DE10148102A1 - Biochip zum quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen - Google Patents

Biochip zum quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen

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Abstract

Der Biochip ist gekennzeichnet durch eine Aminosilan-vorbehandelte Glasoberfläche, die ggf. zusätzlich eine mit biotinyliertem vernetztem Rinder-gamma-globulin und einem Gemisch aus vernetztem Streptavidin- und Avidin-Polymerisat beschichtete Oberfläche aufweist. DOLLAR A Bevorzugt ist der Biochip für ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen geeignet, das darin besteht, das mittels Enzym-markierten Biomolekülen, die an die Oberfläche des Chips binden, die Biomoleküle einer fotometrischen, pixelorientierten Auswertung zugeführt werden, in dem sie mit einem Farbsubstrat für das Enzym sichtbar gemacht werden.

Description

  • Die Erfindung betrifft einen Biochip zum quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen mittels Proteinbindungs-, Immuno- oder Hybridisierungsassay.
  • Einen Überblick über den neusten Stand der Biochip-Technologien gibt die Monographie: Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, Eaton, 2001. Des weiteren existieren Publikationen zu Protein-BioChips. Einen Überblick gibt das Buch von Weinberger, S. R., Morris, T. S. und Pawlak, M.: Recent trends in protein biochip technology, Ashley Publications, 2000. Im Vordergrund stehen dabei sogenannte high-densitiy-Biochips (Biochips mit hoher Punktdichte und kleinen Spots (pl- bis unterer nl-Bereich), die mit laserangeregter Fluorometrie, mit dem MALDI-TOF-Verfahren (Massenspektrometrie) oder Plasmon Pherometrie ausgewertet werden. Gegenstand dieser Schrift ist ein sogenannter Low- Densitiy-Biochip (BioChip mit niedriger Punktdichte und größeren Spots (1 bis 2 µl)), der mittels eines einfachen Durchlichtscanners ausgewertet werden kann.
  • Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, einen Biochip zu entwickeln, der unter Anwendung von farblichen Markierungstechniken einen quantitativen Nachweis von Biomolekülen in Proteinbindungs-, Immuno- oder Hybridisierungsassays durch fotometrische pixelorientierte Erfassung von Farbreaktionen (Farbpunkte) gestattet.
  • Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst. Der Biochip ist gekennzeichnet durch eine Aminosilan-vorbehandelte Glasoberfläche, die ggf. zusätzlich ene mit biotinyliertem vernetztem Rinder-gamma-globulin und einem Gemisch aus vernetztem Streptavidin- und Avidin-Polymerisat beschichtete Oberfläche aufweist. Es finden bevorzugt die in der Mikroskopie üblichen Glasobjekträger Verwendung. Andere Gläser, wie z. B. DIA-Gläser sind ebenfalls geeignet.
  • Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Biochips ist insbesondere durch die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet:
    • Variante 1
  • Beschichtung eines zuvor mit Reaktionspunkten (Spots) versehenen Glasträgers mit einem Aminosilan, vorzugsweise mit 3-Aminopropyltriethoxysilan und anschließend mit Glutaraldehyd.
    • Variante 2
  • Beschichtung eines zuvor mit Reaktionspunkten (Spots) versehenen Glasträgers mit einem Aminosilan, vorzugsweise mit 3-Aminopropyltriethoxysilan und anschließend mit Glutaraldehyd, danach Kopplung von biotinyliertem vernetztem Rinder-γ-Globulin an diesen so vorbehandelten Spots sowie abschließende Beschichtung mit einem vernetztem Streptavidin-Avidin-Polymerisat. Die Herstellung von biotiynyliertem vernetztem Rinder-γ- Globulin sowie von vernetztem Streptavidin-Avidin-Polymerisat und deren Beschichtung nach erfolgter Glutaraldehydbeschichtung der Spots erfolgt gemäß WO 98/55864 A2.
