JPWO2015060431A1 - 糖化ペプチドに作用するアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃ測定法 - Google Patents

糖化ペプチドに作用するアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃ測定法 Download PDF

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Abstract

ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）のβ鎖を加水分解して生じる、多種多様な糖化ペプチドに作用し、過酸化水素を生成することを特徴とするアマドリアーゼを提供し、それを用いたＨｂＡ1cの測定方法および測定試薬キットを提供する。コニオカエタ(Coniochaeta)属等由来のアマドリアーゼの６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換することにより得られるアマドリアーゼであり、多種多様な糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成することを特徴とするアマドリアーゼを用いたＨｂＡ1cの測定方法および該アマドリアーゼを含む測定試薬キット。少ないプロテアーゼの処方量でＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく定量できる測定方法、測定キット、またはＨｂＡ１ｃを迅速、簡便、高精度に、かつ、高感度に定量できる測定方法、測定キットを提供できる。

Description

本発明は、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、およびその測定方法に用いられる測定用試薬キットに関する。
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のα−アミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のε−アミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ＨｂＡ１ｃは、へモグロビン「β鎖」のＮ末端（アミノ末端）のＶａｌ（バリン）の、α−アミノ基にグルコースが結合したタンパク質である。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃの値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、従来、アマドリアーゼを用いる数種類の酵素的方法が知られている。
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素の総称である。アマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃを酵素的方法により測定するために有用な酵素として知られている。アマドリアーゼにより酸化される基質としては、例えば、α−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）が知られている。
アマドリアーゼはこれまでに、細菌、酵母、真菌から見出されており、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜９参照。）。これらの属のことを本明細書においてコニオカエタ(Coniochaeta)属等と呼ぶことがある。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。これらは本明細書において同義に用いる。
上述のような各種のアマドリアーゼを用いて、ＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法としては、プロテアーゼ等の切り出し用酵素でＨｂＡ１ｃを分解し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端より特定の測定用物質を遊離させ、遊離した測定用物質を、上述のようなアマドリアーゼを用いて定量する方法が知られている（例えば、特許文献１〜７参照）。
具体的には、ＨｂＡ１ｃを特定のプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端よりαＦＶＨを遊離させたのちに、遊離したαＦＶＨを定量する方法が知られており、この測定方法が、現在のＨｂＡ１ｃ酵素的測定法の主流となっている。
しかしながら、短時間でＨｂＡ１ｃのβ鎖をαＦＶＨまで十分に加水分解するためには、測定試薬中に多量のプロテアーゼを処方する、および／または反応性の異なる多種類のプロテアーゼを処方する必要がある。これは以下に述べる理由により本来好ましいことではない。
プロテアーゼはタンパク質を加水分解する作用を示すため、タンパク質である酵素もまたプロテアーゼにより加水分解される。したがって、アマドリアーゼもまたプロテアーゼにより加水分解されて失活し、その結果、糖化ペプチドと酸素を消費して過酸化水素を生成する反応が阻害される。これに対する対処法としては、アマドリアーゼの処方量を増やし、アマドリアーゼが完全に失活する前に測定を終えることが考えられるが、アマドリアーゼの増量は、プロテアーゼがＨｂＡ1cよりもアマドリアーゼを優先的に加水分解することに繋がり、本来好ましくはない。
また、αＦＶＨにアマドリアーゼを作用させて生じる過酸化水素を定量してＨｂＡ1cを測定する場合には、過酸化水素の定量にパーオキシダーゼを用いることがある。この場合、パーオキシダーゼもまたプロテアーゼにより加水分解されて失活するため、好ましいことではない。
また別の側面として、酵素によるＨｂＡ１ｃ測定には自動分析装置を使用することが一般的であり、この場合、一つの試料を用いてＨｂＡ１ｃを始めとする様々な生体マーカーを同時測定する。この際、各生体マーカーは酵素もしくは抗体を利用して測定するため、プロテアーゼがコンタミネーションすると、各生体マーカー測定試薬に含まれる酵素もしくは抗体が加水分解され、ＨｂＡ１ｃ以外の生体マーカーが正確に測定できない恐れがある。したがって、自動分析装置にセットする試薬には、本来プロテアーゼが含まれていないことが好ましい。
以上の理由により、ＨｂＡ１ｃを特定のプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端よりαＦＶＨを遊離させたのちに、遊離したαＦＶＨを定量する方法においては、処方するプロテアーゼの量および種類を極力少なくすることが望まれていた。しかしながら、処方するプロテアーゼの量および種類を極力少なくすると、ＨｂＡ１ｃのβ鎖がαＦＶＨまで十分に加水分解されずに、結果として、加水分解反応の途中段階で生じる多種多様な糖化ペプチドが混在することになる。
また一方、プロテアーゼによる加水分解反応の反応速度はその基質濃度に依存するため、ＨｂＡ１ｃの大部分が加水分解されると、プロテアーゼの反応速度は非常に低下する。したがって、ＨｂＡ１ｃの測定、すなわちαＦＶＨの定量が終了した時点では、ＨｂＡ１ｃの大部分がαＦＶＨまで加水分解されているものの、αＦＶＨまで加水分解されない糖化ペプチドもまた残存していると見積もられる。
したがって、αＦＶＨまで加水分解されずに残存したＨｂＡ１ｃβ鎖に由来する糖化ペプチドも同時に定量できれば、プロテアーゼ処方量の低減および／またはアマドリアーゼによるＨｂＡ１ｃ測定法の高感度化が期待できる。しかしながら、多種多様な糖化ペプチドに対して酵素活性を示すアマドリアーゼはこれまでに見出されていなかった。
国際公開第２００４／１０４２０３号 国際公開第２００５／４９８５７号 特開２００１−９５５９８号公報 特公平０５−３３９９７号公報 特開平１１−１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号 特開２０１１−２２９５２６号公報 特開２００３−２３５５８５号公報 特開２００４−２７５０１３号公報 特開２００４−２７５０６３号公報 特開２０１０−３５４６９号公報 特開２０１０−５７４７４号公報 国際公開第２０１０／４１７１５号 国際公開第２０１０／４１４１９号 国際公開第２０１１／１５３２５号
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１１，１０４−１１，２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６，３５８−６６，２０１０ Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０２，２４１−３，２００６ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４，８１３−９，２００７ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２，４９９−５０５，１９９６ Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，６２５−３２，２００４ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，１２５６−６１，２００２ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，２３２３−２９，２００２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７，２７−３２，２００５
本発明が解決しようとする課題は、多種多様な糖化ペプチドに対して酵素活性を示すアマドリアーゼを見出し、それを利用したＨｂＡ1c測定法を構築することにある。
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来するアマドリアーゼに数個のアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼが、多種多様な糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる活性を有することを見出し、それを利用したＨｂＡ1c測定法を実現して本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下を包含する。
[１] 以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法。
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[２] (a)〜(f)のいずれか１以上を含む試料に、(a)〜(f)のいずれか１以上のα−フルクトシルペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルペプチドの測定方法。
（ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
（ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
（ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
（ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
（ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
（ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[３] 試料がさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を含み、アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）に作用するものであり、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素も測定することを特徴とする、[１]または[２]に記載の方法。
[３−２] 試料がさらにα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を含み、アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）に作用するものであり、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素も測定することを特徴とする、[３]に記載の方法。
[４] 試料をプロテアーゼで処理して、以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を含むα−フルクトシルオリゴペプチドを遊離させ、これに遊離したα−フルクトシルオリゴペプチドのいずれか１以上を酸化するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[５] 試料をプロテアーゼで処理して、(a)〜(f)のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを遊離させ、遊離した(a)〜(f)のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを酸化するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
（ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
（ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
（ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
（ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
（ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
（ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[６] 試料をプロテアーゼで処理することによりさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）が遊離し、アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）に作用するものであり、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素も測定することを特徴とする、[４]または[５]に記載の方法。
[６−２] 試料をプロテアーゼで処理することによりさらにα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）が遊離し、アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）に作用するものであり、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素も測定することを特徴とする、[６]に記載の方法。
[７] アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、[１]〜[６]のいずれかに記載の測定方法。
[８] アマドリアーゼがコニオカエタ エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)由来である、[１]〜[６]のいずれかに記載の測定方法。
[９] アマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、[１]〜[６]のいずれかに記載の測定方法。
(i) 配列番号１４１に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
[１０] さらに、α−フルクトシルバリンまたはα−フルクトシルバリルヒスチジンを酸化するアマドリアーゼを用いる、[１]、[２]、[４]、[５]及び[７]〜[９]のいずれかに記載の方法。
[１１] 以下の成分（１）及び（２）を含むことを特徴とする、試料中のα−フルクトシルペプチド測定用試薬キット。
（１）以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
（２）過酸化水素を測定するための試薬。
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[１２] 以下の成分（１）及び（２）を含むことを特徴とする、試料中のα−フルクトシルペプチド測定用試薬キット。
（１）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
（２）過酸化水素を測定するための試薬。
（ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
（ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
（ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
（ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
（ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
（ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[１３] アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するものである、[１１]または[１２]に記載のキット。
[１３−２] アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するものである、[１３]に記載のキット。
[１４] 以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
（１）ＨｂＡ１ｃのβ鎖を加水分解し、以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を含む糖化ペプチドを遊離するプロテアーゼ、
（２）以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
（３）過酸化水素を測定するための試薬。
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[１５] 以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
（１）ＨｂＡ１ｃのβ鎖を加水分解し、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを遊離するプロテアーゼ、
（２）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
（３）過酸化水素を測定するための試薬。
（ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
（ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
（ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
（ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
（ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
（ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
