PT103757A - Processo para a análise, separação e identificação de açúcares, monossacáridos, biologicamente relevantes: seus enanteómeros, anómeros e isómeros estruturais. - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE COM UM PROCESSO DE ANÁLISE, SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO, O QUAL PERMITE A IDENTIFICAÇÃO DOS ENANTEÓMEROS D E L DOS AÇÚCARES MONOSSACÁRIDOS E, SIMULTANEAMENTE, A SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS SEUS ANÔMEROS (CX E II), PERMITINDO IGUALMENTE A SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE ISÓMEROS ESTRUTURAIS. A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE A SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA QUIRAL DOS MONOSSACÁRIDOS, UTILIZANDO COMO METODOLOGIA A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC), A QUAL PERMITE A IDENTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARES, A DETERMINAÇÃO EM SIMULTÂNEO DA SUA CONFIGURAÇÃO ABSOLUTA E CONFIGURAÇÃO DO CENTRO ANOMÉRICO DO MONOSSACÁRIDO. A INVENÇÃO APRESENTA A UTILIZAÇÃO DO PROCESSO EM DIFERENTES MATRIZES ALIMENTARES E EM SAÚDE HUMANA (ANIMAL), NO QUE RESPEITA A CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS E SUAS CONSEQUÊNCIAS, AUTENTICIDADE DOS ALIMENTOS E SUPLEMENTOS ALIMENTARES/NUTRICIONAIS E ACTIVIDADES E/OU ANOMALIA(S)/DESORDENS BIOLÓGICAS DEVIDAS A PATOLOGIA(S)/DOENÇA(S).

Description

DESCRIÇÃO

Processo para a análise, separação e identificação de açúcares, monossacaridos, biologicamente relevantes: seus enanteómeros, anómeros e isómeros estruturais. A presente invenção refere-se a um processo que permite em simultâneo, a identificação dos enanteómeros D e L dos monossacaridos, a separação e identificação dos seus anómeros (a- e β-) e/ou a separação e identificação de isómeros estruturais; processo que permite a determinação de açúcares intactos, monossacaridos, sem derivatização pré ou pós coluna cromatográfica, diminuindo assim o tempo de análise e eliminando as perdas devidas a derivatização incompleta. A análise de açúcares (também designados hidratos de carbono ou carbo-hidratos), monossacaridos ou estruturas mais complexas é, na sua maioria, efectuada por técnicas de cromatografia liquida (LC). A cromatografia liquida em fase normal (NPLC), utilizando colunas de silica amino-1igadas (amíno-bonded) tem sido a mais utilizada desde há vários anos [1]. A cromatografia de alta eficiência de troca-iónica com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) é considerada como uma técnica de alta resolução para análise de hidratos de carbono [2,3]. A derivatização da parte redutora dos monossacaridos, através da introdução de um cromóforo hidrofóbico, possibilita a utilização da cromatografia liquida de fase reversa na separação [4]. A cromatografia de troca-ligante (LEC), baseada na formação de um complexo entre os grupos hidroxilo dos hidratos de carbono e iões metálicos multivalentes, como o Pb2+, ligados a uma coluna 1/13 cromatográfica de troca catiónica, tem sido recentemente bastante usada na separação de monossacaridos [5]. Igualmente, a cromatografia liquida de interacção hidrofílica (HILIC) [6], uma variante da cromatografia em fase normal, é uma técnica referenciada na análise de hidratos de carbono.

Muitas outras técnicas cromatográficas têm igualmente sido utilizadas na separação de monossacaridos; exemplos são a cromatografia de afinidade com Concanavalin A [7], a electroforese fluorforo-assistida {fluorophore-assísted) (FACE) [8], a cromatografia liquida associada à espectrometria de massa (GC/MS) [9] e a electroforese capilar (CE) [10] . Colunas de ciclodextrinas [11] e cromatografia de fluidos supercríticos (SFC) [12] são também métodos utilizados na análise de açúcares.

No que respeita à separação isomérica de açúcares, estão descritos poucos métodos. Está descrita a separação enanteomérica em cromatografia gasosa (GC) dos açúcares permetilados, utilizando beta- e gama-ciclodextrinas como fases estacionárias [13] e a separação por electrocromatografia capilar baseada na complexação com borato, sendo aqui utilizados os derivados-PMP (l-fenil-3-metil-5-pirazolona) [14,15].

