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Die
Erfindung betrifft eine Messvorrichtung mit einer Einweg-Messkassette
zum automatisierten quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low
Density Bereich sowie ein Verfahren hierzu.
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Aus
der Patentschrift
DE
101 48 102 B4 ist ein Biochip zum fotometrischen, pixelorientierten quantitativen
Nachweis von Biomolekülen
bekannt, der 2–8
mm
2 große
Reaktionsareale (Spots) auf der Glasoberfläche eines handelsüblichen
Glasobjektträgers
aufweist. Die Spots sind derart funktionalisiert, dass der Biochip
als Assay unter Verwendung eines Enzym-markierten Biomoleküls (Sonde)
einsetzbar ist. Der Umsatz des eingesetzten Farbsubstrats wird bewertet,
indem die Farbpunkte auf den Spots sowohl in optischer Dichte als
auch in relativer Anzahl pro Spot erfaßt werden. Die Farbintensität der Farben
Rot, Grün
und Blau (RGB) aller Pixel wird mittels eines Durchlichtscanners
vermessen und bewertet.
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Aus
der Gebrauchsmusterschrift
DE 20 2005 006 854 U1 ist ein Low Density
Biochip bekannt, der aus durchsichtigem Kunststoff gebildet ist
und die Größe eines
Objektträgers
aufweist.
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In
der Offenlegungsschrift der
DE 103 13 515 A1 ist ein Biochip mit einer
glasklaren Kunststoffoberfläche
zum Nachweis für
Biomoleküle
beschrieben. Die Auswertung der an der Oberfläche gebundenen enzymmarkierten
Biomoleküle
erfolgt fotometrisch pixelorientiert.
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Die
Patentschrift
DE 102
33 212 B4 offenbart eine Messvorrichtung für ein Hochdurchsatzanalyseverfahren
mit einer Biochip-Anordnung aus einzelnen Biochips, welche auf einem
Träger
angeordnet sind. Der Träger
mit den Biochips wird durch die Messvorrichtung hindurchgeführt, wobei
je nach Analyseschritt der Biochip einer für den jeweiligen Analyseschritt
hergerichteten Einrichtung der Messvorrichtung zugeführt wird.
Der Biochip durchläuft
somit mehrere Stationen der Messvorrichtung bis das Messergebnis
feststellbar ist.
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Die
US 2005/0048519 A1 lehrt
eine Sammelkassette zum Sammeln von Blutmarkern mittels eines Biochips.
Der Biochip wird nach dem Sammeln der Biomarker zur weiteren Analyse
aus der Sammelkassette herausgenommen und in eine Bearbeitungseinheit überführt. In
der Bearbeitungseinheit werden die gebundenen Marker vom Biochip
eluiert und einer POP oder RT-PCR zugeführt.
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Nachteilig
an den bekannten Biochips ist, dass diese manuell mit der Probe
beladen, gespült und
mit der farbreaktiven Markerlösung
versetzt werden müssen.
Die Handhabung unterliegt somit dem individuellen Vorgehen des Laboranten,
wodurch nur Messergebnisse aus der Hand eines Laboranten als vergleichbar
angesehen werden können,
zudem selbst bei routiniert ausgeführter Arbeit mit nahezu identischen
Handgriffen und Zeitmanagement Ungenauigkeiten durch Pipettierfehler
und Raumbedingungen auftreten.
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Ferner
sind die Reaktionsoberflächen
der bekannten Biochips ungeschützt
gegenüber äußeren mechanischen
und chemischen Einflüssen
wie Berührungen
durch Finger oder Laborgeräte
sowie durch in der Luft enthaltene Verbindungen oder Partikel, die
ebenfalls zu einer Verfälschung
und Ungenauigkeit der Messergebnisse führen.
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Die
gewonnen Messergebnisse sind daher nur mit entsprechend hoher Fehlerrate
vergleichbar.
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Ein
weiterer Nachteil der bekannten Biochips ist, dass nur ein Biomolekül pro Chip
nachgewiesen werden kann.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, Nachweise von Biomolekülen mittels
Low Density Biochips auf der Basis fotometrischer, pixelorientierter
quantitativer Erfassung von Messergebnissen zu automatisieren und
die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Nachweise zu erhöhen.
