DE3323137A1 - Verfahren zum nachweis von mehrwertigen, spezifischen, bindenden substanzen in biologischen fluessigkeiten - Google Patents

Verfahren zum nachweis von mehrwertigen, spezifischen, bindenden substanzen in biologischen fluessigkeiten

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DE3323137A1
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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Description

q Q 9 ^ 1 ° n
3980 . -H-
Immunoassays, bei denen Teilchen gezählt werden, sind als nicht-radioaktive Immunoassays bekannt; vgl. J.Immunol. Methods, Bd. 18 (1977) S. 33 bis HH. Dieses Verfahren beruht auf der Agglutination von Latexteilchen oder ähnlichen Teilchen, die mit einer Substanz, die eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingehen kann, be- * schichtet sind. Die Agglutination wird unter Verwendung eines optischen oder elektrischen Zählgeräts (Counter), wie sie beispielsweise beim Zählen von Blutzellen verwendet werden, gemessen, um die Verringerung der Anzahl an nicht-· agglutinierten Teilchen zu bestimmen.' Dieses Verfahren wurde zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und Immunkomplexen angewendet; vgl. J. Autom. Chem., Bd. 2 (1980), S. 1i»9 bis 152, J. Immunol. Methods, Bd. 23 (1978), S. bis 50 und J. Immunol. Methods, Bd. 28 (1979), S. 13 bis 23. Eine Variante dieses Verfahrens wurde zur Bestimmung von kleinen Molekülen, wie Digoxin, angewandt; vgl. Clin. Chem., Bd. 27/1, (1981), S. 1205 bis 1209. Die. Ermittlung der Anzahl von agglutinierten Teilchen ist ebenfalls gut bekannt.
Es wurden Varianten der Verfahren zur Teilchenzählung entwickelt, um die dabei auftretenden Schwierigkeiten zu überwinden. Beispielsweise wurde die Anwendung von 2 Inkubationsstufen und von Teilchen unterschiedlicher Grossen beschrieben, um das sogenannte "prozoning-Problem" (Proben mit sehr hohem Antigengehalt erweisen sich scheinbar als negativ, da eine minimale Agglutination vorliegt) zu überwinden; vgl. DE-0Sen 30 06 899 und 29 18
Das erfindungsgeraässe Verfahren unterscheidet sich vom Stand der Technik insbesondere darin, dass Teilchen eingesetzt werden, die nachweisbar unterschiedliche Eigenschaften,
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3 π ο /
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z.B. in bezug auf die Grosse und die Fluoreszenz, besitzen. Anstelle der Messung des Versehwindens von nicht-aggregierte Teilchen wird die Bildung von Aggregaten der beiden unterschiedlichen Teilchen und der zu bestimmenden Substanzen gemessen, indem man innerhalb des Aggregats unterschiedliche Teilcheneigenschaften, die beispielsweise ein grosses Teilchen (d.h. die Grosse) und ein kleines fluoreszierendes Teilchen (d.h. die Fluoreszenz) aufweisen, bestimmt. Diese Messung wird in einem optisch-elektrischen Doppelkanal-Zählgerät der in der US-PS H 198 160 beschriebenen Art oder in einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer mehrwertigen, spezifischen, bindenden·Substanz in einer biologischen Flüssigkeit. Erste und zweite mikroskopische Teilchen, die unterschiedliche nachweisbare Eigenschaften aufweisen und mit einer Substanz, die mit der mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanz eine Bindung eingehen kann, beschichtet sind, wobei Aggregate, die die ersten und zweiten mikroskopischen Teilchen enthalten, in Gegenwart der mehrwertigen, bindenden Substanz gebildet werden, werden durch Messung der unterschiedlichen Eigenschaften, die mit den ersten und zweiten mikroskopischen Teilchen innerhalb des Aggregats assoziiert sind, nachgewiesen. Typischerweise umfasst die Erfindung den Nachweis von mehrwertigen Antigenen in Lösung unter Verwendung von antikörperbeschich.te.ten Teilchen mit 2 unterschiedlichen Grossen: Nicht-fluoreszierer.de Teilchen im Grössenbereich von 2J bis 50 um und fluoreszierende Teilchen im Grössenbereich von 0,8 bis 10 ^m. In einer Probe ohne Antigen werden das fluoreszierende und nicht-fluoreszierende Teilchen nicht verknüpft, während in einer antigenhaltigen -Probe die grossen, nicht . fluoreszierenden Teilchen mit den fluoreszierenden Teilchen unter Bildung von Aggregaten verknüpft werden.
