JP6363327B2 - 改変アマドリアーゼ - Google Patents

Description

本発明は、改変アマドリアーゼ、その遺伝子および組み換え体ＤＮＡ、並びに糖化アミノ酸への作用が改変されたアマドリアーゼの製造法に関する。

糖化蛋白質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、蛋白質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。蛋白質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、蛋白質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化蛋白質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。

これら生体内で生じる糖化蛋白質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ヘモグロビンはαサブユニット（以降α鎖と表記）２分子とβサブユニット（以降β鎖と表記）２分子の計４分子のサブユニットから構成される蛋白質であり、β鎖のアミノ末端が糖化されたヘモグロビンはＨｂＡ１ｃと称されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。

このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）、若しくはα−フルクトシルバリン（以降αＦＶと表す）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照）。
実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きく、定量性が低いと考えられている。そのため、現在では特定のプロテアーゼを用いてＨｂＡ１ｃのβ鎖からαＦＶＨを遊離させ、それを定量することによりＨｂＡ１ｃを測定する方法が主流となっている。

アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する。
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１６、非特許文献１〜９参照）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。

酵素的方法によるＨｂＡ１ｃの測定においては、アマドリアーゼの性質として厳密な基質特異性が要求される。例えば、先述の様に、特定のプロテアーゼにより遊離されたαＦＶＨを定量することによりＨｂＡ１ｃの測定を実施する場合には、検体中に遊離状態で存在する、および／または、プロテアーゼ等を用いたＨｂＡ１ｃの処理工程において遊離される、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドには作用し難いアマドリアーゼを用いることが望ましい。また、ヘモグロビン分子中に含まれるリジン残基側鎖のε位のアミノ基は糖化を受けることが知られており、この糖化を受けたリジン残基に由来する、ε位のアミノ基が糖化されたε−フルクトシルリジン（以降εＦＫと表す）が、プロテアーゼ処理等によって遊離されることが示唆されている（非特許文献１０参照）。

実際、現在実用化されているＨｂＡ１ｃ測定法として、測定用のサンプルとして全血を利用するキットが存在しているが、全血中には、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端に由来するαＦＶＨ以外にも、種々の糖化アミノ酸が存在していることが示唆されている（特許文献１７参照）。このような現象は、例えば、特に高カロリーアミノ酸輸液が投与された患者で多く発生し、同様の現象が糖化アルブミンの測定においても正誤差を生じ得ることが報告されている（非特許文献１１〜１３参照）。この現象は、高カロリーアミノ酸輸液によって、高濃度の糖およびアミノ酸が体内に補充された結果、血中もしくは輸液バッグ中で遊離の糖化アミノ酸または糖化ペプチドが生成し、これを測り込んでしまうために、測定値が異常に高値となるものと考えられている。

具体的に、高カロリー輸液にどの程度のアミノ酸および糖が含まれているかというと、例えば、アミノトリパ（登録商標）１号輸液（大塚製薬工場社製）中には、Ｌ−ロイシンが３１．４ｍＭ、Ｌ−アラニンが２６．４ｍＭ、グリシンが２３．１ｍＭ、Ｌ−バリンが２０．１ｍＭ、Ｌ−イソロイシンが１７．９ｍＭ、グルコースが５２１ｍＭ含有されている。また、ユニカリック（登録商標）Ｎ輸液（テルモ社製）中には、Ｌ−ロイシンが３０．９ｍＭ、Ｌ−アラニンが２９．０ｍＭ、グリシンが２２．０ｍＭ、Ｌ−バリンが２３．０ｍＭ、Ｌ−イソロイシンが１９．４ｍＭ、グルコースが９７１ｍＭ含まれている。このような種々のアミノ酸を含有する輸液を体内に補充することにより、血中には、種々の糖化アミノ酸、例えば、α−フルクトシルロイシン（以降αＦＬと表す）、α−フルクトシルアラニン（以降αＦＡと表す）、α−フルクトシルグリシン（以降αＦＧと表す）、αＦＶ、α−フルクトシルイソロイシン（以降αＦＩと表す）等が生成され得る。ＨｂＡ１ｃを測定するにあたっては、αＦＶＨ以外のこれらの物質は、測定誤差の原因物質となることが予測されるため、こうした糖化アミノ酸に対し作用し難い、基質特異性の高いアマドリアーゼが強く望まれている。

一般的な技術として、酵素の基質特異性を改変するためには、酵素をコードするＤＮＡに変異を加え、酵素のアミノ酸に置換を導入し、目的とする基質特異性を備えた酵素を選抜する方法が知られている。また、アミノ酸配列の同一性の高い酵素において、アミノ酸置換によって基質特異性を高めたという例が既に知られている場合には、その情報をもとに基質特異性の向上を予想することが可能である。

実際、カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）ＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼおよびネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）４７４由来のケトアミンオキシダーゼについては、数個のアミノ酸を置換することによって、αＦＶＨに対する基質特異性が向上した改変型ケトアミンオキシダーゼが示されている（特許文献１参照）。例えば、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼにおいては、５８位のイソロイシンをバリンに、６２位のアルギニンをヒスチジンに、３３０位のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより、ε−フルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニルリジン）（以降εＦＺＫと表す）に対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるεＦＺＫ／αＦＶＨが０．９５から０．０２５へと低減し、かつ、αＦＶに対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるαＦＶ／αＦＶＨが６．３から２．２へと低減することが示されている。

しかし、上記文献において開示される改変型ケトアミンオキシダーゼはαＦＶ／αＦＶＨが低減しているものの、αＦＶの影響を十分に回避できたとはいえない。また、εＦＺＫやαＦＶ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低減を確認している旨の記載もない。

また、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ａ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、αＦＶＨに対する反応性を新たに付与した改変型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが報告されている（特許文献１１参照）。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ａ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの、５９位のセリンをグリシンに、かつ６５位のリジンをグリシンに置換することにより、または１０９位のリジンをグルタミンに置換することにより、新たにαＦＶＨに対する酵素活性が付与され、αＦＶ／αＦＶＨは２．９となることが示されている。しかしながら、当該アミノ酸置換が糖化アミノ酸に対する反応性の低減に寄与するとの記載はなく、この変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおいても、αＦＶ等の糖化アミノ酸の影響を十分に回避できたとはいえない。

実際の測定条件は個々に異なるが、公知の文献中に、各種アマドリアーゼのεＦＫに対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比である「εＦＫ／αＦＶＨ」および／またはεＦＫに対する酵素活性をαＦＶに対する酵素活性で割って導いた活性比である「εＦＫ／αＦＶ」を低減させた改変型アマドリアーゼに関する開示がみられる：Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、εＦＫ／αＦＶＨおよび／またはεＦＫ／αＦＶが低い改変型アマドリアーゼが報告されている（特許文献１８参照）。

