KR101731613B1 - 켈빈 푸르브 현미경을 이용한 금 또는 실리콘 기판에 의한 dna-나노입자 복합체 기반의 고감도 유전자 변이 검지방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 켈빈 푸르브 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용한 금 또는 실리콘 기판에 의한 DNA-나노입자 복합체 기반의 고감도 유전자 변이 검지방법에 관한 것으로서, 유전자 변이 검지를 위해 켈빈 프루브 현미경을 이용한 표면 전위 측정의 최적화를 위하여 나노입자와 기판의 종류를 한정한 것으로 탐침 DNA를 금(Au) 나노입자에 고정화 시킨 후 표적 DNA와 혼성화(hybridization)시킨 합성물을 금(Au) 또는 실리콘(Si) 기판 위에 뿌리고 켈빈 프루브 현미경으로 측정된 표면 전위face potential)로 유전자의 변이 여부를 1개의 염기 변이 수준에서 식별하는 방법에 관한 것이다.

Description

켈빈 푸르브 현미경을 이용한 금 또는 실리콘 기판에 의한 DNA-나노입자 복합체 기반의 고감도 유전자 변이 검지방법{Detection of Gene Mutation by nanoparticle-DNA corona complex and Au or Si substrate via Kelvin Probe Force Microscopy}
본 발명은 켈빈 푸르브 현미경을 이용한 금 또는 실리콘 기판에 의한 나노입자 기반의 고감도 유전자 변이 검지방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 금(Au) 나노입자에 탐침(probe)으로서 DNA(deoxyrebonucleic acid) 단일가닥을 고정화시키는 단계; 표적 DNA 단일가닥을 처리하여 탐침 DNA 단일가닥과 표적 DNA 단일가닥의 결합을 유도하는 혼성화 단계; 혼성화 단계를 거쳐 이중가닥이 고정화되어 있는 나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)를 실리콘(Si) 또는 금(Au) 기판에 30분 내지 60분 간 반응시키는 단계; 및 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여 표면 전위(surface potential)를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 측정된 표면 전위(surface potential)를 동일한 방식으로 측정한 정상 DNA 또는 상기 측정한 표적 DNA와 상이한 수의 염기 변이를 갖는 표적 DNA에 대한 표면 전위(surface potential)와 비교하여, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법에 관한 것이다.
유전체 검지는 친자확인 검사, 유전자 발현 개요, 약물 스크리닝 및 질병 예측 분야에 있어서 가장 주목 받는 부분이다. 특히, 우리나라의 경우 급격한 고령화 사회로 진행됨에 따라 건강에 관한 관심이 점차 높아지고 있는 추세이다. 실제로 건강관리 및 검진을 위한 병원 이용자 수는 매년 기하급수적으로 증가하고 있다. 따라서 단순한 생명연장이 아닌 삶의 질의 향상을 위한 질병예측에 있어서 DNA 특정 서열 검출은 정밀진단을 위해 반드시 필요한 기술로 요구되어지고 있다.
종래의 나노입자를 이용한 검지방법은 스캐노메트릭(scanometric), 비색적(colorimetric), 및 표면 증강 라만 분광학(sufac-inhanced Raman spectroscopy)과 같은 광학방식으로 화학 잔기에 의해 만들어지는 노이즈 신호(noise signal)와 용액 내의 나노입자 수가 상이하여 시료의 부피를 줄이고, 점 돌연변이를 정량화하는데 적합하지 않아 유전자 변이 검지에 있어 그 사용이 제한적이다.
하나의 염기서열 변이까지 검출 가능한 DNA 분석을 위한 기존의 방법들은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 바탕으로 하는 방법(Mun HY, et al. 2009. Gold Nanoparticle-Based Label-Free Detection of BRCA1 Mutations Utilizing DNA Ligation on DNA Microarray, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, Vol.9, 1019 - 1024)으로 형광표지를 하지 않는다고 하더라도 중합효소 연쇄반응이 선행되어야 하고, 점 돌연변이를 검출하기 위한 결찰연쇄반응(ligation chain reaction, LCR) 등 여러 과정이 필요할 뿐만 아니라 각 반응에서 온도조절이 필요하다는 점에서 번거롭고 오랜 시간이 소요되어 비효율적이다.
