JP3842391B2 - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするｄｎａ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関し、より詳しくは、本発明は、ペニシリウム属の菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする合成ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有し、宿主細胞内で機能的な発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び得られた形質転換体を培養することによるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造、そのようにして得られた組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される物質であり、醤油等の食品、及び血液等の体液に含有されている。その生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数であることから、生成量を測定することにより、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができる。
例えば、生体内では、グルコースとアミノ酸が結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成しており、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパクが糖化された誘導体はフルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
このように、アマドリ化合物の定量分析は医学及び食品を含む広範な分野で有用である。
【０００３】
従来、アマドリ化合物を含有する試料に酸化還元酵素を作用させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することにより、定量する分析法が提案されている。アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解反応は下記の一般式で表すことができる。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
上記の反応に関与する酵素として、従来、様々な微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが知られているが、特定のアマドリ化合物を正確かつ効率的に測定するためには、その目的に最も適した酵素を使用する必要がある。例えば、グリコアルブミンは過去１〜２週間の平均血糖値を反映しており、糖尿病の診断における測定には、血中の糖化タンパクに含まれるフルクトシルバリンよりもフルクトシルリジンに高い基質特異性を有する酵素が適し、糖化ヘモグロビンの測定にはフルクトシルバリンにも活性を有する酵素が適すると考えられる。
【０００４】
本発明者らは、既に、ペニシリウム属（Penicillium)の菌から、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤ−Ｐという）を精製し、その有用性を明らかにした（特開平7-146575(EP-A-0737744））。さらに、該ＦＡＯＤ−ＰをコードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡで宿主細胞を形質転換し組換えＦＡＯＤ−Ｐ活性を有する発現産物を得ることに成功した(WO97/21818)。
【０００５】
【発明が解決すべき課題】
本発明者らは、ＦＡＯＤ−Ｐがフルクトシルバリンに対しても高い酵素活性を有することに注目し、効率的な大量生産の方法を確立することを目的としてさらに研究を重ねてきたが、一定以上に高めることは困難であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発者らはペニシリウム属由来のＦＡＯＤ−Ｐを、異種の宿主（カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii)）を用いて効率的に製造することを目的として鋭意研究を重ね、ＦＡＯＤ−Ｐをコードする天然のＤＮＡを基に、該宿主のコドン使用頻度（codon usage)に適合させたヌクレオチド配列を有し、かつＦＡＯＤ−Ｐをコードする合成ＤＮＡを得、該合成ＤＮＡを用いて、異種の宿主に効率良くＦＡＯＤ−Ｐを産生させることに成功した。
即ち、本発明は、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本明細書中、本発明のＤＮＡを、ペニシリウム属の菌からクローニングしたＦＡＯＤ−ＰをコードするＤＮＡと区別するために、「合成ＤＮＡ」と称することもある。
また、「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）活性」とは、酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化して、α−ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素活性を有することを意味し、具体的には、ペニシリウム・ヤンシネルム属株S-3413（Penicillium janthinellum S-3413, FERM BP-5475)が産生する配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＦＡＯＤ−Ｐと同等又はそれ以上の酵素活性を指す。
【０００８】
さらに、本発明は、本発明の合成ＤＮＡを含有する発現ベクターを提供するものである。そのような発現ベクターは、原核性及び真核性宿主細胞内で機能的である。
本明細書中、発現ベクターが宿主細胞内で「機能的」であるとは、該ベクターを宿主細胞に導入したとき、得られた形質転換体が適当な培地で増殖し、該ベクターにコードされているＦＡＯＤ−Ｐ活性を有するタンパク質を生産しうることを意味する。
本発明はまた、該発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供するものである。
さらに、本発明は、このようにして得られた形質転換体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする組換えＦＡＯＤ−Ｐの製造法、及びそのようにして製造された組換えＦＡＯＤ−Ｐを提供するものである。
本発明の組換えＦＡＯＤ−Ｐは、後述の実施例に記載のごとく、ＦＡＯＤ活性を有しており、アマドリ化合物を含有する試料中のアマドリ化合物の分析に有用である。特に、血清中の糖化タンパクの測定を含む糖尿病の診断、並びに糖化ヘモグロビンの測定に有用と考えられる。
【０００９】
既述のごとく、本発明の合成ＤＮＡは、メタノール酵母（メチロトロフ酵母またはメタノール資化性酵母）、好ましくはＣ.boidinii、とりわけUra要求性のＣ．boidinii TK62における発現効率の向上のために、C.boidiniiのコドン使用頻度に合わせて設計されている。そのような合成ＤＮＡの設計及び合成は、当業者既知の方法で行うことができるが、以下に、その１例を示す。
