KR20110069138A - 신규 프럭토실펩티드옥시다아제 - Google Patents

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가즈오 아이사카
게이코 스즈키
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교와 메덱스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명에 의하면, 이하의 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 단백질이 제공된다.
[1] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 단백질
[2] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
[3] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열과 80 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
[4] 기탁 번호 FERM BP-11026 으로서 기탁된 대장균 XL1-Blue MRF' 주가 담지하는 발현 플라스미드에 의해서 산생되는 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질.

Description

신규 프럭토실펩티드옥시다아제{NOVEL FRUCTOSYL PEPTIDE OXIDASE}
본 발명은 신규 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질, 그 단백질을 코드하는 DNA, 그 단백질의 제조 방법, 그리고, 그 단백질을 사용하는 당화 단백질의 측정 방법 및 그 단백질을 함유하는 당화 단백질 측정용 시약에 관한 것이다.
당화 단백질은 생체내 혈액 등의 체액이나 모발 등의 생체 시료 중에 함유되어 있다. 혈액 중에 존재하는 당화 단백질의 농도는 혈청 중에 용해되어 있는 글루코오스 등의 당류의 농도에 의존하고 있어, 최근, 임상 진단 분야에 있어서, 혈액 중의 당화 단백질인 헤모글로빈 A1c (비특허문헌 1) 의 농도 측정이, 당뇨병의 진단이나 모니터링에 사용되고 있다. 이 헤모글로빈 A1c 를 측정하는 방법으로는, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 사용하는 기기 분석적 방법 (비특허문헌 2), 항원 항체 반응을 사용하는 면역 측정법 (예를 들어, 비특허문헌 3) 등이 알려져 있었지만, 최근에는 효소적 측정법이 개발되어 있어, 예를 들어, 프로테아제와 프럭토실펩티드옥시다아제를 사용하는 방법 (특허문헌 1) 이 개발되어 있다. 효소적 측정법은 범용성이 있는 자동 분석 장치에 대한 적용이 가능하고, 또한 조작도 간편한 점에서 개발이 왕성하게 되어 있다.
효소적 측정법에서 사용되는 프럭토실펩티드옥시다아제는 글루코오스의 헤미아세탈과 펩티드의 N 말단의 아미노기가 반응하여 생성되는 글루코실아민이 아마도리 전위 (Amadori rearrangement) 하여 생성되는 케토오스 유도체에 있어서의 C-N 결합을, 산소 분자의 존재하에서 산화적으로 개열시켜, 당 오손 (sugar osone) (α-케토알데히드체), 펩티드 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다.
효소적 측정법의 경우, 도 1 에 나타낸 바와 같이, 먼저 헤모글로빈 A1c 를 프로테아제에 의해 분해하고, 헤모글로빈의 β-사슬의 N 말단으로부터 α-프럭토실발릴히스티딘 (이하, α-FVH 로 기재한다) 을 생성시킨다. 다음으로, 생성된 α-FVH 에 프럭토실펩티드옥시다아제를 작용시키고, 생성되는 과산화수소를 퍼옥시다아제의 존재하에서 퀴논계 색소의 산화적 축합을 일으켜, 그 생성량을 분광 광도계에 의해 비색 정량하는 방법이 알려져 있다 (특허문헌 1).
그러나, 프로테아제 처리에 의해 ε-프럭토실리신 및 그것을 함유하는 당화 펩티드가 부생되고, 프럭토실펩티드옥시다아제가 그것들에 작용하면, 실제의 헤모글로빈 A1c 값보다 높은 측정값이 될 위험성이 지적되고 있다 (특허문헌 2).
프럭토실펩티드옥시다아제는, 세균, 진균, 식물로부터 발견되고 있다. 예를 들어, 아케토미엘라 (Achaetomiella) 속, 케토미움 (Chaetomium) 속 (특허문헌 3), 커불라리아 (Curvularia) 속 (특허문헌 2), 장미과, 포도과, 미나리과 (특허문헌 4), 생강과 (특허문헌 5) 등에서 유래하는 프럭토실펩티드옥시다아제가 알려져 있다.
그러나, 지금까지 보고되어 있는 프럭토실펩티드옥시다아제는,
(1) α-당화 아미노산 (예를 들어, α-프럭토실발린) 과 비교하여, α-당화 디펩티드 (α-프럭토실발릴히스티딘) 에 대한 활성은 반드시 높지는 않은 것,
(2) 상기 서술한 바와 같이, N 말단의 α-당화 디펩티드 이외에도, 리신의 ε-아미노기에 당이 결합한 ε-당화 아미노산 (ε-프럭토실리신) 에도 작용하여, 헤모글로빈 A1c 측정에 있어서의 실측값을 증가시키는 것,
(3) 효소를 사용하는 측정법의 경우, 측정시나 보존시에 있어서 효소가 불안정해지는 것
등의 결점이 있었다.
이러한 결점들을 극복하기 위해서, 프럭토실펩티드옥시다아제에 인위적으로 변이를 도입함으로써, ε-프럭토실리신에 대한 반응성이 저하된 효소 (특허문헌 4) 나, 역시 변이의 도입에 의해 내열성이 증가된 효소 (비특허문헌 4) 등이 보고되어 있다. 그러나, 상기 (1) ∼ (3) 의 결점을 동시에 높은 레벨로 극복한 효소의 존재는 아직 알려져 있지 않다.
일본 공개특허공보 2001-95598호 국제 공개 제2004/104203호 팜플렛 일본 공개특허공보 2003-235585호 국제 공개 제2004/038033호 팜플렛 국제 공개 제2004/038034호 팜플렛
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 제36권, p.299-308 (1998). Chromatogr. Sci., 제10권, p.659 (1979). 일본 임상 검사 자동 화학회 회지, 제18권, 제4호, p.620 (1993). Appl. Microbiol. Biotechnol., 제78권, 제5호, p.775-781 (2008).
본 발명은 상기 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 α-당화 디펩티드 (α-프럭토실발릴히스티딘) 에 대한 특이성이 높고, 안정성이 우수한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 그 단백질을 코드하는 DNA, 그 DNA 를 함유하는 재조합체 DNA, 그 재조합체 DNA 에 의해 형질 전환된 형질 전환체, 그 형질 전환체 등을 사용한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질의 제조 방법, 그리고, 그 단백질을 사용하는 당화 단백질의 측정 방법 및 그 단백질을 함유하는 당화 단백질 측정용 시약을 제공하는 것에 있다.
본 발명은 이하의 (1) ∼ (17) 에 관한 것이다.
(1) 이하의 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[1] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 단백질
[2] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
[3] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열과 80 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
[4] 기탁 번호 FERM BP-11026 으로서 기탁된 대장균 XL1-Blue MRF' 주가 담지하는 발현 플라스미드에 의해 코드되는 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
(2) 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 (1) 에 기재된 단백질.
(3) 이하의 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 DNA.
[1] (1) 에 기재된 단백질을 코드하는 DNA
[2] 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA
[3] 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열과 상보적인 염기 배열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA
(4) 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 (3) 에 기재된 DNA.
(5) 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 (3) 에 기재된 DNA.
(6) (3) ∼ (5) 중 어느 한 항에 기재된 DNA 를 함유하는 재조합체 DNA.
(7) (6) 에 기재된 재조합체 DNA 를 갖는 형질 전환체.
(8) (7) 에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하여, 배양물 중에 그 단백질을 생성, 축적시키고, 그 배양물로부터 그 단백질을 채취하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 단백질의 제조 방법.
(9) 시료를 단백질 분해 효소와 반응시켜 당화 펩티드를 생성시키고, 이어서, 생성된 당화 펩티드를 (1) 또는 (2) 에 기재된 단백질과 반응시켜, 당해 당화 펩티드와 당해 단백질의 반응에 의해서 생성된 물질 또는 당해 당화 펩티드와 당해 단백질의 반응에 있어서 소비된 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 당화 단백질의 측정 방법.
(10) 당화 단백질이 당화 헤모글로빈인 (9) 에 기재된 측정 방법.
(11) 당화 헤모글로빈이 헤모글로빈 A1c 인 (10) 에 기재된 측정 방법.
(12) 단백질 분해 효소, (1) 또는 (2) 에 기재된 단백질을 함유하는 당화 단백질 측정용 시약.
(13) 또한, (1) 또는 (2) 에 기재된 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 포함하는 (12) 에 기재된 시약.
(14) 생성물이 과산화수소인 (13) 에 기재된 시약.
(15) 당화 단백질이 당화 헤모글로빈인 (12) ∼ (14) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(16) 당화 헤모글로빈이 헤모글로빈 A1c 인 (15) 에 기재된 시약.
(17) 기탁 번호 FERM BP-11026 으로서 기탁된 대장균 XL1-Blue MRF' 주.
본 발명에 의해, α-당화 디펩티드 (α-프럭토실발릴히스티딘) 에 대한 특이성이 높고, 안정성이 우수한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질, 그 단백질을 코드하는 DNA, 그 단백질의 제조 방법, 그리고, 그 단백질을 사용하는 당화 단백질의 측정 방법, 및 그 단백질을 함유하는 당화 단백질 측정용 시약이 제공된다.
도 1 은 헤모글로빈 A1c 의 효소적 측정 스킴을 나타내는 도면이다.
도 2 는 FPOX-9 의 아미노산 배열을 나타내는 도면이다. 한편, 그 위에 둥근 표시가 부기된 아미노산은 프럭토실펩티드옥시다아제 생산균 (유전자원) 의 아미노산 배열에 대한 변이 지점을 나타낸다.
도 3 은 FPOX-9 의 DNA 배열을 나타내는 도면이다. 한편, 그 위에 둥근 표시가 부기된 염기는 프럭토실펩티드옥시다아제 생산균 (유전자원) 의 DNA 배열에 대한 변이 지점을 나타낸다.
도 4 는 FPOX-15 의 아미노산 배열을 나타내는 도면이다. 한편, 그 위에 둥근 표시가 부기된 아미노산은 프럭토실펩티드옥시다아제 생산균 (유전자원) 으로부터의 변이 지점을, 하선이 그어진 아미노산은 FPOX-9 의 아미노산 배열에 대한 변이 지점을 나타낸다.
도 5 는 FPOX-15 의 DNA 배열을 나타내는 도면이다. 한편, 그 위에 둥근 표시가 부기된 염기는 프럭토실펩티드옥시다아제 생산균 (유전자원) 의 DNA 배열에 대한 변이 지점을, 하선이 그어진 염기는 FPOX-9 의 DNA 배열에 대한 변이 지점을 나타낸다.
1. 본 발명의 단백질
본 발명의 단백질로는,
[1] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 단백질,
[2] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질,
[3] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열과 80 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질, 및,
[4] 기탁 번호 FERM BP-11026 으로서 기탁된 대장균 XL1-Blue MRF' 주가 담지하는 발현 플라스미드에 의해 코드되는 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
을 들 수 있다.
상기에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질은, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (이하, 몰레큘러 클로닝 제2판으로 약기한다), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (이하, 커런트 프로토콜 인 몰레큘러 바이올로지로 약기한다), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 예를 들어 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다.
결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기한 부위 특이적 변이법 등의 주지된 방법에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수로서, 1 개 내지 수십 개, 바람직하게는 1 ∼ 20 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개이다.
배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되었을 때에는, 동일 배열 중의 임의의 위치에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있어도 된다.
아미노산의 결실 또는 부가가 가능한 아미노산의 위치로는, 예를 들어 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열의 N 말단측 및 C 말단측의 1 ∼ 수 개의 아미노산을 들 수 있다.
결실, 치환 또는 부가는 동시에 발생해도 되고, 치환 또는 부가되는 아미노산은 천연형과 비천연형을 상관하지 않는다. 천연형 아미노산으로는, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-알기닌, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에, 서로 치환 가능한 아미노산의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산은 서로 치환 가능하다.
A 군 : 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B 군 : 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산
C 군 : 아스파라긴, 글루타민
D 군 : 리신, 알기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
E 군 : 프롤린, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린
F 군 : 세린, 트레오닌, 호모세린
G 군 : 페닐알라닌, 티로신
또한, 본 발명의 단백질이 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖기 위해서는, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열과의 상동성이 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 94 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.
아미노산 배열이나 염기 배열의 상동성은, Karlin and Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] 나 FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)] 를 사용하여 결정할 수 있다. 이 알고리즘 BLAST 에 기초하여, BLASTN 이나 BLASTX 라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다 [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]. BLAST 에 기초하여 BLASTN 에 의해서 염기 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 Score = 100, wordlength = 12 로 한다. 또한, BLAST 에 기초하여 BLASTX 에 의해서 아미노산 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score = 50, wordlength = 3 으로 한다. BLAST 와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 default parameter 를 사용한다.
배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열과 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 94 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질도 또한 본 발명의 단백질이다.
본 발명의 단백질로는, 예를 들어, 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 나타낼 수 있다.
본 발명의 단백질이 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질인 것을 확인하는 수단으로는, 예를 들어 DNA 재조합법을 사용하여 본 발명의 단백질을 발현하는 형질 전환체를 제작하고, 그 형질 전환체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조한 후, α-FVH 를 기질로서 사용하여, 당해 기질과의 반응에 의해 생성되는 과산화수소를 측정함으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 단백질은, 이하의 성질을 갖는다.
(a) 작용 : 분자상 산소를 사용하여 당화 펩티드를 산화시켜, 당 오손 (α-케토알데히드체), 펩티드 및 과산화수소를 생성한다.
(b) 기질 특이성 : α-FVH 에 대한 반응성이 높고, 또한 ε-프럭토실리신 (이하, ε-FK 로 약기한다) 에 대한 반응성이 낮다.
본 발명의 단백질이 α-FVH 에 대하여 활성이 높고 ε-FK 에 대하여 반응성이 낮은 것은, 예를 들어, 기질로서 α-FVH 와 ε-FK 를 사용하여, ε-FK 에 대한 α-FVH 의 활성비 (α-FVH/ε-FK) 를 측정함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 단백질의 프럭토실펩티드옥시다아제 활성의 최적 pH 및 안정 pH 범위는 특별히 제한되지는 않지만, 최적 pH 는 6.0 ∼ 7.0 부근이 바람직하고, 안정 pH 는, 40 ℃, 10 분간의 처리에서 pH 6.0 ∼ 9.0 이 바람직하다.