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Die
Aufgabe wird durch eine Messvorrichtung zum automatisierten quantitativen
fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low Density Bereich
gelöst,
die eine Nachweisreaktionsführungseinheit
mit einem oder mehreren Behältern
für Hilfslösungen und
einen Behälter
zur Aufnahme von Abfalllösungen
sowie Zu- und Ableitungen zu den Behältern, eine Messeinheit mit
einem Mittel zur fotometrischen, pixelorientierten Erfassung einer
Farbreaktion einer Reaktionslösung
mit einem zu detektierenden Biomolekül, eine computergestützt arbeitende Auswerteeinheit
zur Auswertung der Messergebnisse und eine Messkassette bestehend
aus einem lichtdurchlässigen
Kassettengehäuse,
in dem eine Messkammer, in der ein Low Density Biochip mit einem
mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger einsetzbar
ist, eine Oberlaufkammer, eine Einführöffnung für die zu analysierende Probe
oder Proben, eine Probenzufuhr mit Probenfilter, welche mit einer
Probenleitung zur Messkammer verbunden ist, eine Kammer, in die
ein Vorratsbehälter
mit einer Reaktionslösung
eines farbreaktiven Markers einführbar
ist, und ein Aktivierungsstempel zur Öffnung des Vorratsbehälters, eine Zuleitung
für die
Reaktionslösung
des farbreaktiven Markers aus dem Vorratsbehälter zur Messkammer, mindestens
eine Zuleitungsanschluss und eine Zuleitung für eine erste Hilfslösung, mindestens
eine Ableitung und ein Ableitungsanschluss für Abfalllösungen, eine Mischeinrichtung
zum Homogenisieren der Probe und der genannten Lösungen in der Messkammer und
eine gasdurchlässige
Dichtung und/oder ein Ventil und/oder eine Membran zum Druckausgleich im
Kassettengehäuse
eingerichtet ist, aufweist. In der Reaktionsführungseinheit ist mindestens
ein Aufnahmebereich zur passgenauen Aufnahme einer Messkassette
eingerichtet, die über
Anschlüsse
für die
Zu- und Ableitungen
der Behälter
für Hilfslösungen verfügt. An der
Messkassette selbst sind zu den Anschlüssen im Aufnahmebereich korrespondierende
Anschlüsse
eingerichtet, wobei die zueinander korrespondierenden Anschlüsse nach
dem Einlegen der Messkassette eine lösbare dichte Verbindung eingehen.
Mindestens das Beladen und Spülen
der Messkassette mit Reaktions- und Hilfslösungen, die Reaktionsführung sowie
die Auswertung der Farbreaktion erfolgt prozessorgesteuert und vorzugsweise vollautomatisch.
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Die
Hilfslösungen
können
je nach Assay aus einem Puffer beispielsweise einer Elektrolytlösung mit
einem bestimmten pH-Wert sein, welcher in einer besonderen Ausführungsform
Eiweisse, Detergenzien (z. B. Tween) zugesetzt sind.
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Die
Nachweisreaktionsführungseinheit
dient zur Steuerung und Regelung und der Durchführung der Nachweisreaktion
auf dem Low Density Biochips. Hierzu wird eine Messkassette enthaltend
einen Low Density Biochip in eine hierfür vorgesehenen Aufnahmebereich,
der vorzugsweise als Einschubfach ausgebildet ist, eingeführt. Hierbei
werden die korrespondierenden Anschlüsse an der Messkassette und an
der Nachweisreaktionsführungseinheit
miteinander verbunden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Anschlüsse der
Art „male” und „female”, die passformgerecht
ineinandersteckbar sind. In einer besonderen Ausführungsform
weist die Messkassette in den Anschlüssen ein Septum auf. Die Anschlüsse an der
Nachweisreaktionsführungseinheit
sind dagegen mit einer Kanüle
oder holen Anstechnadel ausgestattet, so dass beim Einlegen der
Messkassette und dem gleichzeitigen Verbinden der Anschlüsse die Septen
von den Kanülen
oder holen Anstechnadeln durchstochen werden. Die Einrichtung von
mit Septen versehenen Anschlüssen
an der Messkassette hat den Vorteil, die Messkassette vor der Verwendung
staub- und feuchtigkeitsdicht lagern zu können. Weiter garantieren sie
den erneuten Verschluss bzw. eine Abdichtung bei Entnahme der Kassette
aus der Nachweisreaktionsführungseinheit.
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Die
Messkassette ist mit einer Pumpe, vorzugsweise einer oszillierenden
Membran- oder Ballon-Pumpe ausgestattet, die durch einen Antrieb,
der in der Nachweisreaktionsführungseinheit
eingerichtet ist, angetrieben wird. Diese Pumpe dient sowohl der Homogenisierung
und gleichmäßigen Verteilung
der Probe, der Hilfslösungen
als auch der Farbreagenz in der Messkammer der Messkassette. Der
Antrieb, beispielsweise ein Elektromotor, der Membranpumpe ist derart
in der Nachweisreaktionsführungseinheit
eingerichtet, dass beim Einlegen der Messkassette der Antrieb mit
der Pumpeinrichtung in der Kassette gekoppelt wird, vorzugsweise
mit einem Stößel oder
einer Pleuelstange in einen in der Messkassette eingerichteten Führungskanal
zur Führung
des Stößels oder
der Pleuelstange eingreift, wobei der Stößel oder die Pleuelstange an
der Membran der Pumpe endet. Bei Antrieb wird die Membran durch
den Stößel oder
die Pleuelstange oszillierend auf und niederbewegt und bewirkt so
eine Durchmischung in der an die Pumpe anschließenden Messkammer. Die Nachweisreaktionsführungseinheit
selbst ist mit Pumpen zur Förderung
von Hilfslösungen
aus den Vorratsbehältern
in die Messkassette und zum Absaugen von Probe, Hilfslösungen oder
Farbreagenz aus der Messkassette in einen entsprechenden Auffangbehälter ausgestattet.
