. eckigen Querschnitt beziehen sich diese Werte auf den durchschnittlichen Durchmesser der in etwa dem Durchmesser eines gleichgroßen kreisförmigen Querschnittes entspricht.
  • Solche Strukturen lassen sich je nach verwendetem Material durch Spritzguss, Mikrospritzguss, Abformen, Prägen, Ätzen, Photolithografie, Mikrosandstrahlen, Lasern oder Laminat von Folien mit und ohne Ausnehmungen herstellen.
  • Die Flüssigkeit wird dabei durch geeignete Pumpen und Ventile sowie über Kapillarkräfte von einem Modul zum nächsten bzw. von einer Reaktionskammer in die nächste transportiert.
  • Ebenso kann bevorzugt vorgesehen sein, dass die Benetzungseigenschaften der Kanäle gezielt beeinflusst werden. So kann z.B. die Oberfläche am Ausgang einer Kammer hydrophob ausgebildet sein, um ein Auslaufen von Reaktionsflüssigkeit während einer Reaktion zu verhindern.
  • Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Kanäle nach oben hin geschlossen ausgebildet sind. Dieses Merkmal ist erforderlich, um eine übermäßige Verdunstung des Reaktionsflüssigkeit zu verhindern, birgt aber die Gefahr der Blasenbildung, die zu einer Unterbrechung des Flusses führen würde.
  • Aus diesem Grunde ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass die Kanäle nach oben hin offen ausgestaltet sind und mit einer flüssigkeitsundurchlässigen, aber gasdurchlässigen Struktur abgedeckt sind. Hierbei kann es sich z.B. um eine Folie handeln, die beispielsweise aus PTFE gefertigt ist.
  • In einer weiteren, bevorzugten Ausgestaltung weist die Steuereinheit und/oder die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens zwei Temperatursensoren auf. Diese sind z.B. den Vervielfältigungsmodulen zugeordnet und ermöglichen die Kontrolle und Steuerung der Temperierungseinheiten.
  • In einer ebenfalls bevorzugten Ausgestaltung ist das gemeinsame Bauteil in die Steuer-/Bedienereinheit (Basisgerät) einsetzbar, in der auch die Temperierungseinheiten und/oder Temperatursensoren angeordnet sind.
  • In ersterem Falle ist es erforderlich, dass eine gute thermisch leitende Verbindung zwischen der Temperierungseinheit und dem gemeinsamen Bauteil, insbesondere dem Vervielfältigungsmodul besteht, damit die Thermocyclen schnell abgearbeitet werden können, ohne dass erst umgebendes Material langwierig erhitzt werden muss. Das Basisgerät kann überdies z.B. eine oder mehrere Ultraschallquellen, Pumpen für die Mikrofluidik, Ventile oder optische Detektoren wie Kameras oder Photomultiplier und Photodioden als Einzeldetektor oder in Arrayform aufweisen.
  • Diese Ausgestaltung ist besonders vorteilhaft, weil sie die Verwendung von kostengünstig hergestellten Einweg-Bauteilen, insbesondere aus Polymer, erlaubt, da die erwähnten Funktionalitäten wie Temperierungseinheiten, Temperatursensoren, Ultraschall-Erzeugungseinheiten oder Antriebe für Rührer, aber auch Pumpen für die Mikrofluidik oder Ventile, im Basisgerät verbleiben.
  • Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass die Temperierungseinheit des Vervielfältigungsmoduls ein Peltier-Element umfasst. Peltierelemente sind leicht anzusteuern und ermöglichen eine schnelle und genaue Erzeugung einer gewünschten Temperatur. Überdies sind sie imstande, sowohl Wärme als auch Kälte zu erzeugen. Durch die Anordnung von Peltierelementen direkt auf einer der Flüssigkeit abgewandten Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtungen, insbesondere auf den Oberflächen der Vervielfältigungseinheiten, kann eine extrem schnelle Temperierung, d. h. Heizung und/oder Kühlung erreicht werden. Auf diese Weise wird eine weitere Beschleunigung der jeweiligen Untersuchung ermöglicht. In einer zweckmäßigen Ausgestaltung sind die Peltierelemente nicht in der Vorrichtung bzw. Polymerkartusche integriert.