작용 적온 (適溫) 의 범위에 관해서는 특별히 제한되지는 않지만, 30 ∼ 50 ℃ 부근이 바람직하다. 내열성은 높은 쪽이 바람직하며, 예를 들어, 50 ℃, 15 분간의 열처리 후의 잔존 활성이 25 ％ 이상인 것이 바람직하게 사용된다.
프럭토실펩티드옥시다아제의 활성의 측정은 하기 방법으로 실시하고, α-FVH 로부터, 1 분 동안에 1 μ㏖ 의 과산화수소를 생성하는 효소량을 1 단위 (U) 로 한다.
(활성 측정용 시약의 조제)
A 액 : 발색액
A-1 액 : 4-아미노안티피린을 2.4 m㏖/ℓ 농도가 되도록 이온 교환수에 용해시킨다.
A-2 액 : N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE) 을 32 m㏖/ℓ 농도가 되도록 이온 교환수에 용해시킨다.
B 액 : 퍼옥시다아제 용액
퍼옥시다아제 (110 U/㎎, 토요 방적사 제조) 를 2 ㎎/㎖ 농도가 되도록 0.1 ㏖/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0) 에 용해시킨다.
C 액 : 기질 용액
α-FVH 또는 ε-FK (펩티드 연구소 제조) 를 10 m㏖/ℓ 농도가 되도록 0.1 ㏖/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0) 에 용해시킨다.
(측정 순서)
A-1 액 50 ㎕, A-2 액 50 ㎕, B 액 2 ㎕, C 액 20 ㎕ 를 혼합하고, 물로 200 ㎕ 로 필 업한 후, 30 ℃ 에서 5 분간 프레인큐베이션한 다음, 효소액 1 ㎕ 를 첨가하고, 30 ℃ 에서 30 분간 반응시켜, 플레이트 리더 (infinite F200, Tecan 사 제조) 에 의해 550 ㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 또, 블랭크값은 기질 용액 (C 액) 대신에 이온 교환수를 사용한 것을 측정한다.
그리고 상기 측정계에 각종 양의 과산화수소를 첨가하고, 550 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 과산화수소의 양과 흡광도의 관계를 나타내는 검량곡선을 작성하여, 거기에서 효소의 단위수 (효소력가) 를 구한다.
또한, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 발현하는 플라스미드 (발현 플라스미드) 를 담지하는 대장균 XL1-Blue MRF' 주 (Escherichia coli XL1-Blue MRF'/pTrcFPOX-9) 는 독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되었다. 이하에, 기탁을 특정하는 내용을 기재한다.
(a) 기탁 기관의 명칭·주소
명칭 : 독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터
주소 : 일본국 이바라기현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반찌 1 쥬오 다이 6 (우편 번호 305-8566)
(b) 수령일 (기탁일) : 2008년 9월 19일
(c) 수령 번호 (기탁 번호) : FERM BP-11026
상기 기탁 번호 FERM BP-11026 으로서 기탁된 대장균 XL1-Blue MRF' 주, 그 균주가 담지하는 발현 플라스미드, 및 그 플라스미드에 의해 코드되는 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질도 또한 본 발명에 포함된다.
2. 본 발명의 DNA
본 발명의 DNA 로는,
[1] 상기 1 의 [1] ∼ [3] 의 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA,
[2] 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA, 및
[3] 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열과 상보적인 염기 배열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA,
를 들 수 있다.
여기서 말하는 「하이브리다이즈한다」란, 특정한 염기 배열을 갖는 DNA 또는 그 DNA 의 일부에 대상의 DNA 가 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 따라서, 그 특정한 염기 배열을 갖는 DNA 또는 그 DNA 의 일부의 염기 배열은 노던 또는 서던 블롯 해석의 프로브로서 유용하거나, 또는 PCR 해석의 올리고뉴클레오티드 프라이머로서 사용할 수 있는 길이의 DNA 이어도 된다. 프로브로서 사용하는 DNA 로는, 적어도 100 염기 이상, 바람직하게는 200 염기 이상, 보다 바람직하게는 500 염기 이상의 DNA 를 들 수 있는데, 적어도 10 염기 이상, 바람직하게는 15 염기 이상의 DNA 이어도 된다.
DNA 의 하이브리다이제이션 실험 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 몰레큘러 클로닝 제2판, 제3판 (2001년), Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994), Immunology methods manual, Academic press (Molecular) 에 기재된 것 외에, 다수의 다른 표준 교과서에 따라서 하이브리다이제이션의 조건을 결정하고, 실험을 실시할 수 있다.
상기한 스트린젠트한 조건이란, 예를 들어 DNA 를 고정화시킨 필터와 프로브 DNA 를 50 ％ 포름아미드, 5×SSC (750 m㏖/ℓ 의 염화나트륨, 75 m㏖/ℓ 의 시트르산나트륨), 50 m㏖/ℓ 의 인산나트륨 (pH 7.6), 5×덴하르트 용액, 10 ％ 의 황산덱스트란, 및 20 ㎍/ℓ 의 변성시킨 연어 정자 DNA 를 함유하는 용액 중에서 42 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트한 후, 예를 들어 약 65 ℃ 의 0.2×SSC 용액 중에서 그 필터를 세정하는 조건을 들 수 있는데, 보다 낮은 스트린젠트 조건을 사용할 수도 있다. 스트린젠트한 조건의 변경은, 포름아미드의 농도 조정 (포름아미드의 농도를 내릴수록 저 (低) 스트린젠트가 된다), 염 농도 및 온도 조건의 변경에 의해 가능하다. 저스트린젠트 조건으로는, 예를 들어 6×SSCE (20×SSCE 는, 3 ㏖/ℓ 의 염화나트륨, 0.2 ㏖/ℓ 의 인산2수소나트륨, 0.02 ㏖/ℓ 의 EDTA, pH 7.4), 0.5 ％ 의 SDS, 30 ％ 의 포름아미드, 100 ㎍/ℓ 의 변성시킨 연어 정자 DNA 를 함유하는 용액 중에서, 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트한 후, 50 ℃ 의 1×SSC, 0.1 ％ SDS 용액을 사용하여 세정하는 조건을 들 수 있다. 또한, 더욱 낮은 스트린젠트한 조건으로는, 상기한 저스트린젠트 조건에 있어서, 높은 염 농도 (예를 들어 5×SSC) 의 용액을 사용하여 하이브리다이제이션을 실시한 후, 세정하는 조건을 들 수 있다.
상기한 다양한 조건은, 하이브리다이제이션 실험의 백그라운드를 억제하기 위해서 사용하는 블로킹 시약을 첨가, 또는 변경함으로써 설정할 수도 있다. 상기한 블로킹 시약의 첨가는, 조건을 적합하게 하기 위해, 하이브리다이제이션 조건의 변경을 수반해도 된다.
상기한 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈 가능한 DNA 로는, 예를 들어 상기한 BLAST 및 FASTA 등의 프로그램을 사용하여, 상기 파라미터에 근거해서 계산했을 때, 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열과 적어도 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 94 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 염기 배열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있다.
상기한 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 가 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 인 것은, 그 DNA 를 발현하는 재조합체 DNA 를 제작하고, 그 재조합체 DNA 를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 미생물을 배양하여 얻어지는 배양물로부터 그 단백질을 정제하여, 그 정제 단백질을 효소원으로 사용하고, α-FVH 를 기질로서 사용하여, 당해 기질과의 반응에 의해 생성되는 과산화수소를 측정함으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 DNA 로는, 예를 들어, 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA, 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 DNA 등을 나타낼 수 있다.
3. 본 발명의 형질 전환체
본 발명의 형질 전환체로는, 상기 2 의 DNA 를 함유하는 재조합체 DNA 를 사용하여, 숙주 세포를 공지된 방법으로 형질 전환시켜 얻어지는 형질 전환체를 들 수 있고, 숙주 세포로는, 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포, 바람직하게는 세균, 보다 바람직하게는 원핵 세포, 보다 바람직하게는 에쉐리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물을 들 수 있다.
4. 본 발명의 DNA 의 조제
본 발명의 DNA 는, 예를 들어, 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열에 기초하여 설계할 수 있는 프로브를 사용해서, 사상균 등의 미생물, 바람직하게는 Aspergillus 속, Emericella 속 등에 속하는 미생물, 특히 바람직하게는 Emericella nidulans 등에 속하는 미생물에 의해 취득할 수 있다.
또한, 각종 유전자 배열 데이터베이스에 대하여 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 의 염기 배열과 85 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 배열을 검색하고, 그 검색에 의해서 얻어진 염기 배열에 기초하여, 그 염기 배열을 갖는 생물의 염색체 DNA, cDNA 라이브러리 등으로부터 상기한 방법에 의해 본 발명의 DNA, 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 취득할 수도 있다.
취득한 DNA 를 그대로, 또는 적당한 제한 효소 등으로 절단하고, 통상적인 방법에 의해 벡터에 집어넣고, 얻어진 재조합체 DNA 를 숙주 세포에 도입한 후, 통상적으로 사용되는 염기 배열 해석 방법, 예를 들어 디데옥시법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] 또는 373A·DNA 시퀀서 (파킨 엘머사 제조) 등의 염기 배열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 그 DNA 의 염기 배열을 결정할 수 있다.
본 발명의 DNA 를 집어넣는 벡터로는, pBluescriptII KS(+) (스트라테이진사 제조), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK(+) (스트라테이진사 제조), pT7Blue (노바젠사 제조), pCR II (인비트로젠사 제조) 및 pCR-TRAP (진헌터사 제조) 등을 들 수 있다.
숙주 세포로는, 에쉐리키아속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 에쉐리키아속에 속하는 미생물로는, 예를 들어, 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli) XL1-Blue, 에쉐리키아 콜리 XL2-Blue, 에쉐리키아 콜리 DH1, 에쉐리키아 콜리 MC1000, 에쉐리키아 콜리 ATCC12435, 에쉐리키아 콜리 W1485, 에쉐리키아 콜리 JM109, 에쉐리키아 콜리 HB101, 에쉐리키아 콜리 No.49, 에쉐리키아 콜리 W3110, 에쉐리키아 콜리 NY49, 에쉐리키아 콜리 MP347, 에쉐리키아 콜리 NM522, 에쉐리키아 콜리 BL21, 에쉐리키아 콜리 ME8415 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 의 도입 방법으로는, 상기 숙주 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-248394호), 일렉트로포레이션법 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] 등을 들 수 있다.
염기 배열을 결정한 결과, 취득된 DNA 가 부분장 (部分長) 이었던 경우에는, 그 부분장 DNA 를 프로브에 사용한, 염색체 DNA 라이브러리에 대한 서던 하이브리다이제이션법 등에 의해 전장 (全長) DNA 를 취득할 수 있다.
또한, 결정된 DNA 의 염기 배열에 기초하여, 퍼셉티브 바이오시스템사 제조 8905 형 DNA 합성 장치 등을 사용하여 화학 합성함으로써 목적으로 하는 DNA 를 조제할 수도 있다.
상기한 바와 같이 하여 취득되는 DNA 로서, 예를 들어, 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
5. 본 발명의 제조법에 사용되는 형질 전환체의 제조법
본 발명의 DNA 를 바탕으로 하여, 필요에 따라서, 본 발명의 단백질을 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다. 또한, 그 단백질을 코드하는 부분의 염기 배열을, 숙주의 발현에 최적의 코돈이 되도록 염기를 치환함으로써, 그 단백질의 생산율이 향상된 형질 전환체를 취득할 수 있다.
그 DNA 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합체 DNA 를 제작한다.
그 재조합체 DNA 를, 그 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 본 발명의 단백질을 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
숙주 세포로는, 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 등, 식물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다.
발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자율 복제 가능 내지는 염색체 중에 집어넣는 것이 가능하고, 본 발명의 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.
세균 등의 원핵 생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 DNA 를 갖는 재조합체 DNA 는, 원핵 생물 중에서 자율 복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 배열, 본 발명의 DNA, 전사 종결 배열로 구성된 재조합체 DNA 인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 함유되어 있어도 된다.
발현 벡터로는, pColdI (다카라바이오사 제조), pCDF-1b, pRSF-1b (모두 노바젠사 제조), pMAL-c2x (뉴잉글랜드 바이오랩스사 제조), pGEX-4T-1 (GE 헬스 케어 바이오사이언스사 제조), pTrcHis (인비트로젠사 제조), pSE280 (인비트로젠사 제조), pGEMEX-1 (프로메가사 제조), pQE-30 (퀴아젠사 제조), pET-3 (노바젠사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소58-110600호), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescriptII SK(+), pBluescriptII KS(-) (스트라테이진사 제조), pTrS30 [에쉐리키아 콜리 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 으로부터 조제], pTrS32 [에쉐리키아 콜리 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 로부터 조제], pPAC31 (WO98/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (다카라바이오사 제조), pUC118 (다카라바이오사 제조), pPA1 (일본 공개특허공보 소63-233798호) 등을 예시할 수 있다.
프로모터로는, 에쉐리키아 콜리 등의 숙주 세포 중에서 기능하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, trp 프로모터 (P trp ), lac 프로모터 (P lac ), PL 프로모터, PR 프로모터, PSE 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 Ptrp 를 2 개 직렬시킨 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
또한 바실루스속에 속하는 미생물 중에서 발현시키기 위한 xylA 프로모터 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)] 나 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속에 속하는 미생물 중에서 발현시키기 위한 P54-6 프로모터 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)] 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합 배열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 배열과 개시 코돈과의 사이를 적당한 거리 (예를 들어 6 ∼ 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 를 발현 벡터에 결합시킨 재조합체 DNA 에 있어서는, 전사 종결 배열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 배열을 배치하는 것이 바람직하다.
