JPS5912356A - ２助変数流動免疫試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は２助変数流動免疫試験法（ジュアルパラメータ
ーフローイミノアセイ）ニ関する。

粒子を数える免疫試験はＪ　、　Ｉｒｒｖｎ、ｔｔｎｏ
　ｌ　、Ａ３１ｅ　ｔん□　ｄｓ　、　１８゜８３−４
４（１９７７）罠おけるよく知られた非放射免疫試験法
である。この方法は測定しようとする物質に特に結合性
の物質で波涛されたラテックス又は同様の粒子の凝集反
応に基づく。この凝集反り己は血球をかぞえる（チ設置
ｔされた（子な光学的又は屯気的計痺器を用いて非凝集
粒子数減少を決定して測定される。この方法は抗原、抗
体および免疫重合体の測定に使われている。Ｊ、Ａｗｔ
ｏｎＬ、（：ｈ、ａｍ、　、　’ｌ　。

１４９−１５２（１９８０）　：Ｊ、Ｉｎｖｎｗｎｏｌ
、ｒｎｅｔｈｏｒｌｓ。

２８．２９−５０（１９７８）：およびＪ、ＩｍｎＬｌ
Ｌｎｏｌ。

ｍｅｔｈｏｔｉｓ、’２８．１８　２８（１９７９）。

ジゴキシンの様な小分子測定にこの方法の変法が便われ
ている。（Ｃ１ｉｎ。

Ｃｈｅｍ、、　　２７／１　．１２０５−１２０９（１
９８１））凝！Ｊｊ　ｌｔ’ＧＺ子級をかぞえることも
よく知られている。

明確（！：なった問題解決のため粒子をかぞえる種々の
方法が開発されている。例えばいわゆるプロゾーニング
（ｐｒｏ　−ｚｏｎｉｎσ）問題（非常に筒濃度の抗原
をもつ試料は僅がの凝集であるのでネガチブと思われる
）を解決するに２培養工程と異なる大きさのＩＱ子便用
か記載されている。１９８０年９月の西ドイツ特許出願
ｚａｏｏ６ｇ９９．６および１９８０年１１月２０日の
２９１８　８４２．４゜本発明が検出可能なちがった性
質、例えば本（ｌ子径および螢光性をもつ粒子を１史う
点で本発明は従来法から特に区別できる。非凝集粒子の
消失を測定するよりも、ちがった２種粒子と試験物質の
凝集物内に例えば大粒子（即ち粒子径）とｌＪｉ光性位
子（即ち螢光性）をもつ異なるわｌ子性質を決定するこ
とによってその凝集物生成力畑１１定される。このＣ１
１定は米国特許第４，１９８．１６０号に記載の２チヤ
ンネル）°０学的眠気的セルカウンター又は螢光ｄ口Ｒ
鏡で測定できる。

本発明は生物学的流体中の多原子価特殊結合性物質検出
法に関する。測定できるちがった性ａｔもちまた多原子
価特殊結合性物質に結合できる物質で被ａ８れでいる第
１および第２顆微鏡的粒子を含む凝集物は多原子価特殊
結合性物質の存在において形成されるので、上記第１お
よび第２顕微鏡的わ°ｌ子は凝集物内の第１および第２
顕微鏡的粒子のもつちがった性質の画定Ｖζよって検出
される。一般に本発明はちがった２種の大きさをもつ抗
体で被覆された粒子、Ｐ［Ｊち４〜５０μ（ミクロン）
の径をもつ非螢光性粒子と０．８〜１０μの径をもつ螢
光性粒子を用いて溶液中の多原子価抗原の検出をするの
である。抗原をもだない試料中の螢光粒子と非螢光粒子
は結合しないが、抗原をもつ試料中の大きな非螢光粒子
は螢光粒子とくつついて凝集物を形成する。

本発明は多原子価特殊結合性物質に結合できる物質でい
づれも被覆されておりまたこの多原子価特殊結合性物質
によって共！Ｌ？：固まっている４〜５０μ非螢光性粒
子と０．０８〜１０μ螢光性粒子の新規凝集物を包含す
る。