例えば、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼの９８位のグルタミン酸をアラニンに、１５４位のセリンをアスパラギンに、２５９位のバリンをシステインに置換することにより、εＦＫ／αＦＶＨが０．３１６から０．０１７まで低減され、αＦＶ／αＦＶＨは３．３７から２．３２に低減されることが示されている。また、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、εＦＫ／αＦＶＨが低い改変型アマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１４参照）。
また、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの５８番目のイソロイシンをスレオニンに、２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換することにより、εＦＫ／αＦＶＨが０．１３から０．０２まで低減され、αＦＶ／αＦＶＨは４．９から０．５に低減されることが示されている。さらに５８番目のイソロイシンをスレオニンに、２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに、１１０番目のグルタミンをフェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、またはリジンに置換することにより、αＦＶ／αＦＶＨは４．９から０．４に低減されることが示されている。
しかしながら、これらの置換を導入することによっても、αＦＶＨを測定する上でαＦＶの影響が回避されているとは言い難い。

例えば、上述のＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの５８番目のイソロイシンをスレオニンに置換することにより、αＦＶ／αＦＶＨは４．９から０．５に低減されるが、この置換を有する酵素を用いてαＦＶＨ（終濃度２６μＭ）を測定する際に、１３μＭのαＦＶを共存させた場合には、αＦＶＨのみを測定した吸光度変化量に比べて約５０％も測定値が上乗せされることが示されている（特許文献１９参照）。さらに、αＦＶおよびεＦＫ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低減に寄与するとの記載もない。

なお、各種アマドリアーゼを利用して、実際に血液試料中のＨｂＡ１ｃを測定するためには、アマドリアーゼおよび各種の必要とされる成分が処方された測定用試薬組成物を調製し、これを所定の方法で使用して測定を行う。そして、精度の高い測定値を得るという目的のために、酵素自体の性質を向上させる取り組みに加え、例えば、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫ等の影響をできる限り受け難い測定用試薬組成物や、αＦＶやεＦＫなどの糖化アミノ酸の影響をできる限り受け難い測定方法の開発も行われている。

例えば、αＦＶやεＦＫなどの糖化アミノ酸の影響を低減するための試みとして、アマドリアーゼによってαＦＶＨを測定するのに先立ち、εＦＫ等の影響物質を別の酵素を用いて消去する方法が開示されている（例えば、特許文献１６参照）。この方法により影響物質の量を予め減らすことによって、測定値の精度向上が期待できる。しかし、この方法は、消去操作という付随的な前処理が必要となり、測定操作が複雑化するという課題を有する。消去に要する時間、消去反応を停止させる時間など、消去工程に伴う作業に要する時間の分だけ測定時間が長くなる点も課題である。さらに、消去酵素の反応性や安定性まで考慮に入れて、消去にも、測定にも、そして保存にも適した試薬処方を組まねばならないという点は、処方の検討上、大きな制約となり得る。

εＦＫ等の影響を低減するための別の試みとしては、ｐＨ５．５、ｐＨ６．５等の弱酸性ｐＨ条件下でアマドリアーゼを作用させてαＦＶＨの測定を行う方法が報告されている（特許文献２参照）。しかしながら、εＦＫ以外の糖化アミノ酸についての影響を回避しているという言及はない。

すなわち、天然型若しくは変異型アマドリアーゼを含め、αＦＶＨに対する反応性に対するαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の比率が十分に低いアマドリアーゼや、そのようなアマドリアーゼを用いることにより、糖化アミノ酸の影響をできる限り受け難いαＦＶＨの測定を行うための知見は、これまでにごく僅か報告されているにすぎず、αＦＶＨに対する特異性が高く、精度の高いＨｂＡ１ｃの測定を実現し得るアマドリアーゼが求められている。

国際公開第２００４／１０４２０３号 国際公開第２００５／４９８５７号 特開２００１−９５５９８号公報 特公平０５−３３９９７号公報 特開平１１−１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号 特開２０１１−２２９５２６号公報 特開２００３−２３５５８５号公報 特開２００４−２７５０１３号公報 特開２００４−２７５０６３号公報 特開２０１０−３５４６９号公報 特開２０１０−５７４７４号公報 国際公開第２０１０／４１７１５号 国際公開第２０１０／４１４１９号 国際公開第２０１１／１５３２５号 国際公開第２００７／１０９５０号 特開２０１０−１１０３３３号公報 国際公開第２０１２／１８０９４号 特開２０１０−２３３５０１号公報

Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３１１， １０４−１１， ２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０６， ３５８−６６， ２０１０ Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０２， ２４１−３， ２００６ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４， ８１３−９， ２００７ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４２， ４９９−５０５， １９９６ Ｍａｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６， ６２５−３２， ２００４ Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６， １２５６−６１， ２００２ Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６， ２３２３−２９， ２００２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７， ２７−３２， ２００５ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， ２７６１３−２０， ２００４ 検査と技術 ３２， ５４２−５４４， ２００４ ＪＪＣＬＡ ２８， １３４−１３８， ２００３ 生物試料分析 ２７， ９７−１０３， ２００４

本発明が解決しようとする課題は、糖化ヘモグロビンのβ鎖アミノ末端に由来するα−フルクトシルバリルヒスチジン以外の糖化アミノ酸の存在下においても、α−フルクトシルバリルヒスチジンを正確に測定できるアマドリアーゼを提供することにある。

