CN103160602A

CN103160602A - 副溶血性弧菌的实时荧光pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103160602A
Application number: CN201310119464XA
Authority: CN
Inventors: 曾静; 周琦; 张蕾; 程晋霞; 魏海燕; 张西萌; 张琳
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2033-04-08
Also published as: CN103160602B

Abstract

本发明公开了一种副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，具体涉及一组检测副溶血性弧菌的寡核苷酸，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的碱基序列，及含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。

Description

副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于检验检疫领域，涉及副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，具体涉及应用免疫磁珠技术进行副溶血性弧菌检测。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称Vp）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症。近年来，由感染副溶血性弧菌引发的食物中毒已经成为世界范围内严重的食源性公共卫生问题之一。在日本，由该菌引起的食物中毒占全国食物中毒例数的20%～30%；我国国家食源性疾病监测网数据显示沿海省份副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物食物中毒首位。为确保食品安全，保护人民身体健康，欧盟、美国等发达国家对水产品中的副溶血性弧菌做出了明确的规定。如欧盟规定副溶血性弧菌不得检出，而美国规定小于l×10⁴CFU/g。我国已将该菌列为主要的检验或监测对象。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。

目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5～7天，有时达到10～15天，很难满足快速鉴定的需要；实时荧光PCR（RT-PCR）技术是近几年发展起来的基于检测遗传物质的技术，该技术已经应用在微生物检测、基因表达、新生物医药的筛选等领域，该技术具有高特异性、高灵敏度的特点，所需检测时间短，整个PCR过程只需2个小时左右，经大量的科研实践证明，在检测特异性和灵敏度方面，实时荧光PCR技术与传统方法相当，但是极大地缩短了检测时间，整个检测过程从5～7天时间，缩短到2～3天，节约了时间，缩短了货物在口岸的停留时间，最根本的保护了广大消费者的利益。

纳米磁珠是运用纳米技术，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物科学、医学等方面的研究。在分子、细胞和个体水平上为食源性致病菌检测和疾病的诊断等方面提供新材料、新技术和新方法。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值：（1）高效富集：纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；（2）非常有效的去除PCR反应中的抑制剂：以现在的检测方法，不同种的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加剂往往对PCR反应有较强的抑制作用，采用磁珠分离的方法可以非常有效的去除抑制剂；（3）可操作性：纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离；（4）标记性质：生物分子标记方法简单、可靠。抗体是一类重要的生物活性材料，广泛应用于检验检疫、疾病诊断、药物筛选、国防、航天、司法鉴定、食品卫生、环境监测及军事侦检等领域，已成为发展新型免疫检测技术和推动检测检疫产业快速发展的重要资源。本发明应用与抗副溶血性弧菌单克隆抗体偶联的纳米磁珠，即免疫磁珠（Immunomagnetic Beads，IMB），其具有选择性好，特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用，有效避免或减少漏检，且可去除食品样品中抑制PCR反应的成分。将免疫磁珠分离（Immunomagneticseparation，IMS）与RT-PCR技术相结合，建立IMS-RT-PCR检测方法，可以极大地提高检测效率。并由此开发了副溶血性弧菌IMS-RT-PCR检测试剂盒，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测副溶血性弧菌的RT-PCR寡核苷酸。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的副溶血性弧菌的RT-PCR检测试剂盒。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种副溶血性弧菌的IMS-RT-PCR检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组检测副溶血性弧菌的寡核苷酸，是依据NCBI收录号M36437对应的基因序列设计的，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.3所示碱基序列组成；其中序列SEQ ID No.1为正义引物（P1），序列SEQ ID No.2为反义引物（P2），序列SEQ ID No.3为荧光探针（P），探针的5’端标记报告荧光基团为FAM（6-羧基荧光素），3’端标记淬灭荧光基团为TAMRA。详见表1。

表1引物序列

本发明所提供的引物具有以下优点：（1）高效灵敏；（2）特异性强。

本发明还提供了一种副溶血性弧菌的RT-PCR检测试剂盒，其包括以下物质：

（1）偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；

其中，抗副溶血性弧菌单克隆抗体可以是现有技术中已经公开的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，优选地该单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，具体信息及获得方法见中国发明专利申请CN102659942A中的内容。通过使用偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠，可有效富集待检样品中的副溶血性弧菌，提高检测的特异性和灵敏度。

（2）RT-PCR反应液，其包括序列表SEQ ID No.1所示的正义引物（P1），序列表SEQID No.2所示的反义引物（P2），序列表SEQ ID No.3所示的荧光探针（P）；所述引物均委托大连宝生物工程有限公司合成；

（3）阴性对照：DEPC水；

（4）阳性对照：由副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802提取的核酸作为阳性对照，采用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取1mL样品基因组DNA，核酸浓度约为80μg/mL；

