CN104792992A - 用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金、含胶体金的玻璃纤维样品垫、检测试剂条及检测试剂盒 - Google Patents

用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金、含胶体金的玻璃纤维样品垫、检测试剂条及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金、含胶体金的玻璃纤维样品垫、检测试剂条及检测试剂盒，胶体金通过柠檬酸三钠还原法制得，胶体金制备过程中加入聚乙烯吡咯烷酮稳定剂；玻璃纤维样品垫包括胶体金-抗体结合物和玻璃纤维；空肠弯曲菌抗原检测试剂条包括支持板、抗体-硝酸纤维素膜、吸水垫、玻璃纤维样品垫和玻璃纤维加样垫；空肠弯曲菌抗原检测试剂盒包括检测卡和检测条。本发明提供的用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金，粒径均匀、分散性和稳定性好；空肠弯曲菌抗原检测试剂条及检测试剂盒，显色更快、更均一、更稳定，灵敏度高，使用方便，操作简单，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一。

Description

用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金、含胶体金的玻璃纤维样品垫、检测试剂条及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金、含胶体金的玻璃纤维样品垫、检测试剂条及检测试剂盒。
背景技术
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是近年来影响动物源性食品安全的重要人兽共患病原菌之一，与沙门氏菌、志贺氏菌并列为人类三大腹泻致病菌，空肠弯曲菌感染引起的腹泻在细菌性腹泻病中位居榜首。空肠弯曲菌的感染多为散发，较少有暴发，其是夏秋季腹泻病的主要病原，尤其以学龄前儿童发病率较高。该菌广泛存在于家禽肠道中，并可通过污染肉品、食物或水源而导致人类感染。
我国于上世纪80年代初首次从急性腹泻病人的排泄物中分离出空肠弯曲菌，随后在北京、上海、江苏、福建、黑龙江、辽宁等地也先后从家畜(牛、羊)和家禽(鸡、鸭)中检出了该菌。随着改革开放后经济水平的发展，人们的物质生活水平不断提高，膳食结构中各种禽肉类及奶制品所占的比例越来越高，由于食物被空肠弯曲菌污染所引起的腹泻在我国愈来愈常见，因此尽快了解国内市场上禽肉类及奶类制品中空肠弯曲菌的污染及流行状况，采取积极有效的公共卫生措施以确保人民群众的食品安全极为重要。
目前，国内采用的常规检测空肠弯曲菌的方法存在着诸多不便及欠缺之处，例如培养分离条件苛刻、纯菌落分离困难、检测周期长、生化鉴定结果重复性差等，造成空肠弯曲菌的检出报告率一直较低(6至9％)。
近年来，随着胶体金免疫层析技术的发展，已经出现采用胶体金法检测空肠弯曲菌抗原的检测试剂，胶体金免疫层析技术是指将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果，现有的空肠弯曲菌抗原的检测试剂的灵敏度1×106菌/mL，对于1×106菌/mL以下的空肠弯曲菌检测，其灵敏度不够。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有良好的均一性、分散性和稳定性的用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金，所述胶体金通过柠檬酸三钠还原法制得，包括：
(1)取2mL浓度为1.0×104g/mL氯金酸水溶液，用蒸馏水稀释到20mL，搅拌下加热到80℃，3-5分钟后加入0.1mL质量分数1％的柠檬酸三钠，继续加热10-15分钟，冷却至室温，得金溶液；
(2)取30mL浓度为1.0×104g/mL氯金酸和1mL上述步骤(1)制得的金溶液，混合，搅拌下加热至沸腾，加入聚乙烯吡咯烷酮稳定剂0.1g，5-8分钟后迅速加入强还原剂硼氢化钾0.6mL，在沸腾下反应1-3分钟，自然冷却至室温，即得。
本发明的目的之二在于提供一种使用方便，具有上述胶体金特性的玻璃纤维样品垫。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