이러한 재조합체 DNA 로는, 예를 들어 pET21-plu1440 을 들 수 있다.
원핵 생물로는, 에쉐리키아속, 세라티아 (Serratia) 속, 바실루스속, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 미크로박테리움 (Microbacterium) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속, 알리시클로바실루스 (Alicyclobacillus) 속, 아나베나 (Anabena) 속, 아나시스티스 (Anacystis) 속, 아스로박터 (Arthrobacter) 속, 아조토박터 (Azotobacter) 속, 크로마티움 (Chromatium) 속, 에르비니아 (Erwinia) 속, 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 속, 포르미디움 (Phormidium) 속, 로도박터 (Rhodobacter) 속, 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas) 속, 로도스피릴룸 (Rhodospirillum) 속, 세네데스무스 (Scenedesmus) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 시네코커스 (Synechoccus) 속, 자이모모나스 (Zymomonas) 속 등에 속하는 미생물, 예를 들어, 에쉐리키아 콜리 XL1-Blue, 에쉐리키아 콜리 XL2-Blue, 에쉐리키아 콜리 DH1, 에쉐리키아 콜리 DH5α, 에쉐리키아 콜리 MC1000, 에쉐리키아 콜리 KY3276, 에쉐리키아 콜리 W1485, 에쉐리키아 콜리 JM109, 에쉐리키아 콜리 HB101, 에쉐리키아 콜리 No.49, 에쉐리키아 콜리 W3110, 에쉐리키아 콜리 NY49, 에쉐리키아 콜리 MP347, 에쉐리키아 콜리 NM522, 에쉐리키아 콜리 BL21, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) ATCC33712, 바실루스 메가테륨 (Batillus megaterium), 브레비박테리움 암모니아게네스 (Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 임마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카롤리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14297, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 세라티아 피카리아 (Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아 리퀘파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 슈도모나스 에스피 (Pseudomonas sp.) D-0110, 아그로박테리움 라디오박터 (Agrobacterium radiobacter), 아그로박테리움 리조진스 (Agrobacterium rhizogenes), 아그로박테리움 루비 (Agrobacterium rubi), 아나베나 실린드리카 (Anabaena cylindrica), 아나베나 돌리오럼 (Anabaena doliolum), 아나베나 플로스아쿠아 (Anabaena flos-aquae), 아스로박터 오레센스 (Arthrobacter aurescens), 아스로박터 시트레우스 (Arthrobacter citreus), 아스로박터 글로브포르미스 (Arthrobacter globformis), 아스로박터 하이드로카보글루타미커스 (Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아스로박터 미소렌스 (Arthrobacter mysorens), 아스로박터 니코티아나 (Arthrobacter nicotianae), 아스로박터 파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus), 아스로박터 프로토포르미에 (Arthrobacter protophormiae), 아스로박터 로세오파라피누스 (Arthrobacter roseoparaffinus), 아스로박터 술푸레우스 (Arthrobacter sulfureus), 아스로박터 우레아파시엔스 (Arthrobacter ureafaciens), 크로마티움 부데리 (Chromatium buderi), 크로마티움 테피덤 (Chromatium tepidum), 크로마티움 비노섬 (Chromatium vinosum), 크로마티움 와민기 (Chromatium warmingii), 크로마티움 플루비아틸 (Chromatium fluviatile), 에르비니아 우레도보라 (Erwinia uredovora), 에르비니아 캐로토보라 (Erwinia carotovora), 에르비니아 아나나스 (Erwinia ananas), 에르비니아 허비콜라 (Erwinia herbicola), 에르비니아 푼크타타 (Erwinia punctata), 에르비니아 테레우스 (Erwinia terreus), 메틸로박테리움 로데시아눔 (Methylobacterium rhodesianum), 메틸로박테리움 엑스토르켄스 (Methylobacterium extorquens), 포르미디움 에스피 (Phormidium sp.) ATCC29409, 로도박터 캡술라투스 (Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스페로이데스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 블라스티카 (Rhodopseudomonas blastica), 로도슈도모나스 마리나 (Rhodopseudomonas marina), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 로도스피릴룸 루브럼 (Rhodospirillum rubrum), 로도스피릴룸 살렉시겐스 (Rhodospirillum salexigens), 로도스피릴룸 살리나럼 (Rhodospirillum salinarum), 스트렙토마이세스 암보파시엔스 (Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스 오레오파시엔스 (Streptomyces aureofaciens), 스트렙토마이세스 아우레우스 (Streptomyces aureus), 스트렙토마이세스 푼기시디커스 (Streptomyces fungicidicus), 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스 (Streptomyces griseochromogenes), 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 리비던스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 올리보그리세우스 (Streptomyces olivogriseus), 스트렙토마이세스 라메우스 (Streptomyces rameus), 스트렙토마이세스 타나시엔시스 (Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이세스 비나세우스 (Streptomyces vinaceus), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 를 원핵 생물에 도입하는 방법으로는, 상기 숙주 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-248394호), 일렉트로포레이션법 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] 등을 들 수 있다.
효모 균주를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 사용할 수 있다.
프로모터로는, 효모 균주 중에서 기능하는 것이면 어느 것을 사용해도 되고, 예를 들어, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 폴리펩티드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.
숙주 세포로는, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 속, 클루이베르마이세스 (Kluyveromyces) 속, 트리코스포론 (Trichosporon) 속, 슈와니오마이세스 (Schwanniomyces) 속, 피치아 (Pichia) 속, 또는 캔디다 (Candida) 속 등에 속하는 효모 균주를 들 수 있고, 구체적으로는, 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베르마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 슈와니오마이세스 알루비우스 (Schwanniomyces alluvius), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 캔디다 우틸리스 (Candida utilis) 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 를 효모에 도입하는 방법으로는, 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 일렉트로포레이션법 [Methods Enzymol,, 194, 182 (1990)], 스페로플라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], 아세트산리튬법 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, pcDNAI, pcDM8 (후나코시사에서 시판), pAGE107 (일본 공개특허공보 평3-22979호), pAS3-3 (일본 공개특허공보 평2-227075호), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (인비트로젠사 제조), pREP4 (인비트로젠사 제조), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pAMo, pAMoA 등을 사용할 수 있다.
프로모터로는, 동물 세포 중에서 기능하는 것이면 어느 것도 사용할 수 있고, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터 또는 메탈로티오네인의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주 세포로는, 마우스 미엘로마 세포, 래트 미엘로마 세포, 마우스 하이브리도마 세포, 인간의 세포인 나말바 (Namalwa) 세포 또는 나말바 KJM-1 세포, 인간 태아 신장 (腎臟) 세포, 인간 백혈병 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, 차이니즈 햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299호) 등을 들 수 있다.
마우스 미엘로마 세포로는, SP2/0, NSO 등, 래트 미엘로마 세포로는 YB2/0 등, 인간 태아 신장 세포로는 HEK293 (ATCC CRL-1573), 인간 백혈병 세포로는 BALL-1 등, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포로는 COS-1, COS-7 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 를 동물 세포에 도입하는 방법으로는, 동물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)], Virology, 52, 456 (1973) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예를 들어 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), 커런트 프로토콜 인 몰레큘러 바이올로지, Molecular Biology, A Laboratory Manual, Bio/Technology, 6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 의해서 단백질을 생산할 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충 세포에 공(共)도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 다시 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 단백질을 생산시킬 수 있다.
그 방법에 있어서 사용되는 유전자 도입 벡터로는, 예를 들어, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (모두 인비트로젠사 제조) 등을 들 수 있다.
바큘로바이러스로는, 예를 들어, 밤도둑나방과 (Noctuidae Hadeninae) 곤충에게 감염하는 바이러스인 오토그래파 캘리포니카 뉴클레어 폴리헤드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충 세포로는, 도둑나방 (Spodoptera frugiperda) 의 난소 세포, 양배추금무늬나방 (Trichoplusia ni) 의 난소 세포, 누에 난소 유래의 배양 세포 등을 사용할 수 있다.
도둑나방의 난소 세포로는 Sf9, Sf21 (바큘로바이러스 익스프레션 벡터즈 어 래보러토리 매뉴얼) 등, 양배추금무늬나방의 난소 세포로는 High 5, BTI-TN-5B1-4 (인비트로젠사 제조) 등, 누에 난소 유래의 배양 세포로는 봄빅스 모리 (Bombyx mori) N4 등을 들 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포에 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로바이러스를 공도입하는 방법으로는, 예를 들어, 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.
식물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로는, 식물 세포 중에서 기능하는 것이면 어느 것을 사용해도 되고, 예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로는, 담배, 감자, 토마토, 당근, 콩, 유채, 알팔파, 벼, 밀, 보리 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터를 식물 세포에 도입하는 방법으로는, 식물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 을 사용하는 방법 (일본 공개특허공보 소59-140885호, 일본 공개특허공보 소60-70080호, WO94/00977), 일렉트로포레이션법 (일본 공개특허공보 소60-251887호), 파티클건 (유전자총) 을 사용하는 방법 (일본 특허공보 제2606856호, 일본 특허공보 제2517813호) 등을 들 수 있다.
6. 본 발명의 단백질의 제조법
상기 5 의 방법에 의해 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하여, 배양물 중에 본 발명의 단백질을 생성, 축적시키고, 그 배양물로부터 채취함으로써, 그 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명의 단백질을 제조하기 위한 상기 형질 전환체의 숙주로는, 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 등, 식물 세포 등 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 세균, 보다 바람직하게는 에쉐리키아속에 속하는 미생물, 더욱 바람직하게는 에쉐리키아 콜리에 속하는 미생물을 들 수 있다.
효모, 동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포에 의해 발현시킨 경우에는, 당 또는 당사슬이 부가된 단백질을 얻을 수 있다.
상기 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라서 실시할 수 있다.
에쉐리키아 콜리 등의 원핵 생물 또는 효모 등의 진핵 생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 그 생물이 자화 (資化) 될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 사용해도 된다.
탄소원으로는, 그 생물이 자화될 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프룩토스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.
질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 밖의 함질소 화합물, 및 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 콩깻묵 및 콩깻묵 가수분해물, 각종 발효균체, 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기염으로는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상적으로 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 (deep aeration agitation culture) 등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양 온도는 15 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 배양 시간은, 통상 5 시간 ∼ 7 일간이다. 배양 중 pH 는 3.0 ∼ 9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은, 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라서, 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드 등을, trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)], 이글 (Eagle) 의 MEM 배지 [Science, 122, 501 (1952)], DMEM 배지 [Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)] 또는 이들 배지에 소태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상 pH 6 ∼ 8, 25 ∼ 40 ℃, 5 ％ CO2 존재하 등의 조건하에서 1 ∼ 7 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라서, 카나마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
곤충 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (파밍겐사 제조), Sf-900 II SFM 배지 (라이프 테크놀로지즈사 제조), ExCell400, ExCell405 [모두 JRH 바이오사이엔시스사 제조], Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상 pH 6 ∼ 7, 25 ∼ 30 ℃ 등의 조건하에서 1 ∼ 5 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라서, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
식물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체는, 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관으로 분화시켜 배양할 수 있다. 그 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 앤드 스쿡 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 5 ∼ 9, 20 ∼ 40 ℃ 의 조건하에서 3 ∼ 60 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라서, 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
본 발명의 단백질의 생산 방법으로는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 밖에 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있고, 선택한 방법에 따라서 생산시키는 단백질의 구조를 바꿀 수 있다.
본 발명의 단백질이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴슨 (Paulson) 들의 방법 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], 로우 (Lowe) 들의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평05-336963호, WO94/23021호 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 그 단백질을 숙주 세포 밖에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여, 본 발명의 단백질의 활성 부위를 포함하는 단백질의 앞쪽에 시그널 펩티드를 부가한 형태로 생산시킴으로써, 그 단백질을 숙주 세포 밖에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 공개특허공보 평2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디하이드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
그리고, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조할 수도 있다.
본 발명의 단백질을 생산하는 형질 전환체가 동물 개체 또는 식물 개체인 경우에는, 통상적인 방법에 따라서 사육 또는 재배하여, 그 단백질을 생성 축적시키고, 그 동물 개체 또는 식물 개체로부터 그 단백질을 채취함으로써, 그 단백질을 제조할 수 있다.
동물 개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 공지된 방법 [Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996), Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996), Bio/Technology, 9, 830 (1991)] 에 준하여 유전자를 도입하고 조성한 동물 중에 본 발명의 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우에는, 예를 들어, 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 제조법에 사용되는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하여, 본 발명의 단백질을 그 동물 중에 생성, 축적시키고, 그 동물 중으로부터 그 단백질을 채취함으로써, 그 단백질을 제조할 수 있다. 그 동물 중의 그 단백질을 생성, 축적시키는 장소로는, 예를 들어, 그 동물의 밀크 (일본 공개특허공보 소63-309192호), 알 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로는, 동물에서 기능하는 것이면 어느 것도 사용할 수 있지만, 예를 들어, 유선 세포 특이적 프로모터인 α 카세인 프로모터, β 카세인 프로모터, β 락토글로불린 프로모터, 훼이 산성 프로테인 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
식물 개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법 [조직 배양, 20 (1994), 조직 배양, 21 (1995), Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)] 에 준하여 재배하여, 그 단백질을 그 식물 중에 생성, 축적시키고, 그 식물 중으로부터 그 단백질을 채취함으로써, 그 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 단백질을 생산하는 형질 전환체를 사용하여 제조된 본 발명의 단백질을 단리·정제하는 방법으로는, 통상적인 효소의 단리, 정제법을 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 단백질이 세포 내에 용해 상태로 생산된 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤 고올린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다.
그 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상적인 효소의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미츠비시 화성사 제조) 등 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (GE 헬스 케어 바이오사이언스사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 어피니티-크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기 영동 등과 같은 전기 영동법 등의 수법을 단독으로 또는 조합하여 사용해서, 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 그 단백질이 세포 내에 불용체를 형성하여 생산된 경우에는, 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하고, 원심분리를 실시함으로써 얻어진 침전 획분으로부터, 통상적인 방법에 의해 그 단백질을 회수한 후, 그 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화시킨다.