进一步地，上述RT-PCR反应液还包括（2×）TaqMan Gene Expression Master Mix，其主要成分为Mg²⁺，dNTP，Taq酶，Buffer等，购自ABI公司，货号4369016。

本发明是根据实时荧光RT-PCR反应体系的荧光强度，判断样本中是否存在副溶血性弧菌：阴性对照的检测结果为阴性；阳性对照的Ct值应小于28.0；否则，此次实验视为无效；无Ct值的样本为阴性样品；Ct值≤30.0的样本为阳性样本；Ct值大于30.0的样本建议重做，重做结果无Ct值的为阴性，否则为阳性。

本发明还提供了一种副溶血性弧菌的检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）免疫磁珠富集菌体：取1.5mL免疫磁珠于离心管中，置于磁分离架吸附1min后，弃上清，免疫磁珠用30μL PBS重悬；取1mL待检样品或菌悬液加入免疫磁珠悬液中，颠倒混匀使磁珠处于悬浮状态；30min后，磁分离架吸附磁珠1min以富集菌体，弃上清，免疫磁珠用PBS洗涤两次，每次30s，最后用50μL DEPC水重悬磁珠，获得富集后的菌体样品；

其中，10×PBS缓冲溶液为：NaCl80g，NaHPO₄×12H₂O29g，KCl2g，KH₂PO₄2g，先溶于900ml去离子水，待充分溶解后再加去离子水至1000ml，室温保存，使用时进行1:10稀释。

（2）提取步骤（1）获得的菌体样品的DNA，即模板DNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取，例如细菌基因组DNA提取试剂盒或等效试剂盒，或者煮沸方法提取样品基因组DNA；

（3）进行RT-PCR反应，该RT-PCR反应体系见下表：

表2TR-PCR反应体系

（4）进行RT-PCR反应参数，该RT-PCR反应参数见下表：

表3RT-PCR反应参数

（5）结果判定：

本发明的有益效果：

（1）特异：由于与抗副溶血弧菌单克隆抗体偶联的免疫磁珠可以特异性的吸附增菌液中的副溶血性弧菌，有效的排除了杂菌及抑制剂的干扰；而且实时荧光PCR反应中采用了特异性强的引物和探针，使该方法的特异性高于传统检测方法；

（2）灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统PCR方法灵敏度高100～1000倍；

（3）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；

（4）不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1IMS-RT-PCR检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR图，其中，PC：副溶血性弧菌ATCC17802菌株核酸样本，NC：阴性对照。

图2IMS-RT-PCR检测副溶血性弧菌灵敏度的实时荧光PCR图，其中，稀释度-1～稀释度-4：副溶血性弧菌ATCC17802菌株梯度稀释菌悬液，NC：阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。

实施例1：偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠的制备

抗副溶血性弧菌单克隆抗体的获得

本发明可以使用现有技术中已经公开的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，为了达到更好的检测效果，优选地，本发明使用由保藏编号为CGMCC No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体的具体信息及获得方法见中国发明专利申请CN102659942A中的内容。

偶联有该抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠的制备

1.纳米磁珠的制备

本发明所述的免疫磁珠的制备方法包括纳米超顺磁性Fe₃O₄的制备及其特异性抗体的表面修饰，具体在此提供一种优选的制备方法：

2.聚丙烯酸稳定的超顺磁性Fe₃O₄的制备

（1）铁源的制备：准确称取0.8mmol FeCl₃和8mmol的聚丙烯酸（Mw=～1800）到34mL二乙二醇溶剂中，在快速机械搅拌的条件下，氩气气氛中将混合液加热到220℃，保持加热30min.

（2）氢氧化钠溶液的制备：准确称取2.0gNaOH到20mL二乙二醇溶剂中，在氩气气氛下将混合液加热到120℃，保持1h，然后将温度降低到70℃，待用。

（3）取1.75mL氢氧化钠溶液，快速注入到铁源的混合液中，然后将反应温度调节到210℃，在快速的机械搅拌下保持1h，然后降温到室温，对样品进行清洗。

（4）样品清洗：以乙醇为沉淀剂（体积比2:1）对所得样品进行离心清洗（10000r/min），重复清洗三次，最后将样品分散在去离子水中。

3.特异性抗体的修饰

抗体的修饰包括磁性粒子表面的活化，特异性抗体的偶联修饰及非特异性位点的BSA封闭。

（1）磁性粒子的表面活化：取2mg所制备的磁性纳米粒子，在1mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液中通过磁分离的方法对粒子进行清洗两次。