まず、配列番号２に記載のP.janthinellum S-3413 FERM BP-5475かからクローニングされたＤＮＡ（1314bp）(WO97/21818)のＣ.boidiniiでの発現効率を向上させるため、該ＤＮＡの塩基配列を、表１に記載のC.boidiniiのコドン使用頻度に従って書き換える。
【００１０】
表１ C．boidiniiのコドン使用頻度
【表１】
【００１１】
書き換えたＤＮＡ配列は、４００〜５００ｂｐの３つのブロックに分割して合成する。これらのブロックを構築するにあたり、以下の点を考慮する必要がある。
１）実際に各ブロックを接続するのに使用する制限酵素部位は、全塩基配列を上記の長さのブロックに分けるのに適した位置に存在すると同時に、設計したＤＮＡの他の部位には存在しないことが必要である。
２）各ブロックをＰＣＲで増幅した後、サブクローニングを行う場合、サブクローニングに用いるプラスミド（例、pBluescript II SK+等)との接続を容易にするために、該プラスミド内のマルチクローニングサイト（以下、ＭＣＳという）内に存在する制限酵素部位を用いることが望ましい。
３）合成ＤＮＡ発現ベクターの構築に用いるプラスミド（例、メタノール酵母用プラスミドｐＮＯＴel）との接続を確実にするために、適切な制限酵素部位を有する必要がある。例示のｐＮＯＴelプラスミド場合、接続に際してNot Iを、メタノール酵母の形質転換に際してＢamＨＩ制限酵素部位を使用するが、これらのNotＩ及びＢamＨＩはいずれも合成ＤＮＡの各ブロック内に存在してはならないし、並びに各ブロックの接続の際に用いることはできない。
【００１２】
ＦＡＯＤ−Ｐをコードする塩基配列を、表１に記載するC.boidiniiのコドン使用頻度の最も高い塩基配列の組合わせによって設計して得られた1314bpＤＮＡには上記の条件を満たす制限酵素の組合わせが存在しなかった。そこで、487bp付近のPstI部位を利用すると同時に、902bp付近にHind III部位を導入する事とした。902bp付近のＤＮＡの配列をアミノ酸配列を変えない範囲で変更して制限酵素部位（ＨindIII)を導入すると共に、設計した配列中に存在する２カ所のHindIII制限酵素部位を、C.boidiniiのコドン使用頻度において２番目に高頻度のコドンで書き換えることにより消去した。PstI部位は他に存在せず、NotＩ及びＢamＨＩ部位は、１カ所も存在していなかった。
このようにして設計されたＦＡＯＤ−Ｐをコードする1314bpの新規な塩基配列を新たに作成したHind III部位と、487bp付近のPstI部位とを用いて３ブロック（５'側から、それぞれＡ、Ｂ、Ｃと称する）に分けた。
【００１３】
次いで、これら各ブロックにおいて、ＤＮＡの開始コドンの前と、終止コドンの後ろにｐＮＯＴelに接続するためのNotＩ部位（GCGGCCGC）を接続した。即ち、ブロックＡの５'末端と、ブロックＣの３'末端に該Not I部位を接続した。このようにして得られたブロックＡ〜Ｃが連結されたＦＡＯＤ−Ｐをコードする新規な二本鎖ＤＮＡは、図１及び２に記載されている。
合成に際しては、各ブロックをさらに、５０〜６０塩基の＋鎖と−鎖に分けてＤＮＡ合成機により、合成する。これら各ブロックの配列は、図３〜４、及び配列番号９〜１７（ブロックＡの＋鎖）、配列番号１８〜２６（ブロックＡの−鎖）、配列番号２７〜３４（ブロックＢの＋鎖）、配列番号３５〜４２（ブロックＢの−鎖）、配列番号４３〜５０（ブロックＣの＋鎖）、配列番号５１〜５８（ブロックＣの−鎖）に記載されている。
【００１４】
次いで、合成した各ＤＮＡ断片を接続して、それぞれ、ブロックＡ、Ｂ、Ｃを構築し、ＰＣＲにより各ブロックのＤＮＡを増幅した。常法に従って、増幅された各ブロックに相当するＤＮＡバンドをサブクローニングし、設計されたブロックのＤＮＡ断片の各々が挿入されたプラスミドを得た。これらを切り出し、最終的に目的の合成ＤＮＡがC.boidiniiの染色体挿入型発現ベクターであるプラスミドpＮＯＴel（特開平５−３４４８９５）に正方向に接続された２個のプラスミド（ｐＮＦ４、ｐＮＦ５）を得た。この合成ＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。また、ｐＮＦ４の制限地図を図５に示す。
【００１５】
本発明の合成ＤＮＡを含有するプラスミドｐＮＦ４を用いてＣ．boidinii TK62を形質転換し、得られた形質転換体をメタノールを含有する適当な培地で培養すると、ＦＡＯＤ活性が産生された。この合成ＤＮＡを導入した形質転換体により産生されたＦＡＯＤ−Ｐの比活性は、配列番号２に記載の塩基配列を導入した形質転換体と比較して約６倍活性が高かった。また、多コピーの合成ＤＮＡが導入された形質転換体の場合は、元株（P.janthinellum S-3413)の約２０倍という高発現量が認められた。
【００１６】
以下に実施例を挙げて、本発明を詳しく説明するが、これらは本発明を制限するものではない。以下の実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って使用した。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行なった。また、ＦＡＯＤ酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。この測定法は、生成する過酸化水素を比色法により測定する方法であり、「速度法」として知られている。
方法
１００ｍＭ ＦＺＬ（フルクトシル−Ｎα−Ｚ−リジン）溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で３.０ｍｌとする。３０℃で平衡化した後、１００ｍＭ ＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位とする。
【００１７】
【実施例】
実施例１ ＦＡＯＤ−Ｐをコードする合成ＤＮＡの設計
（１）ブロックＡ，Ｂ，Ｃの設計
配列番号２に記載のＦＡＯＤ−Ｐの全塩基配列（1314bp）を上記表１に示すC.boidiniiのコドン使用頻度に従って書き換え、設計したＤＮＡ配列の487ｂｐ付近に存在したPstI部位とアミノ酸配列を変えない範囲でＤＮＡ配列を変更して導入した制限酵素部位（Hind III)により、1314bpのＦＡＯＤ−Ｐの全塩基配列を３ブロック（ブロックＡ、ブロックＢ、ブロックＣ）に分割した。また、設計した配列の中の他の２カ所に存在していたHindIII制限酵素部位は、C.boidiniiのコドン使用頻度において２番目に高頻度のものを用いて書き換えることによりそれらを消去した。
次いで、これらブロックにおいて、ＤＮＡの開始コドンの前と、終止コドンの後ろにｐＮＯＴelに接続するためのNotＩ部位（GCGGCCGC）を接続した。即ち、ブロックＡの５'末端と、ブロックＣの３'末端に該Not I部位を接続した。このようにして得られたブロックＡ〜Ｃが連結された二本鎖ＤＮＡは、図１及び２に記載されている。
【００１８】
（２）ブロックＡ、Ｂ、Ｃの合成
各ブロックをそれぞれ、５０〜６０塩基の＋鎖と−鎖に分けて合成した。＋鎖と−鎖は８塩基程度がオーバーラップするよう設計されている。これら各ブロックの配列は、図３〜４、及び配列番号９〜１７（ブロックＡの＋鎖）、配列番号１８〜２６（ブロックＡの−鎖）、配列番号２７〜３４（ブロックＢの＋鎖）、配列番号３５〜４２（ブロックＢの−鎖）、配列番号４３〜５０（ブロックＣの＋鎖）、配列番号５１〜５８（ブロックＣの−鎖）に記載されている。また、各ブロックのＰＣＲ用のプライマーも合成した。