그 가용화액을, 단백질 변성제를 함유하지 않거나 또는 단백질 변성제의 농도가 단백질이 변성되지 않을 정도로 희박한 용액에 희석, 또는 투석하여, 그 단백질을 정상적인 입체 구조로 구성시킨 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 정제 표품을 얻을 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 그 당 수식체 등의 유도체가 세포 밖에 분비된 경우에는, 배양 상청에 그 단백질 또는 그 당 부가체 등의 유도체를 회수할 수 있다.
즉, 그 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 가용성 획분을 취득하고, 그 가용성 획분으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써 정제 표품을 얻을 수 있다.
이렇게 해서 취득되는 단백질로서, 예를 들어, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질을 다른 단백질과의 융합 단백질로서 생산하고, 융합된 단백질에 친화성을 갖는 물질을 사용한 어피니티-크로마토그래피를 이용하여 정제할 수도 있다. 예를 들어, 로우 들의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 일본 공개특허공보 평5-336963호, WO94/23021호에 기재된 방법에 준하여, 본 발명의 단백질을 프로테인 A 와의 융합 단백질로서 생산하고, 이뮤노글로불린 G 를 사용하는 어피니티-크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질을 Flag 펩티드와의 융합 단백질로서 생산하여, 항 Flag 항체를 사용하는 어피니티-크로마토그래피 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)] 나, 폴리히스티딘과의 융합 단백질로서 생산하여, 폴리히스티딘과 고친화성을 갖는 금속 배위 레진을 사용하는 어피니티-크로마토그래피에 의해서 정제할 수도 있다. 또, 그 단백질 자신에 대한 항체를 사용한 어피니티-크로마토그래피에 의해 정제할 수도 있다.
상기에서 취득된 단백질의 아미노산 배열 정보를 바탕으로, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 본 발명의 단백질을 제조할 수 있다. 또한, Advanced ChemTech 사, 파킨 엘머사, Pharmacia 사, Protein Technology Instrument 사, Synthecell-Vega 사, PerSeptive 사, 시마즈 제작소 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
7. 본 발명의 단백질을 사용하는 당화 단백질의 측정 방법
본 발명의 단백질은, 당화 단백질에 단백질 분해 효소가 작용하여 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드에 작용하여, 과산화수소를 생성하는 성질을 갖는 점에서, 각종 시료 중의 당화 단백질의 측정에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 시료를 단백질 분해 효소와 반응시켜 당화 펩티드를 생성시키고, 생성된 당화 펩티드와 본 발명의 단백질을 반응시켜, 당해 당화 펩티드와 본 발명의 단백질의 반응에 의해 생성되는 물질 또는 당해 당화 펩티드와 본 발명의 단백질과의 반응에 있어서 소비되는 물질을 측정함으로써, 시료 중의 당화 단백질을 측정할 수 있다. 시료 중의 당화 단백질의 측정에 관련된 반응은, 후술하는 수성 매체 중에서 실시해도 된다. 본 발명에 있어서의 당화 단백질로는, 예를 들어 헤모글로빈 A1c 등의 당화 헤모글로빈이나 당화 알부민 등을 들 수 있고, 당화 헤모글로빈이 바람직하며, 헤모글로빈 A1c 가 특히 바람직하다.
이하, 본 발명의 측정 방법에 관해서 설명한다.
(시료 및 측정 대상물)
본 발명의 측정 방법에 사용되는 시료로는, 당화 단백질을 함유하는 시료이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 전혈액, 혈장, 혈청, 혈구, 세포 시료, 뇨, 수액 (髓液), 땀, 누액, 타액, 피부, 점막, 모발 등의 생체 시료, 및 식품 등을 들 수 있다. 시료로는, 전혈액, 혈장, 혈청, 혈구 등이 바람직하고, 전혈액, 혈구 등이 특히 바람직하다. 또, 전혈액에는, 전혈액 유래의 혈구 분획에 혈장이 혼합되어 있는 시료도 포함된다. 이들 시료는, 용혈, 분리, 희석, 농축, 정제 등의 전처리를 실시한 것을 사용해도 된다.
헤모글로빈은 α 사슬 및 β 사슬의 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 분자량 64,500 의 4량체이다. 헤모글로빈의 α 사슬의 N 말단의 3 아미노산 배열은 발린-류신-세린이고, β 사슬의 N 말단의 3 아미노산 배열은 발린-히스티딘-류신이다. 헤모글로빈 A1c 는 β 사슬의 N 말단 발린이 당화된 것으로 정의되어 있다. 또한, 헤모글로빈은 분자 내에 복수의 당화 부위를 갖는 것이 알려져 있다 (The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127).
당화 헤모글로빈을 함유하는 시료에 단백질 분해 효소를 작용시킴으로써, β 사슬 N 말단의 발린 잔기가 당화된 당화 헤모글로빈에서 유래하는 α-프럭토실발린 (이하, α-FV 로 약기한다) 및 α-FVH, α 사슬 N 말단의 발린 잔기가 당화된 당화 헤모글로빈에서 유래하는 α-FV 및 α-프럭토실발릴류신 (이하, α-FVL 로 약기한다), α 사슬 및/또는 β 사슬 내부의 리신 잔기의 ε-아미노기의 당화에서 유래하는 ε-FK 등의 당화 아미노산 및/또는 당화 올리고 펩티드가 생성된다.
또 시료가 전혈액인 경우, 예를 들어 당화 알부민 등, 전혈액 중의 당화 헤모글로빈 이외의 당화 단백질로부터도 예를 들어 ε-FK 등의 당화 아미노산이 생성된다.
즉, 정제 헤모글로빈을 함유하는 시료 또는 전혈액을 함유하는 시료에 단백질 분해 효소를 작용시키면, 예를 들어 α-FVH, α-FV, ε-FK, α-FVL 등이 생성되고, α-FVH 및 α-FVL 은 당화 헤모글로빈에서 유래하고, α-FVH 는 헤모글로빈 A1c 에서 특이적으로 유래한다.
따라서, 헤모글로빈 A1c 를 측정하는 경우에는, α-FVH 를 특이적으로 측정하면 된다. 본 발명의 단백질은, α-FVH 에 대한 반응성이 높고, 또한 ε-FK 에 대한 반응성이 낮기 때문에, 헤모글로빈 A1c 를 효과적으로 측정할 수 있다.
(단백질 분해 효소)
본 발명에 사용할 수 있는 단백질 분해 효소는, 시료 중에 함유되는 측정해야 할 당화 단백질에 작용하는 것이면 어떠한 것을 사용해도 되고, 예를 들어 동물, 식물, 미생물 유래의 프로테아제, 메탈로프로테아제, 엔도프로테아제, 엑소프로테아제, 세린프로테아제, 시스테인프로테아제, 산성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 티올프로테아제 등을 들 수 있다.
동물 유래의 프로테아제로는, 예를 들어 엘라스타아제 (Elastase), 트립신 (Trypsin), 키모트립신 (Chymotrypsin), 펩신 (Pepsin), 소 췌장 프로테아제, 돼지 간 유래 류신아미노펩티다아제, 카텝신 (Cathepsin), 칼페인 (Calpain), 프로테아제 타입-I, 프로테아제 타입-XX (이상, 시그마사 제조), 아미노펩티다아제 M (Aminopeptidase M), 카르복시펩티다아제 A (Carboxypeptidase A) (이상, 베링거 만하임사 제조), 판크레아틴 (Pancreatin : 와코 순약사 제조, 시그마사 제조) 등을 들 수 있다.
식물 유래의 프로테아제로는, 예를 들어 칼리크레인 (Kallikrein), 피신 (Ficin), 파파인 (Papain), 키모파파인 (Chymopapain), 브로멜라인, 카르복시펩티다아제 W (이상, 시그마사 제조), 파파인 W-40, 브로멜라인 F (이상, 아마노 엔자임사 제조) 등을 들 수 있다.
미생물 유래의 프로테아제로는, 예를 들어 하기 (1) ∼ (14) 를 들 수 있다.
(1) 바실루스 (Bacillus) 속 유래 프로테아제 ; 서브틸리신 (Subtilisin), 프로테아제-타입-VIII, 프로테아제-타입-IX, 프로테아제-타입-X, 프로테아제-타입-XV, 프로테아제-타입-XXIV, 프로테아제-타입-XXVII, 프로테아제-타입-XXXI, 프로테이나아제 TypeVII, 바실루스 리케니포르미스 유래 프로테아제 (이상, 시그마사 제조), 서몰리신 (와코 순약공업사 제조), 오리엔타아제-90N, 오리엔타아제-10NL, 오리엔타아제-22BF, 오리엔타아제-Y, 오리엔타아제-5BL, 뉴클레이신 (이상, 에이치비아이 주식회사 제조), 프로레더 (Proleather) FG-F, 프로테아제 NL 「아마노」, 프로테아제 S「아마노」 G, 프로테아제 N「아마노」G (이상, 아마노 엔자임사 제조), GODO-BNP, GODO-BAP, GODO 고순도 프로테아제 (이상, 고도 슈세이사 정제), 프로틴-AC10F, 프로틴-NL10, 프로틴-NC25, 프로틴-NY10, 프로틴-PC10F, 프로틴-PS10, 데스킨, 데피레이스, 바이오소크, 써모아제-PC10F, 서몰리신 (이상, 야마토 화성사 제조), 토요짐 NEP (Toyozyme NEP), 중성 프로테아제 (이상, 토요 방적사 제조), 뉴트라아제, 에스페라아제, 사비나아제, 듀라자임, 바이오피드 프로, 알칼라아제, NUE, 피라아제, 클리어-렌즈 프로, 에벨라아제, 노보자임-FM, 볼란 (이상, 노보 놀디스크 바이오인더스트리사 제조), 엔지론 (Enzylon)-NBS, 엔지론-SA (이상, 라쿠토 화성 공업사 제조), 나가제 (Nagarse), 바이오풀라아제 APL-30, 바이오풀라아제 SP-4FG, 바이오풀라아제 XL-416F, 바이오풀라아제 AL-15FG, 펙티나아제 XP-534 (이상, 나가세 켐텍스사 제조), 아로아제 AP-10, 프로테아제 YB, (이상, 야쿠르트 약품 공업사 제조), 콜로라아제-N, 콜로라아제-7089, 벨론 W (이상, 히구치 상회사 제조), 키라자임 P-1, 디스파아제 (이상, 로슈사 제조), 사틸리신 (베링거 만하임사 제조), 프로테이나아제 N, 프로테이나아제 Bacterial Subtilisin (이상, 플루카사 제조), 프로나아제 E (카켄 제약사 제조) 등.
(2) 아스페르길루스 (Aspergillus) 유래 프로테아제 ; 프로테아제 타입-XIII, -XIX, -XXIII (이상, 시그마사 제조), 수미짐 (Sumizym)-MP, 수미짐-AP, 수미짐-LPL, 수미짐-LP20, 수미짐-FP, 엔자임 P-3 (이상, 신니혼 화학 공업 주식회사 제조), 오리엔타아제-20A, 오리엔타아제-ONS, 오리엔타아제-ON5, 테트라아제 S (이상, 에이치비아이 주식회사 제조), 우마미자임 G, 뉴라아제 A, 뉴라아제 F3G, 프로테아제 A 「아마노」 G, 프로테아제 K 「아마노」, 프로테아제 M 「아마노」 G, 프로테아제 P 「아마노」3G (이상, 아마노 엔자임사 제조), 알칼리 프로테아제, 산성 프로테아제, 모르신, AO 프로테아제, 펩티다아제 (이상, 기꼬망사 제조), 프로틴-F, 프로틴-FN, 프로틴-FA (이상, 야마토 화성사 제조), 데납신 2P, 데나짐-SA-7, 데나짐-AP, 데나자임 AP (이상, 나가세 켐텍스사 제조), 프로테아제 YP-SS, 판티다아제-NP-2, 판티다아제-P (이상, 야쿠르트 약품 공업사 제조), 사카나아제 (카켄 제약사 제조), 플레보자임 (노보 놀디스크 바이오인더스트리사 제조), 벨론 PS (히구치 상회사 제조), 프로테이나아제 6 (플루카사 제조), 프로테아제 A5 (쿄와 화성사 제조) 등.
(3) 리조푸스 (Rhizopus) 유래 프로테아제 ; 프로테아제 타입 XVIII (시그마사 제조), 펩티다아제 R, 뉴라아제 F (이상, 아마노 엔자임사 제조), XP-415 (나가세 켐텍스사 제조) 등.
(4) 페니실리움 (Penicillium) 유래 프로테아제 ; PD 효소 (기꼬망사 제조), 프로테아제 B 「아마노」 (아마노 엔자임사 제조), 데옥신 1 (나가세 켐텍스사 제조) 등.
(5) 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 유래 프로테아제 ; 프로테아제 타입 XIV (별칭 Pronase), 프로테아제-XXI (이상, 시그마사 제조), 악티나아제-AS, 악티나아제-AF, 악티나아제-E (이상, 카켄 제약사 제조), Alkalofilic Proteinase (토요보사 제조), 프로나아제 E (로슈사 제조, 칼비오켐-노바바이오켐사 제조, 시그마사 제조), 프로나아제 (베링거 만하임사 제조) 등.
(6) 스태필로코커스 (Staphylococcus) 유래 프로테아제 ; 프로테아제 타입 XVII (시그마사 제조), 엔도프로테이나아제 Glu-C (베링거 만하임사 제조), V8 프로테아제 (타카라사 제조, 와코 순약사 제조) 등.
(7) 클로스트리디움 (Clostridium) 유래 프로테아제 ; 클로스트리파인, 논스페시픽 뉴트랄 프로테아제, 콜라게나아제 Type 1A (이상, 시그마사 제조) 등.
(8) 리소박터 (Lysobacter) 유래 프로테아제 ; 엔도프로테이나아제 Lys-C (시그마사 제조) 등.
(9) 그리폴라 (Grifola) 유래 프로테아제 ; 메탈로엔도펩티다아제 (Metalloendopeptidase ; 시그마사 제조) 등.
