CN102426233A - 液相芯片检测空肠弯曲菌的方法 - Google Patents
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Abstract
一种液相芯片检测空肠弯曲菌的方法,属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术,提供一种用于检测空肠弯曲菌的方法,以便实现对空肠弯曲菌的快速检测。本发明制备了液相芯片,然后应用液相芯片检测空肠弯曲菌。本发明应用液相芯片检测空肠弯曲菌与其它几种检测方法相比,优势在于检测样品数量和检测项目的双向高通量(可同时对大量样品进行多达96个项目的检测)且具有灵活性好、灵敏度高、信噪比好、操作简便、标准曲线范围宽和应用范围广等特点,液相芯片技术作为生物信息学先进的操作平台,在临床诊断、兽医传染病诊断、食品微生物检测等领域具有广阔的应用前景。实现对空肠弯曲菌的快速检测,为食品安全做出贡献。
Description
技术领域
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
背景技术
空肠弯曲菌是80年代起受到国内外广泛重视的人畜共同感染的病原菌,可以引起人和动物发生多种疾病,被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要病原菌,对人的感染率不亚于沙门氏菌和志贺氏菌,是一种重要的食源性病原菌。传染源主要是动物及其污染的食品,弯曲菌属广泛散布在各种动物体内,其中以家禽、野禽和家畜带菌最多,其次在啮齿类动物也分离出过弯曲菌。目前对于食品中空肠弯曲菌的检测方法(无论是经典方法,还是分子生物学方法、免疫学方法等)的方法都存在操作繁琐,需要时间较长的特点,而且一次只能检一种菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术,用于检测空肠弯曲菌的方法,以便实现对空肠弯曲菌的快速检测。
本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成,所述微球为羧基化的35号微球;所述捕获抗体是空肠弯曲菌单克隆抗体,所述检测抗体是空肠弯曲菌的多克隆抗体,生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG;所述捕获抗体和检测抗体均能特异与空肠弯曲菌结合,以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光,以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白,测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量,用于间接确定球型基质上结合空肠弯曲菌的数量;
液相芯片的制备:捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min,用超声波清洗机进行超声10min,漩涡震荡30s,使微球均匀分布,用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS,然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中,14000 rpm,离心5min,取出后弃上清,加入NHS和EDC各10ul,再加入80ul的活化缓冲液,混匀后,用铝箔纸包好,置于37℃摇床120 rpm,20min,然后14000 rpm,离心5min,小心移去上清,加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体,重悬混匀,置于37℃摇床120 rpm,孵育2h,取出后离心弃上清,用500ul的PBS进行洗涤,洗涤后加入500ul 1%BSA的 PBS溶液,重悬微球,37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭,封闭后4℃保存;
液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min,漩涡振荡器震荡约3min,取约5000个微球,加入108 CFU/ml 的空肠弯曲菌10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心弃上清,用200ul PBS-TBN洗两次,加入已稀释的检测抗体10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心,弃上清,用PBS-TBN洗两次,然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床反应1h,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗两次,再加入SA-PE,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床反应,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗涤两次,重悬于100ul PBS-TBN中,上机进行检测。
本发明应用液相芯片检测空肠弯曲菌与其它几种检测方法相比,优势在于检测样品数量和检测项目的双向高通量(可同时对大量样品进行多达96个项目的检测)且具有灵活性好、灵敏度高、信噪比好、操作简便、标准曲线范围宽和应用范围广等特点,液相芯片技术作为生物信息学先进的操作平台,在临床诊断、兽医传染病诊断、食品微生物检测等领域具有广阔的应用前景。实现对空肠弯曲菌的快速检测,为食品安全做出贡献。
附图说明
图1是本发明捕获抗体最佳工作浓度;
图2是本发明灵敏度检测结果;
图3是本发明特异性的检测结果;
图4是本发明重复性检测结果。
具体实施方式
本发明所采用的技术方案是:通过空肠弯曲菌的特异抗体,与微球进行偶联后,制备出可以对空肠弯曲菌进行检测的液相芯片,在应用时,加入样品增菌液,使增菌液中的空肠弯曲菌被微球上的捕获抗体所捕获,检测抗体也与空肠弯曲菌结合后,再与生物素标记的抗抗体共同孵育,然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应,应用Luminex100检测系统实现对空肠弯曲菌的特异检测。
本发明涉及的检测空肠弯曲菌液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)组成。其特征是,所述微球为羧基化的35号微球;所述捕获抗体是空肠弯曲菌的单克隆抗体(Ca.j mAb),所述检测抗体是空肠弯曲菌的多克隆抗体(Ca.j pAb),生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG);所述捕获抗体和检测抗体均能特异与空肠弯曲菌结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光,以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白,测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量,用于间接确定球型基质上结合空肠弯曲菌的数量。
上述的检测抗体是用于识别空肠弯曲菌的另一类抗体,其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的空肠弯曲菌与抗抗体结合,而抗抗体能与检测荧光偶联,间接将结合的空肠弯曲菌浓度与检测荧光的强度结合起来,从而实现对空肠弯曲菌的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合,最后通过Luminex100检测系统对空肠弯曲菌进行定性定量检测。
