JP2004156985A - 多孔性担体に固定化された免疫学的活性物質の安定化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】多孔性担体に固定化された免疫学的活性物質の安定化方法において、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液とともに乾燥することを特徴とする、免疫学的活性物質の安定化方法、および、該方法により作製された、少なくとも1種類以上の単糖類を含む、安定化された免疫学的活性物質を固定化した多孔性担体。
Description
【発明の属する技術分野】本発明は、多孔性担体を固相とする免疫測定法において、多孔性担体に固定化した免疫活性物質の保存安定性を向上させる方法に関する。
【0002】
【従来の技術】近年、抗原もしくは抗体を多孔性担体に固定化した免疫学的測定用反応容器を使用した測定法が広く行われている。この測定法は、検体もしくは試薬を順次免疫学的測定用反応容器に滴下するだけで測定できることから、測定操作が簡便であること、測定時間が短いこと、検体廃液が出ないことなどの利点がある。
多孔性担体としては、無機化合物やガラス、ポリスチレン、ポリプロピレンポリエチレン、多糖類などからなる繊維やニトロセルロ−ス、ナイロンなどの多孔性膜などが使用されている。これらの多孔性担体に抗原や抗体などの免疫活性物質を固定化する方法は共有結合、あるいは物理吸着などの一般に公知である技術によって可能である。そして免疫活性物質を多孔性担体に固定化した後は、一般的には動物血清、ウシ血清アルブミン(BSA)、ウシγグロブリン、カゼイン、カゼイン分解物、ゼラチンなどのタンパクを固定化し、十分に乾燥する。こうして調製された多孔性担体は包装袋に乾燥剤と一緒に密封して保存される。このように低湿度条件化(相対湿度30%以下)で保存された場合、多孔性担体に固定化された免疫活性物質は冷蔵(4〜10℃)で1〜2年の長期間にわたり安定である。
【0003】
しかしながら、一旦包装袋から取り出し室温下(気温20〜30℃、相対湿度50〜70%)で放置した場合、多孔性担体に固定化された免疫活性物質は数日で活性が低下する。この傾向は放置される相対湿度条件が高くなるにつれより顕著に現れる。このように免疫活性物質を固定化した多孔性担体は湿度の影響を受けることから、その取扱には注意が必要である。一般的には多孔性担体が組み込まれた免疫学的測定用反応容器は、用手法で測定されることが多い。その際、これらの反応容器は測定直前に包装袋から取り出して使用することが原則であり、開封後はできるだけ速やかに測定に使用しなければならない。
【0004】
一方で、多孔性担体が組み込まれた免疫学的測定用反応容器を自動分析機器で測定する方法も実施されている。なぜなら、多孔性担体が組み込まれた免疫学的測定用反応容器を利用すれば、B/F分離や洗浄などの測定操作が簡便であり、また検体廃液が出ないので自動分析機の機構を単純化でき、小型化、低コスト化が可能である。また測定時間が短いことから小型化、低コスト化を図りながらも、同時に大量処理化が可能となる。
【0005】
これらの理由から、多孔性担体が組み込まれた免疫学的測定用反応容器を専用の自動分析機で測定することは、省力化、大量処理化による測定コストの低減という意味において大きなメリットが考えられるが、その際問題となってくるのが前述した、多孔性担体に固定化された免疫活性物質の開封後の湿度による失活の問題である。多孔性担体が組み込まれた免疫学的測定用反応容器は、あらかじめ開封して自動分析機にセットしておく必要があるが、長時間放置すれば室内の湿度の影響により失活を引き起こす。そして失活を引き起こした免疫学的測定用反応容器は目視での判別は全く不可能である。よって、ある程度放置時間が経過した場合、測定の信頼性を確保するためには測定に使われてない免疫学的測定用反応容器でも廃棄することとなる。
【0006】
湿度の影響を回避する1つの方法としては、自動分析機に恒温恒湿インキュベーターを付加し、免疫学的測定用反応容器をそこに格納する方法が考えられるが、この方法では機械の小型化、低コスト化のメリットを十分に生かすことができなくなる。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような問題点を解決するため種々の検討をした結果得られたものであり、その目的は、多孔性担体に固定化された免疫活性物質の湿度による失活を抑え、室温放置化での保存安定性を向上させることである。また、この安定化方法により製造された免疫学的測定用反応容器を提供することである。