図３及び４に記載のＤＮＡ断片の配列において、下線は制限酵素部位を表している。これらの各ＤＮＡ断片と、配列表における配列の番号との関係は以下の通りである。
【００１９】
【表２】
プライマーＡ１：配列番号３
プライマーＡ２：配列番号４
プライマーＢ１：配列番号５
プライマーＢ２：配列番号６
プライマーＣ１：配列番号７
プライマーＣ２：配列番号８
【００２０】
【表３】
ブロックＡの＋鎖
Ａ１−１：配列番号９；Ａ１−２：配列番号１０；Ａ１−３：配列番号１１；Ａ
１−４：配列番号１２；Ａ１−５：配列番号１３；Ａ１−６：配列番号１４；Ａ
１−７：配列番号１５；Ａ１−８：配列番号１６；Ａ１−９：配列番号１７。ブ
ロックＡの−鎖
Ａ２−１：配列番号１８；Ａ２−２：配列番号１９；Ａ２−３：配列番号２０；
Ａ２−４：配列番号２１；Ａ２−５：配列番号２２；Ａ２−６：配列番号２３；
Ａ２−７：配列番号２４；Ａ２−８：配列番号２５；Ａ２−９：配列番号２６。
ブロックＢの＋鎖
Ｂ１−１：配列番号２７；Ｂ１−２：配列番号２８；Ｂ１−３：配列番号２９；
Ｂ１−４：配列番号３０；Ｂ１−５：配列番号３１；Ｂ１−６：配列番号３２；
Ｂ１−７：配列番号３３；Ｂ１−８：配列番号３４。
ブロックＢの−鎖
Ｂ２−１：配列番号３５；Ｂ２−２：配列番号３６；Ｂ２−３：配列番号３７；
Ｂ２−４：配列番号３８；Ｂ２−５：配列番号３９；Ｂ２−６：配列番号４０；
Ｂ２−７：配列番号４１；Ｂ２−８：配列番号４２。
ブロックＣの＋鎖
Ｃ１−１：配列番号４３；Ｃ１−２：配列番号４４；Ｃ１−３：配列番号４５；
Ｃ１−４：配列番号４６；Ｃ１−５：配列番号４７；Ｃ１−６：配列番号４８；
Ｃ１−７：配列番号４９；Ｃ１−８：配列番号５０。
ブロックＣの−鎖
Ｃ２−１：配列番号５１；Ｃ２−２：配列番号５２；Ｃ２−３：配列番号５３；
Ｃ２−４：配列番号５４；Ｃ２−５：配列番号５５；Ｃ２−６：配列番号５６；
Ｃ２−７：配列番号５７；Ｃ２−８：配列番号５８。
各ブロックを構成する計５０個のＤＮＡ断片は、ＯＰＣカラムで精製し、６本のＰＣＲ用プライマーは、ＨＰＬＣカラムで精製した。
【００２１】
（３）合成ＤＮＡの接続
まず、各ブロック毎に、目的の塩基配列を有するか否かを試験した。合成ＤＮＡを、１mlの蒸留水に溶解した場合の吸光度（ＯＤ260）と、以下の式によりモル数（ＤＮＡ量）を算出し、１０pmol／μlになるように滅菌超純水に溶解して用いた。
【数１】
モル数(pmol/μl)=OD260×100／(A×1.54＋G×0.75＋G×1.17＋T×0.92)
【００２２】
次に５'端の＋鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ１−１、Ｂ１−１又はＣ１−１）と、３'端の−鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ２−１、Ｂ２−１又はＣ２−１）以外の各オリゴヌクレオチド２５pmol相当を以下の反応液でリン酸化した。
オリゴヌクレオチド（１０pmol／μl） ２.５μl
５０ｍＭ ＡＴＰ1) １.５μl
Ｔ４−Kinase2)（１０Ｕ／μl） ０.５μl
×１０Kinaseバッファー3) １.５μl
滅菌超純水 ７ . ５μ l
合計 １５.０μl
１）ATP：アデノシン-5'-三リン酸-2-ナトリウム塩 １水和物（和光純薬）
２）Ｔ４−Kinase（宝酒造）
３）×１０Kinaseバッファー（宝酒造）
反応は各々別々の０.５mlマイクロチューブで行い、反応条件は３７℃、４５分間とした。反応終了後、６８℃、１０分間の処理によりＴ４−Kinaseを失活させた。
【００２３】
次いで、リン酸化したオリゴヌクレオチドを各ブロック毎に１本のマイクロチューブにまとめ、さらに５'端の＋鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ１−１、Ｂ１−１又はＣ１−１）２.５μlと、３'端の−鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ２−１、Ｂ２−１又はＣ２−１）２.５μlを加え、９５℃で５分間加熱後、９０分間かけて２５℃まで冷却した（ＰＣＲ用のサーマルサイクラーを使用）。この操作により、対応するＤＮＡ同士をアニールさせた。
次いで、２本鎖ＤＮＡを氷冷し、１／１０容量の０.１Ｍ ＤＴＴ（０.４５μmフィルター滅菌処理）と１／１０容量のＴ４−Ligase(１Ｕ／μl）を加えて１２℃で一晩反応させた。この操作により、ＤＮＡがライゲーションされ１つのブロックとなった。必ずしも全てのオリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ）がライゲーションされるわけではいが、以下のＰＣＲの操作で、１つのブロックとなったもののみが増幅される。翌朝、反応液を６８℃、１０分加熱し、Ｔ４−Ligaseを失活させた。
【００２４】
（４）各ブロックの合成ＤＮＡのＰＣＲ
上記（３）で調製したブロックＡのライゲーション反応液をテンプレートにし、プライマーＡ１及びＡ２用いて以下の条件下でＰＣＲを行った。
【００２５】
以上の反応液に滅菌ミネラルオイルを５０μl加え、以下の条件でＰＣＲを行った。
［90℃,1 min; 59℃, 2 min; 72℃, 2 min]×30 cycle→72℃, 2 min (→4℃)
電気泳動はＴＡＥバッファーを用いて２％アガロースを作製して使用し、１０μlを泳動した。マーカーとしてφＸ１７４／ＨincII４μlを泳動した。その結果、設計したサイズ（４９５ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られた。
同様にして、ブロックＢ及びＣの反応液（５、１０、２０又は４０μl）をテンプレートにし、それぞれ、プライマーＢ１，Ｂ２及びプライマーＣ１，Ｃ２を用いてＰＣＲを行い、電気泳動し、それぞれ、設計したサイズ（ブロックＢ： ４２５ｂｐ；ブロックＣ：４２２ｂｐ）のバンドを得た。
【００２６】
（５）サブクローニング
ＰＣＲで増幅した目的のサイズのバンドをSephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)を用い、指示通りに処理して切り出した。次いで、切り出したブロックＡ，Ｂ，Ｃのバンドをそれぞれ、pBluescript II SK+(Stratagene）及びpT7 Blue（Novagene社)にライゲーションした。
プラスミドpBluescriptII SK+へのライゲーションに際しては、ブロックＡはNotＩ及びPstＩ処理、ブロックＢは、PstＩ及びＨindIII処理、ブロックＣはＨindIII及びＮotＩ処理を行い、用いるプラスミドにも同様の制限酵素処理を行った後、供給者の指示に従い、アルカリホスファターゼ処理を行った。
pT7 BlueはＰＣＲの際に突出するＡ（アデニン）１個を利用してライゲーションが可能なように、Ｔ（チミン）１個が突出した１本鎖として調製されたプラスミドなので、そのまま、各ブロックに相当するバンドを用い、供給者の指示に従ってライゲーションを行った。
【００２７】
上記ライゲーションによって得られたプラスミドを用いてE.coli JM109を形質転換した。大腸菌のコンピテントセルの調製は常法に従って行った。得られた組換え株の合成ＤＮＡ挿入株（白コロニー）と非挿入株（青コロニー）の数を以下の表４に示す。
【表４】