  • Der so funktionalisierte Biochip ist nun für Assays mit biotinylierten Reaktionspartnern als Variante 2 bzw. Reaktionspartnern mit freien Aminogruppen (z. B. Proteine) als Variante 1 geeignet.
  • Bevorzugt ist er für ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen geeignet, das darin besteht, dass mittels POD (Peroxidase)-markierten Biomolekülen, die an die Oberfläche des Chips binden, die Biomoleküle einer fotometrischen pixelorientierten Auswertung zugeführt werden, in dem sie mit einem Farbsubstrat für POD sichtbar gemacht werden.
  • Der erfindungsgemäße Biochip ist erfolgreich sowohl als quantitativer Immunoassay als auch als quantitativer Hybridisierungsassay einsetzbar, wobei für den Biochip überraschend eine hohe Empfindlichkeit erreicht wird, wenn die Reaktionen auf einer Glasoberfläche von 2 bis 8 mm2 und bei einem Volumen der Reaktionspartner von 1 bis 2 µl ausgeführt werden. Die Farbintensität und die Anzahl der Farbpunkte (Pixel) auf der Glasoberfläche sind von der Konzentration der POD-Konjugate abhängig und werden im Immunoassay oder Hybridisierungsassay als Nachweissubstanz verwendet. Die nach Immunoassay oder Hybridisierungsassay an der Oberfläche gebundenen POD-Konjugate (Sonde) werden durch Umsatz mit einem Farbsubstrat für Peroxidase wie z. B. Tetramethylbenzidin (TMB) und 3-3- Diamino-Benzidin (DAB) sichtbar gemacht und über einen Durchlichtscanner in ihrer Farbintensität (Optische Dichte der Farbanteile der Farben Rot, Grün, Blau (RGB)) aller Pixel über die Punktfläche (2 bis 8 mm2) = Spot entsprechend dem im Beispiel 2 genannten erfindungsgemäßen Verfahren vermessen. Die quantitative Auswertbarkeit der auf dem Biochip ausgeführten Assays wird dadurch erreicht, daß sowohl die optische Dichte der durch die Sonde verursachten Farbpixel als auch deren relative Häufigkeit auf den Spots Berücksichtigung finden.
  • Im folgenden wird seine Herstellung und Verwendung anhand von Beispielen näher erläutert.
    • Beispiel 1 Herstellung des Biochips
    • 1. Es wird z. B. ein handelsüblicher Glasobjekträger als Ausgangsmaterial eingesetzt. Auf diesem werden, z. B. durch Siebdruck, die Position der Reaktionspunkte (Spots) festgelegt. Größe und Abstand der Spots werden dabei bevorzugt entsprechend dem Format der handelsüblichen Testplatten (Mikrotiterplatten) mit 96 oder 384 Vertiefungen gewählt, so dass die per Hand oder mit einem Arrayer auf die Spots aufzutragenden Reaktionslösungen aus diesen Testplatten 1 : 1 übernommen werden können (s. Abb. 1 und 2).
    • 2. Die Glasobjekträger (OT) werden ggf. gereinigt, d. h. z. B. in Alkohol gewaschen und an der Luft getrocknet. Zur Beschichtung werden sie in 3-Aminopropyltriethoxysilan (ALS) (1% ALS in ein Alkohol-Wasser-Gemisch von 50 Vol. %) getaucht. Das ALS läßt man bei 37°C 3 Stunden einwirken. Danach wird der OT abgespült (mit Wasser).
    • 3. Anschließend wird jeder Spots des OT aktiviert, bevorzugt mit 2 µl 2%-ger Glutardialdehyd (GDA)-Lösung in Carbonatpuffer pH = 9,6 (Inkubation von GDA in Petrischale (feuchter Zellstoff), 2 h bei Raumtemperatur). Danach werden die OT mit Aqua dest. gespült und getrocknet (ggf. mit einem Fön).
    • 4. Auf jeden Spot werden 2 µl biotinyliertes vernetztes Rinder-γ-Globulin (0,1-1 mg/ml) gegeben. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur über Nacht in einen feuchten und abgedeckten Behälter. Danach Spülen des OT mit Aqua dest. und Trocknen an der Luft.
    • 5. Die Aldehydreste, die nicht mit dem biotinyliertem vernetztem Rinder-γ-Globulin reagiert haben, werden mit 2 µl/Spot von ~4%iger Lysin-Lösung in PBS, 0,05 M pH = 7,2 geblockt. Die Inkubation erfolgt 30 Minuten bei Raumtemperatur in einen feuchten Behälter. Danach Spülen des OT mit Aqua dest. und Trocknen z. B. mit einem Fön.