따라서 최근 간편한 방법으로 각광받고 있는 기술은 DNA의 상보적 결합을 전기적, 또는 전기화학적인 방법으로 검출하려는 것이다. 미국특허 제2006-0089825호는 생체분자의 상호작용을 알아내기 위해 핵산, 폴리펩타이드(polypeptide), 작은 분자 또는 항체항원 결합 등을 탐침(Probe)과 대상(Target)으로 하여 스캐닝 켈빈 마이크로 프로브 기술을 적용해 분자 간 상호결합에 따른 표면 지형학을 나타내는 접촉전위차 이미지와 접촉전위차 측정치의 변화를 통해 생체 분자의 상호작용을 검출하는 방법에 관한 발명으로 간단한 과정을 통해 빠른 시간 내에 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 하지만 탐침과 대상 사이의 상호작용에 따른 결합 유무 정도를 파악할 수 있을 뿐 결합친화도 까지는 파악할 수 없기 때문에 세밀한 DNA변이 분석은 불가능하다.
고감도의 생체분자 간의 결합을 전기적으로 검출하기 위해 켈빈 프루브 현미경을 이용한 기술을 제시해 주는 연구로 나노탐침을 사용해 10 nm 미만의 분해능, 50 nM의 민감도와 1,100 um/s 속도의 성능으로 3개의 염기서열 부정합까지 분석할 수 있는 방법이 있다.(Sinensky, & Belcher, Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy, Nature Nanotechnology 2, 653 - 659) 하지만 이 기술 역시 하나의 염기서열 변이까지는 파악할 수 없다는 점에서 완벽한 DNA변이 검출 방법이라 할 수 없다.
현재까지 많은 연구진들에 의해 개발된 DNA 분석방법들은 중합효소 연쇄반응을 바탕으로 한 표지 방법으로 그 과정이 매우 복잡하고 재현성이 낮아 효율성이 떨어진다. 또한 효율성을 높이기 위한 DNA의 상보적 결합을 전기적, 또는 전기화학적인 방법으로 검출하려는 방법은 간단한 준비과정으로 신속하게 결과를 얻을 수 있는 반면 정확도가 다소 떨어지는 문제점을 갖고 있다. 따라서 상기의 문제점들을 모두 극복한 간편한 방법으로 신속하게 하나의 염기서열 변이까지 확인할 수 있는 보다 정밀한 DNA 검출 방법이 요구되어진다.
미국공개특허 제2006-0089825호
Mun, H. Y. & Park H. G. (2009). Gold Nanoparticle-Based Label-Free Detection of BRCA1 Mutations Utilizing DNA Ligation on DNA Microarray, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, Vol.9, 1019 - 1024. Sinensky, A. K. & Belcher, A. M. (2007). Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy, Nature Nanotechnology 2, 653 - 659.
본 발명의 목적은 유전자 돌연변이 검지를 위한 DNA가 고정화되어 있는 금 나노입자(nanoparticle-DNA corona complex)에 대한 켈빈 프루브 현미경(Kelvin probe force microscopy, KPFM) 이미징(imaging)의 최적조건을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 금(Au), 실리콘(Si), 이산화규소(SiO2) 및 철(Fe) 이상 4 종류의 기판에 대한 비교실험을 통하여 금(Au) 기판 이용 시 표면 전위에 대한 분포의 오차 범위가 가장 좁고, 실리콘(Si) 기판을 이용 시 단일 염기 변이(mismatch)에 대한 표면 전위 변화 차이가 가장 뚜렷하다는 것을 확인함으로써 켈빈 푸르브 현미경을 이용한 금 또는 실리콘 기판에 의한 금 나노입자 기반의 고감도 유전자 변이 검지방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 변이 검지방법은 유전자 변이 검지를 위해 켈빈 프루브 현미경(Kelvin probe force microscopy, KPFM)을 이용한 표면 전위 측정의 최적화를 위하여 나노입자와 기판의 종류를 한정한 것으로 금 기판을 사용하여 KPFM으로 이미징(imaging)하면 DNA가 고정화되어 있는 금 나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)들이 기판에 균일하게 결합되어 표면 전위 분포가 좁고 균일하게 나타나 정확한 정량적인 수치 측정이 가능해지고, 실리콘 기판을 사용하여 KPFM으로 이미징(imaging)하면 많은 수의 금 나노입자 복합체가 기판에 잘 흡착되어 한 번의 이미징으로 많은 수의 금 나노입자 복합체가 측정되어 하나의 염기 변이 차이가 있는 금 나노입자 복합체 간 표면 전위 변화를 가장 크게 나타내어 표적 DNA 상의 하나의 염기 수준의 변이도 쉽게 구별 가능해져 KPFM을 이용한 DNA 검지를 위한 최적화된 조건으로 점 돌연변이에 의한 미세한 표면 전위의 변화를 명확하게 초고감도로 검지하는 방법이다.