Recorrendo a derivados quirais, através da formação de diastereómeros, a identificação enanteomérica de alguns monossacaridos com utilização da cromatografia gasosa não quiral, está descrita recorrendo aos derivados trimetilsililo (TMS) do (-)-2-butilglicosidos [16] e também através da conversão dos açúcares nos éteres trimetilsililo dos derivados metil 2-(polihidroxialquil)-tiazolidina-4(R)-carboxilatos [17] . Utilizando a cromatografia liquida de 2/13 alta resolução em fase normal (RP-HPLC), os enanteómeros D,L foram separados com recurso aos derivados 1-0-(5)-2-metil-2-beta-naftil-1,3-benzodioxole-4-carboxilatos [derivados (+)-MNB] [18]. Os anómeros a- e β- de alguns açúcares foram separados a baixa temperatura (1,5-4°C) utilizando a cromatografia de troca-ligante numa coluna Aminex HPX-87C na forma Ca2+ [19] . Um método não cromatográfico para a determinação/identificação dos enanteómeros da glucose e frutose tem igualmente sido utilizado [20,21], A presente invenção proporciona a inovação surpreendente de tornar possível, em simultâneo, a análise, separação e identificação de açúcares, monossacaridos, seus enanteómeros D e L, seus anómeros (a- e β-) e igualmente os isómeros estruturais, o que nunca tinha sido efectuado. Outra inovação surpreendente é permitir a análise em simultâneo de vários monossacaridos intactos, sem derivatização (pré ou pós coluna cromatográfica) utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), na qual apenas uma coluna quiral (Chiralpak AD-H) [22] é utilizada, sendo o tempo de análise curto, análoga a outra invenção, a qual proporciona igualmente a separação enanteomérica de compostos orgânicos [23] . Outro facto que é de salientar é que o método é especialmente útil, tendo potencial para contribuir como alternativa analítica na identificação isomérica dos monossacaridos constituintes de diferentes matrizes (alimentares/biológicas), nomeadamente os açúcares principais tais como arabinose, ribose, xilose, lixose, glucose e frutose, uma vez que o desempenho/actividade/consequência biológica depende quer da 3/13 forma anomérica, quer da forma enanteomérica dos açúcares, em particular dos monossacáridos.

Esta invenção constitui um novo processo que proporciona a determinação de caracteristicas nutricionais e autenticidade quer de alimentos quer de suplementos alimentares, bem como a detecção de anomalias/desordens biológicas devidas a patologia e/ou doença.

Este processo tem potencial para ser automatizado/robotizado, permitindo a análise automática de amostras biológicas para identificação de patologia/doença e igualmente na análise de composições farmacêuticas e/ou nutricionais e alimentares.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a um novo processo para a análise estereoisomérica e isomérica de açúcares, monossacaridos. 0 processo utiliza a separação química efectuada recorrendo à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizando uma coluna cromatográfica quiral, Chiralpak AD-H.

Numa forma de realização preferida da invenção, o método consiste na separação de hidratos de carbono, monossacaridos, por cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando uma coluna quiral Chiralpak AD-H, utilizando como eluente mistura de solvente hidrocarbonado/solvente hidroxilado (metanol, etanol ou isopropanol) e modificador ácido (ácido acético e/ou ácido trifluoroacético, em sistema isocrático, com fluxo na gama 0,1-20 mL/min. A detecção efectuada em detector de Índice de 4/13 refracção (RI) ou detector de dispersão de luz (Light Scattering detector, ELSD).

PARTE EXPERIMENTAL

Equipamento e reagentes gerais

Todos os solventes utilizados são produtos analiticamente puros. Os padrões dos monossacaridos utilizados são do grau de pureza disponível mais elevado As separações em cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) foram efectuadas utilizando uma bomba Waters 501 conectada a um detector de índice de refracção (RI) e coluna Chiralpak AD-H (Daicel) e como eluente foi utilizada uma mistura de solvente hidrocarbonado/solvente hidroxilado (metanol, etanol ou isopropanol) e modificador ácido (ácido acético e/ou ácido trifluoroacético). As separações foram realizadas à temperatura ambiente, num sistema isocrático. Foram usados nas dissoluções das amostras um banho de ultrasons e agitação com vortex. As filtrações das amostras foram efectuadas utilizando filtros de 0,45μτη. As amostras foram evaporadas em evaporador rotativo.

