CN114286826A - 检测人α防御素HD5的方法和试剂盒、以及其中所使用的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供一种选择性且简便地检测作为人α防御素的HD5的氧化型、即在人体内发挥有益功能的分子内具有二硫键的HD5的方法。本发明涉及包含序列号1～6或7～12的氨基酸序列作为CDR、特异性结合于分子内具有二硫键的人α防御素HD5的两种新的单克隆抗体、使用前述抗体的免疫学检测方法和包含前述抗体的试剂盒。

Description

检测人α防御素HD5的方法和试剂盒、以及其中所使用的抗体
技术领域
本发明涉及检测氧化型人α防御素HD5的方法和试剂盒、以及其中所使用的抗体。
背景技术
近年来，已经知道肠道环境与以生活习惯疾病为代表的各种疾病的关系。α防御素作为可影响肠道环境、特别是肠道菌群的宿主来源物质受到关注。
α防御素是对病原菌显示强杀菌活性的抗菌肽，由作为一种构成小肠粘膜上皮的细胞的潘氏细胞产生。近年来已确定，作为小鼠α防御素的隐窝素(cryptdin)4具有依赖于其高级结构的选择性杀菌活性。高级结构正常的隐窝素4、即分子内具有3个二硫键的氧化型隐窝素4对于包括Bifidobacterium bifidum(两岐双岐杆菌)、Bacteroides fragilis(脆弱拟杆菌)的很多正常菌几乎不显示杀菌活性，而不具有二硫键的还原型隐窝素4对于正常菌显示出比氧化型强的杀菌活性。另一方面，隐窝素4为氧化型、还原型对于Salmonella enterica serovar typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)、Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)等病原菌均显示强杀菌活性(非专利文献1)。这表明，对于α防御素选择性杀菌活性的发挥而言，高级结构的维持、即分子内具有3个二硫键是很重要的，并且，高级结构正常的α防御素可有助于适当控制肠道菌群、维持宿主理想的肠道环境。
因此认为，如果能够测定高级结构正常的氧化型α防御素，则能够实现可控制肠道环境的有用物质的探索、肠道环境相关疾病的新的预防方法、治疗策略的研究。迄今为止，本发明人等已经报道了对氧化型小鼠α防御素进行选择性检测的方法(非专利文献2)，但并不知道对氧化型人α防御素进行选择性检测的方法。
非专利文献1：K.Masuda等，J.Innate Immun.(先天免疫杂志)，2011,3,315-326
非专利文献2：K.Nakamura等，Analytical biochemistry(分析生物化学)，2013,443(2),124-131
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种选择性且简便地检测作为人α防御素的HD5的氧化型、即在人体内发挥有益功能的分子内具有二硫键的HD5的方法。
用于解决课题的方法
本发明人等制作了对氧化型HD5(ox-HD5)特异性的单克隆抗体，确立了使用该抗体的ox-HD5免疫学检测方法，完成了以下的发明。
(1)一种对分子内具有二硫键的人α防御素HD5进行免疫学检测的方法，其包括使用下述a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段和下述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段，通过三明治法对样本中的分子内具有二硫键的人α防御素HD5进行检测，
a)具有包含作为CDR1的序列号1的氨基酸序列、作为CDR2的序列号2的氨基酸序列和作为CDR3的序列号3的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号4的氨基酸序列、作为CDR2的序列号5的氨基酸序列和作为CDR3的序列号6的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段；
b)具有包含作为CDR1的序列号7的氨基酸序列、作为CDR2的序列号8的氨基酸序列和作为CDR3的序列号9的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号10的氨基酸序列、作为CDR2的序列号11的氨基酸序列和作为CDR3的序列号12的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段；
(2)根据(1)所述的方法，其中，
a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段具有：
具有序列号13的氨基酸序列的重链可变区、或具有与序列号13的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的重链可变区、以及
具有序列号14的氨基酸序列的轻链可变区、或具有与序列号14的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的轻链可变区，并且，
b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段具有：
具有序列号15的氨基酸序列的重链可变区、或具有与序列号15的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的重链可变区、以及
