CN102181571A - 辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用 - Google Patents

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CN102181571A CN2011101331239A CN201110133123A CN102181571A CN 102181571 A CN102181571 A CN 102181571A CN 2011101331239 A CN2011101331239 A CN 2011101331239A CN 201110133123 A CN201110133123 A CN 201110133123A CN 102181571 A CN102181571 A CN 102181571A
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常智杰
甘一迪
任芳丽
王银银
窦琳
夏永静
张�诚
韩斌
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Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用。所述专用引物包括p53引物对；所述p53引物对由序列1和2所示DNA组成。所述专用引物还包括p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对和helb引物对中的至少一种；p21引物对由序列3和4所示DNA组成；chek1引物对由序列5和6所示DNA组成；atm引物对由序列7和8所示DNA组成；cdk1引物对由序列9和10所示DNA组成；helb引物对由序列11和12所示DNA组成。本发明提供的方法具有操作简单、高效特异的特点，同时具有较高的应用价值，可为转基因猪的安全性评价和标准制定提供参考。

Description

辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用
技术领域
本发明涉及一种辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用。
背景技术
在动物的基因组中，p21、cdk1、p53、chek1、helb、atm等基因是维持动物遗传稳定的主要基因，它们在细胞内复杂的调控网络中占据了重要的位置，这些基因的稳定表达对细胞的生长、维持和分化都具有重要意义。
Cdk1蛋白能够与核苷酸结合，是周期蛋白依赖蛋白激酶，参与蛋白氨基酸磷酸化，调控有丝分裂细胞周期，负调控细胞增殖。p21基因也称cdknla，编码周期蛋白依赖激酶抑制因子1A，分布于细胞核中，具有蛋白激酶活性，是周期蛋白依赖蛋白激酶抑制因子，调控周期蛋白依赖蛋白激酶，介导负调控细胞增殖，细胞内信号诱导细胞凋亡。Chek1是CHK1检控点同源物(裂殖酵母)分布于浓缩核染色体；具有、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性；参与DNA损伤检控点，调控周期蛋白依赖蛋白激酶、具有DNA修复功能等。Helb基因编码解旋酶(DNA)B。atm基因被公认为是一个肿瘤抑制基因，共济失调毛细血管扩张突变(包括互补组A，C和D)分布于细胞核，可以直接或间接的参与DNA损伤修复，从而影响细胞周期、减数分裂重组、信号转导和负调控进程。其突变或缺损后共济失调毛细血管扩张、抑癌功能随之丧失，引起乳腺癌、淋巴瘤等病变。p53是一种肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变，P53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，它与细胞内其它信号转导通路间的联系十分复杂，其中P53参与调控的基因已超过160种。
转基因猪的研究已经逐渐成熟，技术方法和应用不断创新。如通过基因组中导入外源功能基因，改良猪肉品质、增强猪抗病和对环境的适应能力。另外，转基因猪可以为医学研究提供动物病理模型和生产人用药品及组织器官等。然而其安全性逐渐成为大众广泛关注的问题。外源基因插入位点的不同可造成不同程度的基因改变，可能引起非预期效应。常常因外源基因的表达产物意外激活(或抑制)其他自然基因的表达，进而改变动物体内一些正常生理过程，从而导致猪发育异常或产生疾病；被修饰的基因产物有可能破坏细胞正常生理功能及代谢平衡，影响猪的健康，甚至具有潜在的致癌性。因此在转基因猪的生产和研究中，检测转基因猪自然基因表达情况的十分必要，尤其是与遗传稳定性相关的基因。因此，建立检测p21基因、cdk1基因、p53基因、chek1基因、helb基因和atm基因的RT-PCR方法对检测遗传稳定性具有重要意义，有助于安全评价标准的制定。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用。
本发明提供的辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的专用引物(引物组合物)，包括p53引物对；所述p53引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
所述专用引物还可包括p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对和helb引物对中的至少一种；所述p21引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述chek1引物对由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述atm引物对由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成；所述cdk1引物对由序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成；所述helb引物对由序列表的序列11和序列表的序列12所示DNA组成。
所述专用引物具体可由所述p53引物对、所述p21引物对、所述chek1引物对、所述atm引物对、所述cdk1引物对和所述helb引物对组成。
所述猪遗传稳定性相关基因具体可为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因和helb基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列13所示(GenBankAccession No.AF124298.1)；所述p21基因如序列表的序列14所示(GenBank Accession No.XM_001929558.1)；所述chek1基因如序列表的序列15所示(GenBank Accession No.XM_003130047.1)；所述atm基因如序列表的序列16所示(GenBank Accession No.NM_001123080.1)；所述cdk1基因如序列表的序列17所示(GenBank Accession No.NM_001159304.2)；所述helb基因如序列表的序列18所示(GenBank Accession No.XM_003126364.1)。
以上任一所述的专用引物均可用于辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因。