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Gegenstand der Erfindung sind auch die neuen Aggregate von 4 bis 50 jim-nicht-fluoreszierenden Teilchen und 0,08 bis 10 um-fluoreszierenden Teilchen, die jeweils mit einer Substanz, die mit einer mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanz, eine Bindung-eingehen kann beschichtet sind und die durch eine derartige mehrwertige, spezifische, bin-"dende Substanz miteinander verbunden sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zum Nachweis von einwertigen, spezifischen, bindenden Substanzen.
Der Ausdruck "mehrwertige, spezifische, bindende Substanz, bezieht sich auf Antigene, Antikörper und andere biologische •Moleküle mit mehr als einer spezifischen bindenden Stelle. Virale Antigene, wie solche,die mit Hepatitis (Hepatitis B-Oberflächen-Antigen, Hepatitis Α-Antigen, Hepatitis-Kern-Antigen), Herpes- oder anderen viralen Erkrankungen assoziiert sind, sowie deren Antikörper sind Beispiele für mehrwertige, spezifische, bindende Substanzen. Bakterien und bakterielle Antigene, wie Neisseria gonorrheae und Streptococcus sind weitere mehrwertige, spezifische, bindende Substanzen. Mit Krebs assoziierte Antigene, wie karzinoembryonales Antigen (CEA) sind ebenfalls mehrwertige, spezifische, bindende Substanzen, die erfindungsgemäss bestimmt werden können. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunoassays sind eine Reihe weiterer mehrwertiger, spezifischer, bindender Substanzen geläufig.
.Ferner können auch einwertige, spezifische, bindende Substanzen unter Anwendung der erfindungsgemässen Methoden und Reagentien bestimmt werden, wobei man Polymerisate mit einer Mehrzahl von gebundenen einwertigen, spezifischen, bindenden Substanzen und Teilchen, die mit einer Substanz beschichtet sind, die mit der einwertigen, spezifischen,
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bindenden Substanz eine Bindung eingehen kann, verwendet. Die einwertigen, spezifischen, bindenden Substanzen in der unbekannten Probe konkurrieren um die bindenden Stellen an den Teilchen und hemmen die Agglutination zwischen dem Teil-, chen und dem Polymerisat mit der daran gebundenen einwertigen, spezifischen, bindenden Substanz. Somit werden Arzneistoffe und Hormone mit einem Polymerisat, beispielsweise mit Proteinen, wie Rinderserumalbumin, oder mit Polysacchariden, wie Dextran, konjugiert, wobei synthetische mehrwertige, spezifische, bindende Substanzen gebildet werden, die in der Lage sind, die mikroskopischen Teilchen der vorstehend beschriebenen Art zu binden, vorzugsweise nichtfluoreszierende mikroskopische Teilchen, die mit einer Substanz, die mit den synthetischen mehrwertigen, spezifischen, bindenden Teilchen eine Bindung eingehen kann, und kleine mikroskopische fluoreszierende Teilchen, die auf entsprechende Weise beschichtet sind. Das entstandene Aggregat, wird auf die vorstehend erläuterte Weise nachgewiesen.
Erfindungsgemäss werden 2 Typen von mikroskopischen Teilchen verwendet, die jeweils nachweisbar unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Bei den Teilchen handelt es sich im allgemeinen um synthetische Polymerisate, wie Polystyrol,.Polypropylen, Polyacrylat und dergleichen. Erfindungsgemäss können auch rote Blutkörperchen der in der US-PS 3 715 427 beschriebenen Art als Teilchen verwendet werden. Ein bevorzugtes Teilchenmaterial ist Polystyrol, auch als Polystyrol-Latex-Teilchen bezeichnet. Entsprechende Teilchen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Mikroteilchen allgemein bekannt. Bevorzugt ist auch die Verwendung von Teilchen mit zwei unterschiedlichen Grossen, d.h. von grösseren Teilchen im Bereich von 4 bis 50 ^m und von kleineren Teilchen im Bereich von 0,08 bis 10 um. Vorzugsweise sind die kleinen Teilchen fluoreszierend markiert. Diese Markierung
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wird erreicht, indem man den Teilchen ein fluoreszierendes Material einverleibt oder an die Oberfläche der Teilchen fluoreszierende Moleküle anheftet.