所述玻璃纤维样品垫通过以下方法制得：
(1)胶体金-抗体结合物的制备，包括以下步骤：
S1取上述胶体金100ml，调节PH至8.0，加入抗空肠弯曲菌单克隆抗体1.5mg，再逐滴加入25mg/mL聚乙二醇2mL，离心，弃去上清液，得沉淀物；
S2将步骤S1中制得的所述沉淀物用含0.4mg/mL聚乙二醇的磷酸盐缓冲液10mL清洗2次，将清洗后的沉淀物用含体积分数为2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液5mL溶解，然后将溶解液用无菌过滤器过滤，即得；
(2)将步骤(1)制得的所述胶体金-抗体结合物固相于玻璃纤维上，即得。
本发明的目的之三在于提供一种可快速检测空肠弯曲菌、灵敏度高的空肠弯曲菌抗原检测试剂条。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
空肠弯曲菌抗原检测试剂条，所述检测试剂条包括支持板，所述支持板上设有抗体-硝酸纤维素膜；所述抗体-硝酸纤维素膜的上方粘贴有吸水垫；所述抗体-硝酸纤维素膜的下方粘贴有所述玻璃纤维样品垫，所述玻璃纤维样品垫的下方粘贴有玻璃纤维加样垫。
作为一种改进，所述吸水垫向下覆盖所述抗体硝酸纤维素膜边沿0.5-1.5mm；所述玻璃纤维加样垫向上覆盖所述玻璃纤维样品垫边沿0.5-1.5mm
作为进一步地改进，所述抗体-硝酸纤维素膜由以下方法制得：
(1)将抗空肠弯曲菌单克隆抗体稀释至1.5±0.1mg/mL，喷于硝酸纤维素膜上；
(2)将羊抗鼠IgG抗体稀释到2.0±0.1mg/mL，喷于上述步骤(1)制得的硝酸纤维素膜上；
(3)将上述步骤(2)制得的固定有两种抗体的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥，即得。
本发明的目的之四在于提供一种携带保存方便、操作简单、灵敏度高、不易被污染的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
空肠弯曲菌抗原检测试剂盒，包括检测卡和设在所述检测卡内的检测条；所述检测条包括底板，所述底板分为手柄区、观察区、标记区和加样区；所述手柄区设有用来吸水的滤纸支撑层；所述观察区设有抗体-硝酸纤维素膜；所述抗体-硝酸纤维素膜靠近所述手柄区的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线，另一端设有包被抗空肠弯曲菌单克隆抗体的检测线；所述标记区设有权利要求2所述玻璃纤维样品垫；所述加样区设有所述玻璃纤维加样垫。
作为一种改进，所述检测卡包括卡盖和卡体；所述卡盖的一端设有用来滴加待测样品的漏斗状的加样孔，所述加样孔与所述加样区的位置相对应；所述卡盖的中间部位设有用来观察测试结果的条形的观测孔，所述观测孔与所述观察区的位置相对应；所述卡盖的底面上设有多个用来固定所述卡盖和所述卡体的定位销，所述卡体上设有与所述定位销相配合的定位槽；所述检测条设置在所述卡盖与所述卡体之间。
作为进一步地改进，所述卡盖的底面设有多个固定柱和多个块状凸起；所述卡体上与所述固定柱相对应的位置设有固定槽，所述卡体上与所述块状凸起对应的位置设有块状凸起槽。
作为进一步地改进，所述卡体上设有多个用来固定所述检测条水平位置的卡位突起。
作为进一步地改进，所述卡盖上与所述对照线相对应的一侧标注有字母“C”，所述卡盖上与所述检测线相对应的一侧标注有字母“T”。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)金颗粒粒径均匀、分散性和稳定性好：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为稳定剂制备胶体金，金颗粒分散性好，粒径大小均匀，无团聚现象，可更迅速、大量、稳定地结合抗空肠弯曲菌单克隆抗体，且结果颜色显色均匀，灵敏度提高。
(2)灵敏度高：采用本发明所提供的技术方案，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为烧金稳定剂制备的胶体金颗粒，其金颗粒分散性好，粒径大小均匀，可更迅速、大量地结合抗空肠弯曲菌单克隆抗体，以提高灵敏度。