【0008】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため検討した結果、免疫活性物質を固定化した多孔性担体を、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液とともに乾燥することで、多孔性担体に固定化した免疫活性物質の湿度による失活を抑え、室温放置下での保存安定性を向上させることができた。
【0009】
すなわち、本発明は以下のようなものである。
項1.多孔性担体に固定化された免疫学的活性物質の安定化方法において、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液とともに乾燥することを特徴とする、免疫学的活性物質の安定化方法。
項2.多孔性担体がガラス繊維である項1記載の方法。
項3.単糖類がグルコースである項1の方法。
項4.単糖類を含む溶液中の単糖類の濃度が5%〜50%である項1の方法。
項5.項1〜4のいずれかに記載の方法により作製された、少なくとも1種類以上の単糖類を含む、安定化された免疫学的活性物質を固定化した多孔性担体。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施態様は、多孔性担体に固定化された免疫学的活性物質を、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液とともに乾燥することを特徴とする、免疫学的活性物質の安定化方法である。
【0011】
本発明において「安定化」とは、免疫学的活性物質の耐湿度性が向上されていることをいう。耐湿度性は、典型的には、温度30℃、湿度90%の条件で3日間(72時間)放置した時の感度と、密封して4℃で3日間保管した時の感度の比をもって評価する。
【0012】
別の観点では、本発明において「安定化」とは、免疫学的活性物質の室温条件下での保存安定性が向上されていることをいう。室温条件下での保存安定性は、典型的には、温度30℃、湿度70%の条件で37日間、14日間放置した時の感度と、密封して4℃で7日間、14日間保管した時の感度の比をもって評価する。
【0013】
耐湿度性が90%以上を示す場合、および/または、室温条件下での保存安定性が90%以上を示す場合、免疫学的活性物質が安定化されていると判断する。
【0014】
本発明において対象となる測定項目の例としては、AFP、CEA、CA19−9、CA125、CA15−3、PSA、フェリチン、DUPANIIなどの腫瘍マーカー関係、CRP、ASO、RFなど炎症関係、アホ゜リホ゜フ゜ロテイン、β2−マイクロク゛ロフ゛リンなどの血漿蛋白、A型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス、D型肝炎ウィルス、E型肝炎ウィルス、HIVウィルス、ヘルヘ゜スウィルス、ロタウィルス、トキソフ゜ラス゛マ、ルヘ゛ラ、クラミシ゛ア、ルヘ゜ロヘータなどの感染症関係の項目が挙げられる。
【0015】
本発明で多孔性担体に含ませる単糖類としては、グルコ−ス、フラクト−ス、キシロ−ス、トレハロ−ス、アラビノ−ス、ソルビト−ルなどが挙げられる。またソルビットなどのように、上記の単糖類の糖アルコ−ルも効果がある。
なかでも、グルコースは溶解性がよく製品コストの点でも安価である理由により好ましい。
【0016】
免疫活性物質を固定化した多孔性担体は、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液とともに乾燥する。多孔性担体を、単糖類を含む溶液で浸す方法としては、特に限定されないが、単糖類を含有した溶液を入れた容器に多孔性担体を一定時間浸漬する方法や、シリンジノズルで滴下する方法、インクジェットノズルやエアースプレーによって吹き付ける方法等がある。
溶液中の単糖類の濃度の下限は特に限定されないが、濃度が高いほど湿度による失活は抑制される傾向があるので、好ましくは5%以上、更に好ましくは10%以上である。一方、単糖類の濃度の上限は特に限定されないが、濃度が高すぎると液の粘性が高くなり、またコスト面においても費用がかかってくることから、好ましくは50%以下、さらに好ましくは40%以下である。
【0017】
