DD260132A1

DD260132A1 - Verfahren zur nutzung monoklonaler antikoerper gegen fitc

Info

Publication number: DD260132A1
Application number: DD30209487A
Authority: DD
Inventors: Burkhard Micheel; Gudrun Scharte; Guenter Kaiser; Peter Jantscheff; Volker Boettger; Leonid Karawajew
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-04-24
Filing date: 1987-04-24
Publication date: 1988-09-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Nutzung von monoklonalen Antikoerpern (MoAk) gegen Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) in immunologischen Tests. Ziel der Erfindung ist der Einsatz von MoAk gegen FITC als universelle Bindungs- und damit Nachweisreagenzien in den verschiedensten immunologischen Verfahren. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass als einheitliche Kopplungssubstanz FITC fuer die Markierung der in immunologischen Nachweisverfahren verwendeten Indikatorreagenzien eingesetzt wird. Der Nachweis bzw. die Bindung erfolgt dann durch den Einsatz von MoAk gegen FITC, die mit einem in hochsensitiven Immuntests verwendeten Marker (Radioisotop, Enzym, usw.) oder auch festen Traegern gekoppelt sind. Fuer die Nachweisreaktionen wurden die durch die Hybridzellklone B13-AF9 und B13-DE1 produzierten MoAk gegen FITC verwendet, die im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie (Liste 1986) unter den Nummern DDR 0108 bzw. DDR 0109 hinterlegt wurden. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschl. der Medizin.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Nutzung von monoklonalen Antikörpern (MoAk) gegen Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) in immunologischen Tests.

Anwendungsgebiet der Erfindung sind die verschiedensten Gebiete der Biowissenschaften, einschließlich der Medizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Hochempfindliche immunologische Nachweisverfahren beruhen auf der spezifischen Erkennung der nachzuweisenden Substanz durch Antikörper. Voraussetzung ist die Markierung der Indikatorreagenzien mit einer Substanz, die noch in sehr geringen Konzentrationen nachweisbar ist. Die wichtigsten Markierungssubstanzen für hochempfindliche Immuntests sind Radioisotope, Enzyme, Fluoreszenzmarker oder Lumineszenzmarker. Die Sensitivität eines Immuntests hängt neben der Bindungsstärke der verwendeten Antikörper auch von der Effektivität der Kopplung der Markierungssubstanzen ab, die für verschiedene Proteinmoleküle, einschließlich Antikörper unterschiedlich sein kann. Aus diesem Grunde muß für jeden Immuntest eine optimale Markierungsmethode der Nachweisreagenzien erarbeitet werden, und für verschiedene Immuntests liegen demzufolge auch die verschiedensten markierten Reagenzien vor.

Fast alle Proteine, einschließlich der Antikörper lassen sich verhältnismäßig leicht mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) markieren, ohne daß die biologische Aktivität der Proteinmoleküle ernstlich beeinträchtigt wird. Diese Eigenschaft wird seit langem in der Immunhistologie durch den Einsatz FITC-markierter Antikörper und der Auswertung der Tests unter dem Fluoreszenzmikroskop genutzt. Für eine generelle Nutzung in hochsensitiven Fluoroimmuntests erwies sich FITC jedoch als bedingt geeignet.