具有序列号16的氨基酸序列的轻链可变区、或具有与序列号16的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的轻链可变区。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为捕获抗体使用，b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为检测抗体使用。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其包括：在固相化有a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的载体中添加样本的工序、在前述载体中添加经标记的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的工序、以及对结合于分子内具有二硫键的人α防御素HD5的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段进行检测的工序。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，样本为人冷冻干燥粪便破碎物的水性介质提取液。
(6)一种用于通过三明治法对分子内具有二硫键的人α防御素HD5进行免疫学检测的试剂盒，其包含下述a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段和下述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段，
a)具有包含作为CDR1的序列号1的氨基酸序列、作为CDR2的序列号2的氨基酸序列和作为CDR3的序列号3的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号4的氨基酸序列、作为CDR2的序列号5的氨基酸序列和作为CDR3的序列号6的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段；
b)具有包含作为CDR1的序列号7的氨基酸序列、作为CDR2的序列号8的氨基酸序列和作为CDR3的序列号9的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号10的氨基酸序列、作为CDR2的序列号11的氨基酸序列和作为CDR3的序列号12的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
(7)根据(6)所述的试剂盒，其中，a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为捕获抗体使用，b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为检测抗体使用。
(8)根据(7)所述的试剂盒，a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段固相化在载体中，b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段是经标记的。
(9)一种与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其具有包含作为CDR1的序列号1的氨基酸序列、作为CDR2的序列号2的氨基酸序列和作为CDR3的序列号3的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号4的氨基酸序列、作为CDR2的序列号5的氨基酸序列和作为CDR3的序列号6的氨基酸序列的轻链可变区。
(10)一种与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其具有包含作为CDR1的序列号7的氨基酸序列、作为CDR2的序列号8的氨基酸序列和作为CDR3的序列号9的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号10的氨基酸序列、作为CDR2的序列号11的氨基酸序列和作为CDR3的序列号12的氨基酸序列的轻链可变区。
(11)一种核酸，其编码(9)或(10)所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
(12)一种载体，其包含(11)所述的核酸。
(13)一种宿主细胞，其包含(11)所述的核酸。
发明效果
本发明的检测氧化型人α防御素HD5的方法和试剂盒、以及其中所使用的抗体能够高灵敏度且简便地对ox-HD5进行检测或测定，能够用于肠道环境的监测、可控制肠道环境的有用物质的探索、肠道环境相关疾病的新的预防方法、治疗策略的研究。
附图说明
图1为显示HD5的氨基酸序列和分子内二硫键的位置的图。
图2A显示的是通过MALDI-TOF MS得到的ox-HD5的质谱。
图2B显示的是通过MALDI-TOF MS得到的分子内不具有二硫键的HD5(还原型HD5，以下表述为r-HD5)的质谱。
图3为显示分别以5种抗ox-HD5单克隆抗体为捕获抗体和检测抗体的合计25种三明治ELISA的标准曲线的图表。
图4为显示将检测抗体39E-7的浓度设定为0.5mg/ml、将捕获抗体12-1的浓度设定为0.1、0.5、1、5或10mg/ml的三明治ELISA的标准曲线的图表。
图5为显示将检测抗体39E-7的浓度设定为0.5mg/ml、将捕获抗体12-1的浓度设定为0.1、0.5、1、5或10mg/ml的三明治ELISA的、ox-HD5浓度30ng/ml的吸光度的图表。
图6为显示将捕获抗体12-1的浓度设定为1mg/ml、将检测抗体39E-7的浓度设定为0.1、0.5或1mg/ml的三明治ELISA的标准曲线的图表。
图7为显示将捕获抗体12-1的浓度设定为1mg/ml、将检测抗体39E-7的浓度设定为0.1、0.5或1mg/ml的三明治ELISA的、ox-HD5浓度30ng/ml的吸光度的图表。