도 1은 본 발명의 나노입자 기반의 켈빈 프루브 현미경을 이용한 유전자 변이 검지방법의 모식도(a) 및 4 종류 기판의 광학 이미지(b: 금(Au) 기판, c: 실리콘(Si) 기판, d: 이산화 규소(SiO2) 기판, e: 철(Fe) 기판)이다.
도 2는 기판 종류에 따른 탐침 DNA와 상보적으로 결합하는 표적 cDNA에 대한 금 나노입자 복합체(DNA Capped Nanoparticle, DCNP)(이하, P-C DCNP)의 위상 및 표면 전위의 3차원 이미지 (a, b: 금(Au) 기판, c, d: 실리콘(Si) 기판, e, f: 이산화 규소(SiO2) 기판, g, h: 철(Fe) 기판) 및 위상 높이 및 표면 전위에 대한 통계적 분석을 나타낸 그래프(i, j)이다.
도 3은 기판 종류에 따른 P-C DCNP 및 1개의 염기 변이가 있는 표적 m1DNA가 탐침 DNA와 혼성화되어 있는 DCNP(이하, P-M1 DCNP)의 표면 전위를 가우시안 분포(Gaussian distribution)로 나타낸 그래프(a: 금(Au) 기판, b: 실리콘(Si) 기판, c: 이산화 규소(SiO2) 기판, d: 철(Fe) 기판) 및 기판 종류에 따른 P-C DCNP와 P-M1 DCNP 간 표면 전위의 차이를 나타낸 그래프(e)이다.
본 발명은 (a) 금(Au) 나노입자에 탐침(probe)으로서 DNA(deoxyrebonucleic acid) 단일가닥을 고정화시키는 단계; (b) 표적 DNA 단일가닥을 처리하여 탐침 DNA 단일가닥과 표적 DNA 단일가닥의 결합을 유도하는 혼성화 단계; (c) 혼성화 단계를 거쳐 이중가닥이 고정화되어 있는 나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex)를 실리콘(Si) 또는 금(Au) 기판에 30분 내지 60분 간 반응시키는 단계; 및 (d) 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여 표면 전위(surface potential)를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 측정된 표면 전위(surface potential)를 동일한 방식으로 측정한 정상 DNA 또는 상기 측정한 표적 DNA와 상이한 수의 염기 변이를 갖는 표적 DNA에 대한 표면 전위(surface potential)와 비교하여, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 탐침 DNA 단일가닥은 정상 DNA 단일가닥과 상보적으로 결합하는 단일가닥이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 금(Au) 나노입자는 90 내지 100 ㎚ 이하인 것일 수 있으며, 금 나노입자의 크기가 100 nm를 초과하는 경우 나노입자 특성이 소멸되어 생리활성물질이 결합된 입자를 제조하는 것이 불가능해질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(a)에서, 금속 나노입자에 고정화되는 탐침 DNA 단일가닥은 티올(thiol)기 개질된 탐침 DNA일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 금 나노입자에 고정화된 탐침 DNA 단일가닥을 금 또는 실리콘 기판 상에 적가하여 탐침 DNA 단일가닥이 금 또는 실리콘 기판 표면과 정전기 결합(electrostatic interaction)에 의해 흡수되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(c)에서, 기판은 금(Au) 기판이고, 여기에서, 금(Au) 기판을 이용해 측정하는 경우 표면 전위에 대한 분포의 오차 범위가 가장 좁은 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(c)에서, 금(Au) 기판을 이용해 측정하는 경우 측정된 표면 전위 변화의 범위가 -0.15 내지 -0.25 V인 경우 싱글 포인트 미스매치(single point mismatch)로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(c)에서, 기판은 실리콘(Si) 기판이고, 여기에서, 금(Au), 이산화규소(SiO2) 및 철(Fe) 기판을 이용할 때 보다 실리콘(Si) 기판을 이용해 측정하는 경우 단일 염기 변이(mismatch)에 대한 표면 전위 변화 차이가 더 크게 나타나는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계(c)에서, 실리콘(Si) 기판을 이용해 측정하는 경우 측정된 표면 전위 변화의 범위가 -0.3 내지 -0.4 V인 경우 싱글 포인트 미스매치(single point mismatch)로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 표적 DNA 단일가닥의 싱글 포인트(single point) 이상의 미스매치(mismatch)된 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 미스매치(mismatch)된 염기서열의 수가 많을수록 표면 전위(surface potential)는 감소하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 10 × 10 ㎛²의 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM) 이미지만으로 2,200개 이상의 DNA가 고정화되어 있는 각각의 나노입자 수십 개가 동일조건에서 한 번에 측정되므로 100 ㎕이하의 미량의 DNA 시료로 높은 신뢰수준의 통계적 분석을 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 통계적 분석은 가우스 분포(Gaussian distribution) 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 DNA의 미스매치(mismatch)란 유전자 상의 염기 변이 또는 부정합을 의미하고 싱글 미스매치(single mismatch)란 유전자 상의 단일 염기 변이를 의미한다.