  • In alternativen Ausführungsformen ist jedoch auch die Verwendung von Luft-Anblaseinrichtungen, Mikrowellen, IR-Strahlern, Heizwiderständen, Heiz- bzw. Kühlflüssigkeit oder leitfähigen und resistiven Polymeren vorgesehen. Letztere können direkt in das Material des Bauteils eingearbeitet sein. Außerdem sind sämtliche Kombinationen der genannten Temperierungseinheiten denkbar.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass in dem Vervielfältigungsmodul eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durchführbar ist. Hierbei kann es sich z.B. um PCR (Polymerase-Kettenreaktion), rtPCR (reverse Transkriptions-PCR), real-time PCR (Echtzeit-PCR), NASBA (Nukleinsäure-Sequenzbasierte Amplifikation), LCR (Ligase-Kettenreaktion), RCA (Rolling Circle Amplifikation), oder SDA (Strand-Displacement-Amplifikation) handeln.
  • Die genannten Verfahren lassen sich im Groben in isotherme und nicht-isotherme Amplifikationsverfahren unterteilen. Dabei ist zu beachten, dass bei isothermen Amplifikationsverfahren keine Thermocylen abgearbeitet werden. Gleichwohl ist die erfindungsgemäße Vorrichtung auch bei diesen Verfahren mit den genannten Vorteilen verwendbar.
  • In jedem Fall ist es erforderlich, dass während des Vervielfältigungsschritts den zu vervielfältigenden Nukleinsäuren Primer, Mononukleotide und eine oder mehrere Polymerase hinzugefügt werden. Bevorzugt ist daher vorgesehen, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Einrichtung zur Abgabe von Primern, Mononukleotiden und/oder einer oder mehrerer Polymerasen aufweist. Diese kann ebenfalls sowohl auf dem gemeinsamen Bauteil als auch auf dem Basisgerät angeordnet sein. Die Erfindung betrifft daher auch einen Reaktionskit, der diese Subs-tanzen zusammen mit erfindungsgemäßer Vorrichtung enthält.
  • Weiterhin ist bevorzugt vorgesehen, dass es sich bei den Temperatursensoren um Thermoelemente, Thermowiderstände, Silizium-Sensoren, PTC- bzw. NTC-Elemente oder Platin-Sensoren (PT 100, PT 1000) handelt.
  • Ebenso kann es sich bei den Temperatursensoren um Elemente aus Chromogenen Polymeren handeln, deren Farbe sich in Abhängigkeit von der Temperatur ändert.
  • So kann z.B. der Boden einer Kammer aus Chromogenem Polymer bestehen, während deren Deckel transparent ausgebildet ist. Die Temperaturmessung erfolgt dann mit einem Photodetektor durch den Deckel der Kammer. Ein Photodetektor kann eine Photodiode oder eine Kamera umfassen. Derartige Messungen sind auch als Reflektionsmessung oder als Transmissionsmessung durchführbar.
  • Ebenso kann es sich bei den Temperatursensoren um partikuläre Elemente handeln, die der Reaktionsflüssigkeit beigegeben werden und die ihre optischen Eigenschaften, so z.B. ihre Transmission, Farbe, Fluoreszenz oder Phosphoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur ändern.
  • Vorteil all dieser Verfahren ist, dass die genannten Sensoren in unmittelbarer Nähe zur Probe liegen und nur eine geringe eigene Wärmeaufnahme haben, so dass sehr genaue Messungen möglich sind. Außerdem vermindert die Tatsache, dass all diese Messungen berührungslos sind, die Gefahr der Kontamination.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Extraktion in dem Extraktionsmodul auf chemischem Wege erfolgt. Dies kann z.B. durch enzymatischen Verdau und/oder durch übliche Fällungsverfahren geschehen.
  • Ebenso kann vorgesehen sein, dass die Extraktion in dem Extraktionsmodul mittels Ultraschall erfolgt. Bei Verwendung einer geeigneten Frequenz und Leistung werden Zellwände und Membranen aufgeschlossen, so dass die Nukleinsäuren aus dem Zellinnern austreten können.
  • Ultraschall kann ebenso für das Mischen der Reaktionsflüssigkeit in einem der Module verwendet werden. Allerdings kommen hierfür andere Frequenzen und Leistungen in Betracht.
  • Ebenso kann aber die Extraktion in dem Extraktionsmodul und/oder das Mischen in einem der Module durch Rühren erfolgen. Entscheidend sind hier die auftretenden Scherkräfte, die durch Wahl einer geeigneten Drehzahl bzw. eines geeigneten Rührers entsprechend eingestellt werden können.