    • 6. Danach werden auf jeden Spot 2 µl vernetztes Streptavidin-Avidin-Polymerisat (0,1-1 mg/ml in PBS, pH = 7,4) gegeben. Die Inkubation erfolgt 4 Stunden bei Raumtemperatur in einen feuchten und abgeschlossenen Behälter. Danach Spülen des OT mit Na-Cl-Lösung und Aqua dest. und anschließend trocknen.
    • 7. Zum Schluß wird der gesamte OT mit einer Lösung von 1% Casein (pH = 6,2) in 0.9% NaCl gespült und getrocknet.
  • Damit ist der Biochip fertig, der nun Assays mit biotinylierten Reaktionspartnern gestattet.
    • Beispiel 2 A) Biotin-Bindungsassay auf den Streptavidin-Avidin-Spots
  • Es werden auf jeden Spot 2 µl doppeltmarkiertes Immunglobulin G (biotinyliert und POD- markiert, Biotin-IgG-POD) in PBS-Puffer, 0,05 M pH = 7,4 mit 0,1% RSA als Sonde (hergestellt nach Vorschrift für die POD-Markierung in DE 100 20 885 A1, nachträgliche Biotinylierung mit Biotinylierungsreagenz von PIERCE, EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin, Produkt-Nr. 21335) als Duplikate in der Konzentrationsreihe 0,39/0,78/1,5625/3,125/6,25/12,5/25/50 ng/ml gegeben. Die Inkubation der Sonde erfolgt 1 Stunde bei Raumtemperatur in einen feuchten und abgeschlossenen Behälter. Danach Spülen des OT mit Na-Cl-Lösung und Aqua dest. und absaugen der Waschflüssigkeit. Der Nachweis der an den Spots gebundenen Sonde erfolgt mit 2 µl/Spot präzipitierendem TMB (Tetramethylbenzidin) als gebrauchsfertige Lösung oder alternativ mit DAB und über 30 Minuten an der Luft.
    • Messung
  • Die Messung erfolgt über einen optischen Durchlichtscanner, wie z. B. Agfa Scan e50 und ähnlichen Scannern und DIA-Scannern, die über eine Durchlichtscanfäche für Glas- Objekträger (mindestens 2,6.7,6 cm) verfügen.
  • Durch den Einsatz von Sonden mit bestimmten Farbeigenschaften ist ein qualitativer Nachweis der auf der Glasoberfläche innerhalb eines Spots gebundener Biomoleküle möglich. Die Informationen, die auf den durch Sonden angefärbten Spots der Glasoberflächen vorhanden sind, müssen in digitalisierter Form verarbeitet werden. Die Glasträger mit den gefärbten Spots werden mit einen der o. g. Durchlichtscanner nach folgenden Verfahren vermessen und anschließend ausgewertet:
    Die Objektträger bzw. Deckgläschen werden zum Scannen in einem Vorlagehalter auf dem Vorlageglas des Scanners abgelegt und die homogene Durchlicht-Lichtquelle wird einige Millimeter über den Glasoberflächen der FarbBioChips positioniert. Zur Gewährleistung einer Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit wird eine Kalibrierung des Scanners vor dem Scannen der Biochips vorgenommen.
  • Das Erscheinungsbild des fertigen Scans muss durch vorherige scannerspezifische Einstellungen definiert werden. Dazu werden der Farbmodus von 256 Farben und eine optische Auflösung von 250 × 250 dpi ausgewählt. Diese Farbtiefe und Auflösung sind geeignet für eine qualitative, statistisch abgesicherte Analyse und ermöglichen eine effektive Auswertung. Die Feineinstellungen des Scanners für Helligkeit, Kontrast und Sättigung werden manuell entsprechend festgelegter Standards eingestellt, damit eine Reproduzierbarkeit gewährleistet ist. Die Größe des Scanbereiches muß innerhalb der Grenzen in Abhängigkeit vom Format des Glaskörpers gewählt werden. Es wird nun pro Biochip ein Scan erstellt, der als BMP-File auf Datenträger der Steuercomputer abgelegt wird.
  • Bedingt durch in der Praxis auftretende Inhomogenitäten innerhalb der einzelnen Spots ist eine pixelorientierte Auswertung notwendig. Eine Anzahl von 100 Pixel pro Spot ist für die Bestimmung der Biomoleküle ausreichend. Durch den Einsatz eines Farbscanners werden für jeden Bildpunkt (Pixel) Wertetripel für die RGB-Farbanteile rot, grün und blau erfasst, die eindeutig mit vorbestimmten Stellen auf dem so genannten Farb-Biochip korrespondieren. Um diese Farben binär darstellen zu können, verwenden wir jeweils 8 Bits, die 256 mögliche RGB-Informationen speichern können. Um diese Daten im Rahmen des Auswerteprogramms übersichtlich darstellen zu können, erfolgt eine Normierung auf eine Bereich zwischen 0 und 99.