본 발명은 또한 일 양태에서, DNA 대신 RNA, 단백질, 또는 탄수화물과 같은 생체분자 간의 결합을 초고감도로 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상설한 유전자 변이 유무를 검출하는 방법으로 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출함으로써, 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 자궁내막체암, 난소암, 위암, 식도암, 간암, 췌장암, 폐암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 골암, 결합조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨 질환, 림프종 및 다발성 골수종혈액암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출함으로써 암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있는 암은 유방암일 수 있다.
본 발명에 있어서 DNA-나노입자 복합체(nanoparticle-DNA corona complex 또는 DNA Capped Nanoparticle, DCNP), DNA 코로나(corona) 란 DNA 단일가닥 또는 이중가닥이 결합되어 있는 나노입자를 의미한다.
이하, 본 발명에 따르는 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실험예 등에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예]
1. 실험 방법
100 ㎚ 금(Au) 나노입자(Sigma Aldrich)에 티올기(thiol group,-HS)를 이용하여 탐침 DNA를 고정시키고 표적 DNA(완벽하게 상보적으로 결합하는 정상 표적 DNA(이하, cDNA) 또는 단일염기 변이가 있는 표적 DNA(이하, m1DNA))를 상보적으로 혼성화 시켜 DNA 이중가닥이 고정화되어 있는 금 나노입자(DNA Capped Nanoparticle, DCNP)를 준비하였다.
상기 티올기를 이용한 탐침 DNA는 BRCA1 유전자 염기서열을 갖는 (5’-HS-CTA CCT TTT TTT TCT G-3’)을 사용하였으며, 그에 대한 표적 DNA의 경우 완전한 상보적 결합을 하는 cDNA는 (5’-CAG-AAA-AAA-AAG-GTA-G-3’)의 염기서열 그리고 단일염기 변이가 있는 m1DNA는 (5’-CAG-AAA-A T A-AAG-GTA-G-3’)의 염기서열을 사용하였다.
실리콘(Si) 기판 및 이산화 규소(SiO2) 기판은 Silicon Technology (Tokyo, Japan)에서 구입하였고, 금(Au) 기판은 구입한 이산화 규소(SiO2) 기판에 50 Å 크롬(Cr)과 200 Å 금(Au)을, 철(Fe) 기판은 50 Å 크롬(Cr)과 70 Å 철(Fe)을 각각 열증착(thermal evaporation)하여 제조하여 10 × 10 mm²잘라 준비하였다.
준비한 4 종류(금, 실리콘, 이산화 규소, 철)의 기판을 피라나 (piranha) 용액(H2SO4 : H2O2 = 1 : 1 (v/v))으로 10분 동안 실온에서 세척한 다음 각각 상기에서 준비한 DCNP를 1 시간 동안 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. DNA-나노입자들의 붕침을 방기하기 위하여 세척한 기판을 질소 에어건(nitrogen gun)을 이용해 부드럽게 건조시킨 다음 KPFM 리프트 모드(lift mode)에서 시판 원자힘현미경((Multimode V, Veeco, CA, USA, Atomic force microscopy, AFM)으로 위상(topology)과 표면 전위(surface potential)를 측정하였다. 이 때 SCM-PIT 실행 팁(tip)(Bruker, CA, USA)은 팁 전압(voltage)를 조절할 수 있는 MMEFCH 팁(tip) 홀더(holder)(Veeco)에 장착되어져 있었으며, KPFM의 조건은 실행 환경, 스캔 기간(scan phase), 스캔 높이(scan height), 및 스캔 속도(sacn rate)에 있어서 모두 동일한 조건이었다.