Exemplos

Exemplo 1: Análise cromatográfica de um monossacárido comercial racémico - separação e identificação dos anómeros a- e β- de cada um dos enanteómeros D e L

Cada monossacárido padrão, racémico, foi dissolvido no eluente utilizado (mistura de solvente 5/13 hidrocarbonado/solvente hidroxilado (metanol, etanol ou isopropanol) e modificador ácido (ácido acético e/ou ácido trifluoroacético) ) numa concentração de aproximadamente lOmg/mL, recorrendo a um banho de ultra-sons e agitação em vortex durante alguns minutos. A solução foi então filtrada utilizando um filtro de 0,45 μη. Utilizaram-se 50 μ]2 da solução para a análise cromatográfica, efectuada numa coluna quiral Chiralpak AD-H, a fluxo constante e à temperatura ambiente, usando-se um detector de indice de refracção (RI). 0 resultado de uma das separações obtidas está ilustrado na Figura 1.

Exemplo 2: Análise cromatográfica de um monossacárido racémico - separação e identificação dos seus enanteómeros D e L

Cada monossacárido padrão, racémico, foi dissolvido no eluente utilizado (mistura de solvente hidrocarbonado/solvente hidroxilado (metanol, etanol ou isopropanol) e modificador ácido (ácido acético e/ou ácido trifluoroacético)) numa concentração de aproximadamente lOmg/mL, recorrendo a um banho de ultra-sons e agitação em vortex durante alguns minutos. A solução foi então filtrada utilizando um filtro de 0,45 μιτι. Utilizaram-se 50 μΐϋ da solução para a análise cromatográfica, efectuada numa coluna quiral Chiralpak AD-H, a fluxo constante e à temperatura ambiente, usando-se um detector de indice de refracção (RI). 0 resultado de uma das separações obtidas está ilustrado na Figura 2. 6/13

Exemplo_3: Análise cromatográfica dos açúcares monossacaridos para controlo e avaliação da qualidade do mel comercial - novo processo de autentificação e avaliação da origem, qualidade e condições de armazenamento

Uma quantidade de mel foi dissolvida no eluente utilizado (previamente referido nos exemplos 1 e 2) numa concentração aproximada de 100 mg de amostra por mililitro de solvente, recorrendo a agitação em banho de ultrasons e vortex durante alguns minutos. Formaram-se duas fases, tendo o sobrenadante sido filtrado de seguida, usando uma seringa e um filtro de 0,45 μτη. Inj ectaram-se 50 μΐ da solução, a qual foi cromatografada numa coluna quiral Chiralpak AD-H, a fluxo constante e à temperatura ambiente, usando-se um detector de Índice de refracção. A Figura 3 mostra um dos cromatogramas da análise de uma das amostras comerciais de mel.

Exemplo 4: Análise cromatográfica de açúcares monossacaridos do vinho do Porto - novo processo para controlo de qualidade da produção e autenticação

Uma quantidade de vinho do Porto (cerca de 5 mL) foi levada à secura utilizando o evaporador rotativo, com pressão reduzida e uma temperatura que não excedeu os 4 0 °C. A amostra seca foi retomada no eluente cromatográfico, numa concentração aproximada de 50mg/mL, tendo sido dissolvida recorrendo a ultrasons e agitação com vortex durante alguns minutos. Formaram-se duas fases tendo sido o sobrenadante filtrado com filtro de 0,45 μηη. Injectam-se 50 μΐ da solução 7/13 obtida, a qual foi cromatografada numa coluna Chiralpak AD- H, a fluxo constante e à temperatura ambiente, usando-se um detector de índice de refracção. A Figura 4 representa o resultado obtido na análise de uma amostra de vinho do Porto.

Exemplo_5: Análise cromatográfica dos açúcares monossacaridos vendidos como suplementos alimentares controle e avaliação da sua qualidade

Uma quantidade de um açúcar comercial vendido como suplemento nutricional (Glucose e/ou Açúcar de Frutos, Diese) foram dissolvidos no eluente, numa concentração aproximada 10 mg/mL, recorrendo a banho de ultrasons e a vortex durante alguns minutos. A solução foi de seguida filtrada em filtro de 0,45 μιτι. Analizaram-se 50 μ!ύ de solução, numa coluna Chiralpak AD-H, a fluxo constante e à temperatura ambiente, usando-se um detector de índice de refracção. A Figura 5 representa a análise de uma amostra de um dos suplementos nutricionais.