（2）准确称取1.38mg Sufo-NHS和3mg EDC到1mL2mg/mL磁性纳米粒子分散液中，在冰浴中震荡条件下保持30min进行表面活化。然后对混合液进行磁分离两次，洗掉过量的Sufo-NHS和EDC活化剂。

（3）将活化后的磁性纳米粒子分散到pH=7.9的磷酸缓冲溶液中，分散液中磁性纳米粒子的浓度为2mg/mL。取100μg特异性抗体到1mL活化的磁性纳米粒子溶液中，室温下在摇床(200r/min)中保持4h，最后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁性粒子表面的过量的特异性抗体。

（4）将2mg步骤3中清洗后的粒子分散到2mL BSA质量浓度为1%的磷酸缓冲溶液中（pH=7.4），室温下在摇床（200r/min）中保持10h进行非特异性位点的封闭，然后通过磁分离将所得粒子进行分离，最后分散到2mL BSA质量浓度为0.1%的磷酸缓冲溶液中（pH=7.4）保存。

（5）所得免疫磁珠的粒径在90nm左右，饱和磁化强度可以达到64emu/g，超顺磁性能好，磁响应性强，分散稳定性好，生物免疫活性高。

实施例2：副溶血性弧菌的RT-PCR检测试剂盒的组成

（1）偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；例如实施例1中制备的免疫磁珠；

（3）阴性对照：DEPC水；

进一步地，上述RT-PCR反应液还包括TaqMan Gene Expression Master Mix（2×），购自ABI公司，货号4369016。

实施例3：副溶血性弧菌的RT-PCR检测试剂盒的特异性和灵敏性试验

1.检测特异性分析

对表4中所列菌株分别进行IMS-RT-PCR检测，结果显示副溶血性弧菌标准菌株的检测结果为阳性；而其余菌株均无特异性扩增，无任何假阳性和假阴性结果出现，说明该方法检测副溶血性弧菌具有良好的特异性。经过三次重复试验，试验结果均一致，表现出良好的稳定性。

表4实验用菌株列表

序号	菌株名称	编号	IMS-RT-PCR检测结果
				1	副溶血性弧菌	ATCC17802	＋
2	溶藻弧菌	ATCC1833	-
				3	创伤弧菌	ATCC1758	－
4	河流弧菌	ATCC1.1611	－
				5	费尼斯弧菌	ATCC1.1612	－
6	解蛋白弧菌	ATCC1.1826	－
				7	单增李斯特氏菌	ATCC15313	－
8	阴沟肠杆菌	CGMCC1.57	－
				9	金黄色葡萄球菌	ATCC25923	－
10	甲型副伤寒沙门氏菌	CMCC50001	－
				11	大肠杆菌	ATCC25912	－
12	肠炎沙门氏菌	CMCC50041	－
				13	福氏志贺氏菌	CMCC51571	－
14	鼠伤寒沙门氏菌	CMCC50115	－
				15	阪崎肠杆菌	ATCC29544	－
16	粪肠球菌	CGMCC1.2135	－

2.检测灵敏度分析

对副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802的菌悬液进行10倍梯度稀释，分别取1mL各梯度稀释液进行IMS-RT-PCR检测。结果发现该方法可检测到-4稀释度（图2），相应的副溶血性弧菌菌体浓度为9×10²CFU/mL，即该检测方法的灵敏度为9×10²CFU/mL。

IMS-RT-PCR检测方法如上所述。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一组检测副溶血性弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQID No.1至序列表SEQ ID No.3所示；其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测副溶血性弧菌的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测副溶血性弧菌的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的检测副溶血性弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光探针序列SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

3.权利要求1或2所述的检测副溶血性弧菌的寡核苷酸在制备检测副溶血性弧菌试剂盒中的应用。

4.一种副溶血性弧菌的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下物质：

（1）偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；

（2）RT-PCR反应液，其包括：序列表SEQ ID No.1所示的正义引物，序列表SEQ IDNo.2所示的反义引物，序列表SEQ ID No.3所示的荧光探针；

（3）阴性对照；

（4）阳性对照。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体为保藏编号为CGMCC No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液还包括TaqMan Gene Expression Master Mix溶液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液中各种成分的使用终浓度为1×TaqMan Gene Expression Master Mix溶液、0.4μM正义引物、0.4μM反义引物、0.4μM荧光探针。

8.一种副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）免疫磁珠富集菌体；

2）提取菌体的DNA；

3）进行RT-PCR反应，其中，使用序列表SEQ ID No.1所示的正义引物，序列表SEQ ID No.2所示的反义引物，序列表SEQ ID No.3所示的荧光探针，所述荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；

4）根据实时荧光RT-PCR反应体系的荧光强度进行结果判定。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述免疫磁珠为偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体为保藏编号为CGMCC No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。