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In
der Nachweisreaktionsführungseinheit sind
vorzugsweise mehrere Aufnahmebereiche zur Aufnahme von Messkassetten
vorgesehen. Jede Nachweisreaktion kann separat und unabhängig von parallel
laufenden Nachweisreaktionen in weiteren Messkassetten durch die
Auswerteeinheit gesteuert werden. Vorteilhaft hieran ist, dass mehrere
Nachweisreaktionen gleichzeitig durchgeführt werden können.
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In
einer besonderen Ausführungsform
ist die Nachweisreaktionsführungseinheit
temperier- und klimatisierbar, so dass die Nachweisreaktion unter optimalen
Reaktionsbedingungen ablaufen kann. Die Reaktionsbedingungen sind
im Nachweisprogramm gespeichert oder separat manuell einstellbar.
Vorzugsweise ist jeder Aufnahmebereich für eine Messkassette separat
temperier- und klimatisierbar.
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Die
Messeinheit dient der fotometrischen, pixelorientierten Erfassung
einer Farbreaktion einer Reaktionslösung mit einem zu detektierenden
Biomolekül.
Der Low Density Biochip der Messkassette ist ein Biochip mit vorzugsweise
2–8 mm2 große
Reaktionsareale (Spots), die auf der Glasoberfläche eines handelsüblichen
Glas- oder Kunststoffobjektträgers
aufgebracht sind. Die Spots sind derart funktionalisiert, dass der
Biochip als Assay unter Verwendung eines markierten Biomoleküls (Sonde)
einsetzbar ist. Der Umsatz des eingesetzten Farbsubstrats wird bewertet,
indem die Farbpunkte auf den Spots sowohl in optischer Dichte als
auch in relativer Anzahl pro Spot erfaßt werden. Zur Detektion der
Farbintensität
der Farben Rot, Grün
und Blau (RGB) aller Pixel ist die Messeinheit vorzugsweise mit
einer CCD-Kamera,
einer Kamera mit CMOS-Technologie oder einem Scanner mit Streulicht
zur Erzeugung von Daten in Dateiformaten für Rastergrafiken ausgestattet.
Die Aufzählung
ist nicht abschließend
zu betrachten. Grundsätzlich
ist jede Kameratechnologie einsetzbar, mit welcher Farbintensitäten auswertbar
aufgezeichnet werden kann. Nach Ende der Nachweisreaktion wird die
Messkassette der Nachweisreaktionsführungseinheit entnommen und
in die Messeinheit eingeführt,
wobei diese über
eine entsprechende Halterung zur Aufnahme der Messkassette verfügt. In einer
besonderen Ausführungsform
kann die Messeinheit auch in die Nachweisreaktionsführungseinheit
integriert sein, so dass die Messung der Spots direkt nach Beendigung
der Nachweisreaktion erfolgen kann, ohne dass die Messkassette der
Messeinheit separat zugeführt
werden muss. Die Erfassung der Farbintensitäten der einzelnen Spots erfolgt
mittels Beleuchtung der Messkammer von unten und Aufnahme eines
Bildes mit dem Scanner oder der CCD-Kamera von oben. Das Bildformat
ist ein Dateiformat für
Rastergrafiken, vorzugsweise ein Tif-Format oder bmp-Format.
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Die
CCD-Kamera ist vorzugsweise eine 12 Bit CCD-Kamera. Hiermit können 1024
Farbwerte pro Farbe erzeugt werden. Mit handelsüblichen 8 Bit CCD-Kameras sind
hingegen nur 256 Farbwerte pro Farbe darstellbar. Durch die hohe
Anzahl an Farbwerten bei einer 12 Bit CCD-Kamera wird eine wesentlich
höhere
Empfindlichkeit gegenüber
Scannern oder 8 Bit CCD-Kameras
erreicht. Bei der Auswertung der Farbintensitäten der Spots, die von der
Anzahl gebundener Biomoleküle
pro Spot abhängt, führt die
Verwendung einer 12 Bit CCD-Kamera zu einer höheren Genauigkeit der Messergebnisse
bei gleichzeitigem Absenken der Nachweisgrenze. Bei einer Farbintensität eines
Spots von 0% sind keine Biomoleküle
an den Bindungsstellen gebunden, hingegen sind bei einer Farbintensität von 100%
alle Bindungsstellen belegt. Die 12 Bit CCD-Kamera ermöglicht nun eine 4-fach höhere Stufenzahl
(eine Stufen ist die kleinste Einheit, der eine Konzentration der
in der Probe enthaltenen Biomoleküle zugeordnet werden kann)
als gegenüber
einer 8 Bit CCD-Kamera. Die Stufen hier liegen bei ca. 0,5% auf
der Farbintensitätswerteskala.
Die 8 Bit CCD-Kamera kann maximal Stufenabstände von 3% der Farbintensitätswerte
darstellen. Dies macht den Vorteil und die höhere Messgenauigkeit einer
12 Bit CCD-Kamera deutlich. Hieraus resultiert, dass Proben kleinster
Volumina auswertbar werden. Entsprechend sinkt die Nachweisgrenze
nach unten, so dass auch geringe Konzentrationen des Biomoleküls in der
Probe nachgewiesen werden können.
Auch kann die Größe der Spots
verringert und so eine deutlich höhere Anzahl an Spots auf dem
Biochip platziert werden, als der Stand der Technik angibt.