RESULTADOS E DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1 e 2 contêm os resultados obtidos na separação individual de dois dos monossacaridos, representando a separação anomérica da L-Glucose e a separação isomérica (enanteomérica e anomérica) da DL-Lixose, respectivamente: Figura 1 - Separação anomérica da L-Glucose: 1- fi-L-Glucopiranose, 2- a-L-Glucopiranose 8/13

Figura 2 - Separação isomérica (enanteomérica e anomérica) da DL-Lixose: 1- α-D-lixopiranose, 2- α-L-lixopiranose, 3-β-L-lixopiranose, 4- β-D-lixopiranose A Tabela 1 contém os tempos de retenção obtidos na separação dos monossacaridos analisados, utilizando uma coluna analítica. O mel, de acordo com a sua proveniência, pode apresentar diferentes perfis de açúcares incluindo monossacaridos, uma vez que a constituição dos diferentes poléns no que respeita a hidratos de carbono varia de flor para flor e, estas de região para região. Contudo, o mel produzido naturalmente apresenta uma razão glucose / frutose pouco variável. No que respeita à distribuição especifica dos seus enanteómeros e anómeros, verificou-se a existência de um perfil constante. 0 processo descrito nesta invenção permite assim a rápida e eficaz averiguação da autenticidade e qualidade de acordo com a região de origem do mel, permitindo a detecção de adulteração e/ou más condições de armazenamento ou rotulagem. A Figura 3 mostra o perfil isomérico característico de um mel:

Figura 3 - Análise isomérica dos monossacaridos de uma amostra de mel comercial: 1- fi-D-Glucopiranose, 2- a-D-Glucopiranose, 3- α-L-Fructopiranose, 4- B-D-Fructopiranose A Figura 4 ilustra a avaliação da qualidade e autenticaçao de um vinho do Porto com base na análise de açucares 9/13 monossacaridos, seus enanteómeros e anómeros, de acordo com o corpo da invenção acima referida. 0 processo permite, também no que respeita ao vinho do Porto, a detecção de adulteração/falsificação/degradaçâo, ou seja, a rápida e eficaz averiguação da autenticidade e qualidade do vinho do Porto:

Figura 4 - Análise isomérica dos monossacaridos de uma amostra de vinho do Porto: 1- β-D-Glucopiranose, 2- a-D-Glucopiranose, 3- a-D-Fructopiranose, 4- B-D-Fructopiranose A Figura 5 demonstra o controle e a avaliação da qualidade de um açúcar vendido como suplemento alimentar (Diese), adoçante de origem natural.

Figura 5 - Análise isomérica dos monossacaridos de um açúcar suplemento nutricional (Frutose): 1- B-D-Glucopiranose, 2-α-D-Glucopiranose, 3- a-D-Fructopiranose, 4- B-D-Fructopiranose. 0 controle da presença efectiva do açúcar monossacarido (seus enanteómeros e anómeros) rotulado como constituinte do suplemento é efectuado de acordo com a invenção, sendo possivel averiguar a sua autenticidade e qualidade. Os açúcares monossacaridos naturais são muito menos calóricos que os açucares dissacáridos de uso corrente (como a sacarose), razão pela qual têm vindo a ser adoptados como suplementos/substituintes em dietas, aquando da existência de algumas doenças e/ou alimentação mais saudável. Sendo consideravelmente mais caros, estes suplementos poderão estar sujeitos a falsificações/adulterações. O processo 10/13 descrito nesta invenção permite assim a rápida e eficaz averiguação da sua autenticidade e qualidade.

Tabela 1 - Tempos de retenção da separação isomérica dos monossacaridos em HPLC

Monossacarido Enanteómero L* Enanteómero D* α/β α/β α/β α/β Tempos de retenção (min) Arabinose 22,996 35,900 27,679 31,550 Lixose 17,985 23,928 16,632 29,071 Xilose 17,408 19,322 17,736 20,858 Ribose 20,762 106,176 25,586 70,653 Glucose 13,721 14,318 13,243β 13,640α Fucose 32,263 36,704 16, 123 25,559 Manose 12,901 28,850 12,489 21,329 Frutose 12,058 19,819 15,853 19,521 ^Separação obtida utilizando a mistura de hexano e etanol (7:3)e modificador TFA 0,1% como eluente. Coluna analítica Chiralpak AD-H, fluxo 0,5 ml/min.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Wei, Y., Ding, M., J. Chromatogr. A 904, 113 (2000). 2. Panagiotopoulos, C., Sempére, R., Lafout, R., Kerhervé, P., J. Chromatogr. A 920, 13 (2001) 3. Currie, H.A., Perry, C., J. Chromatogr. A 1128, 90 (2006) 4 . Kwon, Η ., Kim, J., Anal. Bíochem. 215, 243 (1993) 5. Gey, Μ.Η. , Unger, Κ. Κ. , Fresenius' J. Anal. Chem. 356, 488 (1996 ) 6. Karlsson, G., Winge, S., Sandbe rg, Η., J. Chromatogr. A 1092, 246 (2005) 11/13 7. Santori, F., Hubble, J., J. Chromatogr. A 1003, 123 (2003) 8. Calabro, A., Hascall, V.C., Midura, R.J., Glycobíology 10, 283 (2000) 9. Kenne, L., Stromberg, S., Carbohydr. Res. 198, 173 (1990) 10. Soga, T., Heiger, D.N., Anal. Biochem. 261, 73 (1998) 11. Berthod, A., Chang, S., Kullman, J., Armstrong, D.,