Die einzelnen Teilchen sind mit einer Substanz, die eine spezifische Bindung mit der mehrwertigen, bindenden Substanz eingehen kann, beschichtet- Typischerweise werden zum Nachweis eines mehrwertigen Antigens die Teilchen mit dem Antikörper für das Antigen beschichtet. Insbesondere werden zum Nachweis von Hepatitis B-Oberflächenantigen die Teilchen mit Antikörper oder F (ab1)p-Fragment des Antikörpers gegen Hepatitis B-Oberflächen-Antigen beschichtet. Nachstehend sind Beispiele für entsprechende Systeme angegeben:
Beschichtung der grossen Teilchen
mehrwertige, bindende Substanz
6 μΐη - Meerschweinchen- Hepatitis B-Ober· anti-HBsAg IgG flächen-Antigen
6 um - monoklonaler Antikörper I anti-CEA
6 pm - Hepatitis B-Oberflächenantigen
CEA
Anti-HBsAg
monoklonaler Antikörper I anti-Chlamydia
fixierte rote Blutkörperchen - Meerschweinchen -an ti-HBsAg IgG
6 um Antikörper gegen Digoxin
6 jim - Antikörpergegen Digoxin
Chlaraydia
HBsAg
Beschichtung der kleinen Teilchen
0,49 pm - Ziegenanti-HBsAg F(ab·)2*
0,49 pro - monoklonaler Antikörper II anti-CEA
0,49 pm - Hepatitis B-Oberflächenantigen
0,9 pm monoklonaler Antikörper anti-Chlamydia
0,624 um Ziegenanti-HBsAg F (ab')^
Rinderserumalbumin 0,49 pm- Antikörper mit einer Mehrzahl gegen Digoxin von daran gebundenen Digoxinmolekülen
Dextran mit einer 0,49 pm Antikörper Mehrzahl von daran gegen Digoxin gebundenen Digoxinmolekülen
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• * Λ ψ r r ^ * it t -
* F (ab')p: Fragment von anti-HBsAg IgG mit einer Aktivität gegen HBsAg
Die Teilchen werden durch Adsorption oder durch kovalente Verknüpfung unter Anwendung beliebiger herkömmlicher Beschichtungsverfahren beschichtet.
In der Praxis bewirkt die Anwesenheit der mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanz in einer Testprobe die Agglutination (Aggregation) der Teilchen. Somit sind im Aggregat Teilchen mit nachweisbar unterschiedlichen Eigenschaften vorhanden. Das Aggregat lässt sich durch Messen dieser Eige schäften nachweisen. Typischerweise werden eine Anzahl von kleinen fluoreszierenden Teilchen an ein grosses nichtfluoreszierendes Teilchen gebunden, und das Aggregat wird durch Messen dessen spezieller Kombination aus Grosse und Fluoreszenz nachgewiesen. Das Aggregat kann auch nachgewiesen werden, indem man die grossen und kleinen Teilchen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen markiert und die Doppelfluoreszenz des Aggregats nachweist. Das Zweiparametersystem (Volumen + Fluoreszenz oder zwei fluoreszierende Teilchen) ist deshalb besonders vorteilhaft, da es falsche positive Ergebnisse aufgrund einer nicht spezifischen Aggregation eines jeden Teilchentyps vermeidet.
Falsche positive Ergebnisse werden auch durch eine Vorbehandlung des Serums mit Pepsin unter Verdauung von nichtspezifischen Serumstörfaktoren verringert. Eine wirksame Vorbehandlung besteht beispielsweise darin, dass man gleiche Volumina an Serum und 1-prozentiger Pepsinlösung in 0,15 m Salzsäure 15 Minuten bei 37 C inkubiert und die Lösung anschliessend mit 0,5 ra Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Die Pepsinbehandlung ist bei der Hepatitisbestimmung be-
sonders vorteilhaft, da das Hepatitis-Antigen gegen eine Verdauung durch Pepsin beständig ist.