本発明はまた［原子価特殊結合性物質の検出法をも包含
するＯ 本発明の記述中多原子価特殊結合性物質とは２又はそれ
以上の特殊結合位置をもつ抗原、抗体および１１１３の
生物学的分子をいう。肝炎と結合した様なウィルス性抗
原、（肝炎渋面抗原、肝炎Ａ、肝炎コア抗原）、庖疹お
よび１１ハのウィルス性を伴なう病気Ｎ１にひにそれら
の抗原は多原子価特殊結合性物質の例である。細菌およ
びネイセリアゴノリアおよびストレプトコッカスの様な
細菌性抗原は他の多原子価特殊結合性物質である。カル
ジノエンブリオニック抗原（ＣＥＡ）の様な癌と結合し
た抗原は同峰匡本発明の方法によって測定できる多原子
価特殊結合性物質である。免疫試験分野の知識ある者は
広範な多原子価特殊結合性物質ケ認めるであろう。

１原子価特殊結合性物質°も多数の結合１原子価特殊結
合性物質をもつ１μ合体と１原子価特殊結合性物質に結
合できる物質で被覆された粒子を用いて本発明の方法と
試薬によって決足できる。未知物質中の１原子価特殊結
合性物質は粒子上の結合ｆ；′ＬＲを競い粒子および結
合している１原子価′１を殊結合性物質をもつ１に合体
間の、凝集を妨げるだろう。故に前記した型の！ｎ１（
ｊ？■彰１９粒子、好ましくは合成多原子価特殊結合性
物質に結合しつる物質で被覆された非螢光性顕微鏡的粒
子および同様に被覆された小顕做鏡的螢光性粒子と結合
しつる合成多原子価特殊結合性物質を生成するため薬剤
卦よびホルモンは重合体、例えば牛血清アルブミンの様
な蛋白質又はデキストリンの様な多糖類に結合される。

えられた凝集物は前記のとおり検出される。

本発明は各検出区別できる性質をもつ少なくも２Ｗｉの
顕微鏡的粒子を利用する。粒子は一般にポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリアクリレイト等の様な合成重合体
である。

米国特許第８，７１５，４２７号に記載の形の赤血球は
また本発明に使うに適した粒子である。好ましい粒子物
質はポリスチレンであり、またポリスチレンラテックス
粒子ともいう。適当する粒子は一般に微粒子分野で仰ら
れている。ちがった径の粒子２種、径４〜５０μの犬（
＜ｉ子と径０．０８〜１０μの小粒子の１更用が好まし
い。また小粒子が螢光的にラベル付けされているき好ま
しい。これは粒子中に螢光性物質を混合するか又は粒子
表面に螢光性分子を付着略せて見られる。

各粒子は多原子価結合性物質に特に結合できる物質で被
覆される。一般に多原子価抗原を検出するのであれば粒
子は抗原に対する抗体で被覆される。更に明確にいうな
らば肝炎８表面抗原を検出するのであれば粒子は肝炎８
表面抗原の抗体又は抗体のｐ′（αｂ′）２断片で被覆
されるであろう。

通常方法は次のとおりであるニ ー： ＞６９− 実際に試験試料中の多原子価特殊結合性物質の存在は粒
子を凝集させる。故にちがった性質により検出できる粒
子が凝集物中にあれは凝集物はその性質測定によって検
出できる。最も代表的には多数の小螢光性粒子は非螢光
性大粒子に結会し凝集物はその大きさと螢光性の独特な
組付せ全測って検出される。凝集物はまたちがった螢元
染料金使って大小の粒子にラベル付けしその凝集物の２
螢光性を検査することによって検出できる。２助変数体
系（容量士螢光性又は２螢元性粒子）が谷形の粒子の非
特異凝集による偽のボジチブ結果を避ける点で特にこれ
は利点がある。

偽のボジチブ結果は１だ血清をペプシンで前処理して非
特異血清干渉を消化することにより減少される。故に有
効な前処理法は血清と１％ペプシンの等量ｔｏ、１５＆
塩酸中で８７℃１５分間培養した浴液を０．５モル水酸
化す）　ＩＪウム液で中和するのである。ペプシン処理
は肝炎測定において肝炎抗原がペプシン消化に耐える点
で特に便利である。

貯蔵中並びに試験中の２Ｈ子の非特異凝集が粒子を最適
緩衝液に懸濁させることによって減少することが発見さ
れている。例えば０．１Ｍグリシン、ｐｌｉ９．２にお
けるｌ）、１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液および１％中皿
７にアルブミン、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ６および１０％０％ジ
メチルホルムアミドラ液は非特異凝集を減少し試験を改
良する。

