CN113237987B

CN113237987B - 一种白眉蝮蛇降纤酶hplc检测方法及应用

Info

Publication number: CN113237987B
Application number: CN202110425249.7A
Authority: CN
Inventors: 白淑敏; 栾美丽; 齐硕; 马胜楠; 梁丽娜
Original assignee: BEIJING SAISHENG PHARMACEUTICAL CO LTD
Current assignee: BEIJING SAISHENG PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2024-04-23
Anticipated expiration: 2041-04-20
Also published as: CN113237987A

Abstract

本发明涉及生化检测技术领域，具体公开了一种白眉蝮蛇降纤酶HPLC检测方法及应用。本发明的HPLC检测方法中，采用流动相A、流动相B和流动相C进行洗脱；所述流动相A为：20‑25mM的磷酸二氢钠的水溶液，所述磷酸二氢钠的水溶液的pH值为5.8‑7.0；所述流动相B为：乙腈；所述流动相C为：三氟乙酸的水溶液。反相柱中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以梯度洗脱方式进行。本发明通过建立一种简便灵敏，专属性、准确度及耐用性良好的纯度测定方法，能够有效控制白眉蝮蛇降纤酶的质量，使其质量达到稳定、可控、高效及安全。同时也可用于不同蛇毒来源降纤酶的鉴别，为提高降纤酶原料及其制剂质量标准奠定基础。

Description

一种白眉蝮蛇降纤酶HPLC检测方法及应用

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体地说，涉及一种白眉蝮蛇降纤酶HPLC检测方法及应用。

背景技术

降纤酶是蛇毒类凝血酶制剂中的一种，具有去纤、降黏、解聚、溶栓等显著的抗凝作用，广泛地应用于临床治疗和预防闭塞性心脑血管血栓性疾病。以尖吻蝮蛇和长白山白眉蝮蛇蛇毒为原料提取的类凝血酶制品被命名为降纤酶。近些年研究表明这两种蛇毒来源的降纤酶结构、酶学表征、作用机制及临床表现均不同，属于同工酶，但不能等同于一个物质，需要必要的区分质控方式。

针对蛋白酶类药物纯度的测定方法多为凝胶色谱法。在越来越高的生化药品质量标准要求下，部分蛋白酶类药物也增加了反相色谱纯度检测。两种色谱分离原理不同，可达到互补作用。现行降纤酶原料一般采用凝胶色谱测定纯度，色谱条件如下：1)凝胶色谱柱，其规格为Biosep S2000 7.8*300mm，5μm)；以0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH值为6.8)为流动相，检测波长为280nm，理论板数按降纤酶峰计算应不低于3000。但试验证明，凝胶色谱法专属性较差，杂质被包含在主峰内，使纯度检测结果偏高。而且在制剂中由于右旋糖酐的干扰，凝胶色谱法也不适用于降纤酶制剂的纯度控制。

目前，有文献记载关于白眉蝮蛇降纤酶的反相色谱检测纯度的方法，采用下述条件：1)丁基硅烷键合硅胶为填充剂，其规格为4.6*250mm，5μm)；以0.1％三氟乙酸为流动相A；以0.1％三氟乙酸乙腈-水(90:10)为流动相B，检测波长为280nm，柱温为40℃。经验证，该色谱条件下，白眉蝮蛇降纤酶的两种主要组分(A/B组分)表现为双头峰或者是相邻的两个无法达到基线分离的色谱峰，这与记载此方案的文献结果相吻合。即使本发明在研究时将其色谱柱调整为C8或C18色谱柱，结果A/B组分仍不能达到完全分离，表明该文献记载的色谱体系不能对单一的A/B组分进行准确定量。而白眉蝮蛇降纤酶A/B组分虽然结构非常相近，但是酶学表征试验证明两者的体外活性存在显著差别，基于临床安全性和用药准确性的考虑，准确定量A/B组分尤为重要。

有鉴于此，本发明特提出一种新的针对白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测方法及其应用。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种可准确定量白眉蛇毒降纤酶(降纤酶蛇毒来源为长白山白眉蝮蛇)两个活性组分的反相HPLC色谱检测方法，其可作为现有凝胶色谱法检测的补充，为完善白眉蝮蛇降纤酶的质量标准奠定基础；还可有效促进生产工艺的改进；除此之外，也可以用来鉴别不同蛇毒来源的降纤酶。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种白眉蝮蛇降纤酶HPLC检测方法，其采用流动相A、流动相B和流动相C进行洗脱；