[１６] （１）プロテアーゼがさらに、ＨｂＡ１ｃのβ鎖を加水分解してα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を遊離するものであり、（２）アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するものである、[１４]または[１５]に記載のキット。
[１６−２] （１）プロテアーゼがさらに、ＨｂＡ１ｃのβ鎖を加水分解してα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を遊離するものであり、（２）アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するものである、[１６]に記載のキット。
[１７] アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、[１１]〜[１６]のいずれかに記載のキット。
[１８] アマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、[１１]〜[１６]のいずれかに記載のキット。
(i) 配列番号１４１に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
[１９] 以下のαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法。
α−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジン（αＦ１７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリン（αＦ１８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギン（αＦ１９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリン（αＦ２０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルラギン酸（αＦ２１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミン酸（αＦ２２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリン（αＦ２３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシン（αＦ２４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシン（αＦ２５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミン酸（αＦ２６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニン（αＦ２７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシン（αＦ２８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシン（αＦ２９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニン（αＦ３０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニルロイシン（αＦ３１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニルロイシルロイシン（αＦ３２Ｐ）。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-222789号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明によれば、多種多様な糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる活性を有するアマドリアーゼを提供できる。このようなアマドリアーゼを用いれば、少ないプロテアーゼの処方量でＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく定量できる測定方法、測定キット、またはＨｂＡ１ｃを迅速、簡便、高精度に、かつ、高感度に定量できる測定方法、測定キットを提供できる。また、ＨｂＡ１ｃに作用するプロテアーゼのうち、切断特異性の低いものもしくは切断効率の悪いものでも使用可能となる。さらにアマドリアーゼやペルオキシダーゼに作用しにくいプロテアーゼをＨｂＡ１ｃの切断に用いることもできる。例えばプロテアーゼの処方量を低減し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖がαＦＶＨまで十分に加水分解されずに、結果として、加水分解反応の途中段階で生じる多種多様な糖化ペプチドが混在したとしても、本発明のアマドリアーゼであれば、αＦＶやαＦＶＨのみならず、幅広い糖化ペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ、例えばαＦ１Ｐ〜αＦ１６Ｐ）に作用しうるので、ＨｂＡ１ｃを高精度に定量できる。
各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性を例示する１番目の図である。Co（Coniochaeta sp.）、Et（Eupenicillium terrenum）、Py（Pyrenochaeta sp.）、Ar（Arthrinium sp.）、Cc（Curvularia clavata）、Nv（Neocosmospora vasinfecta）のほか、Cn（Cryptococcus neoformans）、Pn（Phaeosphaeria nodorum）、An（Aspergillus nidulans）、En（Emericella nidulans）、Ul（Ulocladium sp.）及びPj（Penicillium janthinelum）をアライメントした。 図１−１のつづきである。 図１−２のつづきである。 図１−３のつづきである。 図１−４のつづきである。 各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する２番目の図である。Co、Et、Py、Ar、Cc、Nvのほか、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjをアライメントした。 図２−１のつづきである。 図２−２のつづきである。 図２−３のつづきである。 図２−４のつづきである。 本発明のアマドリアーゼを用いたαＦ３Ｐの測定結果を示す。 本発明のアマドリアーゼを用いたαＦ４Ｐの測定結果を示す。 本発明のアマドリアーゼを用いたαＦ５Ｐの測定結果を示す。 本発明のアマドリアーゼを用いたαＦ６Ｐの測定結果を示す。 本発明のアマドリアーゼを用いたαＦ８Ｐの測定結果を示す。 本発明のアマドリアーゼを用いたαＦ１６Ｐの測定結果を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
（糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c）
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
本発明における糖化ペプチドには、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド（α−フルクトシルペプチド）である。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα−糖化ペプチドは、糖化されたＮ末端を含む糖化されたペプチドを指し、特に、ＨｂＡ１ｃを定量する目的からは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドとしては、ペプチド鎖長が２のα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦＶＨ）があり、他にはペプチド鎖長が３のα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、ペプチド鎖長が４のα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、ペプチド鎖長が５のα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、ペプチド鎖長が６のα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、ペプチド鎖長が８のα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、ペプチド鎖長が１６のα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）等があげられる。便宜上、本明細書においてαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐを総称して、「αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド」または「αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）」と呼ぶ。
さらに、Ｎ末端が糖化されているヘモグロビンβ鎖から切り出される糖化されたペプチドとしては、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、および
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、が挙げられる。
便宜上、本明細書においてある範囲のα−フルクトシルペプチドを表すときは、「αＦ１Ｐ〜αＦ１６Ｐ」の如く表現することとし、これは最も鎖長の短いものから、中間的な鎖長のものも含め、最も鎖長の長いものまでの全てのα−フルクトシルペプチドを包含するものとする。例えば本明細書においてαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐを総称して「α−フルクトシルオリゴペプチド」または「α−フルクトシルオリゴペプチド（αＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐ）」と呼ぶが、これはαＦ３ＰからαＦ１６Ｐまでの全ての鎖長のα−フルクトシルペプチドを含む。同様に本明細書において「α−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ１６Ｐ）」又は「α−フルクトシルペプチド（αＦＶ〜αＦ１６Ｐ）」は、αＦＶ（αＦ１Ｐ）からαＦ１６Ｐまでの全ての鎖長のα−フルクトシルペプチドを含む。
例示すると、αＦ１Ｐ〜αＦ８Ｐ、αＦ２Ｐ〜αＦ８Ｐ、αＦ３Ｐ〜αＦ８Ｐ、αＦ２Ｐ〜Ｆ１６Ｐといった範囲も同様に規定される。
ところで１アミノ酸のみからなる化合物をペプチドと呼ぶことは一般的ではないが、本明細書ではα−フルクトシルアミノ酸であるα−フルクトシルバリン（αＦＶ）および２以上のアミノ酸残基を有する各種α−フルクトシルペプチドをまとめてα−フルクトシルペプチドと呼ぶことから、便宜上、上記のように定義し、αＦＶもα−フルクトシルペプチドに含めるものとする。
Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖は１４６アミノ酸により構成されている（配列番号１９３参照）。つまり、Ｎ末端が糖化されているヘモグロビンβ鎖から切り出される糖化されたペプチドは可能性としては、１４５残基のアミノ酸により構成されているαＦ１４５Ｐまで存在しうる。したがって１４５残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する（αＦ１４５Ｐ）。
本明細書において、とりわけαＦＶ（αＦ１Ｐ）から３２個のアミノ酸配列を有するα−糖化ペプチド（αＦ３２Ｐ）までのものを総称するときは、「α−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）」と呼ぶ。また、αＦ３ＰからαＦ３２Ｐのα−糖化ペプチドは「α−フルクトシルペプチド（αＦ３Ｐ〜αＦ３２Ｐ）」と記載する。例示すると、αＦ２Ｐ〜αＦ３２Ｐ、αＦ１６Ｐ〜αＦ３２Ｐ、αＦ１７Ｐ〜αＦ３２Ｐといった範囲も同様に記載する。なおαＦ１７Ｐ〜αＦ３２Ｐは次のとおりである。
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジン（αＦ１７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリン（αＦ１８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギン（αＦ１９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリン（αＦ２０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルラギン酸（αＦ２１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミン酸（αＦ２２Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリン（αＦ２３Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシン（αＦ２４Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシン（αＦ２５Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミン酸（αＦ２６Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニン（αＦ２７Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシン（αＦ２８Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシン（αＦ２９Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニン（αＦ３０Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニルロイシン（αＦ３１Ｐ）、
α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニルロイシルロイシン（αＦ３２Ｐ）。
これらのα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）、例えばαＦ１Ｐ〜αＦ１６Ｐ等はいずれも本発明のアマドリアーゼの基質となり得る。
ある実施形態において、本発明は、αＦ３Ｐ〜αＦ５ＰおよびαＦ７Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ３Ｐ〜αＦ５ＰおよびαＦ７Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法を提供する。
ある実施形態において、本発明は、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８ＰおよびαＦ１６Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８ＰおよびαＦ１６Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法を提供する。
ある実施形態において、本発明は、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ８ＰおよびαＦ１６Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ８ＰおよびαＦ１６Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法を提供する。
ある実施形態において、本発明は、αＦ３Ｐ、αＦ４ＰおよびαＦ５Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ３Ｐ、αＦ４ＰおよびαＦ５Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法を提供する。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。本発明のアマドリアーゼは、多様な糖化ペプチドに対して反応性を有することを特徴とする。
本発明のアマドリアーゼはαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ、例えばαＦ１Ｐ〜αＦ１６Ｐに作用する。本明細書において、アマドリアーゼがある鎖長のα−フルクトシルペプチドに作用する、とは、アマドリアーゼが、酸素の存在下で、当該鎖長のα−フルクトシルペプチドのフルクトシル基に作用し、2-ケト-Dグルコース、過酸化水素、及び当該鎖長に応じたペプチドが生じることをいう。ただしこれは当該アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のより短鎖長のα−フルクトシルペプチド、例えばαＦＶやαＦＶＨに反応することを排除するものではない。すなわち、本発明のアマドリアーゼは、ある鎖長のα−フルクトシルペプチド（例えばαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ７Ｐ、αＦ８Ｐ、αＦ９Ｐ、αＦ１０Ｐ、αＦ１１Ｐ、αＦ１２Ｐ、αＦ１３Ｐ、αＦ１４Ｐ、αＦ１５Ｐ、αＦ１６Ｐ等）に作用するのみならず、ＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のより短鎖長のα−フルクトシルペプチド、例えばαＦＶやαＦＶＨに対しても反応性を有する。
（アマドリアーゼ改変体）
本発明は、配列番号１、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、又は配列番号６２、又は配列番号８９、又は配列番号９９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき作製された、αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体を提供する。本明細書において改変体とは変異体と交換可能に用いられ、アマドリアーゼのアミノ酸配列を野生型の配列と比較したときに、一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているものをいう。ここでいう付加には挿入も包含されるものとする。このアマドリアーゼ改変体はαＦＶ及びαＦＶＨのみならず、α−フルクトシルオリゴペプチド（αＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐ）に対しても反応性を有すると考えられる。
本発明はさらに、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３又は配列番号１４５又は配列番号１４９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき、αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体を提供する。
また、本発明の知見に基づき、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来する他の野生型アマドリアーゼに基づき、αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）、さらにはαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐに対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体を取得することができる。
（Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼに基づく改変体）
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体である。このアマドリアーゼ改変体はα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）に対しても反応性を有すると考えられる。
上記のような変異体の例としては、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列を有し、かつα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）またはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼが挙げられる。
また、このような変異体の例として配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）またはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼを挙げることができる。ここで１又は数個のアミノ酸とは、全長が４００アミノ酸を超えるアミノ酸配列について言う場合は１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。また、１又は数個のアミノ酸とは、全長が２００〜４００アミノ酸の配列について言う場合は、１〜１０個、好ましくは１〜７個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸以上、２００アミノ酸未満の配列について言う場合は、１〜５個、好ましくは１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸未満の配列について言う場合は、１又は２個のアミノ酸をいう。
また、このような変異体の例として、１５２、配列番号１５４、配列番号１５６（一重変異体）、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４（二重変異体）、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４（三重変異体）、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１７６、配列番号１９０（四重変異体）、配列番号１７８、配列番号１８０（五重変異体）、配列番号１４４、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９２（六重変異体）、配列番号１４２又は配列番号１８６（七重変異体）に示す塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、かつかつα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）またはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼを挙げることができる。ここでストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションはSambrookら, Molecular Cloning第２版、（Cold Spring Harbor Laboratory press）やCurrent protocols in molecular biology（Frederick M. Ausubel ら, 編, 1987）等に記載されている。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、6〜10×SSC(0.15〜1.5M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベートし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。また別のストリンジェントな条件において、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
なお、本発明の変異体は、請求の範囲に記載された、基質特異性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、ピレノケータ属、アルスリニウム属、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、アスペルギルス属、エメリセラ属、ウロクラディウム属、ペニシリウム属、フザリウム属、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、レプトスフェリア属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、コニオケチジウム属、ピチア属、コリネバクテリウム属、アグロバクテリウム属、若しくはアルスロバクター属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る。ここで、アマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換とは、１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸置換をいう。好ましくは１又は複数のアミノ酸置換は１、２、３、４、５、６、又は７つのアミノ酸置換である。
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
上記Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）において、好ましくは、（ａ）６２位のアルギニンは、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンは、ヒスチジン又はアラニンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸は、リジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のグルタミンはロイシン又はチロシンへと置換される。好ましくは（ｆ）１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｇ）３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のアラニンはリジンへと置換されていてもよい。
Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（PnFX、配列番号３８）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のセリン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグリシン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５１位のアラニン
（ｈ）４１６位のセリン
上記Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（配列番号３８）において、好ましくは（ａ）６２位のセリンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンは置換されなくともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグリシンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５１位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１６位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（NvFX、配列番号５４）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のグリシン
（ｅ）１１０位のグルタミン酸
（ｆ）１１３位のリジン
（ｇ）３５５位のセリン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（配列番号５４）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミン酸はロイシンへと置換される。場合により１１３位のリジンは置換されなくともよい。場合により３５５位のセリンは置換されなくともよい。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（AnFX、配列番号６２）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のグリシン
（ｅ）１０９位のリジン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（配列番号６２）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンと置換される。好ましくは（ｄ）１０５位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１０９位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（配列番号４０）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のグリシン
上記EFP-T5由来アマドリアーゼ（配列番号４０）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のグリシンはリジンへと置換されてもよい。
Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９又は１４９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のイソロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のセリン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（CnFX、配列番号８９又は１４９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のイソロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のセリンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
上記Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアラニン
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５６位のアラニン
（ｈ）４２１位のアラニン
上記Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５６位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２１位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（Cc95FX、配列番号９９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のセリン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（配列番号９９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のリジン
（ｅ）１０９位のアルギニン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンへと置換される。場合により（ｄ）１０５位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは１０９位のアルギニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
上記Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のアスパラギン酸
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のセリン
上記Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、好ましくは
αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド、具体的にはαＦＶ及びαＦＶＨ並びに以下の(a)〜(f)の糖化ペプチド、
（ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
（ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
（ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
（ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
（ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
（ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
のいずれか１以上を基質として認識し、
作用として（ａ）〜（ｆ）のいずれか１以上を酸化して過酸化水素を生成し、
至適ｐＨ範囲をｐＨ６〜８の範囲に有し、
作用ｐＨ範囲をｐＨ５〜９の範囲に有し、
作用温度が２５〜４０℃であり、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量が約４５〜５５ＫＤａ、例えば約４８〜５０ＫＤａであるものであり得る。
本発明のアマドリアーゼ変異体又は改変体からは、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐに対する活性をほとんど又は全く示さないアマドリアーゼ、例えば配列番号１、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは除くものとする。本発明のアマドリアーゼ変異体又は改変体からは、野生型アミノ酸配列への復帰変異体は除くものとする。
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報）が挙げられる。
また、別の好ましい例として、Phaeosphaeria属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Neocosmospora属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Aspergillus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCryptococcus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCurvularia属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びEupenicillium属由来のアマドリアーゼ遺伝子が挙げられる。
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７（国際公開第２００７／１２５７７９号）から、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Alcrich社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を、抽出、精製して得ることができる。他の生物由来のアマドリアーゼ遺伝子についても、当業者であれば慣用法により、同様の手順でＤＮＡを取得することができる。具体的には、Eupenicillium terrenum ATCC 18547株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５（国際公開第２００７／１２５７７９号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を、細胞から抽出、精製して得ることができる。また、Aspergillus nidulans FGSC A26株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Cryptococcus neoformans由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Neocosmospora vasinfecta由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを、抽出、精製して得ることができる。
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（Stratagene社製）等が好ましい。
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４〜３０、１９８９年６月号）。
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３ （１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３， ８７６５ （１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８ （１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。
また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）等を用いることにより行うことができる。
（形質転換・形質導入）
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
（アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性）
アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似（similar）と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位は相同性領域に該当しうる。
好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。
さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１または配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対して高い反応性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１４１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。