(1)捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min,用超声波清洗机进行超声10min,漩涡震荡30s,使微球均匀分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中,14000 rpm,离心5min。取出后弃上清,加入NHS和EDC各10ul,再加入80ul的活化缓冲液。混匀后,用铝箔纸包好,置于37℃摇床120 rpm,20min,然后14000 rpm,离心5min,小心移去上清。加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体,重悬混匀,置于37℃摇床120 rpm,孵育2h。取出后离心弃上清,用500ul的PBS进行洗涤,洗涤后加入500ul 1%BSA的 PBS溶液,重悬微球,37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4℃保存。
(2)应用液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min,漩涡振荡器震荡约3min。取约5000个微球,加入108 CFU/ml 的空肠弯曲菌10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul。置于37℃摇床120rpm,1h。取出后离心弃上清,用200ul PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul。 置于37℃摇床120rpm,1h。取出后离心,弃上清,用PBS-TBN洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul。 置于37℃摇床反应1h。取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床反应,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗涤两次。重悬于100ul PBS-TBN中,上机进行检测。
1.捕获抗体最佳工作浓度的确定
当单抗浓度为250ug/ml时,其MFI值达到最大,故单抗最佳的工作浓度为250ug/ml(见图1)。
2.偶联是否成功的检测
生物素标记羊抗鼠IgG | 生物素标记羊抗兔IgG | |
MFI | 3297 | 249 |
MFI背景值 | 19 | 21 |
由上述结果可知单抗与微球偶联效果很好,且封闭效果也良好。
3. 正交实验结果—确定反应较优条件
根据上述结果可知实验条件A1B1C5D5为较优实验条件,即多抗工作浓度为1:100,生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500,SA-PE的工作浓度为10ug/ml,生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为90min。
4. 灵敏度检测结果
由图2可以看出,由上述图可以看出,在菌的浓度达到103CFU/ml时仍可被检出。因此本方法的灵敏度较高,可达到103CFU/ml。
5.特异性的检测结果
用已建立的方法检测空肠弯曲杆菌从图3中可看出此方法特异性良好,与其它的菌无交叉反应。
6. 重复性试验
在1d,5,d,7d用此方法分别检测阳性菌和阴性菌,由图4可见阳性菌,阴性菌MFI值上下浮动都不大,可证明本方法重复性较好。
7. 实际样品添加的检测结果
样品 | 细菌 | MFI |
绿豆 | 空弯菌 | 957 |
绿豆 | 沙门氏菌 | 211 |
绿豆 | 空白 | 106 |
绿豆 | 空白 | 13(背景值) |
兔肉 | 空弯 | 899 |
兔肉 | 沙门 | 186 |
兔肉 | 空白 | 156 |
兔肉 | 空白 | 15(背景值) |
分别在绿豆和兔肉中添加空弯菌,沙门氏菌,并做空白对照,由上表可见在添加了实际样品后应用本方法仍可将空弯菌检出。
Claims (1)
1.一种液相芯片检测空肠弯曲菌的方法,其特征在于:由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成,所述微球为羧基化的35号微球;所述捕获抗体是空肠弯曲菌单克隆抗体,所述检测抗体是空肠弯曲菌的多克隆抗体,生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG;所述捕获抗体和检测抗体均能特异与空肠弯曲菌结合,以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光,以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白,测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量,用于间接确定球型基质上结合空肠弯曲菌的数量;
液相芯片的制备:捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min,用超声波清洗机进行超声10min,漩涡震荡30s,使微球均匀分布,用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS,然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中,14000 rpm,离心5min,取出后弃上清,加入NHS和EDC各10ul,再加入80ul的活化缓冲液,混匀后,用铝箔纸包好,置于37℃摇床120 rpm,20min,然后14000 rpm,离心5min,小心移去上清,加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体,重悬混匀,置于37℃摇床120 rpm,孵育2h,取出后离心弃上清,用500ul的PBS进行洗涤,洗涤后加入500ul 1%BSA的 PBS溶液,重悬微球,37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭,封闭后4℃保存;
液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min,漩涡振荡器震荡约3min,取约5000个微球,加入108 CFU/ml 的空肠弯曲菌10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心弃上清,用200ul PBS-TBN洗两次,加入已稀释的检测抗体10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心,弃上清,用PBS-TBN洗两次,然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床反应1h,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗两次,再加入SA-PE,用PBS-TBN补足体积到100ul,置于37℃摇床反应,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗涤两次,重悬于100ul PBS-TBN中,上机进行检测。
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