各々について、任意に合成ＤＮＡ挿入株（白コロニー）から株を選択してプラスミド抽出を行った。そして、挿入された各ブロックに対応する制限酵素処理を行い、目的サイズのＤＮＡが挿入されたプラスミドについてのみ、ジデオキシ法でＤＮＡ配列決定を行った。その結果、各ブロックについて、設計通りのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドが得られた。即ち、Ａブロックは、ＳＡ３、ＴＡ−Ａ１及びＴＡ−Ａ８；ＢブロックはＴＡ−Ｂ３−８、そしてＣブロックはＴＡ−ＣＡ−４である。
【００２８】
（６）合成ＤＮＡの接続
上記（５）のサブクローニングで得た設計通りのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＳＡ３、ＴＡ−Ｂ３−８、及びＴＡ−ＣＡ−４を連結して、全配列を得た。
ＳＡ３株においては、プラスミドpBluescriptII SK+のＭＣＳ内にブロックＡが正方向に挿入されている。そこで、ＳＡ３のブロックＡの後方のＭＣＳ内の制限酵素部位PstＩ−SalＩで切り出し、この部分を削除した。
一方、ブロックＢをＴＡ−Ｂ３−８株からPstＩ−ＨindIIIで切り出した。
さらに、ブロックＣの切り出しには、本来ＨindIII−ＮotＩを使用すべきであるが、ＳＡ３株のプラスミドのＭＣＳ内のＮotＩ部位がブロックＡの接続に際して用いられたためにそれらを使用できない。そこで、ＴＡ−ＣＡ−４株（pT7 Blue＋ブロックＣ）のＮotＩ部位よりも少し後方に位置するSalＩ部位を用いて（ＨindIII−SalＩ）切り出し、ＨindIII−SalＩでライゲーションを行った。切り出しには、Sephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)を用いた。
【００２９】
得られたプラスミドを用いてE.coli JM109を形質転換した。その結果、１０９個の組換え株を得た、この組換え株はpBluescriptII SK+のＭＣＳ内の一部の配列が制限酵素で切り出され、代わりに合成ＤＮＡを挿入されているので、コロニーの色（青又は白）で合成ＤＮＡの挿入が確認できない。そこで、制限酵素処理により確認した。
任意の２４株（Ｆ１〜Ｆ２４）についてプラスミド抽出を行い、２通りの制限酵素処理を行った。１つは、ＮotＩで処理し、ライゲーションが成功していれば、Ａ＋Ｂ＋Ｃのサイズ（約１.３ｋｂ）が切り出される。他の処理は、PstＩ＋ＨindIII処理であり、ライゲーションが成功しておれば、ブロックＢのサイズ（４２５ｂｐ）が切り出される。１２株が、この２つの処理のいずれによっても予想通りの断片を生成した。電気泳動には２％アガロースＲＥ（ＴＡＥバッファー）を使用し、φＸ１７４／ＨincIIをマーカーとして同時に泳動した。このようにして得られた合成ＤＮＡ（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）の塩基配列は、配列番号１に記載されている。
【００３０】
（７）メタノール酵母用プラスミドへの合成ＤＮＡの接続
上記（６）でＡ＋Ｂ＋Ｃの接続が確認された１２株の内、任意の株（Ｆ１２）から、ＮotＩ処理を行って合成ＤＮＡ（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）を切り出した。同様に、ＮotＩ処理を行ったｐＮＯＴeＩをＣＩＰ処理したものに、この合成ＤＮＡ（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）をＴ４ ＤＮＡ Ligase(宝酒造)を用いて１２℃で一夜ライゲーションを行った。次いで、ライゲーション混合物を用いてＥ．coli ＪＭ１０９に形質転換を行い、任意の１２株（ＮＦ１〜ＮＦ１２）について上記と同様にプラスミド抽出を行った。ＨindIII処理により合成ＤＮＡ挿入の有無と、挿入方向の確認を行った。ＨindIII部位は、ブロックＢとＣとを接続している制限酵素部位であり、ｐＮＯＴeＩ（７.５ｋｂｐ）のＡＯＤターミネーター（約５００ｂｐ）の下流にも１個存在しているために、合成ＤＮＡ（約１.３ｋｂｐ）が正方向に挿入されている場合、約７.９ｋｂｐと、約０.９ｋｂｐのバンドが、逆方向に挿入されている場合、約７.４ｋｂｐと、約１.４ｋｂｐのバンドが認められる。泳動には、０.７％アガロースＲＥ（ＴＡＥバッファー）を使用した。マーカーとしてλ−ＥcoＴ14Ｉdigestを同時に泳動した。
その結果、合成ＤＮＡがｐＮＯＴeＩに正方向に接続されたプラスミドが２個（ｐＮＦ４、pＮＦ５）を得た。
【００３１】
（８）メタノール酵母の形質転換
プラスミドｐＮＦ４、pＮＦ５を用いてメタノール酵母C．boidinii TK62株の形質転換を行った。C．boidiniiTK62のコンピテントセルの作成及びメタノール酵母の形質転換は、文献（「遺伝子発現マニュアル」、ｐ．109-110、 講談社、 石田功、 安東民衛編）に従って行った。TK62株はUra要求性であり、プラスミドpNOTelにはURA3遺伝子が含まれているので、Ura要求を指標に形質転換体を選抜することができる。まず、制限酵素Bam HIでプラスミドｐＮＦ４を処理し、相同組換え型形質転換でメタノール酵母に遺伝子を導入した。プレートにはＢＭ培地を使用し、組換え株がウラシル非要求性になることを利用して形質転換株のみを選別した。２８℃、２日間の培養の結果、コロニーの生息が確認でき、それぞれについて１,０００株以上の組換え菌が得られた。
【００３２】
（９）メタノール酵母でのＦＡＯＤ−Ｐの発現
プラスミドｐＮＦ４を用いた（８）で調製した組換え菌から２５株（ｐＮＦ４-１〜２５）と、ｐＮＦ５を用いた組換え菌から２５株（ｐＮＦ５-２６〜５０）を任意に選択し、液体培地（１０ml）で培養した。液体培地は０.５％酵母エキスと１.５％メタノールを含むＢＭ培地である。なお、メタノールは、培地を滅菌した後、加えた。対照として、糸状菌ＤＮＡを、C．boidiniiTK62株に導入したｐＮＥＰ１株及びＰＮＥＰ３株を同様に培養した。２８℃で２日間培養した後、集菌を行い、Cell freeを用いてＦＡＯＤの活性（基質：フルクトシルバリン、ＦＶ）と、タンパク濃度の測定を行った。Cellfreeはメタノール酵母培養液３ml分を遠心分離（3000 rpm×5 min)で集菌し、０.８５％ＫＣｌで洗浄したものに、ジルコニアビーズと０.１Ｍ Tris-HCl バッファーを加え、ミニビーダーで氷冷をはさみながら破砕した（3800rpm, 30 sec × 6回）ものを遠心し（４℃、14000 rpm × 5 min)、その上清を集めた。
【００３３】
活性を、前記「速度法」で測定した。その結果、５０株中、４５株でＦＡＯＤ活性が見られた（表５参照）。
【表５】
上記の表５に示すように、１コピーが導入されていると考えられる株で比較すると、合成ＤＮＡによるＦＡＯＤ発現の効果は約６倍であり、多コピーが導入されている株の場合は、比活性が７.０３（U/mg)と酵素の発現効率が大幅に向上している。これは、元株のP.janthinellum AKU3413 (比活性: 0.354 U/mg)と比較すると 約２０倍も活性が高くなっている。
【００３４】
【配列表】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ５'及び３'末端にＮot Ｉ部位を接続した、二本鎖合成ＤＮＡのＮ末端側の塩基配列。
【図２】 ５'及び３'末端にＮot Ｉ部位を接続した、二本鎖合成ＤＮＡのＣ末端側の塩基配列。
【図３】 ＰＣＲ用プライマー及びブロックＡのＤＮＡ断片の塩基配列。