  • Eine Variante dieser Ausgestaltung ist die Extraktion oder das Vermischen mittels magnetischer Teilchen, die durch ein von außen angelegtes rotierendes Magnetfeld in Bewegung versetzt werden. Hier kann es sich z.B. um die bekannten Rührfische handeln, aber auch um magnetische Mikropartikel. Besonders bevorzugt ist dabei, wie schon erwähnt, vorgesehen, dass der magnetische Antrieb im Basisgerät angeordnet ist.
  • Es versteht sich von selbst, dass die genannten Verfahren zur Extraktion und/oder zum Mischen beliebig miteinander kombiniert werden können, um die Effizienz der Extraktion und/oder des Mischens zu verbessern.
  • Bevorzugt ist bei dieser Ausgestaltung insbesondere vorgesehen, dass der Auslaßkanal des Extraktionsmoduls einen Querschnitt hat, der kleiner ist als der der magnetischen Teilchen, bzw. das magnetische Teilchen verwendet werden, deren Querschnitt größer ist als der des Auslaßkanals. Auf diese Weise wird verhindert, dass die die zum Rühren bzw. Extrahieren verwendeten Teilchen weitertransportiert werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Kammern der Extraktions- und/oder der Vervielfältigungsmodule von Ausnehmungen im Material des Bauteils umgeben sind.
  • Diese Ausnehmungen können insbesondere in Form von nach oben geschlossenen Kanälen ausgebildet sein und dienen einerseits dazu, die Kammern thermisch zu isolieren und so die Abarbeitung der Thermocyclen zu beschleunigen. Andererseits werden durch die thermische Isolierung Spannungen im Material aufgrund unterschiedlicher Temperaturen reduziert. Schließlich können diese Ausnehmungen auch der akustischen Isolierung der Kammern dienen. Dies erhöht z.B. die Effizienz bei der Verwendung von Ultraschall zum Mischen bzw. zum Extrahieren der Nukleinsäuren.
  • Prinzipiell können die Ausnehmungen z. B. mittels einer Abdeckung zu Kanälen geschlossen sein. Sie sind üblicherweise mit Luft, Gas oder einer Flüssigkeit gefüllt oder weisen ein Vakuum auf. Es kann aber auch vorgesehen sein, dass die Temperierung der Kammern über diese Kanäle erfolgt. In diesem Fall werden z.B. kalte bzw. warme Flüssigkeiten in die Kanäle geleitet. In einer Ausführungsform ist das Basisgerät zum Bereitstellen der kalten und der warmen Flüssigkeit ausgelegt. Mit Vorteil ist somit ein schneller Temperaturwechsel der Vervielfältigungsmodule erzielbar.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist vorgesehen, dass das Detektionsmodul in das Vervielfältigungsmodul integriert ist. Auf diese Weise wird es ermöglicht, den Fortgang der Vervielfältigungsreaktion in Echtzeit zu verfolgen. Die entsprechenden Verfahren sind als online-PCR oder Real-Time-PCR bekannt.
  • Die Detektion der Vervielfältigungsprodukte erfolgt dabei z.B. mittels FRET (Fluoreszenz-Resonanzenergie-Transfer) oder durch Quenchen von Fluoreszenzmolekülen. Prinzipiell kann die Detektion auch durch Messung eines elektrischen Stroms oder Spannung erfolgen, die durch eine geeignete elektrochemische Reaktion erzeugt wird.
  • In einer anderen erfindungsgemäßen Ausgestaltung ist vorgesehen, dass die Detektion der vervielfältigten Nukleinsäuren in dem Detektionsmodul mittels Elektrophorese, Southern Blot, Immunoassay oder Hybridisierung mit gelabelten Nukleinsäuresonden erfolgt.
  • In einer alternativen Ausgestaltung sind zur Detektion der vervielfältigten Nukleinsäuren elektrochemische oder massensensitive Detektoren wie ein Schwingquarz oder ein Oberflächenwellenbauelement vorgesehen, die an ihrer Oberfläche eine Fänger-Nukleinsäure aufweisen.
  • Bei dem biologischen Material handelt es sich bevorzugt um Material ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Blut, Serum, Liquor, Urin, Sputum, Stuhl, Pflanzenmaterial und Gewebeproben.