溶液に使用できるバッファーとしてはpH5から8で緩衝能のあるものなら特に限定されるものではない。例としてリン酸バッファー、炭酸バッファー、goodバッファー、酢酸―アンモニウムバッファー、クエン酸バッファー、Trisバッファーなどが使用できる。
【0018】
上記の様に多孔性担体に、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液で浸した後、以下のような方法で乾燥させる。自然乾燥、風乾、真空乾燥、減圧乾燥、凍結真空乾燥、赤外線や遠赤外線による加温乾燥、またマイクロウェーブなどの高周波を利用した方法でも可能である。
【0019】
完全に乾燥されたかどうかの判定は、例えば乾燥前後の重量をもって判断することができる。調製前の未処理の多孔性担体の重量を予め測定しておき、その重量と乾燥後の多孔性担体の重量との差が実質的にないと見なすことが出来れば乾燥されたと判断できる。また、別の方法としては、水分が蒸発している時は気化熱により多孔性担体表面の温度が周囲の温度より低下することを利用して、多孔性担体表面の温度をモニターすることで、例えば、外気温との温度差が実質的にないと見なすことが出来れば乾燥が終了したかどうかを判断することができる。なお、「実質的に差がない」とは、全く差がないか又はほとんど差がないことを意味する。
【0020】
多孔性担体としては、無機化合物やガラス、ポリスチレン、ポリプロピレンポリエチレン、多糖類などからなる繊維やニトロセルロ−ス、ナイロンなどの多孔性膜などが使用できる。ガラスは、非特異的なタンパクの吸着が少ないのでノイズを低くでき、また強度も強い点でより好ましい。
【0021】
本発明の別の実施態様は、多孔性担体に固定化された免疫学的活性物質を、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液とともに乾燥することより作製された、少なくとも1種類以上の単糖類を含む、安定化された免疫学的活性物質を固定化した多孔性担体である。
【0022】
本発明で得られた多孔性担体は図1の示されるような免疫学的測定用反応容器に収納して使用することができる。免疫学的測定用反応容器は、液体不透過性の材料で構成されており、試薬を適用する範囲を限定するための開口部を有している。多孔性担体は開口部の下部に設置される。そして多孔性担体の下部に、多孔性担体を通過した試薬を吸収する吸収層が設けられている。必要に応じて、多孔性担体と吸収層の間に逆流防止層を設け、吸収層に収納された試薬が多孔性担体に逆流するのを防ぐ場合もある。液体不透過性の材料としては、液体を透過させない物質であればよく、例えばポリエチレン、ポリスチレン、ABS樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリアミド樹脂、ポリプロピレン、ポリカーボネート等の樹脂が液体不透過性、成形の容易さ等の点で好ましい。吸収層としては、液体を吸収し得るものであれば特に限定されないが、例えば液体の吸収性が高いセルロース、またはセルロース誘導体を主成分とする紙の重層物などが挙げられる。また、上記逆流防止層としては、疎水性の不繊布シート、ウェーブ材などが例示される。
【0023】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではない。
【0024】
(実施例1)
抗ビオチン抗体を固定化したガラス繊維の調製
ガラス繊維(ワットマン社製)を市販のドットブロティング装置に挟みこみ、ペリスタポンプで減圧状態にし、順次以下の順序で試薬を添加した。
A.100mMクエン酸緩衝液(pH3)
B.抗ビオチン抗体10μg/mL(100mMクエン酸緩衝液pH3)
C.1%カゼイン溶液(10mMリン酸−生理食塩水緩衝液pH7.2、1%カセ゛イン)
ドットブロティング装置からガラス繊維を取り外し、ガラス繊維をキムタオル上に置いて、余分な水分を取り除く。次にバットに以下のD液を満たし、
上記のガラス繊維を全部がD液に浸るように浸漬する。
D.15%グルコース溶液(10mMリン酸−生理食塩水緩衝液pH7.2)
数分間浸漬させた後、ガラス繊維を取りだし、キムタオル上に置いて余分な水分を取り除く。余分な水分を取り除いたガラス繊維は、真空乾燥機、あるいは凍結真空乾燥機で完全に乾燥した。
【0025】
免疫学的測定用反応容器の作製
抗ビオチン抗体を固定化したガラス繊維は、直径8mmの円形にポンチを用いて打ち抜いた。その下部に長さ15mm直径8mmのタバコフィルターを吸収層として、図1の免疫学的測定用反応容器内に組み込んだ。