Ferner wurde festgestellt, dass die nicht-spezifische Agglutination der beiden Teilchen sowohl während der Lagerung als auch während des Tests verringert werden kann, indem . man die Teilchen in einem optimierten Puffer suspendiert'. Beispielsweise verringert ein Puffer mit 0,1 m Glycin und 0,15 m Natriumchlorid vom pH-Wert 9,2 mit einem Gehalt an 1 Prozent Rinderseruraalbumin, 1 m NaCl und TO Prozent Dimethylformamid die nicht-spezifische . Agglutination, was zu einer Verbesserung des Tests führt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Beschichtung von Mikroteilchen mit anti-HBsAg-Antikörperr;
Polystyrolteilchen (6 μηι, 10-prozentige Suspension) werden durch wiederholtes Waschen in Wasser und anschliessendes 3-maliges Waschen in Methanol von oberfkächenaktiven Mitteln freigewaschen. 6 mg Meerschweinchen-anti-HBsAg IgG werden zu einer Suspension von 6 χ 10 Teilchen in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 7,4 (Gesamtvoluraen 14 ml) gegeben. Das Gemisch wird über Nacht (20 Stunden) bei Raumtemperatur unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs gerührt. Die Teilchen werden 2 mal mit PBS gewaschen und in einer Konzentration von 6 χ 10 Teilchen/ml in PBS mit einem Gehalt an 1 Prozent Rinderserumalbumin und 0,1 Prozent Natriumazid resuspendiert.
In entsprechender Weise werden 0,49 lim fluoreszierende Teilchen (Polysciences, Inc., 4 χ 10 insgesamt) mit 300 durch Äffinitätschrcraatographie gereinigtes Ziegen-anti-HRsAg F (ab')p C1 ml Gesaintbeschichtungsvoluraen) beschichtet. Nach dem Beschichten werden die Teilchen 2 mal mit PBS ge-
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waschen und in einer Konzentration von 6 χ 10 Teilchen pro ml in PBS mit einem Gehalt an 1 Prozent Rinderserumalbuniin und 0,1 Prozent Natriumazid resuspendiert.
Beispiel 2 ,HBsAg-Test ·
Vorbehandlung:
100 pi Serum oder Plasma werden mit 100 ul 1-prozentiger Pepsinlösung in 0,15 m HCl versetzt. Man lässt das Gemisch 15 Minuten in einem Wasserbad von 37 C inkubieren und neutralisiert dann mit 0,5 ra NaOH.
50ul 6 um-Teilchen, die mit Meerschweinchen-Anti-HBsAg IgG (3 x 10 Teilchen insgesamt) beschichtet sind, werden zu der vorbehandelten Probe gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Tektator-Brehschüttelgerät (220 U/mii geschüttelt. Kleine fluoreszierende Mikroteilchen (0,^)9 um, 3 x 10 insgesamt), die mit Ziegen-anti-HBsAg F(ab')p-Fragmenten beschichtet sind, werden sodann zugesetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei etwa 1500 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die grossen und die kleinen Teilchen zu vermischen.
In Proben mit einem Gehalt an HBsAg werden Aggregate von 6 umTeilchen und kleinen fluoreszierenden Teilchen gebildet. In HBsAg-negativen Proben wird nur ein geringer Anteil an 6 jjm-0,^9 Jim-Aggregat en gebildet. Die Anwesenheit oder Abwesenheit derartiger Aggregate kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Mikroskops oder mittels einer Vorrichtung, die zur gleichzeitigen Messung von Volumina und Fluoreszenzsignalen geeignet ist, zahlenmässig bestimmt werden. ·
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Beispiel 3
Beschichtung von Mikroteilchen mit anti-CEA-monoklonalen Antikörpern
Mikroteilchen (6^m, 2 χ 10 insgesamt, Microspheres Research) werden 5 mal in PBS vom pH-Wert 8,3 gewaschen. Die gewaschenen Kügelchen werden mit 20OxUg monoklonalem Antikörper I-anti-CEA und 200^1 PBS vom pH-Wert 8,3 versetzt. Die Teilchen werden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, 3 mal in 0,1 m Glycin, 0,15 m NaCl vom pH-Wert 9,2 mit einem Gehalt an 1 Prozent Rinderserumalbumin (GBS-BSA) gewaschen und in 1 ml GBS-BSA resuspendiert.
In entsprechender Weise werden fluoreszierend gefärbte 0,49 ,um-Teilchen (1,6 χ 10 insgesamt, Polysciences Inc.) zu einer Beschichtungslösung mit einem Gehalt an 120xul monoklonalem Antikörper II-anti-CEA (90 ^g) und 120^1 PBS vom pH-Wert 8,3 gegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt, 2 mal mit GBS-BSA gewaschen und in 1 ml GBS-BSA resuspendiert.