所述流动相A为：20-25mM的磷酸二氢钠的水溶液，所述磷酸二氢钠的水溶液的pH值为5.8-7.0；

所述流动相B为：乙腈；

所述流动相C为：三氟乙酸的水溶液。

本发明在研究时发现，现有技术方案不能在检测时将白眉蝮蛇降纤酶中的两个主要活性成分(A组分和B组分，两者分子量均为36KDa～38KDa，十分接近，且A组分的分子量要大于B组分的分子量)进行完全区分，一般蛋白类药物的反相色谱检测多用的水-有机溶剂-三氟乙酸(TFA)体系，也不能针对于结构非常相近的本发明的白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分(两者蛋白结构相同仅糖基修饰不同)，实现完全分离开来。为此，本发明在经过大量摸索实验后发现，当在流动相体系中加入不低于20mM的磷酸盐缓冲液，并通过探究合适的pH值，配合三氟乙酸(TFA)的水溶液，可成功实现两个主峰的完全分离，为准确区分、定量结构如此相近，活性却差异显著的白眉蝮蛇降纤酶的两种活性成分奠定了基础。

本发明中，所述三氟乙酸的水溶液的浓度为1％，在洗脱时所述流动相C的占比为12％～18％，优选为15％。

本发明中，按体积百分比，洗脱程序如下：

本发明在确定流动相后，还对流动相体系洗脱方式进行了大量摸索，最终确定的该洗脱体系洗脱能力较强，糖蛋白不会残留在色谱柱中，即使采用较大的进样量(如20μl)也未检测到残留的主峰，故不影响连续多批次样品的检测。

本发明中，反相柱中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选所述反相柱的孔径为300埃，更优选所述反相柱的长度为250mm，可更好地保证分离效果。例如可选自规格为Agilent ZORBAX 300SB-C18，4.6mm×250mm，5μm的反相色谱柱。

本发明中，流动相的流速为0.8-1.2ml/min；洗脱温度为35-40℃；检测波长为280nm。

优选，流动相的流速为0.8ml/min；洗脱温度为40℃。

作为流动相的一个优选方案，本发明中，所述流动相A为：20mM的磷酸二氢钠的水溶液，所述磷酸二氢钠的水溶液通过氢氧化钠溶液调节至pH值为6.5；所述流动相B为：乙腈；所述流动相C为：1％的三氟乙酸的水溶液。

采用上述方案，色谱峰柱效较高，检测限较低，尽可能的检出较多杂质，故检测结果更接近真实值；其次，A组分和B组分与杂质峰均能完全分离，说明方法的专属性较高；此外，水相中的缓冲盐浓度适宜，与有机溶剂混合后，不易析出沉淀，保证仪器能正产运行。

采用本发明所述的检测方法时，可取待测降纤酶适量，用水稀释至终浓度为每1mL中含1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液；取供试品溶液(如20μL)注入液相色谱仪，记录色谱图。

本发明还提供一种上述检测方法在白眉蝮蛇降纤酶质量控制中的应用，及在白眉蝮蛇降纤酶与尖吻蝮蛇降纤酶鉴别中的应用。

通过本发明的检测方法，白眉蝮蛇降纤酶的色谱图中，两个主峰保留时间分别为17.0±0.5min和18.0±0.5min，两者之间能实现完全分离，分离度在1.5以上，满足质量标准要求。且两个主峰峰纯度匹配值均在980以上，表明两个主峰分别为单组分。

而通过本发明的检测方法进行尖吻蝮蛇降纤酶的检测时，主峰保留时间为20.0±0.5min(主峰峰纯度匹配值为996，也即主峰为单组分)，这与白眉蝮蛇降纤酶两个主峰的保留时间均有显著差异，因此可将两种不同蛇毒来源降纤酶进行有效区分。

本发明的有益效果至少在于：

(1)本发明所述的检测方法能将白眉蝮蛇降纤酶中两不同的活性成分，A组分和B组分完全分离开来，能准确的定量白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分。在当两者混合入药时，可通过准确区分达到质控的目的。若两者分别单独入药，则可准确检出另一组分(作为杂质)的含量，同样能实现有效质控，保证临床用药的安全性。

(2)本发明所述的检测方法还可用来鉴别不同蛇毒来源的降纤酶。具体，按蛇毒来源被分为白眉蝮蛇降纤酶和尖吻蝮蛇降纤酶，研究表明两种蛇毒降纤酶结构、酶学表征及作用方式等均不同。且两种不同来源的降纤酶在临床表现上呈现两种不同的效果，一种比较剧烈、一种比较温和。以尖吻蝮蛇蛇毒为原料的降纤酶降纤作用非常明显，为防止出血并保证疗效，患者需能按设计的时间及剂量用药。有效区分两者可以为降纤酶原料及其制剂的标准提高提供有价值的参考。