  • Anwendungsgebiete sind hier z.B. die Forensik, die medizinische Diagnostik oder die Erbgutanalyse.
  • Bei der Probe handelt es sich hingegen bevorzugt um eine Probe aus der Gruppe enthaltend Wasser, flüssige Lebensmittel, feste Lebensmittel, Babynahrung, Bodenproben, und Luftproben. Anwendungsgebiete sind hier z.B. die Umwelt-, die Wasser- oder die Lebensmittelanalytik, insbesondere die Analytik betreffend gentechnisch veränderte Lebensmittel.
  • Ferner ist ein Verfahren zur Extraktion, Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren aus einem biologischen Material oder einer Probe vorgesehen, bei dem eine Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche verwendet wird.
  • Die Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die beiliegenden Figuren beispielhaft erläutert.
  • Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Auftrags-, Vervielfältigungs- und Detektionseinheiten.
  • Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Analysechips mit Extraktions- und Vervielfältigungseinheit.
  • Fig. 3 zeigt einen Querschnitt durch eine solche erfindungsgemäße Vorrichtung.
  • Fig. 4 zeigt eine beispielhafte Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
  • Wie in Fig. 1 dargestellt, weist die erfindungsgemäße Vorrichtung ein oder auch mehrere Einlässe bzw. Auftragseinrichtungen (1) für verschiedene aus einer Probe gewonnenen Flüssigkeiten mit bereits extrahierten nachzuweisenden Targets, insbesondere Nukleinsäuren auf. Diese werden dann auf 4 verschiedene Nukleinvervielfältigungseinheiten (4) geleitet, in denen diese bei unterschiedlichen Bedingungen bezüglich Enzymen, Temperatur und Zykluslänge vervielfältigt werden und anschließend im Detektor (5) detektiert werden. In diesem Falle wird die Nukleinsäureextraktion außerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt.
  • Gemäß einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform enthält das Chip-Polymerbauteil zusätzlich eine Aufschlusseinrichtung (2), insbesonders Nukleinsäureextraktionseinheit. Im gezeigten Beispiel von Fig. 2 wird ausgehend von einem Probenauftrag (1) die Probe zu jeweils 2 verschiedenen Extraktionseinheiten (2) geleitet und dort verschiedenen Extraktionsverfahren unterzogen. Das Extraktionsverfahren selbst kann mittels Rühren und/oder Ultraschall oder auch durch Beaufschlagung mittels plötzlicher Druckentlastung durchgeführt werden. Auch chemisch ausgelöste Verfahren, z. B. durch pH-Änderung sind möglich. Mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung können gleichzeitig winzige Mengen einer einzigen Probe völlig verschiedenen Bedingungen in den Extraktionseinheiten (2) behandelt und die so erhaltenen Extrakte anschließend auf verschiedene Vervielfältigungseinheiten (4) geleitet werden, wo sie in jeder Einheit individuell und gezielt bei unterschiedlicher Temperatur, Zyklusdauer und Enzymen vervielfältigt werden.
  • Wie in Fig. 3 dargestellt umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Polymergrundbauteil (9), welches ein oder auch mehrstöckig ausgebildet ist. In dem Polymergrundbauteil (9) sind Mikrokanäle (8) angeordnet, in denen die jeweiligen Extraktions- bzw. Vervielfältigungsreaktionen durchgeführt werden. Die Vorrichtung wird mittels einer Abdeckung (11) verschlossen. Auf der gegenüberliegenden Seite des Kanals (8) ist ein Temperatursensor (7) angeordnet, dem auf der gegenüberliegenden Seite eine Temperiereinheit (6), insbesonders Peltier-element gegenüberliegt. In einer weiteren Ausführung kann anstatt des Peltierelementes (6) oder zusätzlich zu diesem ein Ultraschallkopf (nicht gezeigt) oder auch ein anderes Bauteil wie beispielsweise ein Rührer angeordnet sein, der das im Reaktionsraum bzw. Kanal (8) vorliegende Reaktionsmedium mischt und/oder aufschließt. Neben dem Reaktionsraum (8) kann ein Isolierraum (10) angeordnet sein, der eine seitliche Ausbreitung der Temperatur zu weiteren (nicht dargestellten) Reaktionseinheiten isoliert. Prinzipiell kann der Raum auch als Kanal ausgebildet sein und durch Beaufschlagen mittels eins Gases oder Fluids der Temperierung dienen. Alternativ kann die Abdeckung (11) als Flüssigkeitsdichte und gasdurchlässige Folie ausgebildet sein.