2. 실험 결과
1) 기판 종류에 따른 표적 cDNA에 대한 DCNP(이하, P-C DCNP)의 위상 및 표면 전위의 3차원(3D) 이미지 및 통계적 분석 결과
KPFM을 이용해 측정한 P-C DCNP의 높이는 금 기판에서 102.7 ± 4.7 nm, p-type 실리콘 기판에서 102.2 ± 4.4 nm, 이산화 규소 기판에서 103.1 ± 4.8 nm, 철 기판에서 104.5 ± 5.5 nm 로 측정되어 기판의 종류에 따른 높이 변화는 거의 없다는 것을 확인하였다(도 2).
반면, P-C DCNP의 표면 전위는 금 기판에서 -1.4 ± 0.2 V, p-type 실리콘 기판에서 -1.5 ± 0.1 V, 이산화 규소 기판에서, -1.2 ± 0.1 V, 철 기판에서 -1.3 ± 0.1 V 로 측정되었다. 따라서 기판의 종류에 따른 표면 전위 변화가 나타나므로 P-C DCNP가 기판에 영향을 받으며, P-C DCNP는 각 기판과 서로 다른 상호작용을 한다는 것을 확인하였다(도 2).
기판의 종류에 따른 표면 전위 변화는 두 물질(즉, 여기서는 기판과 DNA 분자) 간 의 상대적 전하(charge)를 측정하는 KPFM의 원리에 기인하는 것이며, 표면 전위가 음 전하 값으로 나타나는 이유는 DNA의 인산(phospate) 부분에 기인한 것이다. 즉 동일한 DCNP가 기판에 흡착된다고 하더라도 기판의 종류가 상이하면 KPFM에 의해 측정되는 DCNP의 표면 전위는 상이해진다.
2) 기판 종류에 따른 P-C DCNP 및 표적 m1DNA에 대한 DCNP(이하, P-M1 DCNP)의 표면 전위 가우스 분포
완벽한 상보적인 결합을 이루는 표적 cDNA에 비하여 1개의 염기 변이가 있는 표적 m1DNA는 탐침 DNA 대한 결합 친화도가 떨어지기 때문에 P-C DCNP의 표면 전위에 비해 P-M1 DCNP의 표면 전위는 감소할 것이라는 것을 예측을 할 수 있다.
실제 측정 결과, P-C DCNP와 동일한 조건과 방식으로 KPFM을 이용해 측정한 P-M1 DCNP의 표면 전위는 금 기판에서 -1.3 ± 0.4 V, p-type 실리콘 기판에서 -1.1 ± 0.1 V, 이산화 규소 기판에서 -1.1 ± 0.2 V, 철 기판에서 -1.2 ± 0.1 V 로 측정되었다. 따라서 예측한 바와 같이 P-M1 DCNP의 표면 전위는 전체적으로 P-C DCNP의 표면 전위보다 감소했다는 것을 확인하였다(표 1).
Figure 112015019700513-pat00001
측정된 표면 전위 데이터를 이용해 기판의 종류에 따른 표면 전위에 대한 가우스 분포 및 P-C DCNP와 P-M1 DCNP 간 표면 전위의 차이를 확인하였다(도 3).
그 결과, 금 기판에서의 DCNP에 대한 표면 전위 분포가 가장 좁은 분포를 나타내고 이는 오차 범위가 좁다는 의미이므로 금 기판 사용에 의해 다른 종류의 기판을 사용할 때에 비하여 가장 정확한 정량적 분석이 가능하다는 것을 확인하였다. 또한 P-C DCNP와 P-M1 DCNP 간 표면 전위의 차이는 실리콘 기판 사용 시 -0.41 V, 금 기판 사용 시 -0.25 V, 이산화 규소 기판 사용 시 -0.14 V, 철 기판 사용 시 -0.09 V으로 나타났다. 따라서 단일 염기서열 변이에 의한 표면 전위 변화 차이는 실리콘 기판 사용에 의해 가장 크게 나타나 다른 종류의 기판을 사용할 때에 비하여 명확한 차이로 용이한 검지가 가능하다는 것을 확인하였다(도 3).