(3)本发明所述的反相色谱法基于蛋白药物的疏水性不同而实现分离，与利用分子筛原理实现分离的SDS-PAGE凝胶电泳及凝胶色谱可相互补充，为白眉蝮蛇降纤酶的标准提高奠定基础。

(4)本发明所述的反相HPLC色谱条件可以为其他蛋白类药物(尤其含结构非常相近，蛋白结构相同的不同活性成分的蛋白类药物)的反相色谱方法建立提供参考。

综上，建立相辅相成的分析检测方法，制定高技术水平的控制白眉蝮蛇降纤酶的检测指标和分析方法，使之更加科学化、规范化，增强竞争力，具有重大的实际意义和学术价值。本发明通过建立一种简便灵敏，专属性强及重现性、耐用性、及准确度良好的含量测定方法，能够有效控制白眉蝮蛇降纤酶两个活性组分的相对含量，然后结合体外活性检测，使白眉蝮蛇降纤酶质量实现稳定、可控、高效及安全。同时，本发明通过建立简单易行的方法区分两种蛇毒降纤酶，为不同蛇毒降纤酶的质量标准提高提供依据，可完善降纤酶及其制剂质量标准体系，达到质控目的，利于临床使用。

附图说明

图1为实施例1中白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测纯度色谱图。

图2为实施例3中白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测纯度色谱图；

图2中的2.43和1.88分别代表的是A、B组分与其相邻峰之间的分离度。

图3为对比例1中白眉蝮蛇降纤酶的凝胶HPLC检测纯度色谱图。

图4为实施例4中尖吻蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测纯度色谱图。

图5为白眉蝮蛇降纤酶和尖吻蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测的交互结果图。

图6为对比例2白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测纯度色谱图。

图7为对比例3白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测纯度色谱图。

图8为对比例4白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测纯度色谱图。

图9为对比例5白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC检测纯度色谱图。

其中，各色谱图中横坐标为时间(min)，纵坐标为响应值(mAU)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC色谱分析检测方法，具体步骤如下：

1.纯度测定：

取白眉蝮蛇降纤酶待测样品，制备过程参考许峰发表的“降纤酶制备工艺及质量标准的研究”，取长白山白眉蝮蛇蛇毒先后经离子交换、特异性亲和吸附、疏水及分子筛层析多步纯化分离提取制得的溶液，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。

取供试品溶液20μL注入液相色谱仪进行检测，检测条件如下：

C18反相分析柱：Agilent ZORBAX 300SB-C18，4.6mm×250mm，5μm；

流动相A：称取磷酸二氢钠约2.4g，用950mL水溶解，然后用氢氧化钠溶液调节pH至6.50，再加水定容至1000mL，混匀，过滤，超声15分钟，即得；

流动相B：纯乙腈；

流动相C：200mL水加入2mL TFA，混匀，超声15分钟，即得。

洗脱程序见表1：

表1

洗脱时间：30min；检测波长：280nm；流速：0.8ml/min；洗脱温度：40℃。

记录色谱图，参见图1。按面积归一化法计算，白眉蝮蛇降纤酶两活性成分(A组分和B组分)的相对峰面积比之和。A组分和B组分之间及与其相邻的杂质峰之间的分离度均不得小于1.5，理论板数按两个主峰计算均不得低于3000。积分结果如表2所示。

2.峰纯度测定：

取上述白眉蝮蛇降纤酶待测样品，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。

按上述流动相系统，在高效液相色谱仪上用二极管阵列检测DAD检测器进行峰纯度检测，检测结果见表2所示。白眉蝮蛇降纤酶的两个主峰的峰匹配度均大于980，代表其色谱峰紫外吸收光谱图、三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明两者均为单一纯物质峰。

结果：

从图1可以看出，保留时间在17分钟左右为白眉蝮蛇降纤酶A组分，保留时间在18分钟左右为白眉蝮蛇降纤酶B组分，两者的分离度及B组分与相邻杂质峰的分离度分别为1.94和3.41，理论板数按两个主峰计算均在3000以上。相对峰面积比之和为85.19％。经DAD检测器验证两个主峰的峰纯度匹配值为983和997，代表两个主峰均为单一物质峰，具体数据如表2所示。