图8为显示将捕获抗体12-1的浓度设定为1mg/ml、将检测抗体39E-7的浓度设定为0.5mg/ml的三明治ELISA的、与r-HD5、r-HD6、隐窝素1的还原型(r-Crp1)和氧化型(ox-Crp1)、以及隐窝素4的还原型(r-Crp4)和氧化型(ox-Crp4)的反应性的图表。
图9为显示通过三明治ELISA得到的人粪便和血清中ox-HD5的定量结果的散点图。
具体实施方式
本发明的第1方式涉及一种对ox-HD5进行免疫学检测的方法，其包括：通过三明治法，使用下述a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段和下述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段，对样本中的ox-HD5进行检测，
a)具有包含作为CDR1的序列号1的氨基酸序列、作为CDR2的序列号2的氨基酸序列和作为CDR3的序列号3的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号4的氨基酸序列、作为CDR2的序列号5的氨基酸序列和作为CDR3的序列号6的氨基酸序列的轻链可变区，且与ox-HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段；
b)具有包含作为CDR1的序列号7的氨基酸序列、作为CDR2的序列号8的氨基酸序列和作为CDR3的序列号9的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号10的氨基酸序列、作为CDR2的序列号11的氨基酸序列和作为CDR3的序列号12的氨基酸序列的轻链可变区，且与ox-HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
作为其他方式，本发明还分别提供：一种用于通过三明治法对分子内具有二硫键的ox-HD5进行免疫学检测的试剂盒，其包含上述a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段和上述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段；上述a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段；以及上述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
人α防御素HD5
人α防御素有HD5和HD6两个同工型。HD5(也称为DEFA5、防御素α5)被翻译成包含N末端侧1-19位信号肽的全长94个氨基酸残基的前肽pre-HD5(序列号17)。接下来，信号肽从pre-HD5被切掉，生成原肽pro-HD5(75个氨基酸)，进一步，N末端侧的43个氨基酸残基被切掉，从而生成成熟体HD5(32个氨基酸，序列号18)。成熟体HD5的氨基酸序列中包含6个半胱氨酸残基，它们形成3个分子内二硫键，从而形成ox-HD5。将ox-HD5的氨基酸序列和分子内二硫键的位置示于图1。
抗ox-HD5单克隆抗体
本发明中使用的上述a)和b)的抗ox-HD5单克隆抗体是与ox-HD5、即分子内具有3个二硫键的HD5特异性结合的抗体。与ox-HD5特异性结合的意思是，例如，与分子内不具有二硫键的还原型HD5等非靶标蛋白相比，优先结合于ox-HD5，并不是完全不与非靶标蛋白结合的意思。与ox-HD5特异性结合的抗体也可以表述为与ox-HD5具有高结合亲和性的抗体，具有比与非靶标蛋白的亲和力至少强2倍、优选至少强10倍、更优选至少强20倍、最优选至少强100倍的亲和力，且能够与ox-HD5结合。如果抗体能够不产生不希望的结果、典型地是产生假阳性或假阴性等而对ox-HD5的存在进行检测，则认为该抗体是与ox-HD5特异性结合的抗体。
本发明中，抗ox-HD5单克隆抗体可以是免疫球蛋白分子的任意类(作为例子：IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)和亚类，优选为IgG。此外，单克隆抗体例如可以来源于包括小鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、羊驼、山羊或人的任意物种，也可以是嵌合抗体、人源化抗体。
a)的抗ox-HD5单克隆抗体的重链可变区具有与序列号13的氨基酸序列的同源性为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列，优选具有与序列号13的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
a)的抗ox-HD5单克隆抗体的轻链可变区具有与序列号14的氨基酸序列的同源性为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列，优选具有与序列号14的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
b)的抗ox-HD5单克隆抗体的重链可变区具有与序列号15的氨基酸序列的同源性为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列，优选具有与序列号15的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
b)的抗ox-HD5单克隆抗体的轻链可变区具有与序列号16的氨基酸序列的同源性为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列，优选具有与序列号16的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