所述猪遗传稳定性相关基因具体可为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因和helb基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列13所示；所述p21基因如序列表的序列14所示；所述chek1基因如序列表的序列15所示；所述atm基因如序列表的序列16所示；所述cdk1基因如序列表的序列17所示；所述helb基因如序列表的序列18所示。
本发明还保护一种辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的方法，包括如下步骤：
以待测猪的cDNA为模板，用所述专用引物中的每个引物对分别进行PCR扩增，根据PCR扩增产物辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因；所述猪遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因和helb基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列13所示；所述p21基因如序列表的序列14所示；所述chek1基因如序列表的序列15所示；所述atm基因如序列表的序列16所示；所述cdk1基因如序列表的序列17所示；所述helb基因如序列表的序列18所示。
所述p53引物对用于辅助鉴定所述p53基因，其目的PCR扩增产物为474bp；所述p21引物对用于辅助鉴定所述p21基因，其目的PCR扩增产物为356bp；所述chek1引物对用于辅助鉴定所述chek1基因，其目的PCR扩增产物为353bp；所述atm引物对用于辅助鉴定所述atm基因，其目的PCR扩增产物为532bp；所述cdk1引物对用于辅助鉴定所述cdk1基因，其目的PCR扩增产物为598bp；所述helb引物对用于辅助鉴定所述helb基因，其目的PCR扩增产物为491bp。
所述PCR扩增的反应体系具体可为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer 2.5μl，2.5mMdNTP 2μl，10μmol/L的每条引物各0.5μl，cDNA 2μl，2.5U/μL Taq polymerase0.5μl。
所述PCR扩增的反应参数具体可为：94℃5min；94℃30s、60℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min。
所述RNA可来自待测猪的各种细胞或组织。
所述猪具体可为大约克夏品种的猪。
本发明公开了辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因(p21基因、cdk1基因、p53基因、chek1基因、helb基因和atm基因)的专用引物，基于该专用引物开发了助鉴定猪遗传稳定性相关基因的RT-PCR方法，并优化了检测条件和检测体系。实现了6对引物在同一条件下扩增6个基因的目的。本发明提供的方法具有操作简单、高效特异的特点，同时具有较高的应用价值，可为转基因猪的安全性评价和标准制定提供参考。
附图说明
图1为实施例3的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为实施例4的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为实施例5的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒又称TIANGENTMQuantscript RT Kit，产品目录号为KR103。10×PCR Buffer、dNTP(2.5mM)和Taq DNApolymerase均购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，PBS购自GIBCOTM Dulbecco’sPhosphate-Bufferd Saline，目录号为21600-044。
实施例1、猪成纤维细胞的制备
用于制备猪成纤维细胞的胚胎猪品种为大约克夏，购自西北农林科技大学。DMEM培养基产品为Gibco产品，目录号为21063029。胎牛血清为Hyclone公司产品，货号为SH30070.03。
1、将胚胎猪皮肤组织块在超净工作台中消毒、清洗和组织块分离。
2、用含100μg/ml庆大霉素的0.1M PBS缓冲液清洗组织块，修剪多余的脂肪和皮下结缔组织，然后将组织块剪成小块。
3、将组织块小块用0.25％(g/100mL)的胰酶消化10-30min，用含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养基中止消化，1000转离心5min，弃上清液，再加入2-5mlDMEM培养基，接至培养皿中，将培养皿置于生物培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养，每隔2天换液，当细胞布满培养皿的70％-80％时，进行传代培养。
4、传代培养
用0.25％(g/100mL)的胰酶消化5min，然后用含10％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养基中止消化，1000转离心5min，弃去上清液，加入新的DMEM培养基按1∶5的放大倍数将传代后的细胞植入培养皿，置于生物培养箱(37℃，5％CO2)中继续培养，即为用于实施例3、4、5的猪成纤维细胞。
实施例2、辅助鉴定猪遗传稳定性的专用引物的制备
辅助鉴定猪遗传稳定性的专用引物由p53引物对(由p53-F和p53-R组成)、p21引物对(由p21-F和p21-R组成)、chek1引物对(由chek1-F和chek1-R组成)、atm引物对(由atm-F和atm-R组成)、cdk1引物对(由cdk1-F和cdk1-R组成)和helb引物对(由helb-F和helb-R组成)组成。
合成表1所示的各条引物，合成的引物组成辅助鉴定猪遗传稳定性的专用引物。
专用引物中各条引物均单独包装。
表1各条引物的核苷酸序列及其靶序列长度
Figure BDA0000062592690000041
Figure BDA0000062592690000051
实施例3、退火温度的优化
一、制备cDNA
1、Trizol法提取猪成纤维细胞总RNA，测定浓度为4μg/μl，稀释至1μg/μl。
2、用TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒将步骤1的总RNA反转录为cDNA。
反应液(20μl)：10×RT mix 2μl，dNTP混合液(2.5mmol/L)2μl，Random(10μmol/L)2μl，总RNA(1μg/L)2μl，Quant Reverse Transcriptase 1μl，RNase-free水11μl。
反应条件：37℃，1小时。
二、PCR扩增
以步骤一的cDNA为模板，分别用实施例1制备的p53引物对、p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对和helb引物对进行PCR扩增。
采用上述六对引物对的PCR扩增体系(25μl)均为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，cDNA 2μl，Taqpolymerase(2.5U/μL)0.5μl。