本発明は次の実施例によって側圧されるであろう。

実施例１ ポリスチレン粒子（６μ、１０％懸濁液）に水で反復洗
った後メタノールで８回洗って表面活性剤全きれいにお
とした。りん酸塩緩衝塩溶液ＣＰＢＳ、　　ｐＨ７，４
）中に６×ｌｏ’ａ子の懸濁液（全容’ｇ）　１４ｔＡ
’にギニア豚アンチ−ＨＢ、Ａ、　ＩｔＧ　　６〜を加
えム混合物金亀磁攪拌俸で１伎（２０時間）室温で攪拌
した。粒子をＰＢＳで２回洗った後生血清アルフミンと
０．１％７ジ化ナトリウムヲ富むＰＢＳ中に６Ｘ１０’
粒子／ｄ量に懸濁させた。

同様の方法で０．４９μ螢）七性粒子（ポリサイエンセ
ズ社４Ｘ１０１０全量）ｒ親和力全精製した山羊アンチ
−１１ＢＳ−Ａｙ　Ｆ（ｄ’）、　８００　ｔｔ　ｆ！
　（全被覆量１ｍ１）で被覆した。

被覆後ＰＢＳで２回洗いまた１％牛血清アルブミンと０
．１％アジ化ナトリウム２営むＰＢＳ中に６ＸＩＯ’粒
子／ｄの密度に）酢〆蜀させた。

実施例■ １１Ｂ　ｓ　Ａ　Ｗ試験法 前処理 血清又は血漿１００μｌに０．１５　Ｍ　ＨＣｌ中に１
％ペプシン溶７代１００μｌを加えた。混合物ｔ−３７
℃水浴中で１５分間消化させた後０．５　Ｍ　ＮａＯＨ
で中和した。

試験 ギニア豚アンチ−１１Ｂ８Ａｆ　Ｉ、Ｇ　で被覆した６
μ粒子５０μｌ（全粒子８Ｘ１０りをｍ１処理した試料
に加えた。

混合物をチクティター回転振とう機上室温で１時間振と
り（２２０ｒｐｍ）した。次いで山羊アンチ＝ノ１ＢＢ
Ａｆ　Ｐ’（ａｂつ。

断片で被覆した螢光性微粒（０，４９μ、全部で８Ｘ１
０７）を加えた。混合物を室温で約１５００　　＆で５
分間回転させて大小粒子を混合させた。

ＨＢ８Ａｙ　’＜宮む試料中に６μ粒子と螢光性小粒の
＃果物を生成させた。ＨＢ８Ａ、ネガティブ試料中に６
μｍ０．４９μに凝集物が僅かの量で生成された。この
凝集物の存否は螢光顕微鏡又は一致する容量と螢光性の
測定装置の使用によって数えることができる。

微粒子（６μ全部で２Ｘ１０８、ミクロスフイヤズリサ
ーチ）　’ｒ　ｐＨ８，８のＰ　Ｂ　Ｓ中で５回洗った
。この粒子にモノクロナル抗体Ｉアンチ−ＣＥＡ２００
μ２とｐＨ８，８のＰＢＳ２００μＡ’に加え九粒子を
室温で１夜攪拌し０．１Ｍグリシン、１％牛血清アルブ
ミン（ＧＢＳ−ＢＳＡ）を含むｐＨ９，２の０．１５　
Ｍ　ＮａＣ１ｊ　　中で８回洗いまたＧＢｓ−ＢＳＡｌ
ｒｎｌ中ＫＭ７Ｒｒ　Ｌ７’Ｃ６同様に螢光染色した０
、４９μ粒子（全部で１．６Ｘ１０’°、ポリサイエン
セズ仕）をモノク凸ナル抗体１１アンチ−ＣＥＡＬ２０
ｔｔｌ　Ｃ９０ｐｙ）とｐＨ８，８のＰＢＳ　１２０μ
ｌｋ含む被覆用ｍ銭に加えた。混合物を１夜攪拌しＧＢ
Ｓ−ＢＳＡ中で２回洗いＧＢＳ−１３ＳＡＭｌｌ中に再
懸濁させた。

実施例Ｉ■ ＣＥＡ試験 被覆した微粒子をＧ１１Ｓ−ＢＳＡ中に履ｖｃ　ｍ６釈
しも血清３００μｌにモノクロナル抗体１で被覆した６
μ粒子５０μｌ（全部で８．１８Ｘ　１０’　）および
１Ｍクリシンと１．５　Ｍ　ＮａＣ１のｐＨ９混合液２
００ｆｉｌｆｔ加えた。混合物音４５℃で１時間培養し
た後ＧＢＳ１ｍｌで洗った。これにモノクロナル抗体■
で被覆した螢光染色した０、４９μ粒子５０μｌ（全部
で２．６Ｘ１０’）　を加え混合物を室温、約１５００
ｘｒで５分間回転させて６μと０．４９μ粒子を混合し
た。懸濁液を通常塩溶液１ｒｎｌで稀釈し６μｍ０．４
９μ凝集物の数を測定した。この試験法は次表に示すと
おりＣＥＡ撒の足置的測定を可能にする。