在空肠弯曲菌标准品浓度为105菌/mL时，使用含有本发明提供的胶体金的检测试剂条和检测试剂盒，100例中可检测有95例出现阳性，而普通的胶体金检测出的阳性低于90例，根据检测结果阳性率在90％(样本量大于20)以上的数值作为检测灵敏度的定义，说明使用含有本发明提供的胶体金的检测试剂条或试剂盒，检测空肠弯曲菌的灵敏度可达105菌/mL。
(3)显色更快、更均一、更稳定：由于胶体金具有良好的均一性、分散性和稳定性，在检测样本时，使得检测试剂条和检测试剂盒显色更快、更均一、更稳定。
(4)使用方便，操作简单：减少了许多繁琐的程序，方便、快捷、直观，易操作，全过程只需10分钟，能够满足食品安全监管部门对空肠弯曲菌的污染流行状况进行系统地监测，保障人民大众的食品安全。
(5)真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，本发明提供的检测试剂盒具有保存方便、不易被污染、有效期长的特点。
附图说明
图1是本发明提供的玻璃纤维样品垫的结构示意图；
图2是本发明提供的空肠弯曲菌抗原检测试剂条的结构示意图；
图3是本发明提供的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒的俯视图；
图4是本发明提供的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒的仰视图；
图5是图3沿A-A线的剖视图；
图6是图3和图4中卡体的结构示意图；
图7是图3和图4中检测条的侧视图；
其中：1-玻璃纤维样品垫，2-支持板，3-抗体-硝酸纤维素膜，4-吸水垫，5-玻璃纤维加样垫，6-检测卡，7-检测条，8-加样孔，9-观测孔，10-定位销，11-胶体金-抗体结合物，12-玻璃纤维，13-定位槽，14-固定柱，15-块状凸起，16-固定槽，17-块状凸起槽，18-卡位突起，31-对照线，32-检测线，61-卡盖，62-卡体，71-底板，72-手柄区，73-观察区，74-标记区，75-加样区，721-滤纸支撑层。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一
用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金，所述胶体金通过柠檬酸三钠还原法制得，包括：
(1)取2mL浓度为1.0×104g/mL氯金酸水溶液，用蒸馏水稀释到20mL，搅拌下加热到80℃，3-5分钟后加入0.1mL质量分数1％的柠檬酸三钠，继续加热10-15分钟，冷却至室温，得金溶液；
(2)取30mL浓度为1.0×104g/mL氯金酸和1mL上述步骤(1)制得的金溶液，混合，搅拌下加热至沸腾，加入聚乙烯吡咯烷酮稳定剂0.1g，5-8分钟后迅速加入强还原剂硼氢化钾0.6mL，在沸腾下反应1-3分钟，自然冷却至室温，即得。
实施例二
图1示出了本发明提供的玻璃纤维样品垫的结构示意图，为了便于说明，本图仅提供与本发明有关的结构部分。
如图1所示，玻璃纤维样品垫1，包括胶体金-抗体结合物11和玻璃纤维12，所述玻璃纤维样品垫通过以下方法制得：
(1)胶体金-抗体结合物的制备，所述制备方法包括以下步骤：
S1取上述胶体金100ml，调节PH至8.0，加入抗空肠弯曲菌单克隆抗体1.5mg，再逐滴加入25mg/mL聚乙二醇2mL，离心，弃去上清液，得沉淀物；
S2将步骤S1中制得的所述沉淀物用含0.4mg/mL聚乙二醇的磷酸盐缓冲液10mL清洗2次，将清洗后的沉淀物用含体积分数为2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液5mL溶解，然后将溶解液用无菌过滤器过滤，即得；
(2)将步骤(1)制得的胶体金-抗体结合物固相(涂抹)于玻璃纤维上，即得。
实施例三
图2示出了本发明提供的空肠弯曲菌抗原检测试剂条的结构示意图，为了便于说明，本图仅提供与本发明有关的结构部分。
如图2所示，空肠弯曲菌抗原检测试剂条，包括支持板2，支持板2上设有抗体-硝酸纤维素膜3；抗体-硝酸纤维素膜3的上方粘贴有吸水垫4，吸水垫4向下覆盖抗体-硝酸纤维素膜3边沿0.5-1.5mm；抗体-硝酸纤维素膜3的下方粘贴有上述玻璃纤维样品垫1，玻璃纤维样品垫1的下方粘贴有玻璃纤维加样垫5，玻璃纤维加样垫5向上覆盖玻璃纤维样品垫1边沿0.5-1.5mm。
其中，抗体-硝酸纤维素膜3由以下方法制得：
(1)将抗空肠弯曲菌单克隆抗体稀释至1.5±0.1mg/mL，喷于硝酸纤维素膜上；