本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ属をはじめとする複数の微生物由来のアマドリアーゼにおける特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する；
（ｉｉ）１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を行うことで、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対するα−フルクトシルバリルヒスチジン以外の糖化アミノ酸への反応性の割合が、欠失、挿入、付加、および／または置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、低減している
の性質を有するアマドリアーゼ。
（２）以下の（ｉｉｉ）および（ｉｖ）：
（ｉｉｉ）配列番号１、３０、３３または３５に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有する；
（ｉｖ）１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を行うことで、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対するα−フルクトシルバリルヒスチジン以外の糖化アミノ酸への反応性の割合が、欠失、挿入、付加、および／または置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、低減している
の性質を有するアマドリアーゼ。
（３）糖化アミノ酸が以下の（ａ）から（ｌ）：
（ａ）α−フルクトシルロイシン
（ｂ）α−フルクトシルアラニン
（ｃ）α−フルクトシルグリシン
（ｄ）α−フルクトシルバリン
（ｅ）α−フルクトシルイソロイシン
（ｆ）α−フルクトシルスレオニン
（ｇ）α−フルクトシルフェニルアラニン
（ｈ）α−フルクトシルセリン
（ｉ）α−フルクトシルメチオニン
（ｊ）α−フルクトシルグルタミン酸
（ｋ）ε−フルクトシルリジン
（ｌ）β−フルクトシルアラニン
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上である、上記（１）または（２）記載のアマドリアーゼ。
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ｍ）から（ｓ）：
（ｍ）６２位のアルギニン
（ｎ）６３位のロイシン
（ｏ）６４位のアルギニン
（ｐ）２６１位のチロシン
（ｑ）２６３位のグリシン
（ｒ）３５５位のアラニン
（ｓ）４１７位のアルギニン
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する、上記（３）記載のアマドリアーゼ。
（５）配列番号１に示すアミノ酸配列の（ｍ）から（ｓ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置でのアミノ酸残基の置換が以下の（ｔ）から（ｚ）：
（ｔ）６２位のアルギニンがアラニンまたはセリンに置換されている；
（ｕ）６３位のロイシンがアラニンに置換されている；
（ｖ）６４位のアルギニンがセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはヒスチジンに置換されている；
（ｗ）２６１位のチロシンがフェニルアラニン、アスパラギンまたはリプトファンに置換されている；
（ｘ）２６３位のグリシンがセリンに置換されている；
（ｙ）３５５位のアラニンがヒスチジンまたはアスパラギン酸に置換されている；
（ｚ）４１７位のアルギニンがヒスチジンに置換されている；
である上記（４）記載のアマドリアーゼ。
（６）配列番号１に示すアミノ酸配列において、以下の（ａａ）から（ａｆ）：
（ａａ）２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換；
（ａｂ）６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換；
（ａｃ）２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのアミノ酸のセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換；
（ａｄ）２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換；
（ａｅ）６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換；
（ａｆ）６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、上記（４）記載のアマドリアーゼ。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
（８）上記（７）記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
（９）上記（８）記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（１０）以下の工程：
（ｉ）上記（９）記載の宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程
を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
（１０）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。

本発明によれば、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る基質特異性の優れたアマドリアーゼ、具体的には、「αＦＶＨに対する反応性」に対する「αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性」の割合が低減しているアマドリアーゼを提供することができる。

種々の生物種由来の公知のアマドリアーゼの配列を例示する図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。

一態様において、本発明のアマドリアーゼは、配列番号１、３０、３３または３５に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼに基づき作製された、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体である。このような変異体の例としては、配列番号１、３０、３３または３５と高い配列同一性（例えば、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、および、配列番号１、３０、３３または３５のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。

なお、特許請求の範囲に記載されたアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７５％以上の同一性を有する公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列の数例を、公知のアルゴリズムを用いて整列させたものである。１８４位及び２６５位以外は配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図中に、本発明の変異体における変異点を示している。

図１には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ（配列番号２６）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２７）、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２８）、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２９）、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３０）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３１）、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３４）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列を示してある。
図１から理解されるように、配列番号１で例示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置は、このような配列同一性に基づく公知の整列処理によって、当業者であれば容易に推定することができる。

一態様において、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性が改変されたアマドリアーゼは、アマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つまたは数個のアミノ酸残基を欠失、挿入、付加、および／または置換することによって得ることができる。
αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性の低減をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換を見出した。
（１）６２位のアルギニンの置換、例えば、アラニン、セリンへの置換。
（２）６３位のロイシンの置換、例えば、アラニンへの置換。
（３）６４位のアルギニンの置換、例えば、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンへの置換。
（４）２６１位のチロシンの置換、例えば、フェニルアラニン、アスパラギン、トリプトファンへの置換。
（５）２６３位のグリシンの置換、例えば、セリンへの置換。
（６）３５５位のアラニンの置換、例えば、ヒスチジン、アスパラギン酸への置換。
（７）４１７位のアルギニンの置換、例えば、ヒスチジンへの置換。

αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性を改変させたアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換や欠失を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換または欠失を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６または７を有している。
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換を有している変異体が好ましい。
（８）２６１位のチロシンの置換および２６３位のグリシンの置換、例えば、２６１位のトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換。
（９）６２位のアルギニンの置換、２６１位のチロシンの置換および２６３位のグリシンの置換、例えば、６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換。
（１０）２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換。
（１１）２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換。
（１２）６２位のアルギニンの置換、２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換。
（１３）６２位のアルギニンの置換、２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換。

本発明のαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性を改変させたアマドリアーゼ変異体は、配列番号１、３０、３３または３５に示すアミノ酸配列において、上記の基質特異性の改変をもたらすアミノ酸の置換を有し、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１または数個(例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個)のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されたアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。さらに、上記の基質特異性の改変をもたらすアミノ酸の置換変異を有し、配列番号１、３０、３３または３５に示すアミノ酸配列の該置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、７５％以上、好ましくは８６％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。

上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、本明細書中ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７と称する組換え体プラスミド（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５９３）を保持する大腸菌が生産するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）であり、このアマドリアーゼは先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである（国際特許第２００７／１２５７７９号参照）。ＣＦＰ−Ｔ７は、天然型のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である。

（アミノ酸配列の同一性）
アミノ酸配列の同一性は、公知の任意の方法を用いて計算することができる。例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。

（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。

次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報参照）が挙げられる。

これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ ｓｐ． ＮＩＳＬ ９３３０株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡがｐＫＫ２２３−３ Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・バイオテク社製）に挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特開２００３−２３５５８５号公報参照）が挙げられる。

（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等が好ましい。

（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。

蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２， ９４４１ （１９８４）： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４， ３５０ （１９８７）： Ｇｅｎｅ， ３７， ７３ （１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ８７４９ （１９８５）： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ８７６５ （１９８５）： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １４， ９６７９ （１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８２， ４８８ （１９８５）： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４， ３６７ （１９８７））等が挙げられる。

また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， １， １１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。

上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等を用いることにより行うことができる。

（形質転換・形質導入）
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。

（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。

なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６２位のアルギニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のセリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６１位のアルギニンである。

また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のロイシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のイソロイシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６２位のロイシンである。

さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６４位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６４位のアルギニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のアルギニンである。

さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６１位のチロシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のチロシン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５９位のチロシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のチロシンである。

さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６３位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のグリシン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のグリシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５９位のグリシンである。

さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５３位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３５５位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５１位のアラニンである。

さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１７位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１７位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。

すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは４１７位のアルギニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１６位のアルギニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４１９位のアルギニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４１８位のイソロイシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１８位のアルギニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４１４位のアルギニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１７位のリジンである。

（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。

また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。

また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化蛋白質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化蛋白質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。

培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３７℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。

培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。

上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の糖化アミノ酸に対する反応性が低減したアマドリアーゼを得ることができる。