氨基酸序列的同源性用同源氨基酸残基数相对于比对长度的比例来表示，被比较的2个氨基酸序列的比对以同源氨基酸残基的数量最多的方式按照常规方法来进行。序列同源性可以使用本领域技术人员公知的任意方法、例如BLAST等序列比较程序来确定。
a)和b)的抗ox-HD5单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区在框架区域中、即在CDR以外的氨基酸序列中可以有10个以下、9个以下、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、2个以下或1个氨基酸的缺失、替换或添加。这里，氨基酸的替换优选为保守性替换。“保守性替换”是指不会影响蛋白的生物学活性、抗原亲和力和/或特异性等希望的性质、蛋白中的氨基酸替换成特性(作为例子，为电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架结构和刚性等)类似的其他氨基酸，作为其例子，可以列举甘氨酸(Gly)与脯氨酸(Pro)、甘氨酸与丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)与异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)与谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)与天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)与苏氨酸(Thr)、苏氨酸与丝氨酸(Ser)或丙氨酸、赖氨酸(Lys)与精氨酸(Arg)等氨基酸之间的替换。
本发明中，抗原结合性片段定义为保持了与抗原特异性结合能力的抗体的部分片段。作为抗原结合性片段的例子没有限定，可以列举Fab(fragment of antigen binding，抗原结合片段)、Fab'、F(ab')2、单链抗体(single chain Fv)、二硫键稳定抗体(disulfidestabilized Fv)和包含CDR的肽等。
本发明中使用的抗ox-HD5单克隆抗体和其抗原结合性片段可以使用本领域技术人员公知的方法来制作。例如，抗ox-HD5单克隆抗体可以通过下述方法来制作：以ox-HD5为抗原对适当的动物进行免疫，接下来，使该动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤，对其进行培养。关于杂交瘤法，例如请参照：Meyaard等(1997)Immunity(免疫)7：283-290；Wright等(2000)Immunity(免疫)13:233-242；Kaithamana等(1999)J.Immunol.(免疫学杂志)163:5157-5164等。
ox-HD5可以通过下述方法来制备：通过化学或基因工程方式制作由序列号18所示的氨基酸序列组成的多肽，将其用于公知的蛋白重折叠处理中使用的二硫键形成反应。典型地，二硫键形成反应通过下述方法来进行：在弱碱性水性溶剂中，在4℃～10℃左右缓慢搅拌12小时～48小时左右，或者在将氧化剂和还原剂按适当比例组合的氧化还原试剂(氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽、胱氨酸/半胱氨酸、半胱胺/胱胺等)的存在下，在20℃～30℃左右缓慢搅拌12小时～48小时左右而进行氧化。
此外，ox-HD5也可以通过用编码pre-HD5或pro-HD5的核酸转化宿主细胞、在宿主细胞内将pre-HD5或pro-HD5转变为ox-HD5来制备。ox-HD5可以直接作为抗原使用，此外也可以使用借助适当的缩合剂与各种载体蛋白结合而形成免疫原性偶联物的物质作为抗原。此外，还可以与适当的佐剂一起作为抗原。
此外，本发明中使用的抗ox-HD5单克隆抗体和其抗原结合性片段可以通过包括将包含编码其的核酸的表达载体导入适当宿主细胞并进行表达这样的操作的基因工程方法来制作。通过包括编码抗ox-HD5单克隆抗体和其抗原结合性片段的核酸的制作、宿主细胞的种类和基因导入方法、蛋白的表达和纯化等的基因工程方法进行的抗体制作可以基于对各种基因重组操作进行详细解释的实验操作手册的指示，通过本领域技术人员公知或周知的方法来进行。本发明也提供编码抗ox-HD5单克隆抗体和其抗原结合性片段的核酸、包含该核酸的表达载体和转化的宿主细胞作为其他方式。
a)的抗ox-HD5单克隆抗体的优选例是，2019年12月4日在日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室国家技术评估学会,专利微生物保藏中心作为国际保藏号NITE BP-03086(识别标志：12-1)国际保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体(以下表述为单克隆抗体12-1或简单地表述为12-1)。
b)的抗ox-HD5单克隆抗体的优选例是，2019年12月4日在日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室国家技术评估学会,专利微生物保藏中心作为国际保藏号NITE BP-03087(识别标志：39E-7)国际保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体(以下表述为单克隆抗体39E-7或简单地表述为39E-7)。
此外，a)的抗ox-HD5单克隆抗体的抗原结合性片段的优选例是单克隆抗体12-1的抗原结合性片段，b)的抗ox-HD5单克隆抗体的抗原结合性片段的优选例是单克隆抗体39E-7的抗原结合性片段。
ox-HD5的免疫学检测方法和试剂盒