(10) 효모 (Yeast) 유래 프로테아제 ; 프로테이나아제 A (Proteinase A ; 시그마사 제조), 카르복시펩티다아제 Y (Carboxypeptidase Y ; 베링거 만하임사 제조) 등.
(11) 트리티라치움 (Tritirachium) 유래 프로테아제 ; 프로테이나아제 K (Proteinase K ; 시그마사 제조, 로슈사 제조, 와코 순약사 제조) 등.
(12) 테르무스 (Thermus) 유래 프로테아제 ; 아미노펩티다아제 T (Aminopeptidase T ;베링거 만하임사 제조) 등.
(13) 슈도모나스 (Pseudomonas) 유래 프로테아제 ; 엔도프로테이나아제 Asp-N (Endoproteinase Asp-N ; 와코 순약사 제조) 등.
(14) 아크로모박터 (Achromobacter) 유래 프로테아제 ; 리질엔도펩티다아제 (Lysylendopeptidase), 아크로모펩티다아제 (이상, 와코 순약사 제조), AP-1 (타카라사 제조) 등.
본 발명의 측정 방법에 있어서는, 바실루스속, 아스페르길루스속, 스트렙토마이세스속, 트리티라치움속 유래의 프로테아제가 인간 헤모글로빈에 대한 작용이 크기 때문에 바람직하고, 특히 바실루스속 유래의 프로테아제가 바람직하다.
메탈로프로테아제로는, 예를 들어 서몰리신, 프로테아제 N 등을 들 수 있다. 엔드프로테아제로는, 예를 들어 서몰리신, 파파인, 서브틸리신, 펩신, 트립신, 키모트립신 등을 들 수 있다. 엑소프로테아제로는, 예를 들어 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제 등을 들 수 있다. 세린프로테아제로는, 써미타아제, 프로테이나아제 K, 트립신, 키모트립신, 트롬빈, 플라스민, 엘라스타아제 등을 들 수 있다. 시스테인프로테아제로는, 파파인, 카스파아제 등을 들 수 있다. 산성 프로테아제로는, 펩신, 카텝신 D 등을 들 수 있다. 알칼리성 프로테아제로는, 오리엔타아제 22BF 등을 들 수 있다. 티올프로테아제는, 예를 들어 파파인, 피신, 브로멜라인 등을 들 수 있다.
단백질 분해 효소의 농도로는, 반응액 중에서 0.01 ∼ 100,000 U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.1 ∼ 10,000 U/㎖ 인 것이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
또한 본 발명에 사용하는 단백질 분해 효소는 착색되어 있지 않은 것이 바람직하고, 예를 들어 그 단백질 분해 효소의 1,000 U/㎖ 의 수용액에 있어서 파장 300 ∼ 800 ㎚ 의 흡광도가 100 mAbs 이하인 것이 바람직하며 0 ∼ 10 mAbs 가 보다 바람직하다. 단백질 분해 효소는 각종 크로마토그램, 염석, 투석, 활성탄 처리 등으로 정제하여 상기 서술한 흡광도를 감소시킨 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 측정 방법에 있어서, 본 발명의 단백질인 효소의 농도로는, 반응액 중에서 0.01 ∼ 1,000 U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.1 ∼ 100 U/㎖ 인 것이 보다 바람직하다.
(측정 방법)
본 발명의 시료 중의 측정해야 할 당화 단백질의 측정은, 하기 (i) ∼ (iii) 의 공정을 순차적으로 행함으로써 실시할 수 있다.
(i) 시료를 단백질 분해 효소와 반응시켜 당화 펩티드를 생성시키는 공정,
(ii) 생성된 당화 펩티드를 본 발명의 단백질과 반응시키는 공정, 및,
(iii) (ii) 의 공정에서 생성된 물질, 또는, 소비된 물질을 측정하는 공정.
상기 공정 (i) ∼ (iii) 은, 수성 매체 중에서 실시되어도 된다. 수성 매체로는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있는데, 완충액이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들어 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충제 (트리스 완충제), 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다.
굿 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-하이드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시-3-프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-하이드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 [(H)EPPS], N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-하이드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다.
완충액의 농도는 측정에 적합한 농도이면 특별히 제한되지는 않지만, 0.001 ∼ 2.0 ㏖/ℓ 가 바람직하고, 0.005 ∼ 1.0 ㏖/ℓ 가 보다 바람직하다.
각 공정의 반응의 반응 온도로는, 예를 들어 10 ∼ 50 ℃ 이고, 바람직하게는 20 ∼ 40 ℃ 이며, 반응 시간으로는, 1 초간 ∼ 60 분간, 바람직하게는 1 ∼ 10 분간이다.
단백질 분해 효소는, 공정 (ii) 의 반응에 영향을 미치지 않으면, 공정 (i) 을 실시한 후에 특별히 실활시키지 않아도 되지만, 가열, 냉각, 원심분리, 막 여과, 저해제의 첨가 등에 의해서 그 효소가 공정 (ii) 에서 작용하는 일이 없도록 할 수도 있다.
공정 (ii) 에 있어서, 당화 펩티드와, 본 발명의 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질의 반응에 의해 반응액 중에 생기는 생성물로는, 과산화수소, 당 오손 (α-케토알데히드체), 펩티드 등을 들 수 있다. 또한, 공정 (ii) 에 있어서, 당화 펩티드와, 본 발명의 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질의 반응에 의해 소비되는 물질로는, 예를 들어 산소 분자 등을 들 수 있다. 공정 (ii) 에 있어서 소비되는 산소 분자는, 예를 들어 산소 전극을 사용한 전기 화학적 측정법에 의해 측정된다.
본 발명의 공정 (ii) 에 있어서 생성되는 과산화수소는, 예를 들어 광학적 수법 또는 전기 화학적 수법을 사용하여 측정할 수 있다. 광학적 수법으로는, 예를 들어 흡광도법, 발광법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 과산화수소 측정 시약을 사용한 광학적 측정법, 과산화수소 전극을 사용한 전기 화학적 측정법 등을 들 수 있다.
과산화수소 측정 시약은, 생성된 과산화수소를 검출 가능한 물질로 변환하기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들어 색소, 광 등을 들 수 있는데, 색소가 바람직하다.
검출 가능한 물질이 색소인 경우에는, 과산화수소 측정 시약은, 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질을 함유한다. 산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 후술하는 산화 커플링형 색원체나 후술하는 류코형 색원체를 들 수 있다.
검출 가능한 물질이 광인 경우에는, 과산화수소 측정 시약은 화학 발광 물질을 함유한다. 화학 발광 물질로는, 생물 발광 물질도 포함되고, 예를 들어 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르, 옥살산에스테르 등을 들 수 있다.
과산화수소 측정 시약으로서 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질을 함유하는 시약을 사용하는 경우에는, 과산화수소를 과산화 활성 물질의 존재하에 산화 발색형 색원체와 반응시켜 색소를 생성하고, 생성된 색소를 측정함으로써 과산화수소를 측정할 수 있다. 또한, 화학 발광 물질을 함유하는 과산화수소 측정 시약을 사용하는 경우에는, 과산화수소를 화학 발광 물질과 반응시켜 광자 (photon) 를 생성하고, 생성된 광자를 측정함으로써 과산화수소를 측정할 수 있다.
산화 커플링형 색원체는, 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하에 과산화수소와 반응하여, 산화 커플링 반응에 의해 색소를 생성하는 색원체이다. 산화 커플링형 색원체의 구체예는, 4-아미노안티피린 등의 커플러, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 등을 들 수 있다. 커플러와 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물은, 과산화수소 및 과산화 활성 물질의 존재하에 산화 커플링하여, 색소를 생성한다.
커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논하이드라존 등을 들 수 있다.
페놀계 수소 공여체로는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-하이드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
아닐린계 수소 공여체로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS), N-[2-(숙시닐아미노)에틸]-2-메톡시-5-메틸아닐린 (MASE), N-에틸-N-[2-(숙시닐아미노)에틸]-2-메톡시-5-메틸아닐린 (Et-MASE) 등을 들 수 있다.
류코형 색원체는, 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하에 과산화수소와 반응하여, 단독으로 색소를 생성하는 색원체이다. 구체적으로는, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨염 (DA-64), 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진 나트륨염 (DA-67), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA), N,N,N',N',N'',N''-헥사-3-술포프로필-4,4',4''-트리아미노트리페닐메탄 (TPM-PS), 디아미노벤티딘, 하이드록시페닐프로피온산, 테트라메틸벤티딘, 오르토페닐렌디아민 등을 들 수 있다.
과산화수소의 측정에 있어서, 과산화 활성 물질의 농도는 측정에 적합한 농도이면 특별히 제한되지는 않지만, 과산화 활성 물질로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는, 1 ∼ 100 U/㎖ 가 바람직하고, 2 ∼ 50 U/㎖ 가 보다 바람직하다. 또한, 산화 발색형 색원체의 농도는, 측정에 적합한 농도이면 특별히 제한되지는 않지만, 0.01 ∼ 10 g/ℓ 가 바람직하고, 0.02 ∼ 5 g/ℓ 가 보다 바람직하다.
과산화수소를 과산화수소 전극을 사용하여 측정하는 경우, 사용하는 전극은 과산화수소와의 사이에서 전자를 주고 받는 재료인 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 백금, 금 혹은 은 등을 들 수 있다. 측정 방법으로는, 전류법 (amperometry), 전위차법 (potentiometry), 전기량법 (coulometry) 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 옥시다아제 또는 기질과 전극 사이의 반응에 전자 전달체를 개재시켜, 얻어지는 산화, 환원 전류 또는 그 전기량을 측정할 수도 있다.
전자 전달체로는, 전자 전달 기능을 갖는 임의의 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들어 페로센 유도체, 퀴논 유도체 등의 물질을 들 수 있다. 또한 옥시다아제 반응에 의해 생성되는 과산화수소와 전극 사이에 전자 전달체를 개재시켜 얻어지는 산화, 환원 전류 또는 그 전기량을 측정할 수 있다.
공정 (ii) 에 있어서는, 과산화수소와 함께 당 오손 (α-케토알데히드체) 이 생성되기 때문에, 생성된 당 오손 (α-케토알데히드체) 을 측정함으로써도, 시료 중의 헤모글로빈 A1c 를 측정할 수 있다. α-케토알데히드체에 글루코오스옥시다아제를 작용시켜 생성되는 과산화수소를 함께 측정함으로써, 고감도로 측정할 수 있다 (일본 공개특허공보 2000-333696호).
(시료의 조제 방법)
측정해야 할 당화 단백질을 함유하는 시료는, 필요에 따라서 생체 시료로부터 분리할 수 있다. 분리 방법으로는, 원심, 여과, 혈구 분리막을 사용한 방법 등을 들 수 있다. 예를 들어 원심에 의한 분리 방법은, 전혈액을 혈구, 혈장 또는 혈청으로 분리할 수 있다. 필요에 따라서, 그 혈구를 생리식염수 등의 등장액으로 세정함으로써, 혈장 유래의 성분을 제거한 세정 혈구를 얻을 수도 있다.
시료로서 혈구를 사용하는 경우에는, 전혈액, 혈구, 세정 혈구 등의 혈구를 함유하는 시료를 저장액 (hypotonic solution) 으로 희석하여 용혈시킬 수 있다. 저장액으로는, 혈구를 용혈시킬 수 있으면 어떠한 용액이어도 되지만, 물, 완충액 등을 들 수 있고, 계면 활성제 등의 첨가제를 함유하는 것이 바람직하다. 계면 활성제로는, 예를 들어 비이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
세정 혈구의 조제 방법으로는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다.
건강한 일반인 및 당뇨병 환자로부터 혈액을 채취하여, 전도 (轉倒) 혼화한 후, 25 ℃ 에서 5 분간, 원심분리 (3,000 rpm) 를 실시한다. 원심분리 후, 상청의 혈장은 제거한다. 하층 부분의 혈구층 1 용 (容) 에 대하여 4 용의 생리식염수를 추가하여, 전도 혼화한 후, 25 ℃ 에서 5 분간, 원심분리 (3,000 rpm) 를 실시한다. 원심분리 후, 상청의 생리식염수를 제거한다. 이 세정 조작을 3 회 반복한 후, 세정된 혈구층 1 용에 대해 9 용의 증류수를 첨가하여, 세정 혈구를 얻을 수 있다.
(당화 단백질 측정용 시약 및 측정용 키트)
본 발명의 당화 단백질 측정용 시약 및 측정용 키트는 본 발명의 당화 단백질의 측정 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 당화 단백질 측정용 시약은 보존, 운반, 유통에 적합한 형태로서, 키트의 형태를 취할 수 있다. 키트의 형태로는, 2 시약계, 3 시약계 등을 들 수 있다.
본 발명의 당화 단백질 측정용 시약은 단백질 분해 효소, 및, 본 발명의 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 함유한다. 또한, 본 발명의 당화 단백질 측정용 시약은, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 포함해도 된다. 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물로는, 과산화수소, 당 오손 (α-케토알데히드체), 펩티드 등을 들 수 있다. 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약으로는, 예를 들어 과산화수소 측정용 시약, 당 오손 (α-케토알데히드체) 측정용 시약, 펩티드 (Val-His) 측정용 시약 등을 들 수 있는데, 과산화수소 측정용 시약이 바람직하다.
본 발명의 측정해야 할 당화 단백질 측정용 키트로는, 예를 들어 이하의 양태의 키트를 들 수 있다.
·키트 1 (2 시약계 키트)
이하의 2 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소를 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질을 함유하는 시약.
·키트 2 (2 시약계 키트)
이하의 2 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소를 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약.
·키트 3 (2 시약계 키트)
이하의 2 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질을 함유하는 시약.
·키트 4 (2 시약계 키트)
이하의 2 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약.
·키트 5 (3 시약계 키트)
이하의 3 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소를 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질을 함유하는 시약 ; 및,
(3) 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약.
·키트 6 (3 시약계 키트)
이하의 3 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질을 함유하는 시약 ; 및,
(3) 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약.