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Gleichzeitig
werden mit der Kamera softwaregesteuert Nullpunktswerte aufgenommen.
Hierzu werden um jeden Spot vorzugsweise bis zu vier Farbwerte ermittelt,
die im Mittelwert einer Farbintensität von 0% entsprechen, eine
sogenannte „Shading-Korrektur”. Diese
Bereiche liegen außerhalb
des zu messenden Spots. Diese vier Nullpunktswerte werden für jeden
Spot einzeln bestimmt und bei der Berechnung der Farbintensität des zugehörigen Spots
zu Grunde gelegt. Hierdurch können
Fehler oder Abweichungen in der Beleuchtung der Messkassette herausgerechnet
werden. Darüber
hinaus können
Spots, die nur teilweise belegt sind, sei es durch lückenhafte
Belegung des Spots mit Bindungsstellen oder durch unzulängliche
Benetzung mit der Farbreagenz, mit in die Auswertung einbezogen
werden, da Farbbereiche mit 0% Farbintensität herausgerechnet und nicht
in die Mittelwertsberechnung der Farbwerteberechnung des Spots einbezogen
werden.
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Die
Erfassung der Farbintensitätswerte
erfolgt auf Basis von Bayerfilter-Werten, mit welchem unverfälschte Farbwerte
ermittelt werden können.
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Das
von der CCD-Kamera aufgenommene digitale Bild wird anschließend an
die Auswerteinheit übermittelt,
wo dieses auf einem Bildschirm darstellbar ist. Die Auswertung der
Farbintensitäten
sowie die Zuordnung zu bestimmten Konzentrationen des Biomoleküls erfolgt
softwaregestützt.
In der Auswerteeinheit sind vorzugsweise Farbreferenzwerte als Kalibrier-
oder Eichungswerte gespeichert. Auch können Kalibrier- und Eichungswerte
mittels einer zweiten Messkassette, die eine entsprechende Konditionierung
der Spots aufweist, eingelesen und die Werte zur Grundlage nachfolgender
Nachweisreaktionen herangezogen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
können
manuell Spots aus der Berechnung, beispielsweise aufgrund fehlerhafter
Belegung, Kratzer oder Defekte in der Messkassette herausgenommen
werden. Hierzu werden diese Spots über die Auswertesoftware markiert.
Zusätzlich
ist vorgesehen, bestimmte Spots eines Biochips als Referenzfarbwerte
zu definieren.
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Die
Messvorrichtung besteht somit aus vier Einzelkomponenten, die in
einem Gehäuse
integriert sein können
oder auch als separate Komponenten, sogenannte Stand-Alone-Komponenten, verbunden über Datenübertragungsleitungen
gefertigt sein können.
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Die
computergestützte
Auswerteeinheit verfügt über Steuer- und Regeleinheiten
zur Steuerung und Regelung sowohl der Nachweisreaktionsführungseinheit
als auch der Messeinheit, wobei es sich insbesondere um einen PC
oder MAC handelt. In der computergestützte Auswerteeinheit ist eine
Speichereinheit eingerichtet, in der Farbreferenzwerte und/oder
Nullwerte zur Auswertung der Messergebnisse gespeichert und abrufbar
sind. Darüber
hinaus sind in der Speichereinheit der computergestützten Auswerteeinheit
Programme zur Steuerung der Nachweisreaktionsführungseinheit für definierte Nachweisreaktionen
verschiedenartig konditionierter Low Density Biochips zum Nachweis
unterschiedlicher Biomoleküle
gespeichert und abrufbar. Zusätzlich
kann ein Bedienpaneel zur Eingabe und/oder Starten von Programmen
zur Steuerung definierter Nachweisreaktionen und eine Ausgabe- und/oder Anzeigeeinheit
für Messergebnisse
eingerichtet sein.
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Die
Nachweisreaktionsführungseinheit
kann im Aufnahmebereich zur passgenauen Aufnahme einer Messkassette
mit einer Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit
von auf der Messkassette gespeicherten codierten Informationen ausgestattet sein.
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Ebenso
kann die Messkassette mit einer Speichereinheit und Ausleseeinheit
enthaltend codierte Information, vorzugsweise eine oder mehrere Informationen
ausgewählt
aus der Gruppe „Art
und Konditionierung des Biochips, Nachweisreaktion, Chargennummer,
Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion, gebrauchte Messkassette,
neue Messkassette, Sicherheitscode”, ausgestattet sein.
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Die
Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit der
Nachweisreaktionsführungseinheit
und die Speichereinheit und Ausleseeinheit der Messkassette sind
jeweils derart auf oder in den Komponenten angeordnet, dass beim
Einlegen der Messkassette in die Nachweisreaktionsführungseinheit
diese Daten ausgetauscht werden können. Vorzugsweise sind auf der
Speichereinheit und Ausleseeinheit der Messkassette Daten gespeichert,
die die Art und Konditionierung des Biochips, beispielsweise zum
Nachweis von Mykotoxinen oder Eicosanoiden, und welche Nachweisreaktion
zu laden und starten ist, gespeichert und abrufbar. Zusätzlich können die
Chargennummer, das für
die Nachweisreaktion notwendige Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion
hinterlegt sein. Auch können
Informationen über
den Zustand der Messkassette gespeichert sein, insbesondere ob es
eine bereits gebrauchte Messkassette oder eine neue Messkassette
ist. Vorzugsweise wird hier nach erstmaligen Gebrauch einer Messkassette in
der Nachweisreaktionsführungseinheit
von der Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit
eine Information auf die Speichereinheit und Ausleseeinheit übertragen,
welche bei einer zweiten Verwendung der Messkassette ein Signal
auslöst,
welches darauf hinweist oder verhindert, dass die Messkassette ein
weiteres Mal verwendet wird. Auch kann ein Sicherheitscode gespeichert
sein, der durch die Nachweisreaktionsführungseinheit verifiziert wird.