ある実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１４１のアマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる領域、好ましくは第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域、さらに好ましくは第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、
(i) 配列番号１４１に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼであるか、または
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、前記(ii)に規定される相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。
（アミノ酸に対応する位置の特定）
本発明において、あるベースとなるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置、又は相当する位置という。また、「アミノ酸の位置に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行う方法が挙げられる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６２位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では６２位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６１位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では６１位のアルギニンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６３位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では６３位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６２位のロイシンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０２位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０２位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０２位のリジン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０１位のグルタミン酸である。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１０６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０６位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０５位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０５位のグリシンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１０位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では１１０位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では、１０９位のリジンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１３位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１３位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１１２位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１３位のアスパラギン酸である。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では３５６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では３５５位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では３５１位のアラニンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１９位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では４１９位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では４１８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では４２１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では４２０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では４１６位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では４１９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では４２０位のアラニンである。
（置換の相乗効果について）
本発明のアマドリアーゼ変異体は、一重変異体であってもよいが、２以上のアミノ酸置換を有する多重変異体、例えば二重〜八重変異体であってもよい。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼのαＦ６Ｐに対する活性が増大することを見出した。特に一重、二重、三重、四重、五重、六重及び七重と変異を追加するにつれ変異体のαＦ６Ｐに対する活性が大きく増大することを見出した。実施例に示すアマドリアーゼ変異体のαＦ６Ｐに対する活性の増大からみて、これらのアミノ酸置換が相乗効果を有することは明らかである。また、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置のアミノ酸置換の種々の組合せが同様にαＦ６Ｐに対する活性の増大をもたらす、と当業者であれば理解する。
さらに、本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、及び３５５位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼがαＦＶ及びαＦＶＨのみならず、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐに対しても活性を示すことを見出した。このことから配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、及び３５５位に対応する位置のアミノ酸を同様に置換したCo、Et、Py、Ar、Cc、Nv、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjなどの他の株由来の変異体も、同様にαＦＶ及びαＦＶＨのみならずαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐに対して活性を示すと考えられる。また、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、及び３５５位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼがαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ及びαＦ１６Ｐに対して活性を示すことから、当該アマドリアーゼは、種々のα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ１６ＰやαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）に対しても活性を示すと考えられる。
（予備的な置換について）
アマドリアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これをグリシンへと置換することによって、置換前にαＦＶＨ活性を示さなかった酵素が、置換後にαＦＶＨ活性を示すようになることが報告されている（特開２０１０−３５４６９号公報、国際公開第２０１２／０１８０９４号参照）。したがって、本発明に用いるアマドリアーゼの配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これを予めグリシンへと置換しておくこともできる。あるいは、野生型において配列番号１の６０位に対応する位置がグリシンであるアマドリアーゼを用いて、上記配列番号１の第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置に変異を導入してもよい。本発明のアマドリアーゼ変異体は、特に断らない限り、配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであるものを包含する。例えば、Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼは、配列番号１の６０位に対応する配列番号１４７中の第５９位のアミノ酸が野生型ではセリンであるが、これをグリシンに置換したもの（配列番号６２）を本発明の変異体のための基となるアマドリアーゼとして用いてもよい。Penicillium janthinellum(Pj)由来アマドリアーゼ（配列番号１２３）についても同様である。
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
すなわち、本発明は、基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼの製造方法を提供する。この方法には、本発明のアマドリアーゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここでアマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件とは、アマドリアーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化タンパク質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のアマドリアーゼを得ることができる。
（本発明のアマドリアーゼの反応性の向上）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較してα−フルクトシルオリゴペプチド（αＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐ）またはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド（αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、及びαＦ１６Ｐ）に対する反応性が向上していることを特徴とする。本発明においてα−フルクトシルオリゴペプチドまたはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチドに対する「反応性が向上している」とは、具体的には、改変前のものと比較して、「α−フルクトシルオリゴペプチドに対する反応性」または「αＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチドに対する反応性」が増大していることをいう。なお、「αＦＶＨに対する反応性」は「αＦＶＨ酸化活性」、「αＦＶＨ活性」と表記することもある。αＦＶ等についても同様である。
プロテアーゼ使用量を低減するため、または切断特異性の高いプロテアーゼによらずともＨｂＡ１ｃを測定できるようにするため、あるいはαＦＶＨまで完全にプロテアーゼによる分解が進行しなくともＨｂＡ１ｃを定量できるようにするためには、αＦＶＨのみならずαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、αＦ１６Ｐなどといったα−フルクトシルペプチドに対しても作用しやすいアマドリアーゼを取得することが必要となる。
本発明のアマドリアーゼに関し、αＦＶＨに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合をαＦ６Ｐ／αＦＶＨと表す。αＦ３Ｐ／αＦＶＨ、αＦ４Ｐ／αＦＶＨ、αＦ５Ｐ／αＦＶＨ、αＦ８Ｐ／αＦＶＨ、αＦ１６Ｐ／αＦＶＨについても同様である。他のα−フルクトシルオリゴペプチドについても同様である。
また、本発明のアマドリアーゼに関し、αＦＶに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合をαＦ６Ｐ／αＦＶと表す。なお、「αＦＶに対する反応性」は「αＦＶ酸化活性」と表記することもある。αＦ３Ｐ／αＦＶ、αＦ４Ｐ／αＦＶ、αＦ５Ｐ／αＦＶ、αＦ８Ｐ／αＦＶ、αＦ１６Ｐ／αＦＶについても同様である。また他のα−フルクトシルオリゴペプチドについても同様である。
αＦＶＨに対する反応性に対するαＦ６Ｐに対する反応性の割合（αＦ６Ｐに対する反応性とαＦＶＨに対する反応性との比）は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、ｐＨ６．５において、１ｍＭのαＦ６Ｐを添加して測定した活性を、１ｍＭのαＦＶＨを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶＨに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。また、例えば、ｐＨ６．５において、１ｍＭのαＦ６Ｐを添加して測定した活性を、１ｍＭのαＦＶを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。αＦ３Ｐ／αＦＶＨ〜αＦ１６Ｐ／αＦＶＨやαＦ３Ｐ／αＦＶ〜αＦ１６Ｐ／αＦＶについても同様である。
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦＶに対する比活性（U/mg）が1.0以上、5.0以上、10以上、例えば13以上である。ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦＶＨに対する比活性（U/mg）が1.0以上、1.5以上、例えば1.90以上である。ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦ３Ｐに対する比活性（U/mg）が1.0以上、例えば1.20以上である。ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦ４Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1以上、0.2以上、0.3以上、例えば0.35以上である。ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦ５Ｐに対する比活性（U/mg）が1.0以上、2.0以上、例えば2.10以上である。ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が1.0以上、2.0以上、3.0以上、4.0以上、例えば4.2以上である。ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦ８Ｐに対する比活性（U/mg）が1.0以上、例えば1.5以上である。ある実施形態において本発明のアマドリアーゼはαＦ１６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1以上、0.2以上、例えば0.24以上である。
本発明のアマドリアーゼの一例としては、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。該アマドリアーゼは、αＦＶ及びαＦＶＨに反応するのみならず、改変前のものと比較してαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ及びαＦ１６Ｐに対する反応性が向上している。このような改変されたアマドリアーゼは、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼのような切断特異性の高いプロテアーゼを用いずとも、種々の長さのα−フルクトシルオリゴペプチドを生じる切断特異性の低いプロテアーゼでＨｂＡ１ｃを処理することで生じるα−フルクトシルオリゴペプチドまたはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチドを測定することによりＨｂＡ１ｃ定量を実現できる。すなわち、幅広いプロテアーゼがＨｂＡ１ｃ定量に利用可能となり、産業利用上非常に有利である。また切断特異性が低く、切断効率が高いプロテアーゼを使用し、αＦＶＨまで完全に分解が進行しなくとも、該アマドリアーゼ（CFP-T7-H35）はαＦＶ及びαＦＶＨに反応するのみならず、α−フルクトシルペプチド（αＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐ）にも反応することから、精度よくＨｂＡ１ｃ定量を行うことができる。この際、プロテアーゼの使用量を低減することもでき、それにより他のタンパク質試薬に対するプロテアーゼの望ましくない反応を回避できる。
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りの無い限り、αＦＶ、またはαＦＶＨ、またはαＦ３Ｐ、またはαＦ４Ｐ、またはαＦ５Ｐ、またはαＦ６Ｐ、またはαＦ８ＰまたはαＦ１６Ｐを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＶ、またはαＦＶＨ、またはαＦ３Ｐ、またはαＦ４Ｐ、またはαＦ５Ｐ、またはαＦ６Ｐ、またはαＦ８ＰまたはαＦ１６Ｐをを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。αＦ７Ｐ、αＦ９Ｐ〜αＦ１５Ｐ、αＦ１７Ｐ〜αＦ３２Ｐも同様に活性測定に使用でき、その酵素量(Ｕ)も同様に定義される。
また、比活性（U/mg）は、酵素1mg当たりの酵素力価（U）である。
αＦＶ、αＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報参照）。また、合成基質として提供されるαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８ＰおよびαＦ１６Ｐ（全てペプチド研究所製）を用いることができる。αＦ７Ｐ、αＦ９Ｐ〜αＦ１５Ｐ、αＦ１７Ｐ〜αＦ３２Ｐも同様に合成基質を入手するなどして調製しうる。
Ａ：試薬の調製
（アマドリアーゼ活性の測定用試薬の調製例）
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、０．４９ｍＭ ４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．５
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
（試薬２）：１５ｍＭ ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（試薬３）：基質溶液（３０ｍＭ； 終濃度１ｍＭ）