【図４】 ブロックＢ及びＣのＤＮＡ断片の塩基配列。
【図５】 発現プラスミドｐＮＦ４の制限地図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関し、より詳しくは、本発明は、ペニシリウム属の菌由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする合成ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有し、宿主細胞内で機能的な発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び得られた形質転換体を培養することによるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造、そのようにして得られた組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される物質であり、醤油等の食品、及び血液等の体液に含有されている。その生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数であることから、生成量を測定することにより、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができる。
例えば、生体内では、グルコースとアミノ酸が結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成しており、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパクが糖化された誘導体はフルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
このように、アマドリ化合物の定量分析は医学及び食品を含む広範な分野で有用である。
【０００３】
従来、アマドリ化合物を含有する試料に酸化還元酵素を作用させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することにより、定量する分析法が提案されている。アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解反応は下記の一般式で表すことができる。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ2−ＮＨ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
上記の反応に関与する酵素として、従来、様々な微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが知られているが、特定のアマドリ化合物を正確かつ効率的に測定するためには、その目的に最も適した酵素を使用する必要がある。例えば、グリコアルブミンは過去１〜２週間の平均血糖値を反映しており、糖尿病の診断における測定には、血中の糖化タンパクに含まれるフルクトシルバリンよりもフルクトシルリジンに高い基質特異性を有する酵素が適し、糖化ヘモグロビンの測定にはフルクトシルバリンにも活性を有する酵素が適すると考えられる。
【０００４】
本発明者らは、既に、ペニシリウム属（Penicillium)の菌から、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤ−Ｐという）を精製し、その有用性を明らかにした（特開平7-146575(EP-A-0737744））。さらに、該ＦＡＯＤ−ＰをコードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡで宿主細胞を形質転換し組換えＦＡＯＤ−Ｐ活性を有する発現産物を得ることに成功した(WO97/21818)。
【０００５】
【発明が解決すべき課題】
本発明者らは、ＦＡＯＤ−Ｐがフルクトシルバリンに対しても高い酵素活性を有することに注目し、効率的な大量生産の方法を確立することを目的としてさらに研究を重ねてきたが、一定以上に高めることは困難であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発者らはペニシリウム属由来のＦＡＯＤ−Ｐを、異種の宿主（カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii)）を用いて効率的に製造することを目的として鋭意研究を重ね、ＦＡＯＤ−Ｐをコードする天然のＤＮＡを基に、該宿主のコドン使用頻度（codon usage)に適合させたヌクレオチド配列を有し、かつＦＡＯＤ−Ｐをコードする合成ＤＮＡを得、該合成ＤＮＡを用いて、異種の宿主に効率良くＦＡＯＤ−Ｐを産生させることに成功した。
即ち、本発明は、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本明細書中、本発明のＤＮＡを、ペニシリウム属の菌からクローニングしたＦＡＯＤ−ＰをコードするＤＮＡと区別するために、「合成ＤＮＡ」と称することもある。
また、「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）活性」とは、酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化して、α−ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素活性を有することを意味し、具体的には、ペニシリウム・ヤンシネルム属株S-3413（Penicillium janthinellum S-3413, FERM BP-5475)が産生する配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＦＡＯＤ−Ｐと同等又はそれ以上の酵素活性を指す。
【０００８】
さらに、本発明は、本発明の合成ＤＮＡを含有する発現ベクターを提供するものである。そのような発現ベクターは、原核性及び真核性宿主細胞内で機能的である。
本明細書中、発現ベクターが宿主細胞内で「機能的」であるとは、該ベクターを宿主細胞に導入したとき、得られた形質転換体が適当な培地で増殖し、該ベクターにコードされているＦＡＯＤ−Ｐ活性を有するタンパク質を生産しうることを意味する。
本発明はまた、該発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供するものである。
さらに、本発明は、このようにして得られた形質転換体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする組換えＦＡＯＤ−Ｐの製造法、及びそのようにして製造された組換えＦＡＯＤ−Ｐを提供するものである。
本発明の組換えＦＡＯＤ−Ｐは、後述の実施例に記載のごとく、ＦＡＯＤ活性を有しており、アマドリ化合物を含有する試料中のアマドリ化合物の分析に有用である。特に、血清中の糖化タンパクの測定を含む糖尿病の診断、並びに糖化ヘモグロビンの測定に有用と考えられる。
【０００９】
既述のごとく、本発明の合成ＤＮＡは、メタノール酵母（メチロトロフ酵母またはメタノール資化性酵母）、好ましくはＣ.boidinii、とりわけUra要求性のＣ．boidinii TK62における発現効率の向上のために、C.boidiniiのコドン使用頻度に合わせて設計されている。そのような合成ＤＮＡの設計及び合成は、当業者既知の方法で行うことができるが、以下に、その１例を示す。