表2

序号	峰名称	保留时间	相对峰面积％	分离度	理论塔板数	匹配
							1	A组分	17.330	26.30	1.94	18644	983
2	B组分	18.433	58.89	3.41	14730	997
							3	--	19.535	1.24	3.34	4937	471
4	--	20.485	1.45	1.77	21833	771
							5	--	21.453	12.12	n.a.	21759	927

实施例2

本实施例对实施例1的检测方法的精密度、重复性、稳定性进行了验证。

1、精密度试验

采用与实施例1相同的白眉蝮蛇降纤酶待测样品，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。按照实施例1纯度测定方法，精密吸取上述供试品溶液，连续进样6针，A组分，B组分两个主峰保留时间的RSD值应均不大于1.0％，峰面积的RSD值应均不大于2.0％。检测结果见表3所示，按保留时间算，A组分，B组分的RSD分别为0.04％和0.04％；按峰面积计算，A组分，B组分的RSD分别为0.54％和0.78％。表明实施例1的方法精密度良好。

表3

2、重复性试验

采用与实施例1相同的白眉蝮蛇降纤酶待测样品，按其所述稀释方法平行制备6份，按照实施例1纯度测定方法检测，所测6份供试品溶液中A组分，B组分两个主峰的纯度(相对峰面积比)RSD值应均不大于2.0％。检测结果见表4所示，A组分，B组分的纯度RSD值分别为0.37％和0.42％。表明实施例1的方法的重复性良好。

表4

编号	1	2	3	4	5	6	RSD％(n＝6)
								A组分％	26.08	26.13	25.96	25.99	26.18	25.95	0.37
B组分％	58.79	59.26	58.63	58.61	59.02	58.92	0.42

3、稳定性试验

用与实施例1相同的白眉蝮蛇降纤酶待测样品，按其所述稀释方法平行制备2份，作为供试品溶液。分别置室温(25℃)与低温(4℃)条件下，按照实施例1纯度测定方法，于0、2、4、6、8、12h时进行检测，记录色谱图。按峰面积计算，A组分，B组分两个主峰的RSD值应均不大于2.0％。检测结果见表5所示，按峰面积计算，4℃条件下A组分，B组分的RSD值分别为0.90％和1.13％；25℃条件下A组分，B组分的RSD值分别为1.10％和1.01％。表明供试品溶液在室温和低温条件下12h内较稳定。

表5

实施例3

本实施例提供一种白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC色谱分析检测方法，其纯度测定方式与实施例1相同，区别仅在于：流动相A的磷酸缓冲盐的浓度为25mM。

检测结果参见图2，从中可知，两个主峰之间的分离度及与其相邻杂质峰的分离度也满足要求，考虑到盐与有机溶剂的混合可能会析出结晶，堵塞仪器管道，所以盐浓度要尽可能的小，故优选20mM。

对比例1

本实施例提供一种白眉蝮蛇降纤酶的凝胶色谱检测方法。具体步骤如下：

1.凝胶色谱纯度测定：

采用与实施例1相同的白眉蝮蛇降纤酶待测样品，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。

取供试品溶液20μL注入液相色谱仪进行检测，记录色谱图。检测条件如下：

凝胶分析柱：Biosep S2000 7.8*300mm，5μm；

流动相：0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)(取磷酸氢二钠175.4g与磷酸二氢钠79.56g，溶解于900ml水中，调节pH值至6.8，加水至5000ml，混匀，过滤，超声15分钟，即得)；

检测波长：280nm；流速：1ml/min。

检测结果见图3，从图3可以看出，白眉蝮蛇降纤酶供试品溶液只有一个主峰检出，保留时间为8.960min，也即两个主峰合并成一个色谱峰。

对比可知，本发明实施例1的所述反相色谱法检测为两组分图谱，而相同的供试品采用凝胶色谱法，结果为单组分图谱。显然，如果只通过凝胶色谱控制样品纯度，不能准确反映样品的组分分布和杂质含量，达不到质控目的，可能存在临床风险。

实施例4

本实施例提供一种尖吻蝮蛇降纤酶的反相HPLC色谱分析检测方法，具体步骤如下：

1.反相色谱纯度测定：

按照实施例1的检测白眉蝮蛇降纤酶的方法，区别在于：将供试品调整为尖吻蝮蛇降纤酶。其制备过程参见中国专利CN100336903C“从蛇毒中提取降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法”中的实施例一，取尖吻蝮蛇蛇毒经离子交换得到降纤酶粗品，然后经过特异性亲和吸附收集活性峰，制得纯化后的降纤酶中间体溶液。配制成终浓度为1mL中含1mg蛋白的供试品溶液，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，参见图4。

