CN105301030A - 一种单增李斯特菌检测试剂和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单增李斯特菌的检测试剂，包括免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和稳定剂。本发明的一种单增李斯特菌的检测方法，在待测样品中加入免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和稳定剂，室温下孵育30min，使磁珠特异性结合和富集到单增李斯特菌表面，设定参数进行核磁共振检测。本发明的试剂和检测方法能高灵敏度地检测出样品中的目标菌，尤其在低浓度的目标菌情况下极为灵敏，单增李斯特菌在食品中含量极少，本方法对样品处理简单，而且需要少量的样品，操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。

Description

一种单增李斯特菌检测试剂和检测方法

技术领域

本发明涉及食源性微生物检测领域，公开了一种以核磁共振方法检测生物功能化超顺磁纳米粒子免疫识别目标微生物，实现高灵敏检测食品中单增李斯特菌的方法。

背景技术

食源性疾病是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质(包括生物性病原体)等致病因子所造成的疾病。近年来，食源性疾患的发病率居各类疾病总发病率的前列，是当前世界上最突出的卫生问题。食源性致病菌快速检测是采用微生物学、化学、生物化学、生物物理、免疫学的方法对食品及其加工、贮藏等环境中的致病菌进行分离、检测、鉴定和计数。

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，LM)是世界卫生组织列出重点检测的四大食源性致病菌(致病性大肠奸菌、肉毒梭菌和嗜水气单胞菌)之一，其危害程度可见一斑。随着生活节奏的不断加快，快餐食品和各种即食食品不断增加，单增李斯特菌在食品中的广泛存在对我国人民的健康也带来了潜在的巨大危害。

单增李斯特菌在自然界中广泛存在，如水、土壤、植物，由于其能耐各种极端环境的生物学特性使其易通过各种途径发生播散，可造成多种食品的污染，如奶及奶制品、肉制品包括猪肉、牛肉、羊肉、腌腊食品、水产品、新鲜蔬菜等植物性食品，单增李斯特菌不但存在于食品原料中，在食品的加工、运输和冷冻保存的食品中均可存在。单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌，当牲畜感染后，通过食物链最后导致人类的感染，人类受感染后可导致胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产，对孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者如肿瘤、AIDS的更容易发生。

我国出台的单增李斯特菌检测的行业标准和国家标准，虽然检测方法准确性和灵敏度较高，但存在操作繁琐、时间长等缺陷。分子技术比如PCR技术应用于单增李斯特菌的检测，用PCR技术检测有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点，但是PCR反应受样品情况的影响比较大，特别在食源性有害微生物检查中，食品中的成分(糖类、酸类，油脂等物质)会干扰反应的正常进行。而检测的环境，中间处理环节也会带来一些PCR反应抑制剂。从而使PCR反应呈现较高的假阳性和假阴性率。

近年来，随着科技的发展，纳米技术和核磁共振技术的发展趋势与前景越来越广泛，应用范围也趋于多样化。核磁共振(NMR)的发展已有50多年的研究历史。NMR是原子核和磁场相互作用产生共振的现象。在外加恒定磁场中原子核能级会裂分，用某一特定的频率的射频脉冲激发自旋系统，当电磁波能量等于能级差时，原子核吸收能量产生从低到高的能级跃迁，产生共振吸收信号，就是核磁共振。

核磁共振技术目前已经应用的有：细菌、酵母、丝状真菌、支原体等多种微生物的代谢研究；酒类样品的质量鉴定；肉类样品的质量检验；食品中污染物的分析；核磁共振磷谱31PNMR与HPLC联用筛选高效有机磷降解细菌；食品中农药残留物的分析测定等。核磁共振技术具有与其他方法相比较的独特优点：(l)对样品没有损伤性，它并不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤；(2)只需简单预处理(不必进行提取分离)就可以同时测定多种成分；(3)定量测定不需标定(4)分析速度与精密度接近于高效液相色谱法；(5)实验方法灵活多样。所以核磁共振技术在食品中的应用和发展也越来越趋于广泛。

为了食品安全，为了寻求更快速、灵敏度高食源性致病菌的检测方法，为了替可能出现的食品安全问题提供应对方法，需要对现有的检测方法进行改进，所以研发了“结合免疫化的超顺磁纳米粒子和核磁共振仪器的快速检测食品中单增李斯特菌的方法”。

发明内容

本发明旨在提供一种单增李斯特菌的检测试剂及检测方法，其可以快速、灵敏的检测食品中的单增李斯特菌。

一种单增李斯特菌的检测试剂，包括免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和稳定剂。

所述稳定剂为2％的脱脂牛奶。

所述免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和稳定剂通过以下方法制备得到：

(1)、将10mgFe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和0.16mL正硅酸四乙酯，0.15mL氨水，40μL过硫酸铵,适量正辛醇(0.6mL左右至体系澄清)，1.12mL的Tritonx-100反应得到包上二氧化硅并且表面氨基化的Fe/Fe3O4纳米磁珠；