Talanta 47, 1001 (1998) 12. Herbreteau, B., Lafosse, M. , Morin-Allory, L., Dreux, M., J. Chromatogr. 505, 299 (1990) 13. Heinrich, J. , Konig, W.A., Bretting, H., Mischnick, P.,

Carbohydr. Res. 299, 1 (1997) 14. Gucek, M., Pihlar, B., Acta Chim. Slov. 47, 165 (2000) 15. Kodama, S., Aizawa, S.-i., Taga, A., Yamashita, T.,

Yamamoto, A., Electrophoresis 27, 4730 (2006) 16. Gerwig, G.J., Kamerling, J., Vliegenthart, J.,

Carbohydr. Res. 62, 349 (1978) 17. Hara, S., Okabe, H., Mihashi, K., Chem. Pharm. Buli. 35, 501 (1987) 18. Bai, C., Ohrui, H., Nishida, Y., Meguro, H., Anal.

Biochem. 246, 246 (1997). 19. Nishikawa, T. , Suzuki, S., Kubo, H., Ohtani, H., J. Chromatogr. A 720, 167 (1996) 20. Honda, S., J. Chromatogr. A 720, 1 (1996) 21. Fallico, B., Zappalà, M., Arena, E., Verzera, A., Food Chem. 85, 305 (2004) 22. Caprettini, G. Gasparrini, F., Marchese, A., Misit, D.,

Villani, C., "Chiral stationary phase, e.g. for liquid chromatography, comprises chiral polyamide polymer immobilized by covalent bond onto solid support", W02 003IT00164 20030320. 12/13 23. Guenther, K., Merget, S., Drauz, K. , Krimmer, H.-P., "Chromatographic separation of enantiomers of bicyclic lactaras", US006656902B2 20031202.

Lisboa, 4 de Julho de 2007 13/13

Claims (6)

1» PrOveó SO p3.Γ. ci d.nal.iSaf, SCp ti r<J Γ è xdPnfci f :l.C3f a.ÇUCareS mo no s sa c a r ido s, c a r a c t. e r 1 ?; ado por soparor os sous enanteomeros (D # L), anómer-ôa- (m e β:) -e isámeres estruturais: utilif afido 3 croma t.ocjra t i a liquida de alta éficiência (HPLC), com eiuentes (solventes não qu.irai.s e coluna crornatográfica qulral,

2. Processo para analisar, separar e .identificar açúcares, mono; s S.a c ariaos, cie acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por separar o-s enanteómeros, anómefos: é is©meros estruturais p0f cromatografia liquida de alta eficiência (HlM.C.i quiral, utilizando mistura de so i vont. os aquirais : soven l.c h i droca rbonacio/solventc hídroxllado (metanol,: etanol ou isopropanoi) e modificador ácido (ácido; acético e/ou ácido trifluoroacético) como eluente,

3. Processo para analisar, separar e identificar açúcares., monossacaridos, de acordo: com as reivindicações: 1 e 2, caracterizadQ por utilizar a metodologia de HPL€, em Bistema isocrético, com fluxo na gama 0., 1-2:0 mL/min.

4. Processo para analisar, separar e identificar açúcares, monossacaridos, de acordo com as reivindicações. 1, 2 e 3, caractarizado: por utilizar a metodologia de HFbC em coluna quira" Chi ralpak AB-H.

5. Processo separatlao, de acordo co;m as reivindicações 1. a 4, caracteri cado por poder ser utílloado automâtícámente, de um modo robctizado e/ou "on 7. i ne" na análise da qualidade da produção e producto final das matrizes alimentares e/ou suplementos nutricionais.

6. Processo separatlvo., de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por poder ser utilizado automaticamente, de um modo robotizado e/ou "online" na análise de amostras biológicas para identificação de patologia / doença. 7u. Processo útil na análise de composições farmacêuticas de acordo com as reivindicações 1 a 4, earacterizado por determinar a composição em monossacaridos, seus enanteóiTieros, anomeros: e/ou isómerós estruturais. Lisboa, 5 de Maio de 2009 2/2