まず、配列番号２に記載のP.janthinellum S-3413 FERM BP-5475かからクローニングされたＤＮＡ（1314bp）(WO97/21818)のＣ.boidiniiでの発現効率を向上させるため、該ＤＮＡの塩基配列を、表１に記載のC.boidiniiのコドン使用頻度に従って書き換える。
【００１０】
表１ C．boidiniiのコドン使用頻度
【表１】
書き換えたＤＮＡ配列は、４００〜５００ｂｐの３つのブロックに分割して合成する。これらのブロックを構築するにあたり、以下の点を考慮する必要がある。
１）実際に各ブロックを接続するのに使用する制限酵素部位は、全塩基配列を上記の長さのブロックに分けるのに適した位置に存在すると同時に、設計したＤＮＡの他の部位には存在しないことが必要である。
２）各ブロックをＰＣＲで増幅した後、サブクローニングを行う場合、サブクローニングに用いるプラスミド（例、pBluescript II SK+等)との接続を容易にするために、該プラスミド内のマルチクローニングサイト（以下、ＭＣＳという）内に存在する制限酵素部位を用いることが望ましい。
３）合成ＤＮＡ発現ベクターの構築に用いるプラスミド（例、メタノール酵母用プラスミドｐＮＯＴel）との接続を確実にするために、適切な制限酵素部位を有する必要がある。例示のｐＮＯＴelプラスミド場合、接続に際してNot Iを、メタノール酵母の形質転換に際してＢamＨＩ制限酵素部位を使用するが、これらのNotＩ及びＢamＨＩはいずれも合成ＤＮＡの各ブロック内に存在してはならないし、並びに各ブロックの接続の際に用いることはできない。
【００１２】
ＦＡＯＤ−Ｐをコードする塩基配列を、表１に記載するC.boidiniiのコドン使用頻度の最も高い塩基配列の組合わせによって設計して得られた1314bpＤＮＡには上記の条件を満たす制限酵素の組合わせが存在しなかった。そこで、487bp付近のPstI部位を利用すると同時に、902bp付近にHind III部位を導入する事とした。902bp付近のＤＮＡの配列をアミノ酸配列を変えない範囲で変更して制限酵素部位（ＨindIII)を導入すると共に、設計した配列中に存在する２カ所のHindIII制限酵素部位を、C.boidiniiのコドン使用頻度において２番目に高頻度のコドンで書き換えることにより消去した。PstI部位は他に存在せず、NotＩ及びＢamＨＩ部位は、１カ所も存在していなかった。
このようにして設計されたＦＡＯＤ−Ｐをコードする1314bpの新規な塩基配列を新たに作成したHind III部位と、487bp付近のPstI部位とを用いて３ブロック（５'側から、それぞれＡ、Ｂ、Ｃと称する）に分けた。
【００１３】
次いで、これら各ブロックにおいて、ＤＮＡの開始コドンの前と、終止コドンの後ろにｐＮＯＴelに接続するためのNotＩ部位（GCGGCCGC）を接続した。即ち、ブロックＡの５'末端と、ブロックＣの３'末端に該Not I部位を接続した。このようにして得られたブロックＡ〜Ｃが連結されたＦＡＯＤ−Ｐをコードする新規な二本鎖ＤＮＡは、図１及び２に記載されている。
合成に際しては、各ブロックをさらに、５０〜６０塩基の＋鎖と−鎖に分けてＤＮＡ合成機により、合成する。これら各ブロックの配列は、図３〜４、及び配列番号９〜１７（ブロックＡの＋鎖）、配列番号１８〜２６（ブロックＡの−鎖）、配列番号２７〜３４（ブロックＢの＋鎖）、配列番号３５〜４２（ブロックＢの−鎖）、配列番号４３〜５０（ブロックＣの＋鎖）、配列番号５１〜５８（ブロックＣの−鎖）に記載されている。
【００１４】
次いで、合成した各ＤＮＡ断片を接続して、それぞれ、ブロックＡ、Ｂ、Ｃを構築し、ＰＣＲにより各ブロックのＤＮＡを増幅した。常法に従って、増幅された各ブロックに相当するＤＮＡバンドをサブクローニングし、設計されたブロックのＤＮＡ断片の各々が挿入されたプラスミドを得た。これらを切り出し、最終的に目的の合成ＤＮＡがC.boidiniiの染色体挿入型発現ベクターであるプラスミドpＮＯＴel（特開平５−３４４８９５）に正方向に接続された２個のプラスミド（ｐＮＦ４、ｐＮＦ５）を得た。この合成ＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。また、ｐＮＦ４の制限地図を図５に示す。
【００１５】
本発明の合成ＤＮＡを含有するプラスミドｐＮＦ４を用いてＣ．boidinii TK62を形質転換し、得られた形質転換体をメタノールを含有する適当な培地で培養すると、ＦＡＯＤ活性が産生された。この合成ＤＮＡを導入した形質転換体により産生されたＦＡＯＤ−Ｐの比活性は、配列番号２に記載の塩基配列を導入した形質転換体と比較して約６倍活性が高かった。また、多コピーの合成ＤＮＡが導入された形質転換体の場合は、元株（P.janthinellum S-3413)の約２０倍という高発現量が認められた。
【００１６】
以下に実施例を挙げて、本発明を詳しく説明するが、これらは本発明を制限するものではない。以下の実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って使用した。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行なった。また、ＦＡＯＤ酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。この測定法は、生成する過酸化水素を比色法により測定する方法であり、「速度法」として知られている。
方法
１００ｍＭ ＦＺＬ（フルクトシル−Ｎα−Ｚ−リジン）溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で３.０ｍｌとする。３０℃で平衡化した後、１００ｍＭ ＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位とする。
【００１７】
【実施例】
実施例１ ＦＡＯＤ−Ｐをコードする合成ＤＮＡの設計
（１）ブロックＡ，Ｂ，Ｃの設計
配列番号２に記載のＦＡＯＤ−Ｐの全塩基配列（1314bp）を上記表１に示すC.boidiniiのコドン使用頻度に従って書き換え、設計したＤＮＡ配列の487ｂｐ付近に存在したPstI部位とアミノ酸配列を変えない範囲でＤＮＡ配列を変更して導入した制限酵素部位（Hind III)により、1314bpのＦＡＯＤ−Ｐの全塩基配列を３ブロック（ブロックＡ、ブロックＢ、ブロックＣ）に分割した。また、設計した配列の中の他の２カ所に存在していたHindIII制限酵素部位は、C.boidiniiのコドン使用頻度において２番目に高頻度のものを用いて書き換えることによりそれらを消去した。
次いで、これらブロックにおいて、ＤＮＡの開始コドンの前と、終止コドンの後ろにｐＮＯＴelに接続するためのNotＩ部位（GCGGCCGC）を接続した。即ち、ブロックＡの５'末端と、ブロックＣの３'末端に該Not I部位を接続した。このようにして得られたブロックＡ〜Ｃが連結された二本鎖ＤＮＡは、図１及び２に記載されている。
【００１８】
（２）ブロックＡ、Ｂ、Ｃの合成
各ブロックをそれぞれ、５０〜６０塩基の＋鎖と−鎖に分けて合成した。＋鎖と−鎖は８塩基程度がオーバーラップするよう設計されている。これら各ブロックの配列は、図３〜４、及び配列番号９〜１７（ブロックＡの＋鎖）、配列番号１８〜２６（ブロックＡの−鎖）、配列番号２７〜３４（ブロックＢの＋鎖）、配列番号３５〜４２（ブロックＢの−鎖）、配列番号４３〜５０（ブロックＣの＋鎖）、配列番号５１〜５８（ブロックＣの−鎖）に記載されている。また、各ブロックのＰＣＲ用のプライマーも合成した。