(2)、特异性抗体用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺活化，分散到Ph7.4的PBS中，然后与步骤(1)中的包上二氧化硅并且表面氨基化的Fe/Fe₃O₄纳米磁珠偶联。

所述的特异性抗体为单增李斯特菌诊断血清OⅦ。

所述Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠通过以下方法制备得到：

20mL1-十八碳烯和0.2mL油胺的混合液中加入0.2g盐酸十六胺，在氮气保护下，磁力搅拌30分钟，加热到120℃并保持30分钟，之后继续加热到180℃，快速注射Fe(CO)₅，保持20min后，注射0.3mL油酸，继续保持10min，移除热源,冷却至室温，用异丙醇和正己烷的混合液离心三次(12000rpm,10min)，得到Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠，并分散在环己烷中，待用。

一种单增李斯特菌的检测方法，在待测样品中加入免疫化的超顺Fe/Fe3O4磁性纳米磁珠和稳定剂，室温下孵育30min，使磁珠特异性结合和富集到单增李斯特菌表面，设定参数进行核磁共振检测。

本方法首先制备Fe/Fe₃O₄超顺磁性纳米磁珠，纳米磁珠表面包被上二氧化硅，使磁珠有更好的分散性和对生物大分子有更好的相容性。表面修饰以氨基，使其能与抗体结合，加入特异性抗体，制成免疫化的超顺磁性纳米磁珠。然后将免疫化的磁珠加入到样品中，加入稳定剂，室温孵育30min，磁珠特异性结合和富集到样品中被检微生物食源性致病菌单增李斯特菌上。

本发明中的Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠本身具有磁性，有聚集成团的趋势，使用稳定剂可以有效地提高纳米粒子以及磁珠-抗体-靶标菌复合物的分散性，所以本方法中加入稳定剂，稳定剂能使带磁珠的菌体悬浮在溶液中，并且使各个菌体之间保持一定的距离，这样可以避免磁珠过于聚集或者沉降。优化稳定剂得到最优的稳定剂为2％的脱脂牛奶。

处理好的样品加到直径3cm的核磁管中，设定参数，进行核磁共振检测。磁珠从分散状态到聚集状态的改变，伴随着溶液水质子的自旋-自旋弛豫时间(T₂)的改变，核磁共振仪检测出T₂值的改变以此判定样品中是否存在被检微生物食源性致病菌单增李斯特菌。样品中被检菌越少，有效的结合富集到被检菌表面的磁珠的比例就会增大，导致自旋-自旋弛豫时间(T₂)有很大的改变，当样品中被检菌数目增多，被检菌更多的抗原决定簇就会去竞争有效的磁珠，导致结合到菌表面的磁珠呈现一种类似分散的状态，自旋-自旋弛豫时间(T₂)就会有很小的改变。

本发明的试剂和方法能高灵敏度地检测出样品中的目标菌，尤其在低浓度的目标菌情况下极为灵敏，单增李斯特菌在食品中含量极少，本方法对样品处理简单，而且需要少量的样品，整个检测过程仅需1.5小时，操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。

附图说明

图1是本发明的二氧化硅包裹连接上氨基的Fe/Fe₃O₄纳米粒子TEM图。

图2是实施例2的单增李斯特菌浓度变化与ΔT2值的关系图。

图3是实施例3中的不同菌株与ΔT2值的阴性对照关系图。

图4是实施例4中的不同菌株与ΔT2值的阳性对照关系图。

具体实施方式

实施例1：免疫化的超顺Fe/Fe3O4磁性纳米磁珠

1、Fe/Fe₃O₄的合成以及包被和氨基功能化

(1)在100mL三颈烧瓶中，20mL1-十八碳烯和0.2mL油胺的混合液中加入0.2g盐酸十六胺，在氮气保护下，磁力搅拌30分钟，加热到120℃并保持30分钟，之后继续加热到180℃，快速注射Fe(CO)₅，保持20min后，注射油酸(0.3mL，1mmol)，继续保持10min。移除热源,冷却至室温。用异丙醇和正己烷的混合液离心三次(12000rpm,10min)，得到的Fe/Fe₃O₄磁性核壳纳米粒子，并分散在环己烷中，待用。

(2)由于Fe/Fe₃O₄的分散性不好，粒径也不均匀，且易于和其它物质发生反应，所以必须对纳米粒子进行包裹，来得到化学性能稳定、分散性好的纳米磁珠。1.12mL的Tritonx-100，60mL环己烷混合均匀，加入10mgFe₃O₄，分散均匀，混合液室温移至三口烧瓶中，连续搅拌，加入0.15mL氨水，适量正辛醇至体系澄清(0.6mL左右)，0.16mL正硅酸四乙酯(TEOS)，搅拌24小时后，加入40uLAPS。继续搅拌48h。当反应结束后，立即加入少量丙酮使纳米粒子陈化，磁性分离，磁珠用无水乙醇洗3次。制得表面氨基化包被上二氧化硅的磁珠。