  • Im zweiten Schritt erfolgt die Bildanalyse und Auswertung. Die eingescannten Bilder werden im Computer weiter verarbeitet, um quantitative Daten für jede einzelne Probe zu erhalten. Diese Aufgabe übernimmt ein spezialisiertes Bildverarbeitungsprogramm.
  • Das Bildverarbeitungsprogramm ist modular aufgebaut und besteht im wesentlichen aus drei Abschnitten - der Spoterfassung, der Quantifizierung und dem Vergleichen verschiedener Proben. Das fertig gescannte Bild wird in eine computergesteuerte Anwendung auf der Basis von Pixel eingebunden. Durch Translation und Rotation wird das gescannte Bild mit einer vorgegebenen Maske in Übereinstimmung gebracht. Zur Überprüfung der Richtigkeit der Spoterfassung und der farbgetreuen Erfassung des Scanners erfolgt die Auswertung von 4 Referenzpunkten mit den für Biochip vorgewählten RGB-Eigenschaften (Farbdruck des Biochips). Im Rahmen der Auswertung wird in Abhängigkeit von den Farbeigenschaften der Sonden eine geeignete spektrale Zusammensetzung entsprechend des RGB-Anteils der durch die Sonde erzeugten Färbung des Substrates herausgefiltert, um die Sensitivität zu steigern. Die spezifischen Farbanteile, die durch die Färbung mittels biochemischen Sonden gegeben ist, werden mit Standardreihen (Konzentrationsreihen) der Sonden zum Nachweis der Biomoleküle so optimiert, daß eine eindeutige Korrelation zwischen Konzentration der Sonden und der Farbreaktion besteht.
  • Die Auswertung basiert auf dem pixelorientierten RGB-Farbmodell, wobei prinzipiell zwischen 3 Klassen von Pixelpunkten unterschieden werden muss.
    • 1. Die Klasse 1 von Pixeln, die den RGB-Farbanteilen entsprechen, welche durch die Farbreaktion der Sonden verursacht werden, wobei die Festlegung der Grenzen für die RGB-Anteile empirisch für die gewählten Sonden und Farbsubstrate (TMB, DAB) ermittelt wurden.
    • 2. Die Klasse 2 von Pixeln, die in ihren RGB-Anteilen den Eigenschaften der Sondenleerwerte entsprechen, die in den 4 Referenzpunkten bestimmt wurden.
    • 3. Die Klasse 3 von Pixeln, die den Klassen 1 und 2 nicht zugeordnet werden können. Diese werden als nicht für den Assay relevante Pixel behandelt.
  • Innerhalb der Klasse 1 eines Spots werden die Mittelwerte, die Standardabweichungen und die Anzahl berechnet. Bezüglich der Klasse 2 wird der relative Anteil dieser Pixel ermittelt. Die Anzahl der Pixel der Klasse 3 wird lediglich gezählt und in der weiteren Auswertung als Ausreißer behandelt.
  • Die Pixel der Klassen 1 und 2 sind mit der Konzentration der verwendeten bichemischen Sonde und deren Substratfärbung bei konstantem Dosiervolumen korreliert und ermöglichen einen quantitativen Assay (Proteinbindungs-, Immuno- oder Hybridisierungsassay, s. Beispiele).
  • Die Maßeinheit nach o. g. Normierung wird RPU (Relative Pixel Unit) genannt. Es können sowohl die Mittelwerte über die Pixel der Klassen 1 und 2 als auch die mit der relativen Häufigkeit der in Klasse 1 gefundenen RPU bezogen auf die summe der Pixel in Klasse 1 und 2 für die Auswertung genutzt werden. Die Speicherung ausgewählter Proben- und Scannerinformationen ist implementiert.
  • Ergebnis des Biotin-Bindungsassay auf den Streptavidin-Avidin-Spots siehe Tabelle 1 und Abb. 3 und 4. Beispiel 3 Kompetitiver Immunoassay am Beispiel des Clenbuterol-Immunoassay auf dem BioChip Standardkurve/Nachweis mit Clenbuterol-POD-Tracer