（本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低下）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性が低下し、結果として、αＦＶＨに対する基質特異性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のものと比較して、「αＦＶＨへの反応性」に対する「αＦＶＨ以外の各種糖化アミノ酸に対する反応性」の割合、例えば、「αＦＬへの反応性」の割合が低減していることを特徴とする。
「糖化アミノ酸」は、アミノ酸または短鎖のペプチドが糖化を受けたものであれば特に限定されないが、例えば、血中や輸液中に遊離状態で存在することが想定される各種のα−糖化アミノ酸、β−糖化アミノ酸および／またはε−糖化アミノ酸が挙げられる。
具体的には、例えば、α−フルクトシルロイシン（αＦＬ）、α−フルクトシルアラニン（αＦＡ）、α−フルクトシルグリシン（αＦＧ）、α−フルクトシルバリン（αＦＶ）、α−フルクトシルイソロイシン（αＦＩ）、α−フルクトシルスレオニン（αＦＴ）、α−フルクトシルフェニルアラニン（αＦＦ）、α−フルクトシルセリン（αＦＳ）、α−フルクトシルメチオニン（αＦＭ）、α−フルクトシルグルタミン酸（αＦＥ）、α−フルクトシルリジン、α−フルクトシルトリプトファン、α−フルクトシルシステイン、α−フルクトシルチロシン、α−フルクトシルアルギニン、α−フルクトシルヒスチジン、α−フルクトシルプロリン、α−フルクトシルアスパラギン酸、ε−フルクトシルリジン（εＦＫ）、α, ε−フルクトシルリジン、β−フルクトシルアラニン（βＦＡ）等が挙げられる。
これらの糖化アミノ酸は、例えば遊離状態で輸液や薬物投与等により血中に持ち込まれ得、あるいは、糖とアミノ酸が血中で反応することにより生成し得る。または、糖化ヘモグロビンを測定するための前処理において、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンなどの糖化蛋白質からプロテアーゼやペプチダーゼ等の作用を受けて糖化アミノ酸として切り出され得る。
例えば、輸液中には、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ等が多く含まれ、これらは輸液を受けている患者の検体を測定する際の、αＦＶＨ以外の各種糖化アミノ酸の代表的な例として想定され得る。
本発明において、糖化アミノ酸には、αＦＶＨを測定することによってＨｂＡ１ｃを測定する方法において測定誤差を生じ得る短鎖の糖化ペプチドを含み得る。

本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低下において、Ｌ−ロイシンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＬに対して反応性が低減していることは特に好ましい。αＦＬは、高カロリーアミノ酸輸液中に最も多く存在する。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＬへの反応性の割合を示す「αＦＬ／αＦＶＨ」は、改変前に対して１３％以上、好ましくは２３％以上、より好ましくは３８％以上、さらに好ましくは７２％以上、最も好ましくは８３％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、８７％以下まで低下し、好ましくは７７％以下まで低下し、より好ましくは６２％以下まで低下し、さらに好ましくは２８％以下まで低下し、最も好ましくは１７％以下まで低下していることが好ましい。

また、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低下において、Ｌ−アラニンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＡに対して反応性が低減していることも好ましい。αＦＡは、高カロリーアミノ酸輸液中に多く存在する。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＡへの反応性の割合を示す「αＦＡ／αＦＶＨ」は、改変前に対して６％以上、好ましくは３３％以上、より好ましくは４６％以上、さらに好ましくは５３％以上、さらに好ましくは６７％以上、最も好ましくは７２％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、９４％以下まで低下し、好ましくは６７％以下まで低下し、より好ましくは５４％以下まで低下し、さらに好ましくは４７％以下まで低下し、さらに好ましくは３３％以下まで低下し、最も好ましくは２８％以下まで低下していることが好ましい。

さらに、高カロリーアミノ酸輸液中に多く存在するグリシンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＧに対する反応性が低減していることも、本発明のアマドリアーゼの性質として好ましい。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＧへの反応性の割合を示すαＦＧ／αＦＶＨは、改変前に対して１９％以上、好ましくは３１％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６９％以上、最も好ましくは７５％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、８１％以下まで低下し、好ましくは６９％以下まで低下し、より好ましくは５０％以下まで低下し、さらに好ましくは３１％以下まで低下し、最も好ましくは２５％以下まで低下していることが好ましい。

さらに、高カロリーアミノ酸輸液中に多く存在するＬ−バリンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＶに対する反応性が低減していることも、本発明のアマドリアーゼの性質として好ましい。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＶへの反応性の割合を示すαＦＶ／αＦＶＨは、改変前に対して６％以上、好ましくは１９％以上、より好ましくは３７％以上、さらに好ましくは４９％以上、最も好ましくは５６％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、９４％まで低下し、好ましくは８１％まで低下し、より好ましくは６３％まで低下し、さらに好ましくは５１％まで低下し、最も好ましくは４４％まで低下していることが好ましい。

真の測定対象物質であるαＦＶＨに対する反応性に対する、上述のような測定誤差原因物質である糖化アミノ酸（例えば、αＦＬ）に対する反応性の割合は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、ｐＨ７．０において、５ｍＭのαＦＬを添加して測定した活性を、５ｍＭのαＦＶＨを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶＨに対する反応性に対するαＦＬに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。

改変前のものと比較して基質特異性が向上している本発明のアマドリアーゼの一例としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄ）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。このような基質特異性が改善されたアマドリアーゼは、糖化アミノ酸、例えば、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧおよび／またはαＦＶをノイズとして測り込む度合が良好に低減され、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端由来の糖化アミノ酸であるαＦＶＨのみを測定することが可能となるため、精度の高い測定を行うことができ、産業利用上非常に有利である。

（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。

本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。

本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ、若しくはαＦＶＨを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ、若しくはαＦＶＨを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
αＦＬ等の糖化アミノ酸、およびαＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らやＨａｓｈｉｂａやＨｅｙｎｓらの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４２， ７６３−７６８ （１９７８）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１６， １８３−１９５（１９８３）参照）。

Ａ．：試薬の調製
試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマンバイオケミファ社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５、ｐＨ７．０またはｐＨ６．５）に溶解し、１，０００ｍｌに定容する。
試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学研究所社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ； 終濃度５ｍＭ）
αＦＶＨ ６２５ｍｇ、αＦＬ ４４０ｍｇ、αＦＡ ３７７ｍｇ、αＦＧ ３５５ｍｇ、またはαＦＶ ４１９ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。

Ｂ：活性測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡｓ）を測定した。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡ０）を測定した。３７℃で１分間あたりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出した。

活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×3.0×ｄｆ｝÷（39.2×0.5×0.1）

ΔAs：反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の１分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数（mM^-1・cm^-1）
0.5：１ｍｏｌの過酸化水素により生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
df：希釈係数

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。

（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼの調製）
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの調製
Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを得た。

（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ_４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。