2、氨基功能化磁珠和抗体的连接

0.1mL单增李斯特菌诊断血清中加200mgEDC·HCL和250mgNHS，之后将混合溶液稀释到10mL磷酸缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH＝7.4)，充分混合均匀，将混合体系在4℃孵育活化30min。氨基功能化的Fe/Fe₃O₄，分散于5ml磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)溶液中，与已经活化的抗体混合，室温摇床孵育搅拌4小时，磁性分离后将得到的生物功能化的磁珠重新分散pH＝7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲溶液中，放之4℃保存，待用。

本实施例得到的免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠的TEM图如图1所示。

实施例2：样品检测

将实施例1制得的免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠分散在磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH＝7.4)中，浓度为0.16mg/mL(实验优化过的数据)。单增李斯特菌浓度设置为1CFU/mL、10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL，将0.15mL生物功能化的磁性纳米粒子与2.3mL的2％脱脂牛奶(稳定剂)充分混合均匀，再把已经稀释过的单增李斯特菌0.05mL加入以上混合溶液，充分混匀室温孵育30分钟，以不加入菌液的样品为空白。

将处理好的样品加入到直径3cm的核磁管中，将核磁管放入核磁共振分析仪内，调整参数，核磁共振分析仪NM120-Analyst，测定自旋-自旋弛豫时间(T2)，计算ΔT2值。结果如图2所示。

本方法检测乳制品中食源性致病菌单增李斯特菌的检测范围为1cfu/mL到1000cfu/mL。

实施例3：

将实施例1制得的免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠分散在磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH＝7.4)中，浓度为0.16mg/mL(实验优化过的数据)。将0.15mL生物功能化的磁性纳米粒子与2.3mL的2％脱脂牛奶(稳定剂)充分混合均匀，再把已经稀释过的单增李斯特菌0.05mL加入以上混合溶液，充分混匀室温孵育40分钟，

将处理好的样品加入到直径3cm的核磁管中，将核磁管放入核磁共振分析仪内，调整参数，核磁共振分析仪NM120-Analyst，测定自旋-自旋弛豫时间(T₂)，计算ΔT₂值。

使用阴性对照菌株为鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌和混合菌株(单增李斯特菌：其他四种混合菌株，V:V＝1:1)，阳性对照菌株为英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌和混合菌株(单增李斯特菌：其他三种混合菌株，V:V＝1:1)。将各菌液稀释到合适的浓度，采用相同的条件，分别测定加入菌液前后的T2值，计算出ΔT2值，结果如图3所示。本方法对单增李斯特菌的检测具有高度特异性。

结果判定和报告：

阳性结果及可疑阳性结果：核磁共振测得的自旋-自旋弛豫时间改变(ΔT₂)值大于19为阳性结果；

阴性结果：核磁共振测得的自旋-自旋弛豫时间改变(ΔT₂)值小于等于19为阴性结果；

报告方法

核磁共振检测结果为阴性结果：报告为“未检测出单增李斯特菌”；

核磁共振检测结果为阳性结果或可疑阳性结果：结果记录中出现阳性或可疑阳性结果，均应按依照国家标准对阳性结果及可疑阳性结果进行培养法检查，并根据培养法检查结果做报告。

以所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种单增李斯特菌的检测试剂，其特征在于，包括免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和稳定剂。

2.根据权利要求1所述的食品中单增李斯特菌的检测试剂，其特征在于，所述稳定剂为2％的脱脂牛奶。

3.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的检测试剂，其特征在于，所述免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠通过以下方法制备得到：

(1)、将10mgFe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和0.16mL正硅酸四乙酯，0.15mL氨水，40μL过硫酸铵,加入正辛醇至体系澄清，1.12mL的Tritonx-100反应得到包上二氧化硅并且表面氨基化的Fe/Fe₃O₄纳米磁珠；

(2)、特异性抗体用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺活化，分散到Ph7.4的PBS中，然后与步骤(1)中的包上二氧化硅并且表面氨基化的Fe/Fe₃O₄纳米磁珠偶联。

4.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的检测试剂，其特征在于，所述的特异性抗体为单增李斯特菌诊断血清OⅦ。

5.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的检测试剂，其特征在于，所述Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠通过以下方法制备得到：

20mL1-十八碳烯和0.2mL油胺的混合液中加入0.2g盐酸十六胺，在氮气保护下，磁力搅拌30分钟，加热到120℃并保持30分钟，之后继续加热到180℃，快速注射Fe(CO)₅，保持20min后，注射0.3mL油酸，继续保持10min，移除热源,冷却至室温，用异丙醇和正己烷的混合液，12000rpm,10min离心三次，得到Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠，并分散在环己烷中，待用。

6.一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，在待测样品中加入免疫化的超顺Fe/Fe₃O₄磁性纳米磁珠和稳定剂，室温下孵育30min，使磁珠特异性结合和富集到单增李斯特菌表面，设定参数进行核磁共振检测。