采用上述六对引物对的PCR扩增均在PCR仪(ABI veriti 96well Thermal cycler)中进行，参数为：94℃5min，1个循环；94℃30s、退火温度(每个引物对采用三种退火温度，分别为58℃、60℃和62℃)30s、72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。
PCR扩增结束后，每种PCR扩增产物取5μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图1。结果表明：采用六对引物分别对六个靶基因的进行扩增，采用58-62℃的退火温度，扩增效果差异不大，特异性均较好。将60℃定为最优退火温度。
实施例4、引物浓度的优化
一、制备cDNA
1、Trizol法提取猪成纤维细胞总RNA，测定浓度为4μg/μl，稀释至1μg/μl。
2、用TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒将步骤1的总RNA反转录为cDNA。
反应液(20μl)：10×RT mix 2μl，dNTP混合液(2.5mmol/L)2μl，Random(10μmol/L)2μl，总RNA(1μg/L)2μl，Quant Reverse Transcriptase 1μl，RNase-free水11μl。
反应条件：37℃，1小时。
二、PCR扩增
以步骤一的cDNA为模板，分别用实施例1制备的p53引物对、p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对和helb引物对进行PCR扩增。
采用上述六对引物对的PCR扩增体系(25μl)均为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上、下游引物(每个反应体系中上下游引物的浓度相同，分别加入三种浓度的引物溶液：5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)各0.5μl，cDNA2μl，Taq polymerase(2.5U/μL)0.5μl。
采用上述六对引物对的PCR扩增均在PCR仪(ABI veriti 96well Thermal cycler)中进行，参数为：94℃5min，1个循环；94℃30s、60℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。
PCR扩增结束后，每种PCR扩增产物取5μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图2。结果表明：采用六对引物分别对六个靶基因的进行扩增，引物浓度为10μmol/L时扩增特异性较高。
实施例5、应用专用引物检测猪成纤维细胞中遗传稳定相关基因
一、制备cDNA
1、Trizol法提取猪成纤维细胞总RNA，测定浓度为4μg/μl，稀释至1μg/μl。
2、用TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒将步骤1的总RNA反转录为cDNA。
反应液(20μl)：10×RT mix 2μl，dNTP混合液(2.5mmol/L)2μl，Random(10μmol/L)2μl，总RNA(1μg/L)2μl，Quant Reverse Transcriptase 1μl，RNase-free水11μl。
反应条件：37℃，1小时。
二、PCR扩增
以步骤一的cDNA为模板，分别用实施例1制备的p53引物对、p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对和helb引物对进行PCR扩增。
采用上述六对引物对的PCR扩增体系(25μl)均为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，cDNA 2μl，Taqpolymerase(2.5U/μL)0.5μl。
采用上述六对引物对的PCR扩增均在PCR仪(ABI veriti 96well Thermal cycler)中进行，参数为：94℃5min，1个循环；94℃30s、60℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。
PCR扩增结束后，每种PCR扩增产物取5μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图3。结果表明：采用六对引物分别对六个靶基因的进行扩增，均能得到目的条带，目的带清晰、产物特异。
将各个目的条带进行测序。测序结果表明：采用p53引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列13自5’末端第20-493位核苷酸(p53基因如序列13所示)，474bp；采用p21引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列14自5’末端第44-399位核苷酸(p21基因如序列14所示)，356bp；采用chek1引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列15自5’末端第1290-1642位核苷酸(chek1基因如序列15所示)，353bp；采用atm引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列16自5’末端，第4963-5494位核苷酸(atm基因如序列16所示)，532bp；采用cdk1引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列17自5’末端第66-663位核苷酸(cdk1基因如序列17所示)，598bp；采用helb引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列18自5’末端第933-1423位核苷酸(helb基因如序列18所示)，491bp。
将所述专用引物中的每条引物的5’端或3’端分别增加或减少1至5个核苷酸，或将所述专用引物中的每条引物进行1至5个核苷酸的替换，采用相同的PCR条件和程序进行PCR扩增，电泳显示PCR扩增产物具有杂带，无法得到专一性良好的特异性条带，会给后续的基因分析或测序增加工作量。
Figure IDA0000062592770000011
Figure IDA0000062592770000021
Figure IDA0000062592770000031
Figure IDA0000062592770000041
Figure IDA0000062592770000051
Figure IDA0000062592770000061
Figure IDA0000062592770000071
Figure IDA0000062592770000091
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Figure IDA0000062592770000111
Figure IDA0000062592770000121
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Figure IDA0000062592770000161
Figure IDA0000062592770000171
Figure IDA0000062592770000191