反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ａ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンをアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号６、７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６３Ａ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号８、９の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｓ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをアスパラギン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｄ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをグルタミン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｅ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをヒスチジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｈ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをフェニルアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３、１４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンがフェニルアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをアスパラギンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｎ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをトリプトファンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、１６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンがトリプトファンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１７、１８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６３Ｓ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンをヒスチジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９、２０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｈ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンをアスパラギン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号２０、２１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の４１７位のアルギニンをヒスチジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号２２、２３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の４１７位のアルギニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−４１７Ｈ）を得た。

（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、基質特異性確認のための酵素液０．６ｍｌを調製した。

（４）αＦＬ／αＦＶＨ、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨおよびαＦＶ／αＦＶＨの測定
上述の酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨに対するαＦＬ、αＦＡ、αＦＧまたはαＦＶの酵素活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株から生産した改変前のアマドリアーゼについても、同様の測定を行った。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。
その結果、上述の酵素活性測定の結果から得られた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株によって生産される改変前のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨは１．５３であり、αＦＡ／αＦＶＨは２．８６であり、αＦＧ／αＦＶＨは０．１６であり、αＦＶ／αＦＶＨは３．０７であった。
これに対し、部位特異的変異導入により作製した改変後の各種のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨ、および改変前のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨの値を１００％とした時の改変後のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨの比率を算出した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨおよびαＦＶ／αＦＶＨに対しても算出し、結果を表１に示した。表中のデータにおいて、上段の数値はαＦＶＨの反応性に対する各種糖化アミノ酸の反応性の割合であり、下段の数値はＣＦＰ−Ｔ７の反応性を１００とした場合の、変異導入後の反応性の比率である。

すなわち、表１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｈを除く全ての改変型アマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨは、いずれも８７％以下にまで低下し、顕著なものでは７７％まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−６２ＳおよびＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｄにおいては６２％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆにおいては２８％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗにおいては１７％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、改変型アマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨが６５％以下まで低下すると、輸液中に最も多く含まれ得るαＦＬよりもαＦＶＨが優先的に反応することとなるために、このような改変は特に有用であると考えられる。
同様に、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＡ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ａを除く全ての改変型アマドリアーゼのαＦＡ／αＦＶＨは、いずれも９４％以下にまで低下し、顕著なものでは６７％まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｈにおいては５４％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓにおいては４７％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄにおいては３３％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗにおいては２８％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
同様に、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＧ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、表１に示す全ての改変型アマドリアーゼのαＦＧ／αＦＶＨは、いずれも８１％以下にまで低下し、より顕著なものでは６９％以下まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄにおいては５０％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−６４ＥおよびＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆにおいては３１％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ、ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｓ、ＣＦＰ−Ｔ７−６４ＤおよびＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗにおいては２５％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
さらに同様に、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＶ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、表１に示す全ての改変型アマドリアーゼのαＦＶ／αＦＶＨは、いずれも９４％以下にまで低下し、顕著なものでは８１％まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓにおいては６３％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１ＷおよびＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｈにおいては５１％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆにおいては４４％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄは、αＦＬ／αＦＶＨ、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨおよびαＦＶ／αＦＶＨ、全てにおいて少なくともＣＦＰ−Ｔ７と比較して６９％以下にまで低下し、同様にＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓは少なくとも６３％まで低下し、同様にＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗは少なくとも５１％まで低下する有用な変異であった。
一方、ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｈは、αＦＡ、αＦＧおよびαＦＶへの反応はＣＦＰ−Ｔ７に比べて顕著に低減しているにも関わらず、αＦＬに対しては反応性が向上することが分かった。また、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ａは、αＦＬ、αＦＧおよびαＦＶへの反応はＣＦＰ−Ｔ７に比べて顕著に低減しているにも関わらず、αＦＡに対しては反応性が向上することが分かった。
このように、いくつかの位置に置換を導入することにより、αＦＶＨを測定する際の誤差原因物質となり得るαＦＧおよびαＦＶへの反応を低減できた。また、置換の位置やアミノ酸の種類により効果の有無や程度には差がみられたが、αＦＬまたはαＦＡに対しても反応性を低減できる複数の置換を見出した。

なお、国際公開第２００４／１０４２０３号において、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼの６２位のアルギニンをヒスチジンに置換することにより、αＦＶＨへの反応性に対するεＦＺＫ（ε−フルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニルリジン）に対する反応性の割合であるεＦＺＫ／αＦＶＨが０．９５から０．２４へと低減することが開示されていたため、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンをヒスチジンに置換した場合の効果についても検証した。
具体的には、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、２４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｈ）を得た。得られた組換え体プラスミドを用いて上記の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。

Ｃ．試薬の調製
試薬４：基質溶液（６０ｍＭ； 終濃度２ｍＭ）
αＦＶＨ ２５０ｍｇ、εＦＫ １８５ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。

上述の酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法において試薬３の代わりに試薬４を用いた方法により、αＦＶＨに対するＦＫの酵素活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株から生産した改変前のアマドリアーゼについても、同様の測定を行った。なお、活性測定にはｐＨ７．５に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。
その結果、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株によって生産される改変前のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨは０．１８であり、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｈ）株によって生産される、６２位のアミノ酸をヒスチジンに置換する変異導入後のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨは０．２６であった。つまり、ＣＦＰ−Ｔ７においては、６２位のアルギニンをヒスチジンに置換することは、基質特異性を逆に悪化させ、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼにおけるεＦＺＫを用いた基質特異性改変知見と逆の効果を奏することが確認された。

（基質特異性改善に有効な変異の蓄積）
表２に示した各種組換え体プラスミドＤＮＡを鋳型として、合成オリゴヌクレオチド（配列番号４、５、１８、１９、２０、２１、２５）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。
これにより、その結果、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された二重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ／２６３Ｓ、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがヒスチジンに置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｈ、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄ、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがヒスチジンに置換された四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｈ、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを得た。
そして、配列番号１記載のアミノ酸配列に表２中の「アミノ酸変異」の欄に記載した複数のアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
上述の酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨに対するαＦＬ、αＦＡ、αＦＧまたはαＦＶの酵素活性を測定した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表２に示す。表中のデータにおいて、上段の数値はαＦＶＨの反応性に対する、各種糖化アミノ酸の反応性の割合であり、下段の数値はＣＦＰ−Ｔ７の反応性を１００とした場合の、変異導入後の反応性の比率である。