【0026】
CEAの測定
上記で作製した抗ビオチン抗体を固定化したガラス繊維を組み込んだ免疫学的測定用反応容器に、1%カゼインと防腐剤を含有するブロック液を50μL滴下した。次いで、予めヒトCEA40ng/mLを含むCEA標準液25μLとビオチン化抗ヒトCEA抗体25μLを混合し40℃、5分間インキュベートした混合液を、ブロック液の滴下した1分後に、50μL滴下した。そのまま37℃、2分間加温後、ペルオキシダーゼを標識した抗ヒトCEA抗体を20μL滴下した。37℃、2分間加温後、0.5%非イオン界面活性剤(Tween−20)を含有するリン酸バッファーからなる洗浄液を75μL、2回滴下し、反応しなかった余分な試薬を洗い流した。次に、ペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン(TMB)溶液を40μL滴下して発色させた。青色の発色の色調変化(ΔK/S)を、670nmのレーザー光を光源とする積分球検出器で測定した。
【0027】
湿度による影響の評価
湿度による免疫活性物質の失活の程度は、温度30℃、湿度90%の条件で3日間(72時間)放置した時の感度と、密封して4℃で3日間保管した時の感度の比を耐湿度性とし、この値をもって評価した。耐湿度性は、以下の式で求めた。
耐湿度性(%)=[温度30℃、湿度90%の条件で3日間(72時間)放置した時の感度]÷[4℃で3日間(72時間)保管した時の感度]×100
【0028】
(比較例1)比較例1として、実施例1と同様の調製方法で、D液の組成を D.0%グルコース溶液(10mMリン酸−生理食塩水緩衝液pH7.2)とし、ガラス繊維を調製した。その他の調製方法、測定方法は同様にして評価した。
【0029】
(比較例2)比較例2として、実施例1と同様の調製方法で、D液の組成を D.15%サッカロース溶液(10mMリン酸−生理食塩水緩衝液pH7.2)とし、ガラス繊維を調製した。その他の調製方法、測定方法は同様にして評価した。
【0030】
実施例1、比較例1、比較例2で調製したガラス繊維について、免疫学的測定用反応容器に組み込んで、耐湿度性の評価を実施した結果について示す。
【0031】
【表1】
【0032】
(実施例2)
(実施例1)と同様の方法で調製したガラス繊維について、室温放置下での保存安定性について評価した。
室温放置下での保存安定性
室温条件下での保存安定性については、温度30℃、湿度70%の条件で37日間、14日間放置した時の感度と、密封して4℃で7日間、14日間保管した時の感度の比をもって評価した。室温放置下での保存安定性は、以下の式で求めた。
室温放置下での保存安定性(%)=[温度30℃、湿度70%の条件で7日間、14日間放置した時の感度]÷[4℃で7日間、14日間保管した時の感度]×100
【0033】
(比較例3)
(比較例2)と同様の方法で調製したガラス繊維について、室温放置下での保存安定性について評価した。
【0034】
実施例2、比較例3で調製したガラス繊維について、免疫学的測定用反応容器に組み込んで、室温下での保存安定性の評価を実施した結果について示す。
【0035】
【表2】
【0036】
【発明の効果】
本発明の多孔性担体に固定化された免疫学的活性物質の安定化方法によれば、室温放置下でも長期間保存安定性の良好な免疫学的測定用反応容器を調製することができる。その結果、多孔性担体を組み込んだ免疫学的測定用反応容器を自動分析機上に数日間セットしたまま放置することが可能となり、自動分析機の小型化、低コスト化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】免疫学的測定用反応容器の例
Claims (5)
- 多孔性担体に固定化された免疫学的活性物質の安定化方法において、少なくとも1種類以上の単糖類を含む溶液とともに乾燥することを特徴とする、免疫学的活性物質の安定化方法。
- 多孔性担体がガラス繊維である請求項1記載の方法。
- 単糖類がグルコースである請求項1の方法。
- 単糖類を含む溶液中の単糖類の濃度が5%〜50%である請求項1の方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の方法により作製された、少なくとも1種類以上の単糖類を含む、安定化された免疫学的活性物質を固定化した多孔性担体。
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