Erst nach Gültigkeit
des Sicherheitscodes wird die Messkassette zur Analyse von Biomolekülen in der
Nachweisreaktionsführungseinheit
freigegeben und das Nachweisprogramm gestartet. Darüber hinaus
sind die Speicherung weiterer Informationen sowohl in der Speichereinheit
und Ausleseeinheit als auch in der Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit
möglich.
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Zur
Lösung
des der Erfindung zugrunde liegenden Problems schlägt die Erfindung
auch eine Messkassette vor.
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Die
Messkassette ist zur einmaligen Verwendung in der erfinderischen
Messvorrichtung hergerichtet. Sie besteht aus einem lichtdurchlässigen Kassettengehäuse, in
dem eine Messkammer, in der ein Low Density Biochip mit einem mit
funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger einsetzbar
ist, eine Überlaufkammer,
eine Probenzufuhr mit Probenfilter, und einer Probenleitung zur
Messkammer, einer Kammer, in die ein Vorratsbehälter mit einer Reaktionslösung eines
farbreaktiven Markers einführbar
ist, sowie einem Aktivierungsstempel oder Aktivierungsvorrichtung
zur Öffnung
des Vorratsbehälters
eingerichtet ist. Zusätzlich ist
eine Zuleitung für
die Reaktionslösung
des farbreaktiven Markers aus dem Vorratsbehälter zur Messkammer, mindestens
einem Zuleitungsanschluss und einer Zuleitung für eine erste Hilfslösung, mindestens einer
Ableitung und einem Ableitungsanschluss für Abfalllösungen vorhanden. Die Messkassette
ist mit einer Mischeinrichtung zum Homogenisieren der Probe und
der genannten Lösungen
in der Messkammer und eine gasdurchlässige Dichtung und/oder ein Ventil
und/oder eine Membran zum Druckausgleich im Kassettengehäuse ausgestattet.
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Vorzugsweise
ist das Messkassettengehäuse
aus einem Kunststoff gefertigt.
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Die
Mischeinrichtung kann eine Ballon-Pumpe oder eine oszillierende
Membranpumpe sein. In diesem Fall ist an der Unterseite der Messkassette ein
Führungskanal
zur Führung
des Stößels oder
der Pleuelstange zum Antrieb der Pumpe eingerichtet, wobei der Führungskanal
derart ausgestaltet ist, dass der Stößel oder die Pleuelstange an
der Membran der Pumpe endet.
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Der
in die Kammer der Messkassette einführbare Vorratsbehälter enthält die Reaktionslösung eines
farbreaktiven Markers, vorzugsweise eine Tetramethylbenzidin-Lösung (TMB-Lösung). Vorzugsweise ist die
Kammer zylinderförmig
ausgestaltet, an deren messkammerseitigen Ende ein hohler dornartige
Spitzkegel zentrisch eingerichtet ist. In diese Kammer wir der geschlossene
Vorratsbehälter
eingeführt
und mittels eines zylinderförmigen
Stempels, der anschließend
in die Kammer eingeführt
wird und der mit der Innenwand der Kammer gleitend dicht abschließt, gegen
den hohlen dornartigen Spitzkegel gedrückt. Hierdurch wird der Vorratsbehälter geöffnet und
die Reaktionslösung
freigesetzt. Durch weiteres Drücken
des Stempels in Richtung des dornartigen Spitzkegels wird die Reaktionslösung in
die Messkammer gedrückt.
Dies kann manuell oder automatisch erfolgen.
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Die
Messkassette kann eine Einweg-Kassette sein, wobei nach Konditionierung
und Einlegen des Low-Density Biochips in die Messkammer der Messkassette,
die Messkassette versiegelt wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Messkammer mit dem Low Density Biochip verschlossen. Hierzu
wird der Low Density Biochip mit den funktionalisierten Reaktionsarealen
auf Messkammer wie ein Deckel aufgelegt und der Biochip anschließend fest
und luft- und feuchtigkeitsundurchlässig mit dem Messkassettengehäuse verbunden.
Vorteilhaft ist hieran, dass die Messkassette nur aus einem Formteil
und einem Biochip besteht, und nicht aus zwei Formteilen, die den
Biochip umhüllen.
Dies senkt Kosten in der Herstellung der Formteile und vereinfacht
den Zusammenbau der Messkassette.
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Der
Low Density Biochip kann für
den Nachweis oder Bestimmung von Biomolekülen ausgewählt aus der Gruppe „Mykotoxine,
Eicosanoide, Lungenmarker, Anti-IgE-IgE” hergerichtet sein. Das Prinzip
der Messkassette ist jedoch auf alle Nachweise von Biomolekülen in einem
Assay übertragbar
und soll hier nicht auf die genannten Nachweise begrenzt sein.