本发明的抗ox-HD5单克隆抗体和其抗原结合性片段均与ox-HD5特异性结合，因而能够用于ox-HD5的免疫学检测、针对ox-HD5的亲和柱等。
而且，a)的抗ox-HD5单克隆抗体或其抗原结合性片段与b)的抗ox-HD5单克隆抗体或其抗原结合性片段分别识别ox-HD5中的不同表位，同时结合于1分子的ox-HD5，从而形成三明治复合体，因而通过使用这些抗体的组合，能够利用三明治法，实现样本中ox-HD5的高灵敏度免疫学检测。
ox-HD5的免疫学检测方法包括所有利用抗原抗体反应的免疫分析，作为其例子，可列举ELISA、放射免疫分析、组织或细胞免疫染色、免疫印迹、免疫色谱等。本发明中，优选使用a)的抗ox-HD5单克隆抗体或其抗原结合性片段合b)的抗ox-HD5单克隆抗体或其抗原结合性片段、通过三明治法进行的免疫学检测，特别优选使用a)的抗ox-HD5单克隆抗体或其抗原结合性片段作为捕获抗体、使用b)的抗ox-HD5单克隆抗体或其抗原结合性片段作为检测抗体、通过三明治法进行的免疫学检测、例如三明治ELISA。
为了进行ox-HD5的免疫学检测，本发明的抗ox-HD5单克隆抗体和其抗原结合性片段可以在适当的载体中固相化、或者用适当的标记化合物标记。本发明的优选实施方式中，作为捕获抗体使用的a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段在载体中固相化，作为检测抗体使用的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段是经标记的。
用于使抗体固相化的载体、抗体在该载体中的固相化方法、用于标记检测抗体的标记化合物和使用其的抗体的标记法、以及使用其的免疫分析操作、例如样本与固相化载体的温育条件、洗涤、封闭处理、检测方法等可以参照本领域技术人员公知或周知的方法、例如The Immunoassay Handbook:Theory and Applications of Ligand Binding,ELISAand Related Techniques(4TH)(免疫测定手册：配体结合、ELISA和相关技术的理论与应用(第四版))、Elsevier的记载来进行。该文献整体通过参照并入本说明书。
作为标记化合物的例子，可以列举荧光物质(例如FITC、罗丹明等)、胶体金等金属粒子、Luminex(注册商标，路明克斯公司)等荧光微珠、色素蛋白(例如藻红蛋白、藻蓝蛋白等)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S、125I、131I等)、酶(例如过氧化酶、碱性磷酸酶等)、生物素、链霉亲和素。
作为本发明一个方式的试剂盒包含a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段和上述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段。试剂盒可以进一步包含平板等载体、封闭溶液、洗涤液和显色底物等试剂。
ox-HD5的免疫学检测中使用的样本优选为人来源生物学试样，作为其例子，可以列举组织、细胞、体液(作为例子，血液、淋巴液、唾液、粘液、骨髓液、尿、精液、腹腔液等)或粪便等。生物学试样可以在采集的原始状态下使用，也可以在实施粉碎、匀浆、离心分离、浓缩、稀释等预处理后使用。
检测粪便中的ox-HD5时，优选将冷冻干燥的粪便破碎，使用以水性介质对其进行提取而得到的提取液作为样本。典型地，这样的样本可以通过下述方法来制备：使用珠子粉碎机等粉碎机将冷冻干燥后的粪便破碎，接下来，在经破碎的粪便中加入不会对生物学试样产生不良影响的生物化学领域一般使用的水性介质、例如蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水等，在1小时～48小时、优选为4小时～36小时、更优选为8小时～24小时的时间内在4℃左右的温度下对其进行振荡后，通过离心分离或过滤将固态成分除去。
检测血液中的ox-HD5时，优选使用血清或血浆作为样本。
本发明特别优选的实施方式中，ox-HD5的免疫学检测方法包括：在添加a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的浓度为0.5mg/ml以上、例如为0.5～10mg/ml、优选为1～10mg/ml的溶液并固相化的载体中添加样本的工序、在前述载体中以添加时刻的载体上溶液中的终浓度为0.1mg/ml以上、例如为0.1～1mg/ml、优选为0.5～1mg/ml的方式添加经标记的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的工序、以及对结合于分子内具有二硫键的人α防御素HD5的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的标记进行检测的工序。关于经标记的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段，添加时刻载体上的溶液的终浓度可以考虑从前面的工序带入的残留液体造成的稀释，通过设定添加溶液的浓度来调整。例如，样本添加工序后从载体将液体除去的情况下，载体上几乎不会残留液体，因而上述终浓度与添加的经标记的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的溶液的浓度基本相等。
通过以下的实施例进一步详细地对本发明进行说明，但本发明不受其限定。
实施例
实施例1抗ox-HD5单克隆抗体的制作
1)ox-HD5的制备
将委托赛默飞世尔(Thermo Fisher)公司化学合成的成熟体HD5(序列号18)溶解于0.1％乙酸，用10％氢氧化铵将pH调节至8.4～8.8，在4℃缓慢搅拌18小时从而进行氧化处理。然后，利用透析膜替换为5％乙酸，通过真空冷冻干燥将溶液除去。将得到的试样溶解于0.1％三氟乙酸，用于反相色谱(C-18柱)，回收多肽组分。