Beispiel 4
CEA-Test
Beschichtete Mikroteilchen werden in GBS-BSA 1:30 verdünnt. 300 ul. Serum werden mit 50 ul 6 ^jm-Teilchen, die mit monoklonalem Antikörper I beschichtet sind, (3,18 χ 10 insgesamt) und 200^uI 1 m Glycin, 1,15 m NaCl vom pH-Wert 9 gegeben. Das Geraisch wird 1 Stunde bei 45 C inkubiert und sodann mit 1 ml GBS gewaschen. Fluoreszierend gefärbte 0,49^um-Teilchen (50 ul, 2,6 χ 10 insgesamt), die mit monoklonalem Antikörper II beschichtet sind, werden zugesetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei etwa 1500 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die ö^um- und 0,49^um-Teilchen
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zu vermischen. Die Suspension wird mit 1 ml normaler Kochsalzlösung verdünnt. Die Anzahl der 6 um- 0,49 ^um-Aggregate wird bestimmt. Dieses Testverfahren erlaubt die quantitative Bestimmung von CEA gemäss nachstehender Tabelle.
Eichkurve, aufgestellt' mittels Strömungstest mit gemischten rfronoklonalen CEA-Teilchen
Anzahl der 6 μπι-0,49 ^um-Aggre-
CEA-Konzentration (ng/ml) gate bezogen auf insgesamt 10 000 6^-Teilchen
Mittelwert
0 616
1 709
2 850 5 ' 942
10 1154
20 1541
Beispiel 5
Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich auch zur Bestimmung von einwertigen bindenden Substanzen heranziehen. Nicht-fluoreszierende 6,0 ^um-Teilchen werden mit Antikörper gegen Digoxin beschichtet. Die Testprobe wird mit den beschichteten Teilchen und Rinderserumalbumin mit einer Mehrzahl von daran gekuppelten Digoxinmolekülen inkubiert. Nach der Inkubation werden kleine fluoreszierende Teilchen, die mit anti-Digoxin-Antikörper beschichtet sind, zugesetzt. In einer Probe ohne Digoxin bindet das Digoxin-BSA die grossen und kleinen Teilchen aneinander. In einer Probe mit einem Gehalt an Digoxin konkurriert der Arzneistoff mit Digoxin-BSA um die bindenden Stellen an der ersten festen Phase und verringert dadurch die Anzahl an gebildeten Volumen-Fluoreszenz-Aggregaten,
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Auf entsprechende Weise können andere einwertige (mit einer spezifischen, bindenden Stelle) Substanzen wie,Arzneistoffe, Hormone und dergleichen, an Rinderseruraalbumin, Dextran oder ähnliche synthetische Polymerisate für ähnliche Bestimmungsverfahren gebunden werden.
Ende der Beschreibung

Claims (4)

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois 60064 V.St.A. Verfahren zum Nachweis von mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanzen in biologischen Flüssigkeiten Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer mehrwertigen, spezifischen bindenden Substanz in einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man
mit der biologischen Flüssigkeit erste und zweite mikroskopische Teilchen, die unterschiedliche nachweisbare Eigenschaften aufweisen und mit einer Substnaz, die mit der mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanz eine Bindung eingehen kann, beschichtet sind, vermischt, wobei in Gegenwart der mehrwertigen bindenden Substanz Aggregate gebildet werden, die die ersten und zweiten mikroskopischen Teilchen enthalten, und
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die Aggregate durch Nachweis der unterschiedlichen, mit den ersten und zweiten mikroskopischen Teilchen im Aggregat assoziierten Eigenschaften nachweist.
2. Verfahren zum Nachweis einer mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanz in biologischen Flüssigkeiten, dadurch 'gekennzeichnet, dass man
mit der biologischen Flüssigkeit nicht fluoreszierende mikroskopische Teilchen und kleinere fluoreszierende mikroskopische Teilchen vermischt," wobei die fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Teilchen mit einer Substanz, die mit der mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanz eine Bindung eingehen kann,beschichtet sind, wodurch in Gegenwart der mehrwertigen, spezifischen, bindenden Substanz Aggregate, die die nichtfluoreszierenden Teilchen und eines oder mehrere fluoreszierende Teilchen enthalten, gebildet werden, und
das Aggregat aufgrund seiner Grossen- und Fluoreszenzeigenschaften nachweist.
3- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man biologische Flüssigkeiten verwendet, die durch Pepsinverdauung vorbehandelt worden, sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren in einer Lösung durchführt, die folgendes enthält: etwa 0,1 m Glycin, 0,15 m Natriumchlorid, gepuffert auf pH-Wert 9,2 mit einem Gehalt an 1 Prozent Rinderserumalbumin, 1 m NaCl und 10 Prozent Dimethylformamid .