Die leichte Markierbarkeit von Proteinen mit FITC und die Möglichkeit der Herstellung von Antikörpern gegen FITC wurden in ersten Experimenten für Zelltrennungsverfahren und für immunhistologische Nachweise ausgenutzt. Dabei wurden für die Zelltrennung polyklonale (BARAN, M. M. et al., J. Immunol. Meth. 53,321,1982) und für die Immunhistologie monokonale Anti-FITC-Antikörper (HAAIJMAN, J. J. et al., 84,363,1986) eingesetzt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist der Einsatz von monoklonalen Anitkörpern gegen Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) als universelle Bindungsund damit Nachweisreagenzien in den verschiedensten immunologischen Verfahren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, monoklonale Antikörper gegen FITC als Nachweisreagenzien in den verschiedensten immunologischen Verfahren zu nutzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Nutzung monoklonaler Antikörper gegen FITC ist dadurch gekennzeichnet, daß die in einem immunologischen Test verwendeten Indikatorproteine (Antikörper, Antigene, etc.) mit FITC markiert werden und daß die FITC-markierten Proteine nach Einsatz in den entsprechenden Tests mit den monoklonalen Antikörpern gegen FITC nachgewiesen werden, die ihrerseits mit einer noch in geringer Konzentration nachweisbaren Markierungssubstanz, wie z. B. Radioisotopen, Enzymen etc. gekoppelt sind. Da FITC leicht an unterschiedliche Proteine koppelbar ist, können z. B. Radioisotopoder Enzym-markierte monoklonale Anti-FITC-Antikörper als universelle Reagenzien für die unterschiedlichsten immunologischen Tests genutzt werden.

Die Kopplung mit FITC und der Einsatz von Anti-FITC-Antikörpern kann demzufolge zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern in Lösung, für immunhistologische und -zytologische Tests, als Nachweisreaktionen beim Proteinblotting, zur Nukleinsäurehybridisierung, zur Zelltrehnung etc. eingesetzt werden. Da die Anti-FITC-Antikörper die Fluoreszenz des FITC löschen, ist auch auf dieser Basis eine Testentwicklung möglich

Die für die erfindungsgemäße Nutzung eingesetzten monoklonalen Anti-FITC-Antikörper wurden von den Hybridzellklonen

B13-DE1 und B13-AF9 gewonnen/die im Zentralinstitut für Molekularbiologie (ZIM-Liste 1986) unter den Nummern DDR 0109 bzw. DDR 0108 hinterlegt wurden.

Die Erfindung soll nachstehend an 3 Ausführungsbeispielen erläutert werden. .

Ausführungsbeispiele

1. Monoklonale Antikörper gegen Fluoreszeinisothiozyanat (FITC)

Für die Verfahren wurden spezifische monoklonale Antikörper gegen FITC eingesetzt, die durch die Klone B13-DE1 (ZIM-Liste 1986 Nr. DDR 0109,) und B13-AF9 (ZIM-Liste 1986 Nr. DDR 0108) produziert weTden. Die Antikörper wurden aus der Aszitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatpräzipitation angereichert bzw. über Hydroxyl apatit gereinigt. Als Markierungssubstanz für die Antikörper wurde in vorliegenden Beispielen ¹²⁵J benutzt, so daß die Auswertung auf der Basis von Radioimmuntests erfolgte.

2. Markierung der verwendeten Proteine mit FITC

Die Markierung mit FITC ist eine Standardmethode, die in vorliegenden Beispielen entsprechend der Beschreibung von M. M. GANI, et al. (J. Immunol. Meth. 34,133,1980) durchgeführt wurde.

3. Angewendete Nachweisverfahren a) Antikörpernachweis

Ein sensitiver radioimmunologischer Nachweis von Antikörpern, einschließlich von monoklonalen Antikörpern kann mit Hilfe von Festphasen-Radioimmuntests nach folgendem Inkubationsschema durchgeführt werden:

Gereinigte Anti-Immunglobulin (Ig)-Antikörper werden an Polyvinylchlorid (Tablettenblister) adsorbiert, nach Waschen unter Leitungswasser erfolgt die Inkubation mit den nachzuweisenden Antikörpern und (nach weiterem Waschen) im letzten Schritt mit dem entsprechend ¹²⁵J-markierten Antigen (B. MICHEEL, et al., J. Immunol. Meth. 46,41,1981). Bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen FITC erfolgt an Stelle der Inkubation mit ^12SJ-markiertem Antigen eine Inkubation mit FITC-markiertem Antigen und nachfolgend mit ¹²⁵J-markierten Anti-FITC-Antikörpern. Ein Vergleich beider Methoden ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Nachweis der Reaktivität von monoklonalen Anti-HCG^-Antikörpern²¹ in zwei Festphasen-Radioimmuntests