分别通过MALDI-TOF MS对多肽组分和氧化处理前的合成多肽进行分析(图2A和B)。结果确认到，经氧化处理的多肽组分的分子量与r-HD5(分子量：3588.2)相比减小约6Da。这表明通过氧化处理生成了分子内具有3个二硫键的ox-HD5。
此外，通过MALDI-TOF MS确认，代替上述氧化处理，将成熟体HD5溶解于谷胱甘肽酸化溶液(还原型谷胱甘肽(3mM)、氧化型谷胱甘肽(0.3mM)、尿素(8M))，用碳酸氢钠(0.25M)调节至pH8.4后，在室温缓慢搅拌18小时从而进行氧化处理也可获得分子内具有3个二硫键的ox-HD5。将这些ox-HD5用于以下的实施例。
2)杂交瘤的制作
通过常规方法，用ox-HD5对注射了佐剂的自身免疫疾病小鼠(从日本SLC获得C3H/HeJJmsSlc-lpr/lpr)进行3次腹腔内注射(0.2mg/次)从而进行免疫。然后，按照常规方法从经免疫的小鼠采集脾细胞，使用50％聚乙二醇1500(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司)与小鼠骨髓瘤细胞株P3U1融合，制作杂交瘤。通过间接ELISA对各杂交瘤克隆进行筛选，通过极限稀释法进行4次亚克隆。
间接ELISA按以下步骤进行。用溶解在无Ca2+/Mg2+的磷酸缓冲生理盐水(PBS)中的1μg/ml的ox-HD5对平底微量滴定板(Nunc)的孔进行包被，在4℃温育过夜。用含有0.1％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，在孔中加入各杂交瘤克隆的培养上清，在37℃温育1小时。用PBS-T洗涤后，添加辣根过氧化酶(HRP)结合山羊抗小鼠IgG(GE HealthcareBiosciences)，温育45分钟后洗涤。在各孔中添加100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物缓冲液(KPL)，将平板在25℃温育30分钟后，用酶标仪Multiscan FC(ThermoScientific)测定405nm的吸光度。
对于通过以上操作筛选到的5种杂交瘤克隆(12-1、16-1、39E-7、58-3、60-10B)，使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(roche公司)来确定产生的单克隆抗体的同种型。将结果示于表1。
[表1]
克隆编号 12-1 16-1 39E-1 58-3 60-10B
同种型 IgG<sub>1κ</sub> IgG<sub>1κ</sub> IgG<sub>2aκ</sub> IgG<sub>1κ</sub> IgG<sub>1κ</sub>
实施例2三明治免疫分析的建立
1)免疫分析用抗体的选择
按以下步骤，使用5种单克隆抗体作为捕获抗体或检测抗体中的任一种，进行三明治ELISA，选择适于免疫分析的抗体组合。
将实施例1中得到的各单克隆抗体以成为10mg/ml的方式溶解于50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)，将100μl该溶液加入至微量滴定板的各孔后，4℃温育过夜。将平板用PBS-T洗涤3次后，加入200μl的25％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，在25℃进行1小时封闭。将用PBS-T洗涤后的平板作为捕获抗体固相的平板用于免疫分析。此外，按照制造商的操作规程，使用生物素(Dojindo Laboratories)对各单克隆抗体进行标记，制备检测抗体。
将以成为10或30ng/ml的方式溶解于PBS-T的100μl ox-HD5作为标品加入至固相化平板的各孔，在25℃温育2小时。用PBS-T洗涤3次后，在孔中加入100μl 0.5mg/ml的检测抗体，在25℃温育1小时。接下来在孔中加入100μl的链霉亲和素(Streptavidin)-HRP偶联物(GE Healthcare Biosciences，1:5000稀释)，在25℃温育1小时。洗涤后，在孔中加入100μl的TMB底物缓冲液，在25℃温育30分钟后，加入100μl的0.6N H2SO4使反应停止。使用酶标仪测定450nm(吸收波长)和620nm(参照波长)的吸光度，将两者的差值作为测定值。测定值用平均值±标准偏差表示。
将结果示于图3。确认到在捕获抗体为12-1、检测抗体为39E-7时，检测灵敏度最高。
2)优化
对于捕获抗体12-1、检测抗体39E-7的组合，对各抗体的最佳浓度进行研究。首先，将检测抗体39E-7的浓度设定为0.5mg/ml、将捕获抗体12-1的浓度设定为0.1、0.5、1、5或10mg/ml，与上述1)同样地进行三明治ELISA，对于浓度0～30ng/ml的ox-HD5制作标准曲线(n＝3)。统计分析通过Student t检验来进行，将P值<0.05设为统计学上显著。
将结果示于图4和5。确认到ox-HD5浓度为15ng/ml时捕获抗体浓度1mg/ml的吸光度最高。此外，ox-HD5浓度为30ng/ml的吸光度呈捕获抗体浓度依赖性地上升，在1、5、10mg/ml之间没有显著差异。根据以上结果，将捕获抗体的最佳浓度设为1mg/ml。
接下来，将捕获抗体12-1的浓度设定为1mg/ml、将检测抗体39E-7的浓度设定为0.1、0.5或1mg/ml，同样地进行三明治ELISA，制成标准曲线(n＝8)。将结果示于图6和7。ox-HD5浓度15、30ng/ml时，检测抗体浓度0.5和1mg/ml的吸光度均没有显著差异。根据以上结果，将检测抗体的最佳浓度设为0.5mg/ml。
3)特异性的确认