·키트 7 (3 시약계 키트)
이하의 3 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소를 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약 ; 및,
(3) 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약.
·키트 8 (3 시약계 키트)
이하의 3 개의 시약을 포함하는 키트.
(1) 단백질 분해 효소, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약 ;
(2) 본 발명의 단백질, 및, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약 ; 및,
(3) 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약.
본 발명의 측정용 시약 및 측정용 키트에 있어서 사용되는 단백질 분해 효소, 본 발명의 단백질, 당화 단백질, 본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약으로는, 각각, 전술한 것을 들 수 있다.
본 발명의 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약이 과산화수소 측정용 시약인 경우, 과산화수소 측정용 시약으로는, 예를 들어 전술한 과산화수소 측정용 시약 등을 들 수 있다. 과산화수소 측정용 시약으로서 산화 커플링형 색원체를 사용하는 경우, 커플러와, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체는, 동일 시약 중에 포함되어도 되지만, 별도의 시약에 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 측정용 시약 및 측정용 키트에는, 또한, 표준 단백질 등의 측정용 표준 물질이 함유되어도 된다.
본 발명의 측정용 시약 및 측정용 키트에는, 필요에 따라서 각각 완충제, 안정화제, 방부제, 영향 물질 제거제, 비특이 반응 억제제, 계면 활성제 등이 함유되어도 된다. 완충제로는, 예를 들어 전술한 완충제 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 예를 들어 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA), 수크로오스, 염화칼슘, 아미노산류, 알부민, 덱스트란, 아세트산칼슘 등의 염류 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들어 아지화나트륨, 항생 물질 등을 들 수 있다. 영향 물질 제거제로는, 예를 들어 아스코르브산의 영향을 소거하기 위한 아스코르브산 옥시다아제 등을 들 수 있다. 비특이 반응 억제제로는, 덱스트란황산 등의 고분자 화합물 등을 들 수 있다. 계면 활성제로는, 예를 들어 비이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정용 시약 및 측정용 키트는, 동결 건조된 상태이어도 되고, 반응액에 용해된 상태이어도 된다. 동결 건조된 상태의 키트를 사용하는 경우에는, 당해 키트는 전술한 수성 매체 또는 반응액에 용해시켜 사용할 수 있다. 동결 건조된 상태의 키트를 사용하는 경우에는, 필요에 따라서, 그 키트에 동결 건조 시약을 용해시키기 위한 시약 등이 함유되어도 된다.
본 발명의 측정용 키트에 있어서의 단백질 분해 효소의 함량으로는, 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 0.01 ∼ 1,000,000 U/㎖ 가 되는 함량이 바람직하고, 0.1 ∼ 100,000 U/㎖ 가 되는 함량이 보다 바람직하다.
본 발명의 측정 키트에 있어서의 본 발명의 단백질의 함량으로는, 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 0.01 ∼ 10,000 U/㎖ 가 되는 함량이 바람직하고, 0.1 ∼ 1,000 U/㎖ 가 되는 함량이 보다 바람직하다.
과산화수소 측정 시약으로서 퍼옥시다아제와 산화 커플링형 색원체를 함유한 시약을 사용하는 경우의 키트에 있어서의 퍼옥시다아제 및 그 산화 커플링형 색원체의 함량으로는, 각각, 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 1 ∼ 600 U/㎖, 0.5 ∼ 40 g/ℓ 가 되는 함량이 바람직하고, 2 ∼ 150 U/㎖, 1 ∼ 20 g/ℓ 가 되는 함량이 보다 바람직하다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서 내에 도입된다.
실시예
이하에, 실시예를 나타내는데, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자의 발현계의 구축
α-FVH 에 대한 활성이 비교적 높고, 또한 ε-FK 에 대한 활성이 낮은 효소를 생산하는 균으로서, Emericella nidulans KY125 주를 선택하였다.
다음으로, E. nidulans 의 유연균이고, 또한 그 전체 게놈 배열이 해독되어 있는 Aspergillus nidulans FGSC A4 주의 DNA 배열 (Nature, 438, 1105 (2005)) 을 참고로 한 프라이머 (배열 번호 5, 배열 번호 6) 를 사용하여, 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자의 전장을 PCR 법을 사용하여 증폭하였다. 그 DNA 배열을 DNA 시퀀서를 사용하여 해독한 결과, KY125 주의 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자는, 6 개의 엑손 사이에, 5 개의 인트론을 포함하고 있었다. 그래서, 오버랩 PCR 법 (Nucleic Acids Res., 16, 7351 (1988)) 에 의해서 엑손 부분만을 증폭하고, 그것들을 결합하여, 엑손만으로 이루어지는 성숙형 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자를 조성하였다. 그리고 그 DNA 배열을 해독한 결과, 성숙형의 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자는, 1317 bp, 438 아미노산으로 이루어지는 것이 판명되었다.
E. nidulans KY125 주의 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자의 발현계를 구축하기 위해서, 발현 벡터 pTrc99A (4,176-bp, GE 재팬 제조) 의 NcoI 과 BamHI 의 제한 효소 사이트에 상기에서 얻어진 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자를 삽입하였다. 그 재조합체 DNA (플라스미드) (pTrcFPOX-1) 를 사용하여 E. coli XL1-Blue (후나코시사 제조) 를 형질 전환하였다. 이 형질 전환체를 암피실린 50 ㎎/ℓ 를 함유하는 LB 배지에서 밤새 배양함으로써, 그 균체 내에 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질이 얻어졌다.
[실시예 2] 프럭토실펩티드옥시다아제의 조성
실시예 1 에서 얻어진 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자에 대하여 랜덤 변이를 도입하였다. 랜덤 변이의 도입은, Stratagene 사의 「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」를 사용하여 실시했다. pTrcFPOX-1 을 템플릿 DNA 로 하고, 그 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자의 5'-측 상류와 3'-측 하류에 상당하는 영역에 대응하는 프라이머 (배열 번호 5, 배열 번호 6) 를 사용하는 PCR 법에 의해, 염기 치환의 도입과 전장의 증폭을 동시에 실시하였다.
PCR 산물은, NcoI 와 BamHI 로 절단 후, PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen 사) 에 의해 정제하여, pTrc99A 의 NcoI 과 BamHI 의 사이트로의 라이게이션을 실시하고, 그 후 E. coli XL1-Blue 주를 형질 전환하였다.
암피실린 50 ㎎/ℓ 를 함유하는 LB 배지를 포함한 플레이트에서의 밤샘 배양에 의해 생육된 콜로니 (형질 전환체) 를 픽업하였다. 그것들을 암피실린 50 ㎎/ℓ 를 함유하는 LB 배지를 2 ㎖ 함유하는 24 웰 배양 플레이트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 를 사용하여, 30 ℃ 에서 18 시간 배양하였다. 배양액에 BugBuster (Novagen 사 제조) 를 첨가하여, 용균, 원심분리 후, 그 상청액을 효소원으로 하여 2 종류의 기질 (ε-FK, α-FVH) 에 대한 효소 활성을 측정하였다.
한편, 각 형질 전환체로부터 플라스미드를 조제하고, 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자 부분의 염기 배열을 DNA 시퀀서를 사용하여 해독하였다. 그리고, 효소 활성, 내열성 및 기질 특이성의 변화와 염기 배열 (아미노산 배열) 의 변화를 연관시켰다.
그 중에서, α-FVH 활성 또는 내열성이 증가된 프럭토실펩티드옥시다아제로서, 실시예 1 에서 얻어진 프럭토실펩티드옥시다아제에 있어서, 71 번째의 Ser 을 Tyr 로 치환하고, 109 번째의 Lys 를 Arg 로 치환하고, 94 번째의 Ile 를 Met 로 치환하고, 269 번째의 Phe 를 Ile 로 치환하고, 104 번째의 Glu 를 Lys 로 치환한 프럭토실펩티드옥시다아제 (이하, FPOX-9 라고 한다) 를 얻었다. FPOX-9 의 아미노산 배열을 배열 번호 1 에, 당해 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 배열 번호 2 에 나타내었다.
다음으로 FPOX-9 에 있어서, 59 번째의 Ser 을 Gly 로 치환한 FPOX-10, 그 FPOX-10 의 58 번째의 Met 를 Phe 로 치환하고, 105 번째의 Gly 를 Lys 로 치환한 FPOX-11 을, 그 FPOX-11 의 183 번째의 Gly 를 Glu 로 치환한 FPOX-13, 그 FPOX-13 의 302 번째의 Pro 를 Leu 로 치환한 FPOX-14 를 각각 얻었다. 그리고, 그 FPOX-14 의 272 번째의 Asn 을 Asp 로 치환한 FPOX-15 를 얻었다. FPOX-15 의 아미노산 배열을 배열 번호 3 에, 당해 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 배열 번호 4 에 각각 나타내었다.
이들 조작에 의해, 치환이 누적됨에 따라서, 표 1 에 나타내는 바와 같이 α-FVH 에 대한 활성은 순차 증가하였다. FPOX-15 의 α-FVH 활성은 FPOX-9 의 약 4 배로 증가하였다. 또한, FPOX-15 의 ε-FK 에 대한 활성은 반대로 FPOX-9 의 약 70 ％ 로 감소하였다. 따라서, FPOX-15 의 α-FVH/ε-FK 비는, 약 7.3 이 되어, FPOX-9 의 값과 비교하여 약 5.6 배로 증가하였다. 또한, FPOX-15 는 50 ℃, 15 분간의 열처리 후에도 약 80 ％ 의 효소 활성을 유지하여, 열 안정성도 대폭 향상되어 있었다.
Figure pct00001
한편, 상기 표 1 은 각종 변이형 프럭토실펩티드옥시다아제의 기질 선택성과 내열성을 나타낸다. 상기 표 1 에 있어서, α-FVH 활성 및 ε-FK 활성은 FPOX-9 의 ε-FK 활성을 1.00 으로 했을 때의 상대값을 나타내고, 부가변이의 수는 FPOX-9 로부터의 치환의 수를 나타낸다.
[실시예 3] 변이형 프럭토실펩티드옥시다아제의 취득
실시예 2 에서 얻어진 FPOX-9 를 보유하는 E. coli XL1-Blue 주를 암피실린 50 ㎎/ℓ 를 함유하는 LB 배지를 10 ㎖ 함유하는 시험관 10 개에 식균하여, 30 ℃ 에서, 24 시간 진탕 배양하였다. 이들 배양액을 암피실린 50 ㎎/ℓ 와 IPTG 20 ㎎/ℓ 를 함유하는 LB 배지를 300 ㎖ 함유하는 삼각 플라스크 10 개로 각각 바꿔 옮기고, 30 ℃ 에서, 24 시간 진탕 배양하였다.
약 3,000 ㎖ 의 배양액을 모아, 10,000xg 에서 15 분간 원심분리함으로써, 균체를 모았다. 균체를 약 50 ㎖ 의 10 m㏖/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0) 에 현탁하고, 초음파 파쇄기를 사용하여, 빙랭하에서 1 분간 파쇄하였다. 동 조건에서의 파쇄를 추가로 9 회 반복하였다. 그 균체 파쇄액을 10,000xg 에서 15 분간 원심분리를 실시하여, 얻어진 상청을 조(粗)효소 추출액으로 하였다.
조효소 추출액에, 고형 황산암모늄을 60 ％ 포화가 되도록 첨가하고, 빙랭하에서 2 시간 교반 방치하여, 목적 효소 단백질을 충분히 침전시켰다. 그리고, 10,000xg 에서 15 분간 원심분리에 의해 침전물을 회수하였다. 그 침전물을 약 20 ㎖ 의 10 m㏖/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 용해하고, 그 용액을 5,000 ㎖ 의 동 완충액에 대하여 차가운 곳에서 하룻밤 투석하였다.
투석한 효소액을, DEAE-Toyopearl (토요 방적사 제조) 을 10x100 ㎝ 의 칼럼에 채우고, 10 m㏖/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 미리 평형화한 칼럼에 통과시켜, 동 완충액으로 다시 세정하였다. 목적 효소는, 칼럼에 흡착되지 않고 그냥 통과하였다. 한편, 대부분의 협잡 단백질은 칼럼에 흡착되었다. 그 결과, 표 2 에 나타낸 바와 같이, 목적 효소는, 수율 31 ％ 로 약 50 배로 정제되었다. 동일하게, 실시예 2 에서 얻어진 FPOX-15 를 보유하는 E. coli XL1-Blue 주를 일련의 정제 공정에 적용시켜, 정제 FPOX-15 의 용액을 얻었다.
Figure pct00002
상기 표 2 는 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 의 정제의 각 공정에서의 FPOX-9 의 상태를 나타낸다.
[실시예 4] 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 의 Km 값
실시예 2 에서 얻어진 신규 FPOX-9 의 당화 펩티드 및/또는 당화 아미노산에 대한 기질 특이성을, 이하의 제 1 시약 ∼ 제 3 시약을 사용하여 측정하였다.
제 1 시약
트리스 완충액 (pH 7.5) 100 m㏖/ℓ
제 2 시약
트리스 완충액 (pH 7.5) 100 m㏖/ℓ
프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 2 ㎕
4-아미노안티피린 0.5 m㏖/ℓ
TOOS 0.2 m㏖/ℓ
퍼옥시다아제 (양고추냉이 유래) 10 U/㎖
여기서, FPOX-9 용액은, 실시예 3 에서 조제한 것을 사용하였다.
제 3 시약
트리스 완충액 (pH 7.5) 100 m㏖/ℓ
α-FVH, α-FV 또는 ε-FK X m㏖/ℓ
(α-FVH 또는α-FV 를 사용한 경우에는, X = 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10)
(ε-FK 를 사용한 경우에는, X = 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40, 50, 80, 100)
기질로서, 당화 펩티드α-FVH, 및, 당화 아미노산 ε-FK 및 α-FV 를 사용하였다.