    Ergebnis siehe Tabelle 2 und Abb. 5 und 6. Beispiel 4 Sandwich-Immunoassay am Beispiel des TNF-α- Immunoassays Biochip 4 vom 15.08.0l

    Ergebnis siehe Tabelle 3 und Abb. 9 und 10. Beispiel 5 Hybridisierungsassay am Beispiel des Wildtyps eines kras-Gen-Fragments Hybridisationsassay auf StrAv-Träger Chip 32 (Nr. 9/110901) Biot-Oligo (Konz.-Reihe) und einer FITC-Sonde

    Ergebnis siehe Tabelle 4 und Abb. 9 und 10. Tabellen Tabelle 1 Ergebnis des Biotin-Bindungsassays auf den Streptavidin-Avidin-Spots des BioChips

    Tabelle 2 Ergebnis des kompetitiven Clenbuterol-Immunoassays

    Tabelle 3 Sandwich-Immunoassay am Beispiel des TNF-α-Immunoassays

    Tabelle 4 Hybridisierungsassay am Beispiel des Wildtyps eines kras-Gen-Fragments

Claims (11)

1. Biochip zum fotometrischen, pixelorientierten Nachweis von Biomolekülen gekennzeichnet durch eine mit 2-8 mm2 großen Reaktionsarealen (Spots) versehene Glasoberfläche, wobei die Spots so funktionalisiert sind, dass der Biochip als Assay unter Verwendung eines Enzym-markierten Biomoleküls (Sonde) einsetzbar ist, wobei der Umsatz an Biomolekül mit einem Farbsubstrat bewertet wird, indem die verursachten Farbpunkte auf den Spots sowohl in ihrer optischen Dichte als auch in ihrer relativen Anzahl pro Spot erfaßt werden.
2. Biochip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spotoberfläche mittels Aminosilan und Glutaraldehyd funktionalisiert ist.
3. Biochip nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Spotoberfläche zusätzlich mittels biotinyliertem Rinder-γ-gobulin und einem Gemisch aus vernetztem Streptavidin- und Avidin-Polymerisat funktionalisiert ist.
4. Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierte Spot-Oberfläche zur Bindung Peroxidase oder Alkalische Phosphatasemarkierter Biomoleküle geeignet ist.
5. Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierte Spot-Oberfläche ein Volumen von 1 bis 2 µl erfasst.
6. Verfahren zur Herstellung eines Biochips nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit Reaktionspunkten (Spots) versehenen handelsüblichen Glasträger mit einem Aminosilan vorbehandelt, die Spots aktiviert und ggf. zusätzlich anschließend mit biotinyliertem vernetztem Rinder-γ-Globulin sowie mit einem vernetztem Streptavidin-Avidin-Polymerisat beschichtet.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Spots mittels Siebdruck festgelegt werden, wobei Größe und Abstand der Spots entsprechend dem Format handelsüblicher Testplatten gewählt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbehandlung mit 3-Aminopropyltriethoxysilan erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung der Spot-Oberflächen mit Glutardialdehyd in Carbonatpuffer erfolgt.
10. Verwendung eines Biochips nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum fotometrischen, pixelorientierten quantitativen Nachweis von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass auf den Spots nach entsprechender Vorbeschichtung ein Proteinbindungs-, Immuno- oder Hybridisierungsassay unter Verwendung eines Enzym-markierten Biomoleküls ausgeführt wird, wobei dessen Umsatz mit einem Farbsubstrat ausgewertet wird, indem die dadurch verursachten Farbpunkte auf den Spots sowohl in ihrer optischen Dichte als auch in ihren relativen Anzahl pro Spot erfaßt und mit Standardreihen verglichen werden.
11. Verwendung eines Biochip gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Enzymmarkierung Meerettichperoxidase oder Alkalische Phosphatase eingesetzt werden.
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