为了对上述1)和2)中构建的分析体系的特异性进行研究，调查作为r-HD5、HD5的同工型的HD6(序列号19)的还原型(r-HD6)、两种小鼠α防御素(Crp1、Crp4)的氧化型和还原型(ox-Crp1、r-Crp1、ox-Crp4、r-Crp4)的反应性。这些肽均委托Thermo Fisher公司化学合成。Crp1和Crp4的氧化型按照已有报道(K.Nakamura等，Analytical biochemistry(分析生物化学)，2013，443(2)，124-131)进行制备。将捕获抗体12-1的浓度设定为1mg/ml、将检测抗体39E-7的浓度设定为0.5mg/ml，同样地进行三明治ELISA，对于0～60ng/ml的各抗原制成标准曲线。
将结果示于图8。使用r-HD5作为抗原时，浓度60ng/ml时确认到吸光度的微弱上升，而使用r-HD6、ox-Crp1、r-Crp1、ox-Crp4和r-Crp4作为抗原时，吸光度没有上升，由此确认，本分析体系对于ox-HD5具有强亲和性和特异性。
实施例3单克隆抗体的CDR分析
使用SMART cDNA文库制作试剂盒(宝生物株式会社)，对单克隆抗体12-1和39E-7的CDR序列进行分析。具体地，从杂交瘤克隆12-1和39E-7提取总RNA，以此为模板，使用3'末端IgG1重链特异性引物、IgG2a重链特异性引物或κ轻链特异性引物来制作cDNA。以该cDNA为模板，使用试剂盒附带的5’末端特异性引物作为正向引物、3’末端IgG1重链特异性引物、IgG2a重链特异性引物或κ轻链特异性引物作为反向引物，进行PCR扩增。使用DNA测序仪对扩增的DNA片段的核酸序列进行分析，在IgBLAST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)中对得到的序列信息进行检索。结果确认，单克隆抗体12-1和39E-7均具有新的CDR序列组合。将各抗体的重链CDR1～3和可变区的氨基酸序列示于表2，将轻链CDR1～3和可变区的氨基酸序列示于表3。
[表2]
Figure BDA0003501436770000151
[表3]
Figure BDA0003501436770000161
杂交瘤克隆12-1和39E-7以保藏号NITE BP-03086(识别标志：12-1)和NITE BP-03087(识别标志：39E-7)国际保藏于国家技术评估学会,专利微生物保藏中心。
实施例4使用三明治ELISA对人样本中ox-HD5的定量
从健康人志愿者(30～80岁，合计5名)采集血清和粪便。将粪便冷冻干燥16小时，加入不锈钢珠，使用拍打珠式均质机(Beads CrusherμT-12)进行粉碎。每50mg粪便粉末加入500μL PBS(-)，振荡16小时后，离心分离(20,400G，10min，4℃)，将回收的上清作为测定试样。三明治ELISA在实施例2中确定的最佳条件下实施。
将结果示于图9。从粪便提取液检测到平均6.10±2.63ng/mL的ox-HD5，从血清检测到1.81±0.38ng/mL的ox-HD5。确认到使用粪便提取液、血清中的任一种作为测定试样时，ox-HD5均可定量。
序列表自由文本
序列号1单克隆抗体12-1的重链CDR1的氨基酸序列
序列号2单克隆抗体12-1的重链CDR2的氨基酸序列
序列号3单克隆抗体12-1的重链CDR3的氨基酸序列
序列号4单克隆抗体12-1的轻链CDR1的氨基酸序列
序列号5单克隆抗体12-1的轻链CDR2的氨基酸序列
序列号6单克隆抗体12-1的轻链CDR3的氨基酸序列
序列号7单克隆抗体39E-7的重链CDR1的氨基酸序列
序列号8单克隆抗体39E-7的重链CDR2的氨基酸序列
序列号9单克隆抗体39E-7的重链CDR3的氨基酸序列
序列号10单克隆抗体39E-7的轻链CDR1的氨基酸序列
序列号11单克隆抗体39E-7的轻链CDR2的氨基酸序列
序列号12单克隆抗体39E-7的轻链CDR3的氨基酸序列
序列号13单克隆抗体12-1的重链的氨基酸序列
序列号14单克隆抗体12-1的轻链的氨基酸序列
序列号15单克隆抗体39E-7的重链的氨基酸序列
序列号16单克隆抗体39E-7的轻链的氨基酸序列
序列号17 HD5的前体的氨基酸序列
序列号18 HD5的成熟体的氨基酸序列
序列号19 HD6的成熟体的氨基酸序列
Figure IDA0003501436930000011
Figure IDA0003501436930000021
Figure IDA0003501436930000031
Figure IDA0003501436930000041
Figure IDA0003501436930000051
Figure IDA0003501436930000061
Figure IDA0003501436930000071
Figure IDA0003501436930000081
Figure IDA0003501436930000091
PCT/RO/134表
Figure 000001
Figure 000002

Claims (13)

1.一种对分子内具有二硫键的人α防御素HD5进行免疫学检测的方法，其包括：使用下述a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段和下述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段，通过三明治法对样本中的分子内具有二硫键的人α防御素HD5进行检测，
a)具有包含作为CDR1的序列号1的氨基酸序列、作为CDR2的序列号2的氨基酸序列和作为CDR3的序列号3的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号4的氨基酸序列、作为CDR2的序列号5的氨基酸序列和作为CDR3的序列号6的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段；