  • Eine weitere beispielhafte Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die zur Vervielfältigung und Detektion von Targetsubstanzen dient ist in Fig. 4 dargestellt. Die Vorrichtung umfasst das Polymergrundbauteil (9) und die Abdeckung (11). Das Polymergrundbauteil (9) weist zwei Einlässe (1), drei weitere Einlässe (3), drei Vervielfältigungseinheiten bzw. -module (4), zwei davon getrennte Detektionsmodule (5) und drei Auslässe (14) auf. Die Einlässe (1) und die weiteren Einlässe (3) sind mit den drei Vervielfältigungsmodulen (4) mittels Mikrokanälen (8) verbunden. Ebenso sind die drei Vervielfältigungsmodule (4) mit den drei Auslässen (14) mittels Mikrokanälen (8) verbunden. Dabei sind zwei der drei Vervielfältigungsmodule (4) über jeweils ein Detektionsmodul (5) mit zwei der drei Auslässe (14) gekoppelt. Isolierräume (10), die als Ausnehmungen ausgebildet sind, sind um eines der drei Vervielfältigungsmodule (4) angeordnet. Ein drittes der drei Vervielfältigungsmodule (4) umfasst bereits das dazugehörige Detektionsmodul (5). Jedem der drei Vervielfältigungsmodule (4) ist eine Temperierungseinheit (6) zugeordnet, die jeweils ein Peltier-Element umfasst. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist ausschließlich eine Temperierungseinheit (6) eingezeichnet. Um die Temperaturzyklen steuern zu können, ist jedem der drei Vervielfältigungsmodule (4) ebenfalls ein Temperatursensor zugeordnet. Eine nicht eingezeichnete Betriebseinheit umfasst die Temperatursensoren und die Temperierungseinheiten (6). Beide werden in einer Betriebsphase auf das Polymergrundbauteil (9) und die Abdeckung (11) angeordnet, insbesondere aufgedrückt.
  • Die Abdeckung (11) ist zur besseren Veranschaulichung getrennt von dem Polymergrundbauteil (9) eingezeichnet. Sie wird bei der Herstellung der Vorrichtung auf dem Polymergrundbauteil (9) fest und dauerhaft angeordnet. Die Abdeckung (11) enthält zumindest teilweise ein Polymermaterial, das bei der Wellenlänge des verwendeten optischen Detektionsverfahrens durchsichtig ist. Wird beispielsweise als Detektionsverfahren ein Fluoreszenzverfahren eingesetzt, ist die Abdeckung bei der Anregungswellenlänge und bei der Wellenlänge der aus den Detektionsmodulen (5) emittierten Fluoreszenzstrahlung durchlässig. Das Polymergrundbauteil (9) umfasst ebenfalls ein Polymermaterial.
  • Die aus einer Probe gewonnene Flüssigkeit mit extrahierten Targets wird über die Einlässe (1) dem Polymergrundbauteil (9) zugeführt. An den weiteren Einlässen (3) werden die für die Vervielfältigung nötigen Substanzen dem Polymergrundbauteil (9) zugeleitet. Über Mikrokanäle (8) und durch Anlegen eines Druckunterschiedes zwischen den Einlässen (1) und den weiteren Einlässen (3) sowie den Auslässen (14) werden die Flüssigkeiten mit den Targets sowie die für die Vervielfältigung eingesetzten Substanzen den drei Vervielfältigungsmodulen (4) zugeführt. Die zu vervielfältigende Nukleinsäure wird mit Hilfe von Temperaturzyklen, die von den drei Temperierungseinheiten (6) erzeugt werden, multipliziert. Bei zwei der drei Vervielfältigungsmodulen (4) wird die erzeugte Nukleinsäure zwei Detektionsmodulen (5) zugeleitet und dort mittels Fluoreszenzverfahren erfasst. Bei dem dritten der Vervielfältigungsmodule (4) erfolgt die Detektion bereits in der kombinierten Einheit, umfassend das Vervielfältigungsmodul (4) und das Detektionsmodul (5). Die Abdeckung (11) dient der Führung der Flüssigkeiten und verhindert ein Verdunsten der Flüssigkeiten. Weiter verhindert sie ein Eindringen von Partikeln und anderen störenden Substanzen während eines Transports in die Ausnehmungen des Polymergrundbauteils (9). Die Abdeckung (11) ist so ausgebildet, dass sie an den Einlässen (1), den weiteren Einlässen (3) sowie den Auslässen (14) einfach geöffnet werden kann. Das Öffnen kann beispielsweise mittels Durchstechen der Abdeckung (11) erfolgen.