3. 실험 결론
상보적으로 결합하는 표적 DNA(cDNA)와 단일 염기 변이가 있는 표적 DNA(m1DNA)를 각각 BRCA1 유전자 서열을 갖는 탐침 DNA와 혼성화 시켜 DNA 이중가닥이 고정화되어 있는 금 나노입자(DNA Capped Nanoparticle, DCNP)인 P-C DCNP와 P-M1 DCNP를 대상으로 기판의 종류를 제외한 동일한 실험조건에서 켈빈 프루브 현미경을 이용해 위상과 표면 전위를 한번에 측정하여 비교실험을 실시하였다.
그 결과, 실리콘 기판과 금 기판이 이산화 규소 기판 및 철 기판에 비하여 DCNP의 표면 전위 측정에 있어서 가장 적합하다는 것을 확인할 수 있었다. 이산화 규소 기판과 철 기판을 사용하여 KPFM을 이용해 이미징하면 기판 위에 흡착되어 있는 DCNP들이 뭉쳐져 있어 표면 전위 검출에 어려움이 있을 뿐만 아니라 DCNP들이 잘 흡착되지 않아 하나의 이미지에 많은 수의 DCNP가 이미징되지 않기 때문에 표면 전위 검출에 시간이 오래 걸리게 된다. 그러나 금 기판을 사용하여 KPFM으로 이미징하면 DCNP들이 기판에 균일하게 결합되어 표면 전위 분포가 좁고 균일하게 나타나 정확한 정량적인 수치 측정이 가능하다는 것을 확인하였다. 또한 실리콘 기판을 사용하여 KPFM으로 이미징하면 많은 수의 DCNP가 기판에 잘 흡착되어 한 번의 이미징으로 많은 수의 DCNP가 측정되어 P-C DCNP와 P-M1 DCNP 간 표면 전위 변화를 가장 크게 나타내어 표적 DNA 상의 하나의 염기 수준의 변이도 쉽게 구별 가능하다는 것을 확인하였다.

Claims (13)

  1. (a) 금(Au) 나노입자에 탐침(probe)으로서 DNA(deoxyrebonucleic acid) 단일가닥을 고정화시키는 단계;
    (b) 표적 DNA 단일가닥을 처리하여 단계 (a)의 금 나노입자에 고정화된 탐침 DNA 단일가닥과 표적 DNA 단일가닥의 결합을 유도하는 혼성화 단계;
    (c) 혼성화 단계를 거쳐 이중가닥이 고정화되어 있는 금 나노입자를 실리콘(Si) 또는 금(Au) 기판에 30분 내지 60분 간 반응시키는 단계; 및
    (d) 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscope, KPFM)을 이용하여 표면 전위(surface potential)를 측정하는 단계;
    (e) 대조군으로 상기 단계 (b)의 표적 DNA 단일가닥과 상이한 수의 염기 변이를 갖는 DNA를 표적 DNA로 하여, 상기 단계 (a) 내지 (d)와 동일한 단계로 대조군 표적 DNA의 표면전위를 측정한 후, 상기 단계 (d)의 표면전위와 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 단계 (d)의 표면전위가 상기 단계 (e)의 대조군의 표면전위보다 감소할 경우, 단계 (b)의 표적 DNA가 단계 (e)의 표적 DNA보다 미스매치된 염기서열 수가 많은 것으로 판정하는 단계를 포함하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 상기 금(Au) 나노입자는 90 내지 100 ㎚ 이하인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이를 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계(a)에서, 금 나노입자에 고정화되는 탐침 DNA 단일가닥은 티올(thiol)기 개질된 탐침 DNA인 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 금(Au) 기판을 이용해 측정하는 경우, 실리콘, 이산화규소 및 철로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 기판으로 이용해 측정하는 경우와 비교하여 표면 전위에 대한 분포의 오차가 가장 좁은 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계(c)에서, 실리콘 또는 금 기판을 이용할 때, 이산화규소(SiO2) 및 철(Fe) 기판을 이용할 때 보다 실리콘(Si) 기판 또는 금 기판을 이용해 측정하는 경우 단일 염기 변이(mismatch)에 대한 표면 전위 변화 차이가 더 크게 나타나는 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (f)의 검출하는 방법은 표적 DNA 단일가닥의 싱글 포인트(single point) 이상의 미스매치(mismatch)된 서열을 검출하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA상 유전자 변이 유무를 검출하는 방법.

  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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