αＦＶ（キッコーマン社製） ８３．８ｍｇ、若しくはαＦＶＨ（キッコーマン社製） １２５ｍｇ、若しくはαＦ３Ｐ（ペプチド研究所製） １５９ｍｇ、若しくはαＦ４Ｐ（ペプチド研究所製） １８９ｍｇ、若しくはαＦ５Ｐ（ペプチド研究所製） ２１８ｍｇ、若しくはαＦ６Ｐ（ペプチド研究所製） ２５７ｍｇ、若しくはαＦ８Ｐ（ペプチド研究所製） ３３４ｍｇ、若しくはαＦ１６Ｐ（ペプチド研究所製） ５７０ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。αＦ７Ｐ、αＦ９Ｐ〜αＦ１５Ｐ、αＦ１７Ｐ〜αＦ３２Ｐも同様に合成基質を入手するなどして調製し、試薬３に含めうる。
Ｂ：活性測定法
（アマドリアーゼ活性の測定方法の例）
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定する。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定する。３７℃で１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(Ｕ)とし、下記の式に従って算出する。
活性(U/ml)＝｛(ΔAs−ΔA0)×3.0×df｝÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数
（α−フルクトシルオリゴペプチドを含む測定用試料の調製）
ある実施形態において、本発明の測定法では、糖化蛋白質由来のα−フルクトシルオリゴペプチドを含む試料にアマドリアーゼ（α−フルクトシルペプチドオキシダーゼ）を作用させ、その作用による生成物又は消費物を測定する。ＨｂＡ１ｃ等の糖化蛋白質の測定を目的として、測定対象の糖化蛋白質からα−フルクトシルオリゴペプチドを切り出すための好適な方法としては、プロテアーゼやペプチダーゼを用いた消化が挙げられる。プロテアーゼまたはペプチダーゼとしては、臨床検査に使用が可能で、ＨｂＡ１ｃのβ鎖（１４６アミノ酸残基、配列番号１９３）から、少なくとも１種以上のα−フルクトシルオリゴペプチド（αＦＶ〜αＦ１４５Ｐ）を有効に切り出し得るものであれば、いかなるプロテアーゼを用いても良い。ＨｂＡ１ｃのβ鎖から、少なくとも１種以上のα−フルクトシルオリゴペプチド（αＦＶＨ〜αＦ１４５Ｐ）を切り出し得るプロテアーゼの例としてはエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｖ８プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＰ、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン、カルボキシペプチダーゼ、キモトリプシン、ディスパーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン、アミノペプチダーゼ等のプロテアーゼあるいはペプチダーゼ等、特開2005-110657の表１に記載の各種プロテアーゼ、例えばアスペルギルス由来のIP酵素（キッコーマン）、AOプロテアーゼ（キッコーマン）、ペプチダーゼ（キッコーマン）、プロテアーゼA5（協和化成）、ウマミザイム（天野）、プロテアーゼＡ（天野）、プロテアーゼＭ（天野）、プロテアーゼＰ（天野）、スミチームＭＰ（新日本化学工業）、スミチームLP-20（新日本化学工業）、プロテイナーゼ６（フルカ）；リゾパス由来のペプチダーゼR（天野）；バチルス由来のディスパーゼ（ロシュ）、プロテイナーゼＮ（フルカ）、プロテイナーゼTypeVII（シグマ）、プロテイナーゼBacterial Subtilisin（フルカ）、プロテアーゼＮ（天野）、プロテアーゼＳ（天野）、プロテイナーゼTypeX（シグマ）、サーモリシン（大和化成）、プロナーゼＥ（科研化学）、中性プロテアーゼ（東洋紡）；ストレプトマイセス由来のプロナーゼ（べーリンガー）、プロテイナーゼTypeXIV（シグマ）、アルカリプロテアーゼ（東洋紡）；トリチラチウム由来のプロテイナーゼＫ（ロシュ）、プロテイナーゼＫ（和光）；パパイヤ由来のパパイン（ロシュ）、パパイン（和光）、パパイン（シグマ）、パパインW40（天野）、パパイン（アサヒ）；イチジク由来のフィシン（シグマ）；ブタ膵臓由来のパンクレアチン（和光）；及びウシ脾臓由来のカテプシンＢ（シグマ）等が挙げられるが、これらに限られない。また適当なプロテアーゼを２以上組み合わせてもよい。
試料のプロテアーゼ処理またはペプチダーゼ処理の条件は、用いるプロテアーゼが測定対象の糖化蛋白質に作用し、α−糖化ヘキサペプチドを短時間に効率よく遊離する条件であれば、いかなる条件でもよい。使用するプロテアーゼの量は、試料中に含まれるＨｂＡ１ｃの含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、プロテアーゼを、終濃度が０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍＬとなるように加える。さらに必要により適宜他のプロテアーゼを加えてもよい。プロテアーゼで処理する際のｐＨは、無調整でもよく、使用するプロテアーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ３〜８に調整してもよい。処理温度は、例えば、２０〜５０℃で行ってもよく、用いる酵素によっては、より高温域の４５〜７０℃で行ってもよい。この際の処理時間は、ＨｂＡ１ｃを分解するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間〜１８０分間、好ましくは１〜６０分間、さらに好ましくは１〜１０分間で行うことができる。得られる処理液を、そのまま、あるいは必要により適宜、加熱、遠心分離、濃縮、希釈等を行ったのち、α−フルクトシルオリゴペプチドを含む試料として糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの反応に供する。
（遊離させたα−フルクトシルペプチドの測定）
上記のα−フルクトシルペプチドを含む試料に、本発明の測定法に使用するアマドリアーゼ（α−フルクトシルペプチドオキシダーゼ）を作用させる。α−フルクトシルオリゴペプチドの切り出しとα−フルクトシルペプチドオキシダーゼの作用の時期は連続的でも、同時でも、切り出しを終了してからα−フルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させてもよい。α−フルクトシルペプチドに対するα−フルクトシルペプチドオキシダーゼの作用時間は例えば、５秒以上、１０秒以上、又は２０秒以上、１８０分未満又は１５０分未満、例えば０．５〜１２０分間、好ましくは０．５〜６０分間、より好ましくは１〜３０分間とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中の糖化ヘキサペプチドを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。α−フルクトシルペプチドオキシダーゼ作用時間を０．５〜６０分間、より好ましくは１〜３０分間、さらに好ましくは１〜１０分間とすることにより、迅速かつ良好にα−フルクトシルペプチドを測定することができる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
本発明に使用するアマドリアーゼ（α−フルクトシルペプチドオキシダーゼ）の好適な使用量は、試料溶液中に含まれるα−フルクトシルペプチドの量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍＬとなるように添加すればよい。作用させる際のｐＨは、α−フルクトシルペプチドオキシダーゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように緩衝剤を用いて調整することが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。例えば、ｐＨ３〜１１、特に好ましくはｐＨ５〜９、例えばｐＨ６〜８である。
本発明の測定方法においては、酵素や試薬の安定化や反応性向上等の目的でｐＨを調節及び／又は維持するため、必要により適宜、各種の緩衝剤を使用することが好ましい。使用可能な緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤等として、界面活性剤（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、１−ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ−１００、ブリッジ３５、ツイーン８０、コール酸塩、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、トレハロースＣ８、トレハロースＣ１０、トレハロースＣ１２、トレハロースＣ１４、トレハロースＣ１６、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０、ヘキサデシルピリジニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ノニルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、へキシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ−システイン等）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
ある実施形態において本発明は、アマドリアーゼ（α−フルクトシルペプチドオキシダーゼ）の作用による生成物又は消費物を測定することによりα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ、例えばαＦ１Ｐ〜αＦ１６Ｐ）を測定する方法を提供するが、測定が容易な生成物であり、測定対象として好ましいものとして過酸化水素が挙げられる。α−フルクトシルペプチドオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素は、発色基質等によって検出してもよく、本発明に用いられる発色基質としては、４−アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム）、ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３、７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノシアジン）、ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４、４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４−アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ−６４、ＤＡ−６７は４−アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。過酸化水素の測定は、一般に、過酸化水素を生成する工程と同時に行うことが好ましく、α−フルクトシルペプチドオキシダーゼの作用時と同時に進行させることが好ましい。また、測定する消費物としては、溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。
本発明においては、上述のアマドリアーゼ（α−フルクトシルペプチドオキシダーゼ）と過酸化水素の測定用試薬、それに所望により緩衝剤等を添加したα−フルクトシルペプチドまたはＨｂＡ１ｃ測定用試薬を得ることができる。この試薬中には、各種既知の成分、例えば、界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加することができる。上述の本発明の測定用試薬は、各試薬を異なる容器に含むものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供することもできる。また、これらの測定用試薬は、乾燥物又は溶解した状態で用いてもよく、薄膜上の担体、例えば、シート含浸性の紙等に含浸させて用いてもよい。また、測定用試薬に用いられる酵素類は、常法により固定化させて反復使用することもできる。本発明の測定用試薬は、糖化蛋白質からα−フルクトシルペプチドを切り出すためのプロテアーゼを組み込んだ試薬キットの一部を構成することができる。
本発明の測定用試薬の仕様や使用条件は、その含有成分等に応じて最適なものを選択すればよいが、例えば、測定を２０〜４５℃において行うよう設定することができる。測定に要する時間も種々の測定条件により適宜選択できるが、例えば、０．５〜６０分間、好ましくは、０．５〜３０分間、さらに好ましくは１〜１０分間が好ましい。例えば、上記測定試薬の発色の程度（吸光度変化量）を分光光度計により測定し、標準の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化ペプチドあるいは糖化蛋白質を測定することができる。測定には、通常の自動分析装置を用いることもできる。
（ＨｂＡ１ｃの定量）
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法は、定性的であってもよいが、定量的な測定方法とすることもできる。ここでＨｂＡ１ｃの定量的測定方法とは、試料中のＨｂＡ１ｃの濃度を決定する方法をいう。すなわち本発明の一実施形態は、アマドリアーゼ変異体を使用することを含む、試料中のＨｂＡ１ｃの定量法を提供する。この定量法は、ＨｂＡ１ｃ由来のα−フルクトシルペプチドを含む試料と本発明のアマドリアーゼを接触させる工程、及び該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃ由来α−フルクトシルペプチドに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程を含む。ここで該定量法について用いる接触とは、本発明のアマドリアーゼがα−フルクトシルペプチドの酸化反応を触媒しうるように、該アマドリアーゼを試料と物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とα−フルクトシルペプチドを混合する場合のみならず、固相担体に担持された本発明のアマドリアーゼにα−フルクトシルペプチドを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。この定量法はまた、ＨｂＡ１ｃを適当なプロテアーゼで処理しα−フルクトシルペプチドとする工程を含みうる。プロテアーゼは切断特異性の高いものであってもよく、また、切断特異性の低いものであってもよい。
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に用いる試料は、糖化ヘモグロビンを含む可能性のあるあらゆる生物学的試料、例えば血液、体液、リンパ液等に由来する試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。
用いるアマドリアーゼ変異体の酵素量及び反応時間（作用時間）を一定とし、ＨｂＡ１ｃの量を変化させた場合に、ＨｂＡ１ｃの量が減少するにつれて、検出される発光基質の吸光度も比例的に減少するＨｂＡ１ｃ濃度範囲を調べることで、当該アマドリアーゼを用いた場合の検出可能な最低ＨｂＡ１ｃ濃度を決定することができる。この濃度を本明細書において検出限界濃度ということがある。本発明のＨｂＡ１ｃ定量法では、ＨｂＡ１ｃの検出限界が、測定試料中のαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド濃度又は血中糖化ヘモグロビン濃度よりも低くなるように酵素量及び反応時間を設定することが好ましい。
本発明のＨｂＡ１ｃ定量的測定では、予め、濃度既知のＨｂＡ１ｃまたはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチドを含む対照の吸光度等の測定値から最小二乗法などの回帰分析を行うことによって検量線を作成しておくこともできる。作成した検量線に対し、ＨｂＡ１ｃまたはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド濃度が未知である試料の測定値をプロットすることで、当該試料中のＨｂＡ１ｃまたはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチド濃度を定量できる。
本発明者らは、Coniochaeta由来アマドリアーゼ変異体、例えば本発明のアマドリアーゼ２５（CFP-T7-H35）がαＦＶ及びαＦＶＨのみならず、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８ＰおよびαＦ１６Ｐにも反応することを示した。こうした知見に基づき、αＦ６Ｐに対する良好な活性を示す他の本発明のアマドリアーゼ変異体も同様にαＦＶ及びαＦＶＨのみならず種々の鎖長のα−フルクトシルペプチド（αＦＶ〜αＦ１６Ｐ）に活性を示すと考えられる。こうしたα−フルクトシルペプチド（αＦＶ〜αＦ１６Ｐ）に活性を示すアマドリアーゼにより、切断特異性の低いプロテアーゼもＨｂＡ１ｃ定量測定に使用可能となる。また、当業者であればそのような定量的測定のための酵素量（酵素濃度）、反応時間等の条件を適宜設定することができる。
これまでにＨｂＡ１ｃ定量測定のために、ＨｂＡ１ｃをまずプロテアーゼで切断し、αＦＶＨを生じ、次いでαＦＶＨに反応するアマドリアーゼを用いる方法が開発されている（特許文献１〜７）。しかしながらプロテアーゼによる加水分解反応の反応速度は基質濃度に依存するため、ＨｂＡ１ｃの大部分が加水分解されると、プロテアーゼの反応速度は低下する。したがって、従来のＨｂＡ１ｃの測定ではαＦＶＨまで加水分解されない糖化ペプチドも残存している可能性がある。本発明のアマドリアーゼはαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルペプチドに活性を示すため、これを用いるとαＦＶＨ等まで加水分解されずに残存したＨｂＡ１ｃβ鎖に由来するαＦＶ及びαＦＶＨのみならず種々の鎖長のα−フルクトシルペプチド（αＦ３Ｐ〜αＦ３２Ｐ、例えばαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐ）も同時に定量可能となり、プロテアーゼ処方量を低減でき、アマドリアーゼによるＨｂＡ１ｃ測定を高感度化できる。
ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ定量的測定では、測定される試料中のＨｂＡ１ｃ由来α−フルクトシルペプチドの主成分はαＦＶＨであるが、αＦＶＨまで完全にプロテアーゼによる分解が進行していないためにαＦ３Ｐ〜αＦ３２Ｐ、例えばαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐなど種々の鎖長のα−フルクトシルペプチドも少量存在してよい。本発明のアマドリアーゼはこのような種々の鎖長のα−フルクトシルペプチドにも作用するため、ＨｂＡ１ｃ定量測定が可能である。ここで、主成分がαＦＶＨである、とは、種々の鎖長のα−フルクトシルペプチドのうち、αＦＶＨが５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上を占めることをいう。
別の実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ定量的測定では、測定される試料中のα−フルクトシルペプチドは主成分がαＦ３Ｐ〜αＦ３２Ｐ、例えばαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐである。このような試料であってもＨｂＡ１ｃを切断する種々のプロテーゼのうち、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端からαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ８Ｐ、またはαＦ１６Ｐを特異的に生じるものを本発明のアマドリアーゼと組み合わせることによりＨｂＡ１ｃを定量できる。本発明のアマドリアーゼはα−フルクトシルペプチド（αＦ３Ｐ〜αＦ３２Ｐ）にも作用するからである。このように、本発明はＨｂＡ１ｃ定量に利用可能な試料の幅を広げ、ＨｂＡ１ｃ定量に応用可能なプロテアーゼの幅を広げる。