(2)将羊抗鼠IgG抗体稀释到2.0±0.1mg/mL，喷于上述步骤(1)制得的硝酸纤维素膜上；
(3)将上述步骤(2)制得的固定有两种抗体的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥，即得。
实施例四
图3和图4分别示出了本发明提供的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒的俯视图和仰视图，为了便于说明，本图仅提供与本发明有关的结构部分。
空肠弯曲菌抗原检测试剂盒，包括检测卡6和设在检测卡6内的检测条7；如图7所示，检测条7包括底板71，底板71分为手柄区72、观察区73、标记区74和加样区75；手柄区72设有用来吸水的滤纸支撑层721；观察区73设有抗体-硝酸纤维素膜3；抗体-硝酸纤维素膜3靠近手柄区72的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线31，另一端设有包被抗空肠弯曲菌单克隆抗体的检测线32；标记区74设有玻璃纤维样品垫1；加样区75设有玻璃纤维加样垫5。
如图5和图6所示，检测卡6包括卡盖61和卡体62；卡盖61的一端设有用来滴加待测样品的漏斗状的加样孔8，加样孔8与加样区75的位置相对应；卡盖61的中间部位设有用来观察测试结果的条形的观测孔9，观测孔9与观察区73的位置相对应；卡盖61的底面上设有多个用来固定卡盖61和卡体62的定位销10，卡体62上设有与定位销10相配合的定位槽13；检测条7设置在卡盖61与卡体62之间。
卡盖61的底面设有多个固定柱14和多个块状凸起15；卡体62上与固定柱14相对应的位置设有固定槽16，卡体62上与块状凸起15对应的位置设有块状凸起槽17；卡体62上还设有多个用来固定检测条水平位置的卡位突起18；卡盖61上与对照线31相对应的一侧标注有字母“C”，卡盖61上与检测线32相对应的一侧标注有字母“T”。
实施例五
使用实施例四提供的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒检测粪便中空肠弯曲菌
(一)检测样处理
旋开采便管，用盖上附带的采便勺取一勺样本。如样本较稀薄，用吸管吸取2滴样本滴至采便管中。将样本和样本稀释液充分混匀。混匀样本应在1小时内检测。粪便样本应储存在干净容器中，取样后立即检测。样本冷藏(2-8℃)可保存3天，-20℃冷冻最长可储存1年。如冷冻，应完全解冻并恢复至室温后方可进行检测。
(二)样品检测
检测方法：折断采便管上的盖帽，垂直向试剂加样端加入2～3滴(约80～100μL)稀释样本，5-10分钟内观察结果，10分钟后结果无效。
(三)检测结果判断
如果对照线(C)、检测线(T)各出现一条红线，不管色带深浅如何，都表明结果为阳性，表示样本中存在空肠弯曲菌抗原且浓度高于可检范围；只有对照线(C)出现一条红线，检测线(T)位置无红线出现，表明结果为阴性，表示样本中不存在空肠弯曲菌抗原或浓度高于可检范围；如果对照线(C)位置无线条出现，说明操作失误或试剂失效。
对比例
普通胶体金
取200ml超纯水加入到500ml锥形瓶中，用移液器吸取2ml 1％氯金酸溶液于上述200ml超纯水中，搅拌1min，加热至沸腾，搅拌，快速经微孔滤膜过滤，滤液中加入1％柠檬酸三钠溶液0.8ml，溶液由灰色变黑色最后变为红色，再继续加热搅拌10分钟，停止加热，搅拌至室温，定容至200ml，即得普通胶体金。
将空肠弯曲菌标准品进行梯度稀释，浓度如下表1中所示，分别采用本发明实施例四提供的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒与对比例提供的普通胶体金进行检测，结果如下：
表1 空肠弯曲菌检测灵敏度对比
由表1可以看出，在空肠弯曲菌标准品浓度为106菌/mL时，两种检测方法分别检测100例样本的检测结果均能显示阳性；但在空肠弯曲菌标准品浓度为105菌/mL时，PVP作为烧金稳定剂的胶体金法检测结果有95例出现阳性，胶体金法的检测结果有86例出现阳性，根据检测结果阳性率在90％(样本量大于20)以上的数值作为试剂盒灵敏度的定义，说明PVP作为烧金稳定剂的胶体金法灵敏度可达105菌/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于空肠弯曲菌抗原检测的胶体金，其特征在于，所述胶体金通过柠檬酸三钠还原法制得，包括：