図３及び４に記載のＤＮＡ断片の配列において、下線は制限酵素部位を表している。これらの各ＤＮＡ断片と、配列表における配列の番号との関係は以下の通りである。
【００１９】
【表２】
プライマーＡ１：配列番号３
プライマーＡ２：配列番号４
プライマーＢ１：配列番号５
プライマーＢ２：配列番号６
プライマーＣ１：配列番号７
プライマーＣ２：配列番号８
【００２０】
【表３】
ブロックＡの＋鎖
Ａ１−１：配列番号９；Ａ１−２：配列番号１０；Ａ１−３：配列番号１１；Ａ
１−４：配列番号１２；Ａ１−５：配列番号１３；Ａ１−６：配列番号１４；Ａ
１−７：配列番号１５；Ａ１−８：配列番号１６；Ａ１−９：配列番号１７。ブ
ロックＡの−鎖
Ａ２−１：配列番号１８；Ａ２−２：配列番号１９；Ａ２−３：配列番号２０；
Ａ２−４：配列番号２１；Ａ２−５：配列番号２２；Ａ２−６：配列番号２３；
Ａ２−７：配列番号２４；Ａ２−８：配列番号２５；Ａ２−９：配列番号２６。
ブロックＢの＋鎖
Ｂ１−１：配列番号２７；Ｂ１−２：配列番号２８；Ｂ１−３：配列番号２９；
Ｂ１−４：配列番号３０；Ｂ１−５：配列番号３１；Ｂ１−６：配列番号３２；
Ｂ１−７：配列番号３３；Ｂ１−８：配列番号３４。
ブロックＢの−鎖
Ｂ２−１：配列番号３５；Ｂ２−２：配列番号３６；Ｂ２−３：配列番号３７；
Ｂ２−４：配列番号３８；Ｂ２−５：配列番号３９；Ｂ２−６：配列番号４０；
Ｂ２−７：配列番号４１；Ｂ２−８：配列番号４２。
ブロックＣの＋鎖
Ｃ１−１：配列番号４３；Ｃ１−２：配列番号４４；Ｃ１−３：配列番号４５；
Ｃ１−４：配列番号４６；Ｃ１−５：配列番号４７；Ｃ１−６：配列番号４８；
Ｃ１−７：配列番号４９；Ｃ１−８：配列番号５０。
ブロックＣの−鎖
Ｃ２−１：配列番号５１；Ｃ２−２：配列番号５２；Ｃ２−３：配列番号５３；
Ｃ２−４：配列番号５４；Ｃ２−５：配列番号５５；Ｃ２−６：配列番号５６；
Ｃ２−７：配列番号５７；Ｃ２−８：配列番号５８。
各ブロックを構成する計５０個のＤＮＡ断片は、ＯＰＣカラムで精製し、６本のＰＣＲ用プライマーは、ＨＰＬＣカラムで精製した。
【００２１】
（３）合成ＤＮＡの接続
まず、各ブロック毎に、目的の塩基配列を有するか否かを試験した。合成ＤＮＡを、１mlの蒸留水に溶解した場合の吸光度（ＯＤ260）と、以下の式によりモル数（ＤＮＡ量）を算出し、１０pmol／μlになるように滅菌超純水に溶解して用いた。
【数１】
モル数(pmol/μl)=OD260×100／(A×1.54＋G×0.75＋G×1.17＋T×0.92)
【００２２】
次に５'端の＋鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ１−１、Ｂ１−１又はＣ１−１）と、３'端の−鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ２−１、Ｂ２−１又はＣ２−１）以外の各オリゴヌクレオチド２５pmol相当を以下の反応液でリン酸化した。
オリゴヌクレオチド（１０pmol／μl） ２.５μl
５０ｍＭ ＡＴＰ1) １.５μl
Ｔ４−Kinase2)（１０Ｕ／μl） ０.５μl
×１０Kinaseバッファー3) １.５μl
滅菌超純水 ７ . ５μ l
合計 １５.０μl
１）ATP：アデノシン-5'-三リン酸-2-ナトリウム塩 １水和物（和光純薬）
２）Ｔ４−Kinase（宝酒造）
３）×１０Kinaseバッファー（宝酒造）
反応は各々別々の０.５mlマイクロチューブで行い、反応条件は３７℃、４５分間とした。反応終了後、６８℃、１０分間の処理によりＴ４−Kinaseを失活させた。
【００２３】
次いで、リン酸化したオリゴヌクレオチドを各ブロック毎に１本のマイクロチューブにまとめ、さらに５'端の＋鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ１−１、Ｂ１−１又はＣ１−１）２.５μlと、３'端の−鎖オリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ Ａ２−１、Ｂ２−１又はＣ２−１）２.５μlを加え、９５℃で５分間加熱後、９０分間かけて２５℃まで冷却した（ＰＣＲ用のサーマルサイクラーを使用）。この操作により、対応するＤＮＡ同士をアニールさせた。
次いで、２本鎖ＤＮＡを氷冷し、１／１０容量の０.１Ｍ ＤＴＴ（０.４５μmフィルター滅菌処理）と１／１０容量のＴ４−Ligase(１Ｕ／μl）を加えて１２℃で一晩反応させた。この操作により、ＤＮＡがライゲーションされ１つのブロックとなった。必ずしも全てのオリゴヌクレオチド（合成ＤＮＡ）がライゲーションされるわけではいが、以下のＰＣＲの操作で、１つのブロックとなったもののみが増幅される。翌朝、反応液を６８℃、１０分加熱し、Ｔ４−Ligaseを失活させた。
【００２４】
（４）各ブロックの合成ＤＮＡのＰＣＲ
上記（３）で調製したブロックＡのライゲーション反応液をテンプレートにし、プライマーＡ１及びＡ２用いて以下の条件下でＰＣＲを行った。
以上の反応液に滅菌ミネラルオイルを５０μl加え、以下の条件でＰＣＲを行った。
［90℃,1 min; 59℃, 2 min; 72℃, 2 min]×30 cycle→72℃, 2 min (→4℃)
電気泳動はＴＡＥバッファーを用いて２％アガロースを作製して使用し、１０μlを泳動した。マーカーとしてφＸ１７４／ＨincII４μlを泳動した。その結果、設計したサイズ（４９５ｂｐ）のＤＮＡの増幅が見られた。
同様にして、ブロックＢ及びＣの反応液（５、１０、２０又は４０μl）をテンプレートにし、それぞれ、プライマーＢ１，Ｂ２及びプライマーＣ１，Ｃ２を用いてＰＣＲを行い、電気泳動し、それぞれ、設計したサイズ（ブロックＢ： ４２５ｂｐ；ブロックＣ：４２２ｂｐ）のバンドを得た。
【００２６】
（５）サブクローニング
ＰＣＲで増幅した目的のサイズのバンドをSephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)を用い、指示通りに処理して切り出した。次いで、切り出したブロックＡ，Ｂ，Ｃのバンドをそれぞれ、pBluescript II SK+(Stratagene）及びpT7 Blue（Novagene社)にライゲーションした。
プラスミドpBluescriptII SK+へのライゲーションに際しては、ブロックＡはNotＩ及びPstＩ処理、ブロックＢは、PstＩ及びＨindIII処理、ブロックＣはＨindIII及びＮotＩ処理を行い、用いるプラスミドにも同様の制限酵素処理を行った後、供給者の指示に従い、アルカリホスファターゼ処理を行った。
pT7 BlueはＰＣＲの際に突出するＡ（アデニン）１個を利用してライゲーションが可能なように、Ｔ（チミン）１個が突出した１本鎖として調製されたプラスミドなので、そのまま、各ブロックに相当するバンドを用い、供給者の指示に従ってライゲーションを行った。
【００２７】
上記ライゲーションによって得られたプラスミドを用いてE.coli JM109を形質転換した。大腸菌のコンピテントセルの調製は常法に従って行った。得られた組換え株の合成ＤＮＡ挿入株（白コロニー）と非挿入株（青コロニー）の数を以下の表４に示す。
【表４】
【００２８】
（６）合成ＤＮＡの接続
上記（５）のサブクローニングで得た設計通りのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＳＡ３、ＴＡ−Ｂ３−８、及びＴＡ−ＣＡ−４を連結して、全配列を得た。