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Der
Low Density Biochip kann für
den gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Biomolekülen hergerichtet
sein, wobei die Reaktionsareale eines Low Density Biochips unterschiedlich
funktionalisiert sind. Somit ist es möglich mehrere Biomoleküle einer Probe
mit einem Biochip nachzuweisen, beispielsweise diverse Mycotoxine
enthaltend in einer Getreideprobe.
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Durch
unterschiedliche Konzentrationen der Nachweismoleküle auf den
Spots kann zusätzlich
erreicht werden, dass der Biochip einen extrem weiten Messbereich
abdecken kann. Das ist insbesondere dafür sinnvoll, bei unbekannten
Proben mit sehr niedriger bzw. sehr hoher Konzentration des Analyten eine
Analyse durchführen
zu können,
ohne eine neue Kalibrierkurve aufnehmen zu müssen.
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Vorzugsweise
ist die Messkassette mit einer Speichereinheit und/oder Ausleseeinheit
enthaltend codierte Information, vorzugsweise eine oder mehrere
Informationen ausgewählt
aus der Gruppe „Art
und Konditionierung des Biochips, Nachweisreaktion, Chargennummer,
Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion, gebrauchte Messkassette,
neue Messkassette, Sicherheitscode”, ausgestattet. Die Speicher-
und/oder Ausleseeinheit kann dabei ein Barcode oder ein Speicherchip
sein. Darüber
hinaus sind alle weiteren Systeme zur Abfrage und Überprüfung von
gespeicherten codierten Informationen einsetzbar.
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Vorteilhaft
an der erfinderischen Messkassette ist, dass der eingesetzte Low
Density Biochip geschützt
vor Umwelteinflüssen
oder mechanischen wie chemischen Einflüssen in der Messkassette eingeschlossen
ist. Dies erleichtert die Handhabung der empfindlichen Biochips
in der Anwendung erheblich. Durch die abgeschlossene Atmosphäre in der
Messkassette kann diese auch über
längere
Zeit gelagert werden, ohne dass der Biochip an Funktionalität verliert.
Somit können
Messkassetten auf Vorrat hergestellt werden. Ebenso können die
Reaktionslösung und
Messkassette nach Maßgabe
ihrer notwendigen Lagerbedingungen getrennt voneinander aufbewahrt werden
und müssen
erst kurz vor Gebrauch zusammengesetzt werden. Die Messkassette
ist unter geringen Herstellungskosten einfach herzustellen.
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Ein
Austrocknen des Low Density Biochip vor der Erfassung der Messdaten,
wie es bei den bekannten offenen Biochips auftreten kann, führt zwangsläufig zu
einer Verfälschung
der Messergebnisse. Dies kann bei der erfinderischen Messkassette nicht
auftreten, da sich der Biochip in der Messkassette während und
nach der Nachweisreaktion in seiner eigenen abgeschlossenen und
optimierten Atmosphäre
befindet und aufgrund der Versiegelung der Messkassette nicht austrocknen
kann.
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Zur
Lösung
des der Erfindung zugrunde liegenden Problems schlägt die Erfindung
auch ein Verfahren zur Erzeugung und Auswertung fotometrisch, pixelorientiert
erfassten Messergebnisse einer Farbreaktion eines zu detektierenden
Biomoleküls
in Dateiformaten für
Rastergrafiken vor.
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Das
Verfahren zur Erzeugung und Auswertung fotometrisch, pixelorientiert
erfasster Messergebnisse einer Farbreaktion eines zu detektierenden Biomoleküls in Dateiformaten
für Rastergrafiken weist
nachstehende Verfahrensschritte auf:
- a) Einlegen
der erfinderischen Messkassette in den Aufnahmebereich der. Nachweisreaktionsführungseinheit,
- b) Auslesen der auf der erfinderischen Messkassette gespeicherten
Information,
- c) Auswerten der auf der erfinderischen Messkassette gespeicherten
Informationen nach einem oder mehreren Parametern „Art und
Konditionierung des Biochips, Nachweisreaktion, Chargennummer, Programm
zur Steuerung der Nachweisreaktion, gebrauchte Messkassette, neue
Messkassette, Sicherheitscode”, Übertragung
der Daten in die Auswerteeinheit und Abgleich dieser Parameter mit
in der Auswerteeinheit gespeicherten Informationen,
- d) Laden des auf der erfinderischen Messkassette gespeicherten
Nachweisprogramms in die Auswerteeinheit oder Abrufen eines in der
Auswerteeinheit gespeicherten, dem Low Density Biochip zugeordneten
Nachweis programms,
- e) Zugabe der Probe zur erfinderischen Messkassette, die vorzugsweise
vorher mit einem Tracer gemischt wurde,
- f) Einsaugen der Probe in die Reaktionskammer und Mischen und
Bewegen der Probe in der Reaktionskammer für eine im Programm festgelegte (vorbestimmte)
Reaktionszeit.