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Wässrige Suspension von Aggregaten eines nicht-fluoreszierenden mikroskopischen Teilchens, an das kleinere, fluoreszierende, mirkoskopische Teilchen gebunden sind, wobei die einzelnen Teilchen mit einer spezifischen, bindenden Substanz beschichtet und miteinander durch eine mehrwertige, spezifische, bindende Substanz, die eine Bindung mit der spezifischen, bindenden Substanz, mit denen die Teilchen beschichtet sind, eingehen kann, gebunden sind.
Verfahren zum Nachweis einer einwertigen, spezifischen, bindenden Substanz in einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man mit der biologischen Flüssigkeit ein Polymerisat , an das eine Mehrzahl der einwertigen, spezifischen, binden Substanz gebunden ist, nicht-fluoreszierende mikroskopische Teilchen und kleinere fluoreszierende mikroskopische Teilchen vermischt,
wobei die fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Teilchen mit einer Substanz, die mit der einwertigen, spezifischen, bindenden Substanz in der biologischer. Flüssigkeit und der polymergebundenen, einwertigen, spezifischen, bindenden Substanz eine Bindung eingehen kann, beschichtet sind, wobei die einwertige, spezifische bindende Substanz in der biologischen Flüssigkeit die Bildung von Aggregaten des Polymerisats, an das eine Mehrzahl der einwertigen, spezifischen, bindenden Substanz und der fluoreszierenden und nicht-fluoreszierendeh mikrc skopischen Teilchen gebunden sind, hemmt, und
das Ausmass der Aggregatbildung misst, indem man die Grossen- und Fluoreszenzeigenschaften der Aggregate misst
BAD ORIGINAL
DE3323137A 1982-06-28 1983-06-27 Verfahren zum nachweis von mehrwertigen, spezifischen, bindenden substanzen in biologischen fluessigkeiten Ceased DE3323137A1 (de)

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IT (1) IT1163607B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989001161A1 (en) * 1987-07-28 1989-02-09 International Institute Of Cellular & Molecular Pa Turbidimetric assay

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3322373C2 (de) * 1983-05-19 1986-12-04 Ioannis Dr. 3000 Hannover Tripatzis Testmittel und Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern
AU4158785A (en) * 1984-03-26 1985-11-01 International Health Services A method of determining the clotting time of blood and particulate reagents therefor
JPS61128169A (ja) * 1984-11-27 1986-06-16 Mitsubishi Chem Ind Ltd 免疫分析法
FR2627286B1 (fr) * 1988-02-15 1993-08-20 Canon Kk Procede et appareil pour l'examen d'un echantillon en immunologie
US5162863A (en) * 1988-02-15 1992-11-10 Canon Kabushiki Kaisha Method and apparatus for inspecting a specimen by optical detection of antibody/antigen sensitized carriers
FR2638848B1 (fr) * 1988-11-04 1993-01-22 Chemunex Sa Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination
US5155021A (en) * 1989-02-09 1992-10-13 Eastman Kodak Company Method and kit for determination of herpes simplex viral antigen by direct binding to polymeric particles
DE69328727T2 (de) * 1992-08-03 2000-09-07 Marconi Gec Ltd Immunologisches nachweisverfahren unter verwendung von zwei bestimmbaren markern
GB2270158B (en) * 1992-08-03 1997-03-19 Marconi Gec Ltd Detection
EP1365240B1 (de) * 2002-05-22 2006-09-13 Sysmex Corporation Immunologische Verfahren, Vorrichtungen und Reagenzien
GB2420850A (en) 2004-12-03 2006-06-07 Orion Diagnostica Oy Particle based binding assay

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3853987A (en) * 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
DE2632478A1 (de) * 1975-07-23 1977-02-24 Coulter Electronics Verfahren zur erfassung und trennung von antigenen und antikoerperchen im blut und in anderen proben
GB1590525A (en) * 1976-12-10 1981-06-03 Technicon Instr Biological analysis
US4115535A (en) * 1977-06-22 1978-09-19 General Electric Company Diagnostic method employing a mixture of normally separable protein-coated particles
GB2045431B (en) * 1979-02-26 1983-04-20 Technicon Instr Immunoassay utilising two particulate reagents
DE2918342A1 (de) * 1979-05-07 1980-11-20 Behringwerke Ag Latex-reagenz

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989001161A1 (en) * 1987-07-28 1989-02-09 International Institute Of Cellular & Molecular Pa Turbidimetric assay

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