b)具有包含作为CDR1的序列号7的氨基酸序列、作为CDR2的序列号8的氨基酸序列和作为CDR3的序列号9的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号10的氨基酸序列、作为CDR2的序列号11的氨基酸序列和作为CDR3的序列号12的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段具备：
具有序列号13的氨基酸序列的重链可变区、或具有与序列号13的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的重链可变区，以及
具有序列号14的氨基酸序列的轻链可变区、或具有与序列号14的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的轻链可变区，
并且，
b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段具备：
具有序列号15的氨基酸序列的重链可变区、或具有与序列号15的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的重链可变区，以及
具有序列号16的氨基酸序列的轻链可变区、或具有与序列号16的氨基酸序列同源性为90％以上的氨基酸序列的轻链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为捕获抗体使用，b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为检测抗体使用。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其包括：在固相化有a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的载体中添加样本的工序、在所述载体中添加经标记的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段的工序、以及对结合于分子内具有二硫键的人α防御素HD5的b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段进行检测的工序。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，样本为人冷冻干燥粪便破碎物的水性介质提取液。
6.一种用于通过三明治法对分子内具有二硫键的人α防御素HD5进行免疫学检测的试剂盒，其包含：下述a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段和下述b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段，
a)具有包含作为CDR1的序列号1的氨基酸序列、作为CDR2的序列号2的氨基酸序列和作为CDR3的序列号3的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号4的氨基酸序列、作为CDR2的序列号5的氨基酸序列和作为CDR3的序列号6的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段；
b)具有包含作为CDR1的序列号7的氨基酸序列、作为CDR2的序列号8的氨基酸序列和作为CDR3的序列号9的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号10的氨基酸序列、作为CDR2的序列号11的氨基酸序列和作为CDR3的序列号12的氨基酸序列的轻链可变区，且与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为捕获抗体使用，b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段作为检测抗体使用。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，a)的单克隆抗体或其抗原结合性片段固相化在载体中，b)的单克隆抗体或其抗原结合性片段是经标记的。
9.一种与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其具有包含作为CDR1的序列号1的氨基酸序列、作为CDR2的序列号2的氨基酸序列和作为CDR3的序列号3的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号4的氨基酸序列、作为CDR2的序列号5的氨基酸序列和作为CDR3的序列号6的氨基酸序列的轻链可变区。
10.一种与分子内具有二硫键的人α防御素HD5特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其具有包含作为CDR1的序列号7的氨基酸序列、作为CDR2的序列号8的氨基酸序列和作为CDR3的序列号9的氨基酸序列的重链可变区、以及包含作为CDR1的序列号10的氨基酸序列、作为CDR2的序列号11的氨基酸序列和作为CDR3的序列号12的氨基酸序列的轻链可变区。
11.一种核酸，其编码权利要求9或10所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
12.一种载体，其包含权利要求11所述的核酸。
13.一种宿主细胞，其包含权利要求11所述的核酸。
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