Antikörperverdünnung Bindung von Radioaktivität

an fester Phase³¹

10-¹ ΙΟ"² ΙΟ"³ ΙΟ"⁴ ΙΟ"⁵ 10"^e 10-⁷ 10"³ ΙΟ'⁹ 10

Methode 1⁴⁾	Methode 2^5I
5906	5844
5682	6598
5934	6189
6112	5997
5209	5166
4089	5731
2363	2 046
1116	1318
754	937
700	793

1) HCG = humanes Choriogonadotropin

2) Es werden die vom Hybridzellklon B9-AB9 (ZIM-Liste 1986, Nr. DDR 0107, WP 244564) produzierten monoklonalen Antikörper eingesetzt 3^ Wertein c. p.m. (counts per minute)

4J Inkubationsreihenfolge: Ziege-Anti-Maus Ig, MoAk gegen HCG, ¹²⁵J-HCG

5) Inkubationsreihenfolge: Ziege-Anti-Maus Ig, MoAk gegen HCG, FITC-HCG, ¹²⁵J-MoAk gegen FITC (zur Vermeidung unerwünschter Bindungen wurde dem Verdünnungspuffer der letzten MoAk normales Mausserum in einer Konzentration von 1 % zugesetzt)

Beide Methoden zeigen die gleiche Nachweisgrenze. Die ¹²⁵J-markierten Anti-FITC-Antikörper konnten mit gleichem Ergebnis für eine Reihe weiterer Antigen-Antikörpersysteme eingesetzt werden.

b) Antigennachweis

Der Nachweis von Antigenen in wäßrigen Lösungen wurde auf der Basis von Zwei-Seiten-Bindungstests (Sandwich-Tests) durchgeführt.

Derartige Tests beruhen darauf, daß ein Antikörper an eine feste Phase gebunden wird, darauf erfolgt die Inkubation mit der zu untersuchenden Probe und im letzten Schritt mit markierten Antikörpern. Der Einsatz von monoklonalen Anti-FITC-Antikörpern erfolgte in einem Testsystem zum Nachweis von HCG in einer Standardlösung. Folgende Inkubationssequenz wurde durchgeführt: Adsorption von MoAk gegen HCG produziert vom Hybridzellklon B9-AB9, ZIM-Liste 1986, Nr. DDR 0107, WP 244564 an Polyvinylchlorid, HCG-Standardlösung in verschiedenen Verdünnungen, FITC-markierte MoAk gegen HCG produziert vom Klon B9-BA8, ZIM-Liste 1986, Nr. DDR 0104, Patentanmeldung WP 244565 ¹²⁵J-markierte MoAk gegen FITC.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: Nachweis von HCG in einer Standardlösung in einem Zwei-Seiten-Bindungstest mit MoAk gegen HCG und einem MoAk gegen FITC

Verdünnung der	Bindung von Radioaktivität
Standardlösung¹'	an der festen Phase²¹
1:10	13747 ±4294
1:20	10 696 + 1497
1:40	5896± 653
1:80	3 599± 272
1:160	1965+ 195
1:320	1542+ 158 . .
1:640	1240± 81
1:1280	1119± 78
1:2560	1094± 52 '
1:5120	1116± 25
1) Standardlösung enthielt 1 IU/mI
2) Werte in cp.m. (counts per minute), Mittelwerte und Standardabweichungen von Vierfachbestimmungen

Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, liegt die Sensitivitätsgrenze des Tests unter 10 mlU/ml (das würde der Verdünnungsstufe 1:100 entsprechen). Der Test entspricht damit dem internationalen Standard für hochsensitive HCG-Nachweisverfahren. Die ¹²⁵J-markierten Anti-FITC-Antikörper konnten mit ähnlichen Resultaten für andere Antigenbestimmungen eingesetzt werden, c) Nutzung in der Immunzytologie