すなわち、表２に示す通り、実施例１で確認された各種の単独変異を組み合わせて作製した各種多重変異体においては、ほとんどの場合、基質特異性が顕著に改善した。
具体的には、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された二重変異体におけるαＦＬ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して１７％であり、αＦＡ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＡ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して３０％であり、αＦＧ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＧ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して２５％であり、αＦＶ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＶ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して４４％であった。
さらに同様に、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された三重変異体におけるαＦＬ／αＦＶＨは７％であり、αＦＡ／αＦＶＨは５％であり、αＦＧ／αＦＶＨは６％であり、αＦＶ／αＦＶＨは１７％であった。
さらに同様に、前記三重変異体に対して変異を蓄積させた６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された四重変異体におけるαＦＬ／αＦＶＨは２％であり、αＦＡ／αＦＶＨは２％であり、αＦＧ／αＦＶＨは０％であり、αＦＶ／αＦＶＨは６％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して顕著に改善した。
すなわち、得られたさらなる多重変異体の基質特異性は段階的に改善しており、実施例１で確認された本発明の変異点を適宜組み合わせることによって、一層優れた基質特異性を有するアマドリアーゼが作出され得ることが明らかとなった。

（本発明のアマドリアーゼにおける各種糖化アミノ酸に対する反応性の低下）
次に、改変型アマドリアーゼを用いて、αＦＶＨの反応性に対するαＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ以外の糖化アミノ酸、すなわちαＦＩ、α−フルクトシルスレオニン（αＦＴ）、α−フルクトシルメチオニン（αＦＭ）、α−フルクトシルフェニルアラニン（αＦＦ）、α−フルクトシルセリン（αＦＳ）、α−フルクトシルグルタミン酸（αＦＥ）、εＦＫ、β−フルクトシルアラニン（βＦＡ）の反応性についても評価した。
Ｄ．：試薬の調製
試薬５：アマドリアーゼ溶液
配列番号１記載のアマドリアーゼ、及び配列番号１記載のアマドリアーゼの６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型のアマドリアーゼ（以降ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄと表記）を実施例１（３）と同様に調製した。
試薬６：基質溶液（６０ｍＭ； 終濃度２ｍＭ）
αＦＶＨ ２５０ｍｇ、αＦＬ １７６ｍｇ、αＦＡ １５１ｍｇ、αＦＧ １４２ｍｇ、αＦＶ １６７ｍｇ、αＦＩ １７６ｍｇ、αＦＴ １６９ｍｇ、αＦＦ １９６ｍｇ、αＦＭ １８７ｍｇ、αＦＳ １６０ｍｇ、αＦＥ １８５ｍｇ、εＦＫ １８５ｍｇまたはβＦＡ １５１ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。

上記のＢ：活性測定法において酵素液の代わりに試薬５を、試薬３の代わりに試薬６を用いた方法により、αＦＶＨに対する各種糖化アミノ酸の酵素活性を測定した。なお、活性測定にはｐＨ６．５に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。
以上のように測定した活性値から、αＦＶＨの活性値を１とした場合のαＦＬの活性値に相当するαＦＬ／αＦＶＨを算出した。αＦＡ、αＦＶ、αＦＧ、αＦＩ、αＦＴ、αＦＦ、αＦＳ、αＦＭ、αＦＥ、εＦＫ、またはβＦＡに対しても同様にして、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＶ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨ、αＦＩ／αＦＶＨ、αＦＴ／αＦＶＨ、αＦＦ／αＦＶＨ、αＦＳ／αＦＶＨ、αＦＭ／αＦＶＨ、αＦＥ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶＨまたはβＦＡ／αＦＶＨを算出した。比較例としてＣＦＰ−Ｔ７、実施例としてＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いた。また、本発明の変異導入前の反応性の割合（比率１）に対する、変異導入後の反応性の割合（比率２）の比率を算出した（比率２／比率１）。以上の結果を表３に示す。

表３に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨは９５％となった。これに対し、ＣＦＰ−Ｔ７の６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨは３％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０３まで低減し、すなわち９７％もαＦＬ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＡ／αＦＶＨは１５１％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＡ／αＦＶＨは２％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０１まで低減し、すなわち９９％もαＦＡ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＶ／αＦＶＨは２２５％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＶ／αＦＶＨは７％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０３まで低減し、すなわち９７％もαＦＶ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＩ／αＦＶＨは２６９％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＩ／αＦＶＨは８％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０５まで低減し、すなわち９５％もαＦＩ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＭ／αＦＶＨは２４４％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＭ／αＦＶＨは４％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０２まで低減し、すなわち９８％もαＦＭ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
αＦＬ、αＦＡ、αＦＶ、αＦＩ、αＦＭ以外の糖化アミノ酸、具体的にはαＦＧ、αＦＴ、αＦＦ、αＦＳ、αＦＥ、εＦＫ、またはβＦＡに対しても、反応性が少なくとも０．５まで低下し、より顕著なものは０．２９まで低下し、さらに顕著なものは０．１４まで低下し、さらに顕著なものは０．０４まで低下した。すなわち、改変前の反応性の割合を１００％とした場合に、改変後の反応性の割合は、少なくとも５０％まで低下し、より顕著なものは７１％まで低下し、さらに顕著なものは８６％まで低下し、さらに顕著なものは９６％まで低下し、基質特異性が改善された。
以上より、ＣＦＰ−Ｔ７の６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型のアマドリアーゼは、糖化アミノ酸の影響を低減させ、αＦＶＨに特異的に反応することが可能であることが示唆された。

（αＦＶ、αＦＬまたはεＦＫが共存するフルクトシルペプチド試料の測定）
（５）αＦＶ、αＦＬまたはεＦＫを含むフルクトシルペプチド試料の調製
（試薬７）に記載したαＦＶＨ、若しくはαＦＶの溶液を混合し、イオン交換水で希釈することで、０．６ｍＭ αＦＶＨ溶液、０．６ｍＭ αＦＶ溶液、０．１２ｍＭ αＦＶ溶液、０．０６ｍＭ αＦＶ溶液、０．６ｍＭ αＦＬ溶液、０．１２ｍＭ αＦＬ溶液、０．６ｍＭ εＦＫ溶液を調製した。
０．６ｍＭ αＦＶＨ溶液に等量のイオン交換水、あるいは０．６ｍＭ αＦＶ溶液、あるいは０．６ｍＭ αＦＬ溶液、あるいは０．６ｍＭ εＦＫ溶液を混合することで、０．３ｍＭ αＦＶＨ溶液、あるいは０．３ｍＭ αＦＶとの混合溶液、あるいは０．３ｍＭ αＦＬとの混合溶液、あるいは０．３ｍＭ εＦＫとの混合溶液とした。
同様にして、０．６ｍＭ αＦＶＨ溶液に０．１２ｍＭ αＦＶ溶液、あるいは０．０６ｍＭ αＦＶ溶液、あるいは０．１２ｍＭ αＦＬ溶液を混合することで、０．３ｍＭ αＦＶＨ溶液と０．０６ｍＭ αＦＶとの混合溶液、あるいは０．０３ｍＭ αＦＶとの混合溶液、あるいは０．０６ｍＭ αＦＬとの混合溶液とした。