(1)取2mL浓度为1.0×104g/mL氯金酸水溶液，用蒸馏水稀释到20mL，搅拌下加热到80℃，3-5分钟后加入0.1mL质量分数1％的柠檬酸三钠，继续加热10-15分钟，冷却至室温，得金溶液；
(2)取30mL浓度为1.0×104g/mL氯金酸和1mL上述步骤(1)制得的金溶液，混合，搅拌下加热至沸腾，加入聚乙烯吡咯烷酮稳定剂0.1g，5-8分钟后迅速加入强还原剂硼氢化钾0.6mL，在沸腾下反应1-3分钟，自然冷却至室温，即得。
2.玻璃纤维样品垫，其特征在于，所述玻璃纤维样品垫通过以下方法制得：
(1)胶体金-抗体结合物的制备，包括以下步骤：
S1取权利要求1所述胶体金100ml，调节PH至8.0，加入抗空肠弯曲菌单克隆抗体1.5mg，再逐滴加入25mg/mL聚乙二醇2mL，离心，弃去上清液，得沉淀物；
S2将步骤S1中制得的所述沉淀物用含0.4mg/mL聚乙二醇的磷酸盐缓冲液10mL清洗2次，将清洗后的沉淀物用含体积分数为2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液5mL溶解，然后将溶解液用无菌过滤器过滤，即得；
(2)将步骤(1)制得的所述胶体金-抗体结合物固相于玻璃纤维上，即得。
3.空肠弯曲菌抗原检测试剂条，其特征在于，所述检测试剂条包括支持板，所述支持板上设有抗体-硝酸纤维素膜；所述抗体-硝酸纤维素膜的上方粘贴有吸水垫；所述抗体-硝酸纤维素膜的下方粘贴有权利要求2所述玻璃纤维样品垫，所述玻璃纤维样品垫的下方粘贴有玻璃纤维加样垫。
4.如权利要求3所述的空肠弯曲菌抗原检测试剂条，其特征在于，所述吸水垫向下覆盖所述抗体硝酸纤维素膜边沿0.5-1.5mm；所述玻璃纤维加样垫向上覆盖所述玻璃纤维样品垫边沿0.5-1.5mm。
5.如权利要求3或4所述的空肠弯曲菌抗原检测试剂条，其特征在于，所述抗体-硝酸纤维素膜由以下方法制得：
(1)将抗空肠弯曲菌单克隆抗体稀释至1.5±0.1mg/mL，喷于硝酸纤维素膜上；
(2)将羊抗鼠IgG抗体稀释到2.0±0.1mg/mL，喷于上述步骤(1)制得的硝酸纤维素膜上；
(3)将上述步骤(2)制得的固定有两种抗体的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥，即得。
6.空肠弯曲菌抗原检测试剂盒，其特征在于，包括检测卡和设在所述检测卡内的检测条；所述检测条包括底板，所述底板分为手柄区、观察区、标记区和加样区；所述手柄区设有用来吸水的滤纸支撑层；所述观察区设有抗体-硝酸纤维素膜；所述抗体-硝酸纤维素膜靠近所述手柄区的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线，另一端设有包被抗空肠弯曲菌单克隆抗体的检测线；所述标记区设有权利要求2所述玻璃纤维样品垫；所述加样区设有所述玻璃纤维加样垫。
7.如权利要求6所述的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒，其特征在于，所述检测卡包括卡盖和卡体；所述卡盖的一端设有用来滴加待测样品的漏斗状的加样孔，所述加样孔与所述加样区的位置相对应；所述卡盖的中间部位设有用来观察测试结果的条形的观测孔，所述观测孔与所述观察区的位置相对应；所述卡盖的底面上设有多个用来固定所述卡盖和所述卡体的定位销，所述卡体上设有与所述定位销相配合的定位槽；所述检测条设置在所述卡盖与所述卡体之间。
8.如权利要求7所述的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒，其特征在于，所述卡盖的底面设有多个固定柱和多个块状凸起；所述卡体上与所述固定柱相对应的位置设有固定槽，所述卡体上与所述块状凸起对应的位置设有块状凸起槽。
9.如权利要求7所述的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒，其特征在于，所述卡体上设有多个用来固定所述检测条水平位置的卡位突起。
10.如权利要求7所述的空肠弯曲菌抗原检测试剂盒，其特征在于，所述卡盖上与所述对照线相对应的一侧标注有字母“C”，所述卡盖上与所述检测线相对应的一侧标注有字母“T”。
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