2.峰纯度测定：

取上述尖吻蝮蛇降纤酶待测样品，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。

按实施例1的流动相系统，在高效液相色谱仪上用二极管阵列检测DAD检测器进行峰纯度检测，检测数据如表6所示。尖吻蝮蛇降纤酶主峰的峰匹配度大于980，代表其色谱峰紫外吸收光谱图、三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。

结果：

从图4可以看出，保留时间在20分钟左右为尖吻蝮蛇降纤酶，其活性成分为单一组分，与文献所述结果相吻合。

将实施例1的反相HPLC检测结果和本实施例的反相HPLC检测结果进行交互，结果见图5。

从图5可以清晰的看出，两种蛇毒降纤酶的主峰保留时间有明显的差异，表明本发明方法可以快速准确的鉴别不同蛇毒来源的降纤酶。

尖吻蝮蛇降纤酶的二极管阵列DAD峰纯度检查的具体数据如表6所示，峰纯度匹配值为996，表明其为单一的峰，对应的为纯物质。

表6

序号	峰名称	保留时间	相对峰面积％	分离度	理论塔板数	匹配
							1	--	17.398	0.25	n.a.	26888	204
2	--	19.165	0.90	n.a.	n.a.	851
							3	尖吻蝮蛇降纤酶	20.083	96.55	3.98	8235	996
4	--	23.113	3.34	n.a.	20789	808

对比例2

本对比例提供一种白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC色谱分析检测方法，其测定方式与实施例1相同，区别仅在于：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为1％的TFA，在梯度洗脱时，流动相C的比例为10％，流动相B的比例设计三个处理组(流动相A相应增减)，在实施例1的各时间段范围内，处理组1中流动相B的比例分别为55％、55％～70％、70％～55％、55％；处理组2中流动相B的比例分别55％、55％～65％、65％～55％，55％；处理组3中流动相B的比例分别60％、60％～70％、70％～60％、60％。

结果显示在流动相B的变化比例为60％～70％时(处理组3)，为TFA体系下最佳的分离结果，见图6，A/B两个主成分仍无法实现基线分离，达不到准确定量单一成分的目的。

对比例3

本对比例提供一种白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC色谱分析检测方法，其测定方式与实施例1相同，区别仅在于：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为1％的磷酸。

流动相B的比例不变，多次调整流动相C的比例为3％、10％、15％(流动相A相应增减)，实验结果大致相同，见图7，只有一个宽而钝的峰检出，各组分之间无分辨率。足见磷酸作为离子对调节剂，对样品中各组分的选择性还远不及TFA。

对比例4

本对比例提供一种白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC色谱分析检测方法，其测定方式与实施例1相同，区别仅在于：流动相A的磷酸二氢钠浓度为15mM。

实验结果见图8，各色谱峰之间的分辨率较差，且峰形也较差，两个主峰出现峰裂分的情况。

对比例5

本对比例提供一种白眉蝮蛇降纤酶的反相HPLC色谱分析检测方法，其测定方式与实施例1相同，区别仅在于：流动相体系中无流动相C，将洗脱程序中流动相C的比例添加到A相(水相)中。

实验结果见图9，各色谱峰的响应值较差，导致检测限较高，无法检出微量的杂质。且出现单一成分的离子与分子共存的情况，导致了检出色谱峰个数增加，不能准确定量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种白眉蝮蛇降纤酶HPLC检测方法，其特征在于，采用流动相A、流动相B和流动相C进行洗脱；反相柱中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

所述流动相B为：乙腈；

所述流动相C为：三氟乙酸的水溶液；所述三氟乙酸的水溶液的浓度为1％；

洗脱程序如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述反相柱的孔径为300埃。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述反相柱的长度为250mm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，流动相的流速为0.8-1.2ml/min；洗脱温度为35-40℃；检测波长为280nm。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，流动相的流速为0.8ml/min；洗脱温度为40℃。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为：20mM的磷酸二氢钠的水溶液，所述磷酸二氢钠的水溶液通过氢氧化钠溶液调节至pH值为6.5；所述流动相B为：乙腈；所述流动相C为：1％的三氟乙酸的水溶液。

7.权利要求1-6任一项所述的检测方法在白眉蝮蛇降纤酶质量控制中的应用。

8.权利要求1-6任一项所述的检测方法在白眉蝮蛇降纤酶与尖吻蝮蛇降纤酶鉴别中的应用。