  • Somit können vorteilhafterweise aus einer Probe mehrere Nukleinsäuren gleichzeitig und parallel vervielfältigt und nachgewiesen werden. Vorteilhafterweise können die Temperaturzyklen für die Vervielfältigung in den drei Vervielfältigungsmodulen (4) unterschiedlich sein, da jedem Vervielfältigungsmodul (4) eine eigene Temperierungseinheit (6) zugeordnet ist.
  • In einer alternativen, nicht gezeigten Ausführung sind Extraktionsmodule zwischen den Einlässen 1 und den Vervielfältigungsmodulen (4) geschaltet.
  • In einer weiteren alternativen Ausführung umfassen die Detektionsmodule (5) elektrochemische Detektoren. Die elektrochemischen Detektoren weisen ein Array von Elektroden auf.

Claims (15)

  1. Vorrichtung zur Vervielfältigung und Detektion von Targetsubstanzen, insbesondere von Nukleinsäuren, aus einer Probe, umfassend
    mindestens zwei Vervielfältigungsmodule sowie mindestens zwei Detektionsmodule,
    wobei die Vervielfältigungs- und Detektionsmodule auf einem Bauteil angeordnet sind, und die Vervielfältigungsmodule über eine jeweils individuell anzusteuernde Temperierungseinheit temperierbar sind.
  2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Modul zur Extraktion von Nukleinsäuren enthält, das auf dem Bauteil angeordnet ist.
  3. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Bauteil, das Extraktionsmodul, das Vervielfältigungsmodul und/oder das Detektionsmodul aus einem Polymermaterial bestehen.
  4. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Module über Mikrokanäle mit einer Querschnittsfläche kleiner gleich 1 mm2 in Verbindung stehen, über die das biologische Material, die Probe, die extrahierten Nukleinsäuren oder die Vervielfältigungsprodukte weitertransportiert werden.
  5. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokanäle unterschiedliche Benetzungseigenschaften aufweisen.
  6. Vorrichtung gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanäle mittels einer Abdeckung verschlossen sind, die eine flüssigkeitsundurchlässige, aber gasdurchlässige Struktur aufweist.
  7. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung außerdem mindestens zwei Temperatursensoren aufweist.
  8. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das gemeinsame Bauteil zur Aufnahme in eine Betriebseinheit angepasst ist, in dem die Temperierungseinheiten und/oder Temperatursensoren angeordnet sind.
  9. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperierungseinheit ein Peltier-Element aufweist.
  10. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatursensoren Thermoelemente, Platin-Sensoren, Thermowiderstände, Silizium-Sensoren oder PTC- bzw. NTC-Elemente und/oder Elemente aus chromogenen Polymeren, deren Farbe sich in Abhängigkeit von der Temperatur ändert, sind.
  11. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammern der Extraktions- und/oder der Vervielfältigungsmodule von Ausnehmungen im Material des Bauteils umgeben sind.
  12. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eines der mindestens zwei Detektionsmodule in eines der mindestens zwei Vervielfältigungsmodule integriert ist.
  13. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eines der mindestens zwei Detektionsmodule einem der mindestens zwei Vervielfältigungsmodule nachgeschaltet ist.
  14. Kit of Parts umfassend eine Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche zusammen mit Amplifikationsenzymen, Trenngelen, Ultrafiltrationsmembranen und/oder Markern.
  15. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche zur Extraktion, Vervielfältigung und Detektion von Targetsubstanzen, insbesondere von Nukleinsäuren, aus einem biologischen Material oder einer Probe.
EP06022542A 2005-10-28 2006-10-27 Vorrichtung zur Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren Withdrawn EP1780290A3 (de)

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DE200510051850 DE102005051850A1 (de) 2005-10-28 2005-10-28 Vorrichtung zur Vervielfältigung und Detektion von Nukleinsäuren

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EP1780290A2 true EP1780290A2 (de) 2007-05-02
EP1780290A3 EP1780290A3 (de) 2008-06-11

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