Claims (10)

1.辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的专用引物，包括p53引物对；所述p53引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
2.如权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物还包括p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对和helb引物对中的至少一种；所述p21引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述chek1引物对由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述atm引物对由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成；所述cdk1引物对由序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成；所述helb引物对由序列表的序列11和序列表的序列12所示DNA组成。
3.如权利要求2所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物由所述p53引物对、所述p21引物对、所述chek1引物对、所述atm引物对、所述cdk1引物对和所述helb引物对组成。
4.如权利要求1至3中任一所述的专用引物，其特征在于：所述猪遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因和helb基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列13所示；所述p21基因如序列表的序列14所示；所述chek1基因如序列表的序列15所示；所述atm基因如序列表的序列16所示；所述cdk1基因如序列表的序列17所示；所述helb基因如序列表的序列18所示。
5.权利要求1至4中任一所述的专用引物在辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述猪遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因和helb基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列13所示；所述p21基因如序列表的序列14所示；所述chek1基因如序列表的序列15所示；所述atm基因如序列表的序列16所示；所述cdk1基因如序列表的序列17所示；所述helb基因如序列表的序列18所示。
7.一种辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因的方法，包括如下步骤：
以待测猪的cDNA为模板，用权利要求1至3中任一所述专用引物中的每个引物对分别进行PCR扩增，根据PCR扩增产物辅助鉴定猪遗传稳定性相关基因；所述猪遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因和helb基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列13所示；所述p21基因如序列表的序列14所示；所述chek1基因如序列表的序列15所示；所述atm基因如序列表的序列16所示；所述cdk1基因如序列表的序列17所示；所述helb基因如序列表的序列18所示。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述p53引物对用于辅助鉴定所述p53基因，其目的PCR扩增产物为474bp；所述p21引物对用于辅助鉴定所述p21基因，其目的PCR扩增产物为356bp；所述chek1引物对用于辅助鉴定所述chek1基因，其目的PCR扩增产物为353bp；所述atm引物对用于辅助鉴定所述atm基因，其目的PCR扩增产物为532bp；所述cdk1引物对用于辅助鉴定所述cdk1基因，其目的PCR扩增产物为598bp；所述helb引物对用于辅助鉴定所述helb基因，其目的PCR扩增产物为491bp。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O17μl，10×PCR Buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，10μmol/L的每条引物各0.5μl，cDNA 2μl，2.5U/μL Taq polymerase 0.5μl。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应参数为：94℃5min；94℃30s、60℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min。
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CN1295615A (zh) * 1998-03-27 2001-05-16 大塚制药株式会社 人p51基因及其基因产物
CN1760208A (zh) * 2004-10-15 2006-04-19 苏先狮 一种人野生型p53融合蛋白
EP2096173A1 (en) * 2003-05-21 2009-09-02 Asahi Kasei Pharma Corporation Method of measuring glycolated hemoglobin A1C, enzyme to be used therefor and process for producing the same

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

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Title
PLASS M ET AL: "AF124298.1", 《GENBANK》 *

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