（スクリーニング方法）
ある実施形態において、上記の測定方法を用いて、あるアマドリアーゼがα−フルクトシルペプチド（例えばαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ、さらにはαＦ１Ｐ〜αＦ６４Ｐ、αＦ１Ｐ〜αＦ１２８Ｐ、αＦ１Ｐ〜αＦ１４５Ｐ等）に反応するか否か、決定することができる。候補となるアマドリアーゼとしては、種々の天然アマドリアーゼまたはそれらの改変体、例えばαＦＶ活性を有するアマドリアーゼ、αＦＶＨ活性を有するアマドリアーゼ、αＦ６Ｐ活性を有するアマドリアーゼ、α−フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼまたはそれらの改変体、例えば上記の（アマドリアーゼの改変体）に記載のものが挙げられる。スクリーニングは96ウェルプレート等を用いて多数の候補を一度に処理しハイスループットにて迅速に行うことができる。候補アマドリアーゼが適当な鎖長のα−フルクトシルペプチド（例えばαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ）に作用するかスクリーニングすることができる。または候補アマドリアーゼについて、まずαＦＶ活性、αＦＶＨ活性、αＦ６Ｐ活性等を有するか否か一次選抜を行い、次いで当該活性を有するものについてαＦ８Ｐ〜αＦ３２Ｐに作用するか二次選抜してもよい。スクリーニングは生物試料から調製した粗酵素抽出液またはその精製物について行うことができる。また、α−フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼの遺伝子を慣用法により取得し、遺伝子組換技術を用いて酵素を製造し、これを選抜に用いてもよい。慣用法とは、α−フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼを精製し、そのアミノ酸配列を決定し、その配列情報を元にPCR用プライマーを設計して遺伝子を取得する方法や、公知のアマドリアーゼの配列情報を基にPCR用プライマーを設計してある生物のゲノムライブラリーやcDNAライブラリーから遺伝子を取得する方法が挙げられるがこれに限らない。上記の（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）も参照されたい。取得したアマドリアーゼ遺伝子について慣用の遺伝子組換技術を用いて適当な変異を導入し、得られた変異体が目的のα−フルクトシルペプチド（例えばαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ、さらにはαＦ１Ｐ〜αＦ６４Ｐ、αＦ１Ｐ〜αＦ１２８Ｐ、αＦ１Ｐ〜αＦ１４５Ｐ等）に作用するか調べることができる。また、取得したアマドリアーゼ遺伝子について遺伝子組換技術を用いて適当な変異を導入して鎖長の長いα−フルクトシルペプチド、例えばαＦ６Ｐに対する活性を示す改変体を作製し、次いでこれがより長い鎖長のα−フルクトシルペプチド（例えばαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ、さらにはαＦ１Ｐ〜αＦ６４Ｐ、αＦ３Ｐ〜αＦ１２８Ｐ、αＦ３Ｐ〜αＦ１４５Ｐ等）に作用するか調べることもできる。こうした改変体の作製に当たっては、配列番号１のアミノ酸配列の（ａ）６２位に対応する位置のアミノ酸を、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸へと置換すること、（ｂ）６３位に対応する位置のアミノ酸をヒスチジン又はアラニンへと置換すること、（ｃ）１０２位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること、（ｄ）１０６位に対応する位置のアミノ酸をアラニン、リジン、又はアルギニンへと置換すること、（ｅ）１１０位に対応する位置のアミノ酸をロイシン又はチロシンへと置換すること、（ｆ）１１３位に対応する位置のアミノ酸をリジン又はアルギニンへと置換すること、（ｇ）３５５位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、および／または（ｈ）４１９位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換することを参考にしてもよいが、導入する変異はこれに限られず、これに基づいてさらなる変異を導入したり、ランダムな突然変異を導入する手法を用いることもできる。変異導入と活性の確認を複数回繰り返し、よりα−フルクトシルペプチド（例えばαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐ、さらにはαＦ１Ｐ〜αＦ６４Ｐ、αＦ１Ｐ〜αＦ１２８Ｐ、αＦ１Ｐ〜αＦ１４５Ｐ等）に対する活性の高い変異体を取得することもできる。上記の（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）も参照されたい。
本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットには、上述のα−フルクトシルペプチド測定用試薬に加え、切り出し用プロテアーゼまたはペプチダーゼ、さらに、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを包含してもよい。ＨｂＡ1ｃを酵素法により測定することを目的とした、各種の試薬やキットに用いられている技術を、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットに適宜用いることができる。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの調製
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを得た。
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）を得た。
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
（４）αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶの測定
上述のＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１を含む酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表１に示す。
Figure 2015060431
表１に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７は、αＦＶ酸化活性およびαＦＶＨ酸化活性は示したが、αＦ６Ｐ酸化活性は示さなかった。これにより、ＣＦＰ−Ｔ７はα−フルクトシルジペプチドに極めて特異性が高く、α−フルクトシルヘキサペプチドには作用しないことがわかった。
一方、変異体ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１は、αＦＶ、αＦＶＨ酸化活性に加えて、αＦ６Ｐ酸化活性も示した。
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７に対しＲ６２Ａのアミノ酸置換を導入することにより、ＣＦＰ−Ｔ７に新たにαＦ６Ｐ酸化活性を付与することができ、αＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１ ＤＮＡを鋳型として、配列番号５〜８のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換され、かつ１１０位のグルタミンがロイシン、またはフェニルアラニン、若しくはチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４）を得た。
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表２に示す。
Figure 2015060431
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４は、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１と比較して、αＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）がさらに増大していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２ ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、配列番号９〜１２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、かつ６２位のアルギニンがアスパラギン、またはアスパラギン酸、またはグルタミン、若しくはグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｑ、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｅ）を得た。
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｑ、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｅを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｑ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｅ）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性比率は表３の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、またはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表４の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２よりも大幅にαＦ６Ｐ酸化活性が向上し、αＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３〜２４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに６４位のアルギニンがアラニン、またはグルタミン酸、若しくはヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ７、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ８、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ９）、および、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１０６位のアスパラギン酸がアラニン、またはリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２）、及び、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４）を得た。
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ７、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ８、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ９、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ７、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ８、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ９、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表５の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６よりも全て大幅にαＦ６Ｐ酸化活性比率が向上し、一部のものでは飛躍的に向上した。
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表６の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、表６に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６よりもαＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が大幅に向上していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１ ＤＮＡを鋳型として、配列番号２１〜２４のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１）を得た。
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表７の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１は、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０ ＤＮＡを鋳型として、配列番号２５〜２９のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに６３位のロイシンがアラニン、またはアスパラギン酸、またはヒスチジン、若しくはリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２５、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２７）を得た。
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２５、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２７を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２５、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２７）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表８の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、表８に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、またはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、若しくはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表９の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、表９に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６ ＤＮＡを鋳型として、配列番号３０〜３３のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに１０２位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８）、および配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに４１９位のアラニンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９）を得た。
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、又はｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１０の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、表１０に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、又はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、若しくはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１１の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、表１１に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、及びＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８ ＤＮＡを鋳型として、配列番号３４〜３５のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに３５５位のアラニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）を得た。
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して改変型アマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１２の通りとなった。
Figure 2015060431
すなわち、表１２に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、１０のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ）を得た。続いて、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を作製した。
［実施例２］
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Coniochaeta属由来改変型アマドリアーゼの生産および精製）
Coniochaeta属由来の野生型アマドリアーゼ、および上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地１２０ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液２４ｍｌを調製した。
調製した粗酵素液を１．３５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１２ｍｌのＢｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃ樹脂（東ソー社製）に吸着させ、次に１２０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて８４ｍｌの１．０５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着していたアマドリアーゼを溶出させ回収した。