（６）αＦＶ、αＦＬまたはεＦＫを含むフルクトシルペプチド試料の測定
（試薬７）
アマドリアーゼ溶液
比較例：５．０Ｕ／ｍｌ ＣＦＰ−Ｔ７
実施例：２１．０Ｕ／ｍｌ ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄ
（試薬８）
６．３Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（キッコーマンバイオケミファ社製）
０．６２ｍＭ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
０．７ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学研究所社製）
１２６ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）

２５μｌの（試薬７）に１５０μｌの（試薬８）を加え、３７℃で５分間加温した。次いで上記（５）で調製した３５μｌのフルクトシルペプチド試料あるいはαＦＶ、αＦＬまたはεＦＫとの混合試料を添加して反応を開始し、３７℃で５分間反応後の波長５４５ｎｍにおける吸光度を自動分析装置Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ‐ＢＭ１６５０（日本電子）で測定した。試料の代わりにイオン交換水を用いて同様に操作して測定した波長５４５ｎｍにおける吸光度（試薬ブランク）を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量を算出した。

吸光度変化量＝ΔＡｅｓ−Ａｅ０
ΔＡｅｓ：反応開始から５分経過後の吸光度
ΔＡｅ０：対照液を添加した場合の反応開始から５分経過後の吸光度

得られた各吸光度変化量を用いて、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、αＦＶＨに加えてαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸を混合させた試料を測定した時の吸光度変化量の割合を求めた。
具体的には、まず、ＣＦＰ−Ｔ７を用いて、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を求めた。また、０．３ｍＭ αＦＶＨおよび０．３ｍＭ、０．０６ｍＭまたは０．０３ｍＭ αＦＶを含む混合試料を測定した時の吸光度変化量を求めた。そして、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、０．３ｍＭ、０．０６ｍＭまたは０．０３ｍＭ αＦＶ混合試料を測定した時の吸光度変化量割合である「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＶ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。

同様に、０．３ｍＭ αＦＶＨまたは０．３ｍＭ、０．０６ｍＭ αＦＬを含む混合試料を測定した時の吸光度変化量を求め、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の０．３ｍＭまたは０．０６ｍＭ αＦＬ混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合である「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＬ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。
同様に、０．３ｍＭ αＦＶＨおよび０．３ｍＭ εＦＫを含む混合試料を測定した時の吸光度変化量を求め、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の０．３ｍＭ εＦＫ混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合である「ΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。
一方、ＣＦＰ−Ｔ７に代えて、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いて、同様に、上述の各試料を測定し、その吸光度変化量から、「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＶ）／ΔＡαＦＶＨ」「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＬ）／ΔＡαＦＶＨ」「ΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。そして、各々について、双方を比較した。結果を表４に示す。表中、右から３列目の数値は、ＣＦＰ−Ｔ７を用いて、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、αＦＶＨに加えて右から４列目に記載の糖化アミノ酸を混合させた試料を測定した時の吸光度変化量の割合である。また、表中、右から２列目の数値は、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いて、同様に各試料を測定した場合の、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、αＦＶＨに加えて右から４列目に記載の糖化アミノ酸を混合させた試料を測定した時の吸光度変化量の割合である。

表４から明らかなように、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを含む試薬を用いて測定した「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＶ）／ΔＡαＦＶＨ」、「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＬ）／ΔＡαＦＶＨ」、「ΔＡ（αＦＶ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ」は、全て、本発明の置換を導入する前のＣＦＰ−Ｔ７を含む試薬を用いて得られた値よりも低値であった。すなわち、本発明の置換を導入することにより、混合させるαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸の測定値に与える影響が低減していることが確認された。
表４中、最右列には、上述の「混合させるαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸の測定値に与える影響が低減」した度合を「糖化アミノ酸の影響低減率（％）」として示した。この数値は、右から３列目の数値と右から２列目の数値の差分（減少分）を計算し、これを右から３列目の数値で割ることにより算出される。
具体的には、ＣＦＰ−Ｔ７に代えてＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いた場合は、０．３ｍＭ αＦＬを混合させた時に、αＦＶＨのみを測定する場合よりも測定値が高値に出る度合が５３％減少した。また、０．０６ｍＭ αＦＬを混合させた時には、２４％減少することが分かった。また、０．３ｍＭ αＦＶを混合させた時には、αＦＶの影響が４１％減少し、０．０６ｍＭ αＦＶを混合させた時には、１８％減少し、０．０３ｍＭ αＦＶを混合させた時には、９％減少することが分かった。また同様に、ＣＦＰ−Ｔ７よりもＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いた場合は、０．３ｍＭ εＦＫを含んでいる時には、εＦＫの影響が８％減少することが分かった。

また、表４より、０．０６ｍＭのαＦＬまたは０．０３ｍＭのαＦＶを混合した場合、つまり終濃度が１０μＭのαＦＬまたは５μＭのαＦＶが共存している場合において、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いることにより、共存するαＦＬまたは５μＭのαＦＶの影響は５％以内に抑えられ、正確にαＦＶＨを測定できることが分かった。
生物試料分析 Ｖｏｌ２７， ｐ９７−１０３， ２００４によれば、高カロリーアミノ酸輸液であるユニカリック（登録商標）を投与した患者の血液中に含まれる糖化アルブミンを酵素法で測定した際に、糖化アルブミン量を血清アルブミン量で割って得られる値が、ＨＰＬＣ法による測定値と比較して平均６．８８％高いことが示されている。この知見を元に、血清アルブミン量を３．８ｇ／ｄＬ、アルブミンの分子量を６６，０００として計算を行った場合、ユニカリック（登録商標）の投与により、血中の糖化アミノ酸濃度が３９．４μＭ上昇すると考えられる。また、ユニカリック（登録商標）にはＬ−ロイシンが１２．９％、Ｌ−バリンが９．６％含まれていることから、これらの全量が糖化されたと仮定すると、高カロリーアミノ酸輸液に由来して体内へと混入した３９．４μＭの糖化アミノ酸のうち、αＦＬは５μＭが含まれ、αＦＶは４μＭが含まれることになる。
例えば、上記のような値をもとに、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄの効果を推定してみると、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄは１０μＭのαＦＬまたは５μＭのαＦＶが共存しても、ほとんど影響を受けず、正確にαＦＶＨを測定できると考えられ、ユニカリック（登録商標）を投与された患者の血液中に持ち込まれると予測される糖化アミノ酸による影響を受ける可能性は顕著に低いことが示唆される。すなわち、本発明の置換を導入したアマドリアーゼを用いることにより、従来課題とされていた高カロリーアミノ酸輸液由来の糖化アミノ酸の影響をほとんど受けることなく、αＦＶＨを簡便かつ精度よく定量できることが分かった。

（各種アマドリアーゼへの点変異導入）
本発明の知見は、まずＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼを用いて検証されたが、上述の通り、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様な効果を奏することが期待できるという示唆を与え得る。そこで、発明者らは、実際に本発明の知見を、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも導入して、この検証を行った。