α-FVH 용액 및 α-FV 용액은 제 3 시약 중에 있어서 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 m㏖/ℓ 의 각 농도가 되도록 트리스 완충액을 사용하여 조제하였다. ε-FK 용액은 제 3 시약 중에 있어서 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40, 50, 80, 100 m㏖/ℓ 의 각 농도가 되도록 트리스 완충액을 사용하여 조제하였다.
제 1 시약 10 ㎕ 에, 제 2 시약 170 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 반응시킨 후, 제 3 시약 20 ㎕ 를 첨가하여, 다시 37 ℃ 에서 5 분간, 합계 10 분간 반응시켰다. 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 5.4 분 후의 546 ㎚ (주파장)/800 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0' (Abs), 각각의 기질 농도에서의 반응 개시 5.4 분후의 546 ㎚ (주파장)/800 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0 x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅰ) 에 따라서 ΔA0 을 산출하였다.
(수학식 1)
ΔA0 = A0 x - A0' (Abs) (Ⅰ)
또한, 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/800 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As' (Abs), 각각의 기질 농도에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/800 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅱ) 에 따라서 ΔAs 를 산출하였다.
(수학식 2)
ΔAs = As x-As' (Abs) (Ⅱ)
얻어진 ΔA0 및 ΔAs, 총 반응액량 0.2 ㎖, TOOS 의 분자 흡광 계수 39,200, 반응 시간 1.2 분, 반응 큐벳의 광로장 0.5 ㎝ 를 식 (Ⅲ) 에 대입하여, 각각의 기질 농도에 있어서의 효소 활성 (U/㎖) 을 산출하였다.
(수학식 3)
효소 활성 (U/㎖) = {(ΔAs-ΔA0)×총 반응액량 (㎖)}/{분자 흡광 계수 ε/1000×효소액량 (㎖)×0.5×반응 시간 (min)×광로장 (㎝)} (Ⅲ)
α-FVH, ε-FK, α-FV 의 각각의 기질에 관해서, 가로축에 기질 농도 (m㏖/ℓ), 세로축에 대응하는 효소 활성 (U/㎖) 을 플롯하고, 최대 효소 활성의 1/2 에 상당하는 기질 농도를 Km 값 (미카엘리스 상수) 으로서 산출하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00003
상기 표 3 은 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 의 각종 기질에 대한 Km 값을 나타낸다. 표 3 에서 알 수 있듯이, 본 발명의 프럭토실펩티드옥시다아제는 α-FVH 및 α-FV 에 기질 특이성이 높고, ε-FK 에는 반응하기 어려운 효소임이 나타났다.
[실시예 5] 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 의 변이와, 변이체에 있어서의 기질 특이성
pTrcFPOX-9 를 템플릿 DNA 로 하고, 그 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자의 5'-측 상류와 3'-측 하류에 상당하는 영역에 대응하는 프라이머 (배열 번호 5, 배열 번호 6) 를 사용하고, 「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」를 사용하는 PCR 법에 의해, 염기 치환의 도입과 전장의 증폭을 동시에 실시하였다.
PCR 산물은, NcoI 와 BamHI 로 절단 후, PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen 사) 에 의해 정제하여, pTrc99A 의 NcoI 과 BamHI 의 사이트로의 라이게이션을 실시하고, 그 후 E. coli XL1-Blue 주를 형질 전환하였다.
암피실린 50 ㎎/ℓ 를 함유하는 LB 배지를 포함한 플레이트에서의 밤샘 배양에 의해 생육된 콜로니 (형질 전환체) 를 픽업하였다. 그것들을 암피실린 50 ㎎/ℓ 를 함유하는 LB 배지를 2 ㎖ 함유하는 24 웰 배양 플레이트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 를 사용하여, 30 ℃ 에서 18 시간 배양하였다. 배양액에 BugBuster (Novagen 사 제조) 를 첨가하여, 용균, 원심분리 후, 그 상청액을 효소원으로 하여 2 종류의 기질 (ε-FK, α-FVH) 에 대한 효소 활성을 측정하였다.
한편, 각 형질 전환체로부터 플라스미드를 조제하고, 프럭토실펩티드옥시다아제 유전자 부분의 염기 배열을 DNA 시퀀서를 사용하여 해독하였다. 그리고, 기질 특이성의 변화와 염기 배열 (아미노산 배열) 의 변화를 연관시켰다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
Figure pct00004
한편, 상기 표에 있어서, α-FVH 활성 및 ε-FK 활성은 FPOX-9 의 ε-FK 활성을 1.00 으로 했을 때의 상대값을 나타낸다. 표 4 로부터, FPOX-9 의 아미노산에 변이를 집어넣은 경우에도, 변이체의 ε-FK 활성에 대한 α-FVH 활성의 활성비 (FVH/FK) 는 FPOX-9 와 비교하여 변하지 않거나, 또는 향상되는 것이 분명해졌다.
[실시예 6] 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-15 의 Km 값
실시예 2 에서 얻어진 FPOX-15 의 당화 펩티드 및/또는 당화 아미노산에 대한 기질 특이성을, 이하의 제 1 시약 ∼ 제 3 시약을 사용하여 측정하였다.
제 1 시약
인산2수소나트륨 (pH 8.0) 100 m㏖/ℓ
프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-15 2 ㎕
여기서, FPOX-15 용액은, 실시예 3 에서 얻어진 용액을 4 배 희석한 것을 사용하였다.
제 2 시약
인산2수소나트륨 (pH 6.0 또는 pH 7.0 또는 pH 8.0) 100 m㏖/ℓ
퍼옥시다아제 (양고추냉이 유래) 3 U/㎖
4-아미노안티피린 0.5 m㏖/ℓ
EMSE 0.4 m㏖/ℓ
제 3 시약
α-FVH, α-FV 또는 ε-FK X m㏖/ℓ
(α-FVH 또는α-FV 를 사용한 경우에는, X = 0, 2, 2.5, 3, 3.66)
(ε-FK 를 사용한 경우에는, X = 0, 20, 30, 40, 50)
기질로서, 당화 펩티드 α-FVH, 그리고, 당화 아미노산 ε-FK 및 α-FV 를 사용하였다.
α-FVH 용액, 및 α-FV 용액은, 제 3 시약 중에 있어서 0, 2, 2.5, 3, 3.66 m㏖/ℓ 의 각 농도가 되도록 정제수를 사용하여 조제하였다. ε-FK 용액은, 제 3 시약 중에 있어서 0, 20, 30, 40, 50 m㏖/ℓ 의 각 농도가 되도록 정제수를 사용하여 조제하였다.
제 1 시약 5 ㎕ 에, 제 2 시약 150 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 반응시킨 후, 제 3 시약 20 ㎕ 를 첨가하여, 다시 37 ℃ 에서 5 분간, 합계 10 분간 반응시켰다. 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 5.4 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0' (Abs), 각 농도의 기질에서의 반응 개시 5.4 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0 x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅰ) 에 따라서 ΔA0 을 산출하였다.
(수학식 1)
ΔA0 = A0 x - A0' (Abs) (Ⅰ)
또한, 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As' (Abs), 각각의 기질 농도에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅱ) 에 따라서 ΔAs 를 산출하였다.
(수학식 2)
ΔAs = As x-As' (Abs) (Ⅱ)
얻어진 ΔA0 및 ΔAs, 총 반응액량 0.2 ㎖, EMSE 의 분자 흡광 계수 33,800, 반응 시간 1.2 분, 반응 큐벳의 광로장 0.5 ㎝ 를 식 (Ⅲ) 에 대입하여, 각각의 기질 농도에 있어서의 효소 활성 (U/㎖) 을 산출하였다.
(수학식 3)
효소 활성 (U/㎖) = {(ΔAs-ΔA0)×총 반응액량 (㎖)}/{분자 흡광 계수 ε/1000×효소액량 (㎖)×0.5×반응 시간 (min)×광로장 (㎝)} (Ⅲ)
α-FVH, ε-FK, α-FV 의 각각의 기질에 관해서, 가로축에 기질 농도 (m㏖/ℓ), 세로축에 대응하는 효소 활성 (U/㎖) 을 플롯하고, 최대 효소 활성의 1/2 에 상당하는 기질 농도를 Km 값 (미카엘리스 상수) 으로서 산출하였다. 그 결과를 표 5 에 나타낸다.
Figure pct00005
상기 표 5 는 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-15 의 각종 기질에 대한 Km 값을 나타낸다. 표 5 에서 알 수 있듯이, 본 발명의 프럭토실펩티드옥시다아제는 α-FVH 및 α-FV 에 대한 기질 특이성이 높고, ε-FK 에 대한 기질 특이성이 낮은 효소임이 나타났다.
[실시예 7] 프럭토실펩티드옥시다아제 (FPOX-9 및 FPOX-15) 의 등전점 pI
FPOX-9 및 FPOX-15 의 1 ㎎/㎖ 인산 완충액 (pH 7.0) 용액의 각 용액 (3 ㎕) 을, Phast System (전자동 전기 영동 시스템, GE Healthcare 사) 의 등전점 전기 영동겔에 어플라이하고, 조작 순서에 따라서, 전기 영동, 염색, 탈색 조작을 실시하여, 각 프럭토실펩티드옥시다아제의 pI 를 결정하였다. 그 결과를 표 6 에 나타낸다.
Figure pct00006
표 6 에 나타내는 바와 같이, 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 및 FPOX-15 의 pI 값이 약알칼리측임을 알 수 있었다.
[실시예 8] 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 및 FPOX-15 의 안정성에 대한 pH 의 영향
프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 및 FPOX-15 의 안정성에 대한 pH 의 영향을, 이하의 제 1 시약 ∼ 제 3 시약을 사용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 제 1 시약으로서, 조제 직후의 시약, 조제 후 30 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존한 시약, 조제 후 30 ℃ 에서 5 일간 보존한 시약을 사용하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 5.0 또는 pH 6.0 또는 pH 7.0 또는 pH 8.0) 100 m㏖/ℓ
프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 또는 FPOX-15 2 ㎕
여기서, FPOX-9 용액은 실시예 3 에서 얻어진 용액을 20 배 희석한 것, FPOX-15 용액은 실시예 3 에서 얻어진 용액을 20 배 희석한 것을 사용하였다.
제 2 시약
인산2수소나트륨 (pH 6.0 또는 pH 7.0 또는 pH 8.0) 100 m㏖/ℓ
퍼옥시다아제 (양고추냉이 유래) 3 U/㎖
4-아미노안티피린 0.5 m㏖/ℓ
EMSE 0.4 m㏖/ℓ
제 3 시약
α-FG (프럭토실글리신) 0 또는 15 m㏖/ℓ
기질로서, 당화 아미노산 α-FG 를 사용하였다.
제 1 시약 5 ㎕ 에, 제 2 시약 150 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 반응시킨 후, 제 3 시약 20 ㎕ 를 첨가하여, 다시 37 ℃ 에서 5 분간, 합계 10 분간 반응시켰다. 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 5.4 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0' (Abs), 기질 15 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 5.4 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0 x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅰ) 에 따라서 ΔA0 을 산출하였다.
(수학식 1)
ΔA0 = A0 x - A0' (Abs) (Ⅰ)
또한, 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As' (Abs), 15 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅱ) 에 따라서 ΔAs 를 산출하였다.
(수학식 2)
ΔAs = As x-As' (Abs) (Ⅱ)
얻어진 ΔA0 및 ΔAs, 총 반응액량 0.2 ㎖, EMSE 의 분자 흡광 계수 33,800, 반응 시간 1.2 분, 반응 큐벳의 광로장 0.5 ㎝ 를 식 (Ⅲ) 에 대입하여, 기질 15 m㏖/ℓ 에 있어서의 효소 활성 (U/㎖) 을 산출하였다.
(수학식 3)
효소 활성 (U/㎖) = {(ΔAs-ΔA0)×총 반응액량 (㎖)}/{분자 흡광 계수 ε/1000×효소액량 (㎖)×0.5×반응 시간 (min)×광로장 (㎝)} (Ⅲ)
이 일련의 조작을, 조제 직후의 시약, 30 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존 후의 시약, 30 ℃ 에서 5 일간 보존 후의 시약 각각에 대해 실시하여, 조제 직후의 시약에 있어서의 효소 활성 E0day, 30 ℃ 에서 24 시간 보존 후의 시약에 있어서의 효소 활성 E1day, 30 ℃ 에서 5 일간 보존 후의 시약에 있어서의 효소 활성 E5day 으로부터, 식 (Ⅳ) 에 따라서, 조제 직후의 시약에 대한, 30 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존 후의 시약, 및, 30 ℃ 에서 5 일간 보존 후의 시약의 효소 활성 잔존율 (％) E' 을 산출하였다. 그 결과를 표 7 및 표 8 에 나타낸다.
(수학식 4)
효소 활성 잔존율 E'(％) = (E1day, 또는, E5day)/E0day×100 (Ⅳ)
Figure pct00007
Figure pct00008
표 7 은 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 의 안정성에 대한 pH 의 영향을, 표 8 은 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-15 의 안정성에 대한 pH 의 영향을 나타내는 것이다. 표 7 및 표 8 에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 및 FPOX-15 는 pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0 의 어느 pH 하에서도 안정적인 것이 판명되었다.
[실시예 9] 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 및 FPOX-15 의 안정성에 대한 금속의 영향
프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 및 FPOX-15 의 안정성에 대한 금속의 영향을, 이하의 제 1 시약 ∼ 제 3 시약을 사용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 제 1 시약으로서, 조제 직후의 시약, 조제 후 5 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존한 시약, 조제 후 30 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존한 시약을 사용하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 100 m㏖/ℓ
프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 또는 FPOX-15 2 ㎕
금속 이온 X m㏖/ℓ
(금속 이온이 Na+, K+, Li+ 인 경우 : X = 100 ; 금속 이온이 Mg2+, Ca2+ 인 경우 : X = 10 ; 금속 이온이 Cr3+, Mn2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Ag+, Cd2+, Pb2+, Ba2+, Al3+, Sr2+ 인 경우 : X = 0.1)
여기서, FPOX-9 용액은 실시예 3 에서 얻어진 용액을 20 배 희석한 것, FPOX-15 용액은 실시예 3 에서 얻어진 용액을 100 배 희석한 것을 사용하였다.