得られたアマドリアーゼを含む粗酵素液を透析チューブ（Spectra/Por MWCO: 12,000-14,000）に移し、１０倍量の５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析する操作を三度繰り返し、アマドリアーゼを含む粗酵素液から（ＮＨ４）２ＳＯ４を完全に除去した。続いて、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥヘルスケア社製）にアマドリアーゼを含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に含まれるＮａＣｌ濃度を０ｍＭから１６０ｍＭまで直線的に増加させることにより、樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られたアマドリアーゼ活性を示す画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１、およびｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５の精製標品とした。
（Aspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
配列番号３６はAspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＦＡＯＡｏ２と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３７）を挿入した組換え体プラスミド（以降ｐＵＣ１９−ＦＡＯＡｏ２と称する）を大腸菌ＤＨ５αで発現させることにより、ＦＡＯＡｏ２が生産され、ＦＡＯＡｏ２がフルクトシルヘキサペプチドに対して作用することが示されている（国際公開第２００８／１０８３８５号公報参照）。
上記ＦＡＯＡｏ２生産能を有する大腸菌ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＦＡＯＡｏ２）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
調製した粗酵素液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂に吸着していたＦＡＯＡｏ２を溶出させ回収した。
得られたＦＡＯＡｏ２粗酵素液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにアプライして同緩衝液でＦＡＯＡｏ２を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＦＡＯＡｏ２の精製標品とした。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産株の作製）
配列番号３８はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＰｎＦＸと称する）のアミノ酸配列である（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８−３６６, ２０１０参照）。配列番号３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３９）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号３９の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のＰｎＦＸの配列と一致していることを確認した。
続いて、取得した配列番号３９の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋） Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ）株を得た。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
上記のようにして得られたＰｎＦＸ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
調製したＰｎＦＸの粗酵素液を前述の非特許文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８−３６６, ２０１０）記載の方法に従い、精製した。すなわち、粗酵素液を硫酸アンモニウムにより分画し、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（本実施例ではＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを用いた）により精製し、ゲルろ過クロマトグラフィー（本実施例ではＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｅｐｒｄｅｘ ２００を用いた）により精製した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＰｎＦＸの精製標品とした。
得られたＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５、およびＦＡＯＡｏ２、およびＰｎＦＸの精製標品を用いて、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１３に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ４， ２４１１−２３， １９９５参照）。
Figure 2015060431
精製したＣＦＰ−Ｔ７は、予想通り、αＦ６Ｐに対する反応を示さなかった。それに対し、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５のαＦ６Ｐに対する比活性はそれぞれ０．０１８Ｕ／ｍｇ、０．８５０Ｕ/ｍｇ、０．７９５Ｕ/ｍｇ、４．２７Ｕ／ｍｇであり、宿主である大腸菌由来のプロテアーゼ／ペプチダーゼの影響を排除した測定方法においても、αＦ６Ｐに対する十分に高い反応性が示された。
また、既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼである、ＦＡＯＡｏ２（国際公開第２００８／１０８３８５号参照）、およびＰｎＦＸ（国際公開第２０１１／１５３２６号参照、該当文献中ではＰ．ｎ ＦＰＯＸと記載されている）のαＦ６Ｐに対する比活性は、それぞれ０．００２２Ｕ／ｍｇ、０．００９１Ｕ／ｍｇであった。本明細書に記載の手順で作製したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼの改変体はこれら既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼの２倍（アマドリアーゼ２６／比較例３）から１９４０倍（アマドリアーゼ２５／比較例２）もの比活性を示した。すなわち、本明細書に記載の手順でαＦ６Ｐに対して高い反応性を示すアマドリアーゼを得ることができた。
なお、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１が示すαＦ６Ｐ／αＦＶＨの値は、粗酵素液を用いて測定した場合と、精製酵素を用いて測定した場合の間で、大きな乖離は確認できなかった。
得られたＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５の精製標品を用いて、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８ＰおよびαＦ１６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．４，２４１１−２３，１９９５参照）。
Figure 2015060431
精製したＣＦＰ−Ｔ７はαＦＶ、αＦＶＨを酸化する活性を示したが、ペプチド鎖長が３以上の糖化ペプチドを酸化する活性は示さなかった。それに対し、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５はαＦＶ、αＦＶＨに加えてペプチド鎖長が３から１６に至るまでの糖化ペプチドを酸化する活性を示した。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５はαＦＶおよびαＦ６Ｐに対して特に高い比活性を示すが、中間的な鎖長のαＦＶＨ〜αＦ５Ｐに対しても十分な比活性を示した。このこと及びＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５がαＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ及びαＦ１６Ｐに対しても活性を示すことから、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５は中間的な鎖長のαＦ７Ｐ、αＦ９Ｐ〜αＦ１５Ｐについても同様に活性を示す蓋然性が高い。また、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５はαＦ１６Ｐに対しても活性を示すことから、より鎖長の長い基質、例えばαＦ１７Ｐ〜αＦ３２Ｐ等に対しても活性を示すと考えられる。
以上より、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５は、野生型酵素（ＣＦＰ−Ｔ７）では基質とすることができなかったペプチド鎖長の長い多種多様な糖化ペプチドも基質とすることが明らかとなった。このようなアマドリアーゼを用いれば、少ないプロテアーゼの処方量でＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく定量できる測定方法、測定キット、またはＨｂＡ１ｃを迅速、簡便、高精度に、かつ、高感度に定量できる測定方法、測定キットを提供できる。
［実施例３］
（各種アマドリアーゼへの点変異導入）
上記の変異を導入することによりConiochaeta属由来のアマドリアーゼのαＦ６Ｐに対する反応性が上昇し、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、およびαＦ１６Ｐに対する反応性が上昇した。このことから、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様にαＦ６Ｐ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、およびαＦ１６Ｐに対する反応性の上昇が期待できる。そこで、実際にＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも対応する位置に変異を導入した。
１．Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号４０はEupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＥＦＰ−Ｔ５と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号４０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４１）を挿入した組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を保持する大腸菌により生産でき、ＥＦＰ−Ｔ５はαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２００７／１２５７７９号公報および国際公開第２００８／０１８０９４号公報参照）。
ＥＦＰ−Ｔ５に基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を鋳型にして、配列番号４２、４３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＥＦＰ−Ｔ５変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄを鋳型とし、配列番号４４，４５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号４６、４７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号４８，４９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号５０，５１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
さらに、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号５２，５３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
２．Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号５４はNeocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ（以降ＮｖＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号５４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５５）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＮｖＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
ＮｖＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号５６、５７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＮｖＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−６２Ｄ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号５８，５９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のグリシンがリジンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号６０，６１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアルギニンがリジンに、１１０位のグルタミン酸がロイシンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）株を得た。
３．Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号６２はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために５９位のセリンをグリシンへ置換したAspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＡｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号６２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号６３）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＡｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
ＡｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号６４、６５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＡｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄを鋳型とし、配列番号６６，６７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋを鋳型とし、配列番号６８，６９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）株を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌを鋳型とし、配列番号１１２，７０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋを鋳型とし、配列番号７１，７２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７３，７４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７５，７６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０１位のグルタミン酸がリジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換された置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）株を得た。
４．Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
ＰｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸを鋳型にして、配列番号７７、７８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＰｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号７９、８０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号８１、８２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号８３、８４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号８５，８６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓを鋳型とし、配列番号８７，８８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）株を得た。
５．Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号８９はCryptococcus neoformans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＣｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号９０）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＣｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
ＣｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号９１、９２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号９３、９４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号９５、９６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号９７、９８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
６．Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産株の作製）