１．Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号３０はＮｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼのアミノ酸配列であり、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３６）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを大腸菌で発現させることにより、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼの活性が確認されている（国際公開第２０１２／１８０９４号パンフレット参照）。

Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号３７、３８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがセリンに置換されたＮｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｓ）株を得た。

２．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号３５はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために６０位のセリンをグリシンへ置換したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、配列番号３５のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸを大腸菌で発現させることにより、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性が確認されている（国際公開第２０１２／１８０９４号パンフレット参照）。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸを鋳型にして、配列番号４０、４１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３５記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがセリンに置換されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ−６２Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ−６２Ｓ）株を得た。

３．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号３３はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために５９位のセリンをグリシンへ置換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、配列番号３３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを大腸菌で発現させることにより、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性が確認されている（国際公開第２０１２／１８０９４号パンフレット参照）。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号４３、４４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３３記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがセリンに置換されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｓ）株を得た。

４．点変異を導入した各種アマドリアーゼの基質特異性改善効果の評価
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｓ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ−６２Ｓ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｓ）株を、実施例１の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。比較対象として、変異を導入する前のアマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ）株も、同様の方法で培養して、各種アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１（４）に準じた活性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの基質特異性評価を行った。結果を表５に示す。表中のデータにおいて、上段の数値はαＦＶＨの反応性に対する各種糖化アミノ酸の反応性の割合であり、下段の数値は改変前の各種アマドリアーゼの反応性を１００とした場合の、変異導入後の反応性の比率である。

表５に示す通り、本実施例の条件下では、ＮｖＦＸのαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＮｖＦＸ−６２ＳのαＦＬ／αＦＶＨは、９１％まで低下した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨは６４％まで低下し、αＦＧ／αＦＶＨは６８％まで低下し、αＦＶ／αＦＶＨは７８％まで低下した。
また、ＰｃＦＸのαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＰｃＦＸ−６２ＳのαＦＬ／αＦＶＨは、８１％まで低下した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨは８６％まで低下し、αＦＧ／αＦＶＨは３６％まで低下し、αＦＶ／αＦＶＨは８７％まで低下した。
また、ＡｎＦＸのαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＡｎＦＸ−６１ＳのαＦＬ／αＦＶＨは、６７％まで低下した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨは２１％まで低下し、αＦＧ／αＦＶＨは３０％まで低下し、αＦＶ／αＦＶＨは６３％まで低下した。
すなわち、配列番号１に示すＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換は、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおいても実際に基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることが確認された。

Claims (10)

1. 以下の（ｉ）および（ｉｉ）の性質を有するアマドリアーゼ：
   （ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；
   （ｉｉ）以下の置換：
   （ｔ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換；
   （ｕ）配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；
   （ｖ）配列番号１の６４位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸への置換；および
   （ｚ）配列番号１の４１７位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換；
   から選択される１以上のアミノ酸残基の置換を有し、基質終濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０で活性を測定して、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対する、以下の（ａ）から（ｄ）：
   （ａ）α−フルクトシルロイシン
   （ｂ）α−フルクトシルアラニン
   （ｃ）α−フルクトシルグリシン
   （ｄ）α−フルクトシルバリン
   よりなる群から選択される１以上の糖化アミノ酸への反応性の割合が、上記置換のいずれも有さないアマドリアーゼと比較して、低減している。
2. 以下の（ｉ）および（ｉｉ）の性質を有するアマドリアーゼ：
   （ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；
   （ｉｉ）以下の置換：
   （ｔ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換；
   （ｕ）配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；
   （ｖ）配列番号１の６４位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換；および
   （ｚ）配列番号１の４１７位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換；
   から選択される１以上のアミノ酸残基の置換を有し、基質終濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０で活性を測定して、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対する、以下の（ｂ）から（ｄ）：
   （ｂ）α−フルクトシルアラニン
   （ｃ）α−フルクトシルグリシン
   （ｄ）α−フルクトシルバリン
   よりなる群から選択される１以上の糖化アミノ酸への反応性の割合が、上記置換のいずれも有さないアマドリアーゼと比較して、低減している。
3. 配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下の置換：
   （ａｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンに対応する位置のアミノ酸のトリプトファンへの置換および配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換；
   （ａｅ）配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンに対応する位置のアミノ酸のトリプトファンへの置換、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換および配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換；
   （ａｆ）配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンに対応する位置のアミノ酸のトリプトファンへの置換、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換および配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
   よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、基質終濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０で活性を測定して、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対する、以下の（ａ）から（ｄ）：
   （ａ）α−フルクトシルロイシン
   （ｂ）α−フルクトシルアラニン
   （ｃ）α−フルクトシルグリシン
   （ｄ）α−フルクトシルバリン
   よりなる群から選択される１以上の糖化アミノ酸への反応性の割合が、上記置換のいずれも有さないアマドリアーゼと比較して、低減している、アマドリアーゼ。
4. 以下の（ｉ）および（ｉｉ）の性質を有するアマドリアーゼ：
   （ｉ）配列番号３０、３３または３５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；
   （ｉｉ）以下の置換：
   （ｔ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換；
   （ｕ）配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；および
   （ｖ）配列番号１の６４位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸への置換；
   から選択される１以上のアミノ酸残基の置換を有し、基質終濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０で活性を測定して、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対する、以下の（ａ）から（ｄ）：
   （ａ）α−フルクトシルロイシン
   （ｂ）α−フルクトシルアラニン
   （ｃ）α−フルクトシルグリシン
   （ｄ）α−フルクトシルバリン
   よりなる群から選択される１以上の糖化アミノ酸への反応性の割合が、上記置換のいずれも有さないアマドリアーゼと比較して、低減している。
5. 以下の（ｉ）および（ｉｉ）の性質を有するアマドリアーゼ：
   （ｉ）配列番号３０、３３または３５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；
   （ｉｉ）以下の置換：
   （ｔ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換；
   （ｕ）配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；および
   （ｖ）配列番号１の６４位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換；
   から選択される１以上のアミノ酸残基の置換を有し、基質終濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０で活性を測定して、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対する、以下の（ｂ）から（ｄ）：
   （ｂ）α−フルクトシルアラニン
   （ｃ）α−フルクトシルグリシン
   （ｄ）α−フルクトシルバリン
   よりなる群から選択される１以上の糖化アミノ酸への反応性の割合が、上記置換のいずれも有さないアマドリアーゼと比較して、低減している。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアマドリアーゼのアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
7. 請求項６記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
8. 請求項７記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
9. 以下の工程：
   （ｉ）請求項８記載の宿主細胞を培養する工程；
   （ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
   （ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程
   を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
10. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。

Images