Der Nachweis von Antigenen auf Zellen wurde auf der Basis eines indirekten Radioimmunbindungstests durchgeführt. Derartige Tests beruhen darauf, daß Zellen mit einem Antigenspezifischen Antikörper inkubiert werden und in einem zweiten Schritt die Bindung des Antikörpers an die Zellen durch einen markierten Anti-Antikörper nachgewiesen wird. In konventionellen Tests wird zum Nachweis des gebundenen Antigen-spezifischen Antikörpers ein Anti-Immunglobulin-Antikörper einer anderen Spezies eingesetzt. Der Einsatz von Anti-FITC-Antikörpern erfolgte in einem Testsystem zum Nachweis von karzinoembryonalem Antigen (CEA) auf Zellen. Dabei wurde die Effektivität des Nachweises durch ¹²⁵J-markierte Anti-FITC-Antikörper mit der konventionellen Nachweismethode durch ¹²⁵J-markierte Kaninchen-anti-Maus-lmmunglobulin-Antikörper verglichen.

Folgende Versuchsanordnung wurde gewählt: Methode 1: Zellen der Kolonkarzinom-Zellinie LS 174 inkubiert mit FITC-markierten MoAk gegen CEA, die vom Hybridzellklon D14-HD11 (ZIM-Liste 1986, Nr. DDR 0103, produziert wurden, waschen, danach Inkubation mit ¹²⁵J-markierten

Kaninchen-anti-Maus-lmmunglobulin-Antikörpem

Methode 2: Zellen der Kolonkarzinom-Zellinie LS 174 inkubiert mit FITC-markierten MoAk gegen CEA, die vom Hybridzellklon D14-HD11 (ZIM-Liste 1986, Nr. DDR 0103, produziert wurden, waschen, danach Inkubation ¹²⁵J-markierten MoAk

gegen FITC

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3: Nachweis von CEA auf Zellen der Kolonkarzinom-Zellinie LS 174 im Radioimmunbindungstest mit Hilfe von MoAk gegen CEA und ¹²⁵J-markierten Kaninchen-anti-Maus-lmmunoglobulin-Antikörpern bzw. ¹²⁵J-markierten MoAk gegen FITC

Verdünnung der FITC-markierten MoAk gegen CEA

Methode 1	Methode 2
(¹²⁵J-Anti-Maus-	(¹²⁵J-MoAk
Immunoglobulin)	gegen FITC)
3120¹¹	12163
2925	8699
2461	5451
1105	2 040
450	1010
325	850

Kontrolle

1) Werte in cp.m. (counts per minute).

Die Ergebnisse zeigen, daß die Nachweisgrenze mit beiden Methoden vergleichbar ist. Sie liegt bei der Antikörperverdünnung 1:51200. Die quantitativen Unterschiede in den Meßwerten sind wahrscheinlich auf Unterschiede in der ¹²⁵J-Markierung zurückzuführen.

Die Methode konnte auch auf andere Testsysteme übertragen werden. Sie bietet besondere Vorteile bei Arbeiten, die im konventionellen Versuchsansatz zu unerwünschten Kreuzreaktionen führen (wie z. B. in autologen oder allogenen Systemen).

Claims

1. Verfahren zur Nutzung von monoklonalen Antikörpern (MoAk) gegen Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) für immunologische Nachweisverfahren, gekennzeichnet dadurch, daß die für derartige

- Verfahren eingesetzten Indikatorreagenzien mit FITC gekoppelt werden und daß nach Einsatz der FITC-gekoppelten Reagenzien ein Nachweis bzw. eine Bindung durch MoAk gegen FITC erfolgt, die ihrerseits mit einem Marker bzw. festen Träger gekoppelt sind oder durch die Löschung der FITC-Fluoreszenz einen meßbaren Effekt hervorrufen.

2. Verfahren zur Nutzung von monoklonalen Antikörpern (MoAk) gegen Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) für immunologische Nachweisverfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die MoAkgegen FlTC von den Hybridzellklonen B13-AF9 (ZIM-Liste 1986: DDR Nr.0108) und B13-DE1 (ZIM-Liste 1986: DDR Nr. 0109) produziert werden.