０　　　　　　　　　　　　６１６ １　　　　　　　　　　　　７０９ ２　　　　　　　　　　　　８５０ ５　　　　　　　　　　　　９４２ １０　　　　　　　　　　　　１１５４２０　　　　　
　　　　　　　１５４１実施例■ 本発明は１原子価結合性物質の測定に使用できる。非螢
光性６．０μ粒子をジゴキシンに対する抗体で被覆した
。試験試料を被覆粒子および多数のジゴキシン分子が結
合した牛、［ｒ［Ｉ渭アルブミンと培養した。培養後ア
ンチージゴキシン抗体で被覆された螢光性小粒を加えも
ジゴキシンのない試料においてはジゴキシン−ＢＳＡは
大小粒と共に結合する。ジゴキシンを含む試料において
は薬剤はジゴキシン−ＢＳＡと第１固相上の結合性位置
を争って生成する容−１ｄ−螢光性凝集物の数音減少す
る。

同様に薬４ｋ　ホルモン等の様なＬ原子価（％足１結合
性位置をもつ）物質は牛血消アルブミン、デキストラン
又は同様の合成重合体に結合して同様の測定が可能であ
る。

特許出願人　　アボット　ラボラトリーズ代　理　人　
弁理士　　川　瀬　良　治弁理士　斉藤武彦

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的流体をちがった検出可能な性質をもちまた
   多原子価特殊結合性物質に結合しつる物質で被覆されだ
   第１および第２顕微鏡的粒子と混合して上記第１および
   第２　Ｒ。 子を営む凝集物を多原子価結合ｔｌ物質の存在で生成さ
   せかつ上記吠集物中の第１および第２顕１）及説的粒子
   のもつちがった性質を測定して上記イ疑果物を検出する
   ことを待機とする生物学的流体中の多原子価特殊結合性
   物質の検出法。 ２、生物学的流体を原子価特殊結合性物質に結合しつる
   物質でいづれも被覆された非螢光性顕微鏡的粒子および
   より小さい螢光性顕微鏡的粒子と混合して上記卯螢）′
   ｆＳ性粒子粒子び１又は２１以上の螢光性粒子を含む凝
   集・物を多原子価特殊結合性物質の存在において生成さ
   、Ｉ−セかつ」二記凝′果物を−との大きさと螢光性ｒ
   よって倹り毘することを％徴とする生物学的流体中の多
   原子価特殊結合性物質の検出法。 ８、生物学的流体を々プシン消化によって前処理する特
   許請求の範囲第２項ＺＥ：載の方法。 ４、方法’＜約ｏ、　Ｉ　Ｍグリシン、ｐＨ９２におい
   て緩衝されたｏ、１５Ａｔｔ＝化ナトリウムおよび１％
   生血損アルブミン、［ＭΔｒａ、ｃｅおよび１０％ジメ
   チルホルノ、アミドを含む溶液中で行なう特許請求の範
   囲第３項に記載の方法。 ５、各粒子が特殊結合性物質で被覆されているより小さ
   な螢ゲ０性％ｌ’（微鏡的粒子がそれに結合しておりか
   つ粒子上に被覆をれている′ｆＩｆ殊結合性物質に結合
   しつる多原子価特殊結合性物質と共に固まっている非螢
   光性顕微鏡的粒子より成ることを特徴とする凝集物の懸
   濁水液。 ６、生物学的流体を多敬の１原子価結合性物質が結合し
   ている重合体：上ａ］シ生物学的流体および上記重合体
   中１　ノ＋：ｔ’ｆ−価’ｒ：Ｊ件結合性物買１で結合
   しうる物質でいづれも彼：膚されている非螢光性顕微鏡
   的粒子およびより小さな・；に光性１１０微鏡的粒子と
   混合し、その場合生物学的流体中の１原子（ｉｉ１ｉ％
   殊結合性物鰐は多数の１原子価特殊結合性物質の、ｒ、
   、ｊｊ合している重合体と螢光性および非螢光性顕微鏡
   的心を子間の凝集を妨げるので、凝集物の大きさと螢光
   性を検査して凝集物事成度を測定することを特徴とする
   生物学的流体中の１原子価特殊結合性物質の検出法。