- g) Absaugen der Probe
- h) Einmaliges oder mehrmaliges Spülen der Kassette mit einer
Hilfslösung
- i) Absaugen der letzten Hilfslösung
- j) Öffnen
des Vorratsbehälters
mit einer Reaktionslösung
eines farbreaktiven Markers,
- k) Starten des Nachweisprogramms und Steuerung der Nachweisreaktionsführungseinheit
durch die Auswerteinheit nach Maßgabe des Nachweisprogramms,
- l) Reaktionsführung
der Nachweisreaktion in der erfinderischen Messkassette nach Maßgabe des Nachweisprogramms,
- m) fotometrische, pixelorientierte Erfassung der Farbreaktion
einer Reaktionslösung
mit einem zu detektierenden Biomolekül auf dem Low Density Biochip
nach Beendigung der Nachweisreaktion durch die Messeinheit, vorzugsweise
mit einer CCD-Kamera, insbesondere mit einer 12 Bit CCD-Kamera
- n) Übertragung
der fotometrisch, pixelorientiert erfassten Daten an die Auswerteeinheit,
- o) softwaregestützte
Auswertung der fotometrisch, pixelorientiert erfassten Daten einer
Farbreaktion einer Reaktionslösung
mit einem zu detektierenden Biomolekül auf dem Low Density Biochip
in der Auswerteeinheit,
- p) Ausgabe und/oder Anzeige der Messergebnisse.
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Das
Verfahren sieht auch vor, den Verfahrensschritt e) vor den Verfahrensschritt
a) zu legen. Ferner schließt
das Verfahren einen Verfahrensschritt „Einbringen der Reaktionslösung mittels
eines Vorratsbehälters
in die Messkassette” vor
dem Verfahrensschritt f) ein, wenn ein gesonderter Vorratsbehälter verwendet
wird.
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Nachstehend
wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert:
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1:
schematische Darstellung der Messvorrichtung
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2:
Messkassette
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3:
softwaregestützte
Auswertung des Biochips
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Die 1 zeigt
eine Ausführungsvariante der
erfinderischen Messvorrichtung zum automatisierten quantitativen
fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low Density Bereich.
Sie besteht aus einer Auswerteeinheit 13, einer Nachweisreaktionsführungseinheit 1 mit
einem Behälter 2 für eine Hilfslösung und
einem Behälter 3 zur
Aufnahme von Abfalllösungen
sowie Zu- 4 und Ableitungen 5 zu den Behältern und
einer Messeinheit 6 mit einem Mittel 7 zur fotometrischen,
pixelorientierten Erfassung einer Farbreaktion einer Reaktionslösung mit
einem zu detektierenden Biomolekül.
Die Messeinheit 6 ist mit einem Einschub 8 zum
Einführen
und Aufnehmen der Messkassette 9 und einer bodenseitig
eingerichteten Beleuchtung 10 zur Durchlichtbeleuchtung
der Messkassette nach dem Einführen
in die Messeinheit 6 ausgestattet. Sowohl die Nachweisreaktionsführungseinheit 1 als
auch die Messeinheit 6 sind über Datenübertragungskabel 11, 12 mit
einer computergestützten
Auswerteeinheit 13 zur Auswertung der Messergebnisse verbunden.
Die 1. zeigt eine Ausführungsvariante mit Stand-Alone-Vorrichtungen. Es
können
jedoch auch alle Komponenten in einem Gehäuse eingerichtet sein.
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Die
Messkassette 9 enthält
einen Low Density Biochip 14 mit einem mit funktionalisierten
Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger, wobei
die Messkassette über
eine Einführöffnung 15 für die zu
analysierende Probe 16 verfügt.
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Die
Nachweisreaktionsführungseinheit 1 hat mehrere
Aufnahmebereiche 17a, 17b, 17c zur passgenauen
Aufnahme einer Messkassette 9 (1 zeigt
nur eine Messkassette). In diese werden die funktionalisierten Messkassetten
eingeschoben. Anschließend
wird durch die Probenöffnung 15 die
Probe 16 in die Messkassette 9 injiziert. Dieser
Vorgang kann aber auch vor dem Einlegen der Messkassette 9 in
die Nachweisreaktionsführungseinheit 1 vorgenommen
werden. Die Messkassette 9 verfügt über Anschlüsse 18 für die Zu-
und Ableitungen der Behälter
für Hilfslösungen,
die nach dem Einlegen der Messkassette mit den im Aufnahmebereich
eingerichteten korrespondierenden Anschlüssen dicht abschließen. Nach
dem Einlegen der Messkassette 9 in die Nachweisreaktionsführungseinheit 1 wird
von der Auswerteeinheit 13 ein Nachweisreaktionsprogramm gestartet,
welches programmgesteuert die Nachweisreaktion in der Nachweisreaktionsführungseinheit 1 durchführt, wobei
das Beladen und Spülen
der Messkassette mit Reaktions- und Hilfslösungen prozessorgesteuert und
vollautomatisch erfolgt.
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Nach
Beendigung der Nachweisreaktion wird die Messkassette 9 in
die Messeinheit 6 eingelegt. Die Messkassette wird während der
fotographischen Aufnahme von unten im Durchlichtverfahren beleuchtet.
Hierzu ist in der Messeinheit bodenseitig eine Lampe eingerichtet.