ＳＡ３株においては、プラスミドpBluescriptII SK+のＭＣＳ内にブロックＡが正方向に挿入されている。そこで、ＳＡ３のブロックＡの後方のＭＣＳ内の制限酵素部位PstＩ−SalＩで切り出し、この部分を削除した。
一方、ブロックＢをＴＡ−Ｂ３−８株からPstＩ−ＨindIIIで切り出した。
さらに、ブロックＣの切り出しには、本来ＨindIII−ＮotＩを使用すべきであるが、ＳＡ３株のプラスミドのＭＣＳ内のＮotＩ部位がブロックＡの接続に際して用いられたためにそれらを使用できない。そこで、ＴＡ−ＣＡ−４株（pT7 Blue＋ブロックＣ）のＮotＩ部位よりも少し後方に位置するSalＩ部位を用いて（ＨindIII−SalＩ）切り出し、ＨindIII−SalＩでライゲーションを行った。切り出しには、Sephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)を用いた。
【００２９】
得られたプラスミドを用いてE.coli JM109を形質転換した。その結果、１０９個の組換え株を得た、この組換え株はpBluescriptII SK+のＭＣＳ内の一部の配列が制限酵素で切り出され、代わりに合成ＤＮＡを挿入されているので、コロニーの色（青又は白）で合成ＤＮＡの挿入が確認できない。そこで、制限酵素処理により確認した。
任意の２４株（Ｆ１〜Ｆ２４）についてプラスミド抽出を行い、２通りの制限酵素処理を行った。１つは、ＮotＩで処理し、ライゲーションが成功していれば、Ａ＋Ｂ＋Ｃのサイズ（約１.３ｋｂ）が切り出される。他の処理は、PstＩ＋ＨindIII処理であり、ライゲーションが成功しておれば、ブロックＢのサイズ（４２５ｂｐ）が切り出される。１２株が、この２つの処理のいずれによっても予想通りの断片を生成した。電気泳動には２％アガロースＲＥ（ＴＡＥバッファー）を使用し、φＸ１７４／ＨincIIをマーカーとして同時に泳動した。このようにして得られた合成ＤＮＡ（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）の塩基配列は、配列番号１に記載されている。
【００３０】
（７）メタノール酵母用プラスミドへの合成ＤＮＡの接続
上記（６）でＡ＋Ｂ＋Ｃの接続が確認された１２株の内、任意の株（Ｆ１２）から、ＮotＩ処理を行って合成ＤＮＡ（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）を切り出した。同様に、ＮotＩ処理を行ったｐＮＯＴeＩをＣＩＰ処理したものに、この合成ＤＮＡ（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）をＴ４ ＤＮＡ Ligase(宝酒造)を用いて１２℃で一夜ライゲーションを行った。次いで、ライゲーション混合物を用いてＥ．coli ＪＭ１０９に形質転換を行い、任意の１２株（ＮＦ１〜ＮＦ１２）について上記と同様にプラスミド抽出を行った。ＨindIII処理により合成ＤＮＡ挿入の有無と、挿入方向の確認を行った。ＨindIII部位は、ブロックＢとＣとを接続している制限酵素部位であり、ｐＮＯＴeＩ（７.５ｋｂｐ）のＡＯＤターミネーター（約５００ｂｐ）の下流にも１個存在しているために、合成ＤＮＡ（約１.３ｋｂｐ）が正方向に挿入されている場合、約７.９ｋｂｐと、約０.９ｋｂｐのバンドが、逆方向に挿入されている場合、約７.４ｋｂｐと、約１.４ｋｂｐのバンドが認められる。泳動には、０.７％アガロースＲＥ（ＴＡＥバッファー）を使用した。マーカーとしてλ−ＥcoＴ14Ｉdigestを同時に泳動した。
その結果、合成ＤＮＡがｐＮＯＴeＩに正方向に接続されたプラスミドが２個（ｐＮＦ４、pＮＦ５）を得た。
【００３１】
（８）メタノール酵母の形質転換
プラスミドｐＮＦ４、pＮＦ５を用いてメタノール酵母C．boidinii TK62株の形質転換を行った。C．boidiniiTK62のコンピテントセルの作成及びメタノール酵母の形質転換は、文献（「遺伝子発現マニュアル」、ｐ．109-110、 講談社、 石田功、 安東民衛編）に従って行った。TK62株はUra要求性であり、プラスミドpNOTelにはURA3遺伝子が含まれているので、Ura要求を指標に形質転換体を選抜することができる。まず、制限酵素Bam HIでプラスミドｐＮＦ４を処理し、相同組換え型形質転換でメタノール酵母に遺伝子を導入した。プレートにはＢＭ培地を使用し、組換え株がウラシル非要求性になることを利用して形質転換株のみを選別した。２８℃、２日間の培養の結果、コロニーの生息が確認でき、それぞれについて１,０００株以上の組換え菌が得られた。
【００３２】
（９）メタノール酵母でのＦＡＯＤ−Ｐの発現
プラスミドｐＮＦ４を用いた（８）で調製した組換え菌から２５株（ｐＮＦ４-１〜２５）と、ｐＮＦ５を用いた組換え菌から２５株（ｐＮＦ５-２６〜５０）を任意に選択し、液体培地（１０ml）で培養した。液体培地は０.５％酵母エキスと１.５％メタノールを含むＢＭ培地である。なお、メタノールは、培地を滅菌した後、加えた。対照として、糸状菌ＤＮＡを、C．boidiniiTK62株に導入したｐＮＥＰ１株及びＰＮＥＰ３株を同様に培養した。２８℃で２日間培養した後、集菌を行い、Cell freeを用いてＦＡＯＤの活性（基質：フルクトシルバリン、ＦＶ）と、タンパク濃度の測定を行った。Cellfreeはメタノール酵母培養液３ml分を遠心分離（3000 rpm×5 min)で集菌し、０.８５％ＫＣｌで洗浄したものに、ジルコニアビーズと０.１Ｍ Tris-HCl バッファーを加え、ミニビーダーで氷冷をはさみながら破砕した（3800rpm, 30 sec × 6回）ものを遠心し（４℃、14000 rpm × 5 min)、その上清を集めた。
【００３３】
活性を、前記「速度法」で測定した。その結果、５０株中、４５株でＦＡＯＤ活性が見られた（表５参照）。
【表５】
【００３４】
【配列表】
【００３５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ５'及び３'末端にＮot Ｉ部位を接続した、二本鎖合成ＤＮＡのＮ末端側の塩基配列。
【図２】 ５'及び３'末端にＮot Ｉ部位を接続した、二本鎖合成ＤＮＡのＣ末端側の塩基配列。
【図３】 ＰＣＲ用プライマー及びブロックＡのＤＮＡ断片の塩基配列。
【図４】 ブロックＢ及びＣのＤＮＡ断片の塩基配列。
【図５】 発現プラスミドｐＮＦ４の制限地図。
Claims (6)
- 配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性が、フルクトシルリジンよりもフルクトシルバリンに対してより高いことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
- 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
- 請求項３記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
- 請求項４記載の宿主細胞を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法。
- 請求項５記載の方法で製造されるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質。
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