제 2 시약
인산2수소나트륨 (pH 8.0) 100 m㏖/ℓ
퍼옥시다아제 (양고추냉이 유래) 3 U/㎖
4-아미노안티피린 0.5 m㏖/ℓ
EMSE 0.4 m㏖/ℓ
제 3 시약
α-FG (프럭토실글리신) 0 또는 15 m㏖/ℓ
기질로서, 당화 아미노산 α-FG 를 사용하였다.
제 1 시약 5 ㎕ 에, 제 2 시약 150 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 반응시킨 후, 제 3 시약 20 ㎕ 를 첨가하여, 다시 37 ℃ 에서 5 분간, 합계 10 분간 반응시켰다. 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 5.4 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0' (Abs), 기질 15 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 5.4 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 A0 x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅰ) 에 따라서 ΔA0 을 산출하였다.
(수학식 1)
ΔA0 = A0 x - A0' (Abs) (Ⅰ)
또한, 0 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As' (Abs), 15 m㏖/ℓ 에서의 반응 개시 6.6 분 후의 546 ㎚ (주파장)/700 ㎚ (부파장) 에 있어서의 흡광도를 As x (Abs) 로 하고, 식 (Ⅱ) 에 따라서 ΔAs 를 산출하였다.
(수학식 2)
ΔAs = As x-As' (Abs) (Ⅱ)
얻어진 ΔA0 및 ΔAs, 총 반응액량 0.2 ㎖, EMSE 의 분자 흡광 계수 33,800, 반응 시간 1.2 분, 반응 큐벳의 광로장 0.5 ㎝ 를 식 (Ⅲ) 에 대입하여, 기질 15 m㏖/ℓ 에 있어서의 효소 활성 (U/㎖) 을 산출하였다.
(수학식 3)
효소 활성 (U/㎖) = {(ΔAs-ΔA0)×총 반응액량 (㎖)}/{분자 흡광 계수 ε/1000×효소액량 (㎖)×0.5×반응 시간 (min)×광로장 (㎝)} (Ⅲ)
이 일련의 조작을, 조제 직후의 시약, 5 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존 후의 시약, 30 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존 후의 시약 각각에 대해 실시하여, 조제 직후의 시약에 있어서의 효소 활성 E'0day, 5 ℃ 또는 30 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존 후의 시약에 있어서의 효소 활성 E'1day 으로부터, 식 (Ⅴ) 에 따라서, 조제 직후의 시약에 대한, 5 ℃ 또는 30 ℃ 에서 24 시간 (1 일) 보존 후의 시약의 효소 활성 잔존율 (％) E'' 을 산출하였다. 그 결과를 표 9 및 표 10 에 나타낸다.
(수학식 5)
효소 활성 잔존율 E''(％) = (E'1day/E'0day)×100 (Ⅴ)
Figure pct00009
Figure pct00010
표 9 는 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 의 안정성에 대한 금속의 영향을, 표 10 은 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-15 의 안정성에 대한 금속의 영향을 나타낸다. 표 9 및 표 10 에서 알 수 있듯이, 본 발명의 프럭토실펩티드옥시다아제 FPOX-9 및 FPOX-15 는 각종 금속의 공존하에 있어서도 안정적임이 판명되었다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, 당뇨병 등의 생활 습관병의 진단에 유용한 신규 단백질, 그 단백질을 코드하는 DNA, 그 단백질의 제조 방법, 그리고, 그 단백질을 사용하는 당화 단백질의 측정 방법, 및, 그 단백질을 함유하는 당화 단백질 측정용 시약이 제공된다.
배열표 프리텍스트
배열 번호 5 - 인공 배열의 설명 : 합성 DNA
배열 번호 6 - 인공 배열의 설명 : 합성 DNA
독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 FERMBP-11026 20080919
<110> KYOWA MEDEX CO.,LTD <120> NOVEL FRUCTOSYL PEPTIDE OXIDASE <130> 1000P12037WO0 <150> JP 2008-262601 <151> 2008-10-09 <160> 6 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 438 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 1 Met Ala Pro Arg Ala Asn Thr Lys Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Thr 20 25 30 Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Gln 35 40 45 Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Met Ser Ile Arg Leu Arg Asn 50 55 60 Lys Pro Asp Leu Gln Leu Tyr Leu Glu Ala Leu Asp Met Trp Lys Asn 65 70 75 80 Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Gln Met Asp Val 85 90 95 Ser Ser Thr Glu Glu Gly Ile Lys Gly Leu Arg Met Arg Tyr Gln Ser 100 105 110 Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Phe Leu Leu Glu 115 120 125 Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Arg Glu Gln 130 135 140 Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Gln Gly 165 170 175 Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Thr Phe Lys Lys Pro Leu Phe 180 185 190 Ala Asp Ala Asp Glu Lys Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Ser Thr Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Lys Asn 245 250 255 Thr Pro Val Ile Tyr Asp Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Ile Glu Pro Asn 260 265 270 Glu Asn Gly Ile Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr His 275 280 285 Phe Lys Met His Gln Pro Tyr Gly Ser Pro Val Pro Lys Pro Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Thr Ile Lys Lys Ala Ile Asn Arg Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Asn Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Asn Leu Leu Val Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Ser Val 385 390 395 400 Phe Lys Asp Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ser Gly Asp Ala Leu Lys 405 410 415 Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp 420 425 430 Arg Asn Glu Ala Lys Met 435 <210> 2 <211> 1317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 2 atggcgcccc gagccaacac caaaatcatc gtcgtcggcg gcggcggcac aatgggctcg 60 tcgacagccc tacacctcct gcgcgccggc tacacgccgt ccaacatcac agtgctcgac 120 acgtacccta tcccttccgc acagtctgca ggctacgacc tgaacaaaat catgagcatc 180 aggctgcgca acaagcctga cttacaactc tatcttgagg cgctggacat gtggaaaaat 240 gatcctctat tcaagccgtt tttccacaat gttggacaga tggacgtctc ttcaacagaa 300 gaaggcatca aaggtcttcg catgagatac cagtctcttc tcgacgcagg cattgggctc 360 gagaagacga atttcctgct ggaaagtgaa gacgagatcc tggctaaagc gccgcatttc 420 acgcgggagc agattaaagg ctggaaaggg ctgttctgtg gcgacggcgg ttggctcgct 480 gcagccaaag ccatcaatgc catcgggcag ttcctcaagg aacagggcgt caagtttgga 540 tttggcgggg ccggcacgtt caaaaagcca ctcttcgccg atgccgacga gaagacgtgc 600 atcggcgtcg aaactgtaga cggcacaaaa tactacgccg acaaggtcgt tctagcagct 660 ggtgcctgga gttcgacgtt ggtcgatctg gaggagcagt gcgtttcaaa ggcctgggtc 720 tttgcccaca tccaactgac gcccgctgaa gcagccgcgt acaagaacac tcctgttata 780 tacgacggtg actatgggtt tttcattgag ccgaatgaga acggcatcat aaaagtctgc 840 gacgaattcc ctggcttcac gcacttcaag atgcaccagc cgtacggctc accggtgccc 900 aaacccatct ctgtgcctcg ctcccatgcg aagcacccca cagatacata cccgcacgcg 960 tcggaggtca ccatcaaaaa ggctatcaac cggttcctgc cgaggttcaa tgacaaggaa 1020 ctgtttaaca gggccatgtg ctggtgcacc gataccgcgg atgcaaatct gcttgtttgt 1080 gagcatccac gctggaaggg gttttatctt gcaacagggg acagcgggca ttcgttcaag 1140 ttgctgccga atattggaaa gcacgttgtc gagttattgg aggggaggct ggaaagtgtg 1200 tttaaggatg cttggaggtg gaggcctggc agtggggatg cattaaagag tagacgggct 1260 gcgcctgcga aggacctggc ggatatgccg gggtggagga atgaggcaaa gatgtag 1317 <210> 3 <211> 438 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 3 Met Ala Pro Arg Ala Asn Thr Lys Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Thr 20 25 30 Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Gln 35 40 45 Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ile Arg Leu Arg Asn 50 55 60 Lys Pro Asp Leu Gln Leu Tyr Leu Glu Ala Leu Asp Met Trp Lys Asn 65 70 75 80 Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Gln Met Asp Val 85 90 95 Ser Ser Thr Glu Glu Gly Ile Lys Lys Leu Arg Met Arg Tyr Gln Ser 100 105 110 Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Phe Leu Leu Glu 115 120 125 Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Arg Glu Gln 130 135 140 Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Gln Gly 165 170 175 Val Lys Phe Gly Phe Gly Glu Ala Gly Thr Phe Lys Lys Pro Leu Phe 180 185 190 Ala Asp Ala Asp Glu Lys Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Ser Thr Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Lys Asn 245 250 255 Thr Pro Val Ile Tyr Asp Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Ile Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Asn Gly Ile Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr His 275 280 285 Phe Lys Met His Gln Pro Tyr Gly Ser Pro Val Pro Lys Leu Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Thr Ile Lys Lys Ala Ile Asn Arg Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Asn Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Asn Leu Leu Val Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Ser Val 385 390 395 400 Phe Lys Asp Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ser Gly Asp Ala Leu Lys 405 410 415 Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp 420 425 430 Arg Asn Glu Ala Lys Met 435 <210> 4 <211> 1317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 4 atggcgcccc gagccaacac caaaatcatc gtcgtcggcg gcggcggcac aatgggctcg 60 tcgacagccc tacacctcct gcgcgccggc tacacgccgt ccaacatcac agtgctcgac 120 acgtacccta tcccttccgc acagtctgca ggctacgacc tgaacaaaat cttcggcatc 180 aggctgcgca acaagcctga cttacaactc tatcttgagg cgctggacat gtggaaaaat 240 gatcctctat tcaagccgtt tttccacaat gttggacaga tggacgtctc ttcaacagaa 300 gaaggcatca aaaagcttcg catgagatac cagtctcttc tcgacgcagg cattgggctc 360 gagaagacga atttcctgct ggaaagtgaa gacgagatcc tggctaaagc gccgcatttc 420 acgcgggagc agattaaagg ctggaaaggg ctgttctgtg gcgacggcgg ttggctcgct 480 gcagccaaag ccatcaatgc catcgggcag ttcctcaagg aacagggcgt caagtttgga 540 tttggcgagg ccggcacgtt caaaaagcca ctcttcgccg atgccgacga gaagacgtgc 600 atcggcgtcg aaactgtaga cggcacaaaa tactacgccg acaaggtcgt tctagcagct 660 ggtgcctgga gttcgacgtt ggtcgatctg gaggagcagt gcgtttcaaa ggcctgggtc 720 tttgcccaca tccaactgac gcccgctgaa gcagccgcgt acaagaacac tcctgttata 780 tacgacggtg actatgggtt tttcattgag ccggacgaga acggcatcat aaaagtctgc 840 gacgaattcc ctggcttcac gcacttcaag atgcaccagc cgtacggctc accggtgccc 900 aaattgatct ctgtgcctcg ctcccatgcg aagcacccca cagatacata cccgcacgcg 960 tcggaggtca ccatcaaaaa ggctatcaac cggttcctgc cgaggttcaa tgacaaggaa 1020 ctgtttaaca gggccatgtg ctggtgcacc gataccgcgg atgcaaatct gcttgtttgt 1080 gagcatccac gctggaaggg gttttatctt gcaacagggg acagcgggca ttcgttcaag 1140 ttgctgccga atattggaaa gcacgttgtc gagttattgg aggggaggct ggaaagtgtg 1200 tttaaggatg cttggaggtg gaggcctggc agtggggatg cattaaagag tagacgggct 1260 gcgcctgcga aggacctggc ggatatgccg gggtggagga atgaggcaaa gatgtag 1317 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 5 catgccatgg cgccccgagc caacacc 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 6 cgcggatccc tacatctttg cctcattcc 29

Claims (17)

  1. 이하의 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
    [1] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 단백질
    [2] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
    [3] 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열과 80 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
    [4] 기탁 번호 FERM BP-11026 으로서 기탁된 대장균 XL1-Blue MRF' 주가 담지하는 발현 플라스미드에 의해 코드되는 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질
  2. 제 1 항에 있어서,
    배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질.
  3. 이하의 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 DNA.
    [1] 제 1 항에 기재된 단백질을 코드하는 DNA
    [2] 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA
    [3] 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열과 상보적인 염기 배열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 프럭토실펩티드옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA
  4. 제 3 항에 있어서,
    배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 DNA.
  5. 제 3 항에 있어서,
    배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 DNA.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 를 함유하는 재조합체 DNA.
  7. 제 6 항에 기재된 재조합체 DNA 를 갖는 형질 전환체.
  8. 제 7 항에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하여, 배양물 중에 그 단백질을 생성, 축적시키고, 그 배양물로부터 그 단백질을 채취하는 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 단백질의 제조 방법.
  9. 시료를 단백질 분해 효소와 반응시켜 당화 펩티드를 생성시키고, 이어서, 생성된 당화 펩티드를 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 단백질과 반응시켜, 당해 당화 펩티드와 당해 단백질의 반응에 의해서 생성된 물질 또는 당해 당화 펩티드와 당해 단백질의 반응에 있어서 소비된 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 당화 단백질의 측정 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    당화 단백질이 당화 헤모글로빈인 측정 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    당화 헤모글로빈이 헤모글로빈 A1c 인 측정 방법.
  12. 단백질 분해 효소, 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 단백질을 함유하는 당화 단백질 측정용 시약.
  13. 제 12 항에 있어서,
    또한, 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 단백질과 당화 단백질로부터 생성되는 당화 펩티드의 반응에 의해 생성되는 생성물을 측정하기 위한 시약을 함유하는 시약.
  14. 제 13 항에 있어서,
    생성물이 과산화수소인 시약.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    당화 단백질이 당화 헤모글로빈인 시약.
  16. 제 15 항에 있어서,
    당화 헤모글로빈이 헤모글로빈 A1c 인 시약.
  17. 기탁 번호 FERM BP-11026 으로서 기탁된 대장균 XL1-Blue MRF' 주.
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