Mittels der CCD-Kamera 7 wird die Farbintensität der einzelnen
Reaktionsareale des Biochips 14 in der Draufsicht fotografiert.
Gleichzeitig werden Nullpunktswerte jedes einzelnen Reaktionsareals
aufgenommen, die zur Grundlage der Berechnung jedes Farbwertes jedes
einzelnen Reaktionsareals zu Grunde gelegt werden. Die Steuerung und
das Auslösen
der CCD-Kamera erfolgt über
die Auswerteeinheit 13.
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Das
von der CCD-Kamera erstellte digitale Bild sowie die ermittelten
Nullpunktswerte der einzelnen Reaktionsareale werden über das
Datenverbindungskabel 12 an die Auswerteeinheit 13,
hier ein PC, übermittelt,
in welcher softwaregestützt
die Auswertung der Nachweisreaktion erfolgt. In einer besonderen
Ausführungsform
können
Reaktionsareale mittels der Auswertesoftware oder manuell ausgewählt bestimmten
Farbintensitätswerten
zugeordnet werden. Die berechneten Messergebnisse werden am Bildschirm
der Auswerteeinheit 13 angezeigt.
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Die 2 zeigt
eine erfinderische Messkassette zur einmaligen Verwendung in der
erfinderischen Messvorrichtung. Diese weist ein lichtdurchlässiges Kassettengehäuse 19 und
eine Messkammer 20, in der ein Low Density Biochip 14 mit
einem mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder
Kunststoffträger
eingesetzt ist, auf.
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Hinter
der Messkammer 20 ist eine Überlaufkammer 21 eingerichtet
zur Aufnahme von überschüssiger Proben-,
Reaktions- oder
Hilfslösungen. In
die Messkammer 20 ist die Probe 16 über eine Probenzufuhr 22 mit
Probenfilter 23 und einer Probenleitung 24 zur
Messkammer 20 einführbar.
Die Probeneingabe kann manuell oder prozessgesteuert, beispielsweise über einen
Probensampler, erfolgen. In die Kammer 25 ist ein Vorratsbehälter 26 mit
einer Reaktionslösung
eines farbreaktiven Markers eingesetzt. Der Vorratsbehälter 26 mit
einer Reaktionslösung
eines farbreaktiven Markers wird mit einem Aktivierungsstempel 27 in
die Kammer hineingedrückt und
durch Pressen auf beispielsweise einen hohlen spitzen Dorn, der
am der Öffnung
der Kammer 25 gegenüberliegenden
Ende der Kammer 25 eingerichtet ist, geöffnet. Durch weiteres Herunterdrücken des Aktivierungsstempels 27 wird
die Reaktionslösung des
farbreaktiven Markers aus dem Vorratsbehälter 26 in die Messkammer 20 gedrückt. Dies
kann manuell oder automatisch erfolgen. Die Messkassette 9 weist
einen Zuleitungsanschluss 28 und eine Zuleitung für eine erste
Hilfslösung
sowie eine Ableitung und einem Ableitungsanschluss 29 für Abfalllösungen auf.
Vor der Messkammer 20 ist eine Mischeinrichtung 30 zum
Homogenisieren der Probe und der genannten Lösungen in der Messkammer eingerichtet.
Zum Druckausgleich in der Messkassette verfügt diese über eine gasdurchlässige Dichtung 31.
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Die 3 zeigt
das digitale Bild 32 des Low Density Biochips, welches
durch die CCD-Kamera 7 aufgenommen wurde. Das Bild wird
auf dem Bildschirm der Auswerteeinheit 13 angezeigt. Darunter sind
die über
die Auswertesoftware berechnete Farbwerte mit entsprechender Zuordnung 33 einer
Konzentration eines detektierten Biomolekül angezeigt. Mittelwerte der
ermittelten Nullpunktswerte sind in die Ausgabewerte eingerechnet.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Nachweisreaktionsführungseinheit
- 2
- Behälter für Hilfslösung
- 3
- Behälter zur
Aufnahme von Abfalllösungen
- 4
- Zuleitung
- 5
- Ableitung
- 6
- Messeinheit
- 7
- CCD-Kamera
- 8
- Einschub/Aufnahmebereich
für Messkassette
- 9
- Messkassette
- 10
- Beleuchtung
- 11
- Datenübertragungskabel
- 12
- Datenübertragungskabel
- 13
- Auswerteeinheit
- 14
- Low
Density Biochip
- 15
- Einführungsöffnung für die Probe
- 16
- Probe
- 17
abc
- Aufnahmebereiche
für Messkassetten
- 18
- Anschlüsse
- 19
- lichtdurchlässiges Messkassettengehäuse
- 20
- Messkammer
- 21
- Überlaufkammer
- 22
- Probenzufuhr
- 23
- Probenfilter
- 24
- Probenleitung
- 25
- Kammer
für Vorratsbehälter
- 26
- Vorratsbehälter
- 27
- Aktivierungsstempel
- 28
- Zuleitungsanschluss
- 29
- Ableitungsanschluss
- 30
- Mischeinrichtung
- 31
- gasdurchlässige Dichtung
- 32
- digitales
Bild des Low Density Biochips
- 33
- Messergebnisse