配列番号９９はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである（以降Ｃｃ９５ＦＸと称する）。配列番号９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１００）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号１００の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。
続いて、取得した配列番号１００の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋） Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ）株を得た。
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入）
Ｃｃ９５ＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸを鋳型にして、配列番号１０１、１０２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｃ９５ＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号１０３、１０４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号１０５、１０６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号１０７、１０８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号１０９、１１０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓを鋳型とし、配列番号１１１、１０２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）株を得た。
［実施例４］
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
野生型のＥＦＰ−Ｔ５、および前述の様にして得られた改変型ＥＦＰ−Ｔ５を生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
調製した野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５の粗酵素液に硫酸アンモニウムを３５％飽和濃度になるように添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収した。続いて、得られた上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和濃度になるように追加添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を廃棄し、沈殿物を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。
得られた野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５の粗酵素液を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後、同緩衝液で平衡化した４ｍｌのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に供し、同緩衝液で樹脂に吸着しないタンパク質を溶出させた。続いて、得られた野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５Ｍの粗酵素液を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて同緩衝液中のＮａＣｌの濃度を０ｍＭから１００ｍＭまで直線的に増加させながら樹脂に吸着していた野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５を溶出させ回収した。
得られた野生型、または改変型ＥＦＰ−Ｔ５を含む粗酵素液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５を溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５の精製標品とした。
（Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
野生型のＮｖＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＮｖＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
調製した粗酵素液を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＮｖＦＸを溶出させ回収した。
得られた野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＮｖＦＸの精製標品とした。
（Aspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
野生型のＡｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
調製した粗酵素液を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂に吸着していた改変型ＡｎＦＸを溶出させ回収した。
得られた改変型ＡｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにアプライして同緩衝液で改変型ＡｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＡｎＦＸの精製標品とした。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を、前述の、野生型ＰｎＦＸの精製方法に従い精製した。ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムによる精製終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＰｎＦＸの精製標品とした。
（Cryptococcus neoformans由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
野生型のＣｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＣｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
調製した粗酵素液を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＣｎＦＸを溶出させ回収した。
得られた野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＣｎＦＸの精製標品とした。
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産）
野生型のＣｃ９５ＦＸ、および前述の様にして得られた改変型Ｃｃ９５ＦＸを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
得られた各種アマドリアーゼの野生型酵素、および改変型酵素の精製標品を用いて、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１５に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ４， ２４１１−２３， １９９５参照）。
また、Ｃｃ９５ＦＸ、またはＣｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１６の通りとなった。
Figure 2015060431
Figure 2015060431
本明細書に記載の手順で作製した、Coniochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７；比較例１）と比較してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を各種のアマドリアーゼに導入した結果、予想通り、ＥＦＰ−Ｔ５、ＮｖＦＸ、ＡｎＦＸ、ＣｎＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与された。また、ＰｎＦＸは従来よりαＦ６Ｐに対する反応を僅かながら示したが、本明細書に記載のアミノ酸置換の導入によりαＦ６Ｐに対する比活性が１３．７倍向上した。
また、本明細書に記載の手順で作製した、Coniochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７；比較例１）と比較してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を、本明細書に記載の手順で作製した、Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Ｃｃ９５ＦＸ；比較例８）に導入した結果、予想通り、Ｃｃ９５ＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与され、Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓでは、αＦ６Ｐ酸化活性がαＦＶＨ酸化活性を上回った。
すなわち、本明細書に記載のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼに対してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するするアミノ酸置換の効果は、Coniochaeta由来アマドリアーゼに対してのみ限定される訳ではなく、図１および図２に示した様なＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼと７４％以上の配列同一性を示すアマドリアーゼであれば、普遍的に同様にαＦ６Ｐに対する反応性が付与または増強された。
以下の表に比較例と、本発明の変異体の、６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位のアミノ酸及び置換があれば置換後のアミノ酸の関係を示す。
Figure 2015060431
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Figure 2015060431
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上記のようにＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５は、αＦＶやαＦＶＨのみならず、野生型酵素（ＣＦＰ−Ｔ７）では基質とすることができなかったペプチド鎖長の長い糖化ペプチド（αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、およびαＦ１６Ｐ）も基質とした。
この知見に基づき、配列番号１のアミノ酸配列の位置に対応する位置で同様の変異を有する改変体を上記の手順で作製したところ、こうした改変体もαＦ６Ｐに活性を示した。したがってこれらの改変体はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５と同様にαＦＶ、αＦＶＨ及びαＦ６Ｐのみならず、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ８Ｐ、およびαＦ１６Ｐに対しても活性を示すと考えられる。また、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５がαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦ８Ｐ、およびαＦ１６Ｐを基質としたことから、同様にこれはαＦ７Ｐ、αＦ９Ｐ〜αＦ１５Ｐを含むα−フルクトシルペプチド（αＦ１Ｐ〜αＦ１６Ｐ）、さらにはαＦＶ〜αＦ３２Ｐを含むα−フルクトシルペプチドを基質とすると考えられる。こうしたアマドリアーゼ改変体は、ＨｂＡ１ｃ定量測定に用いることができる。これにより、ＨｂＡ１ｃからα−フルクトシルペプチドを切り出すプロテアーゼが、切断効率は高いが切断特異性の低いものであり、αＦＶＨまで完全に分解が進行しなくとも、アマドリアーゼがαＦＶＨのみならず種々の長さのα−フルクトシルペプチドに作用することにより、切断された種々のα−フルクトシルペプチドの長さとそれぞれの全体に占める割合にかかわらず、高精度にてＨｂＡ１ｃ定量が行える。またＨｂＡ１ｃからα−フルクトシルペプチドを切り出すプロテアーゼが、切断特異性の高いαＦ６Ｐを切り出すものに限られず、容易に入手できる他の切断特異性の低いプロテアーゼもＨｂＡ１ｃ定量測定に使用可能となる。
[実施例５]
（各α−フルクトシルペプチドの定量）
以下の組成から成る測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子）を利用して下記の通りα３Ｐ、α４Ｐ、α５Ｐ、α６Ｐ、α８Ｐ、α１６Ｐの測定を実施した。
試料１：各α−フルクトシルペプチド溶液（終濃度０．５０〜４．０μＭ）
４．０μＭ、８．０μＭ、１６μＭ、２４μＭおよび３２μＭの各濃度で調製したα３Ｐ、α４Ｐ、α５Ｐ、α６Ｐ、α８Ｐ、α１６Ｐの溶液。
濃度０μＭのα−フルクトシルペプチド溶液としてはイオン交換水を使用した。
試薬４：ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
１２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
０．１６ｍＭ Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
１６Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
試薬５：ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５溶液
１２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
１００Ｕ／ｍｌ（２３．４ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５（本発明２５）
ただし、Ｕ／ｍｌは１ｍＭのαＦ６Ｐに対する活性を示す。
１２５μｌの試薬４に２５μｌの試料１を添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、波長７５１ｎｍの光の吸光度を測定した（Ａ０）、続いて５０μｌの試薬５を添加して各α−フルクトシルペプチドの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた後、再度波長７５１ｎｍの光の吸光度を測定した（Ａ５）。試料１に由来する各α−フルクトシルペプチドの終濃度を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の吸光度差ΔＡ（Ａ５−Ａ０より算出）を縦軸にプロットしたグラフを図３に示した。なお、グラフ中の吸光度差ΔＡは、ブランク測定（試料１としてイオン交換水を使用）のΔＡを引いた値を表示した。
各α−フルクトシルペプチド終濃度０．５０μＭ〜４．０μＭの範囲でΔＡと各α−フルクトシルペプチド濃度の間に良好な相関関係が成立した（図３−１〜図３−６）。したがって、本発明のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）を配合することで、各α−フルクトシルペプチドの定量を迅速（５分）かつ高感度（０．５μＭまで）に行えることが示された。
本実施例では本発明のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）を使用し、基質αＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ８Ｐ、およびαＦ１６Ｐを定量することができた。本発明のアマドリアーゼを用いれば、基質αＦ７Ｐ、αＦ９Ｐ〜αＦ１５Ｐについても同様に定量することができると考えられる。
[実施例６]
（各α−フルクトシルペプチドを含むα−フルクトシルバリルヒスチジン試料の定量）
以下の組成から成る測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子）を利用して、下記の通り各α−フルクトシルペプチドを含むα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）試料の測定を実施した。
試料２：各α−フルクトシルペプチドを含むα−フルクトシルバリルヒスチジン溶液
下記９種の試料（２Ａ−２Ｉ）を調製した。
２Ａ：イオン交換水
２Ｂ：２０μＭ α−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）
２Ｃ：１６μＭ αＦ２Ｐ
２Ｄ：１６μＭ αＦ２Ｐ ＋ ４μＭ αＦ３Ｐ
２Ｅ：１６μＭ αＦ２Ｐ ＋ ４μＭ αＦ４Ｐ
２Ｆ：１６μＭ αＦ２Ｐ ＋ ４μＭ αＦ５Ｐ
２Ｇ：１６μＭ αＦ２Ｐ ＋ ４μＭ αＦ６Ｐ
２Ｈ：１６μＭ αＦ２Ｐ ＋ ４μＭ αＦ８Ｐ
２Ｉ：１６μＭ αＦ２Ｐ ＋ ４μＭ αＦ１６Ｐ
試料２Ｄ〜２Ｉは、試料２Ｂと２Ｃの間のαＦ２Ｐの濃度差（４μＭ、終濃度では０．５μＭに相当）を他のα−フルクトシルペプチドで補った試料である。
試薬４：ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
１２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
０．１６ｍＭ Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
１６Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
試薬６：ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５溶液
１２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
５０Ｕ／ｍｌ（１１．７ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５（本発明２５）
ただし、Ｕ／ｍｌは１ｍＭのαＦ６Ｐに対する活性を示す。
試薬７：ＣＦＰ−Ｔ７溶液
１２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
１１．７ｍｇ／ｍｌ ＣＦＰ−Ｔ７（比較例１）
１２５μｌの試薬４に２５μｌの試料２を添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、波長７５１ｎｍの光の吸光度を測定した（Ａ０）、続いて５０μｌの試薬６または試薬７を添加して各α−フルクトシルペプチドの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた後、再度波長７５１ｎｍの光の吸光度を測定した（Ａ５）。試料ごとの過酸化水素の定量反応前後の吸光度差ΔＡ（Ａ５−Ａ０より算出）を算出し、続いて、試料２Ｂ〜２ＩのΔＡの値から、ブランク測定として行った試料２ＡのΔＡを引き、試薬６で測定した場合の結果を表２３に、試薬７で測定した場合の結果を表２４に示した。相対値は試料２Ｂを測定した時の吸光度差ΔＡを１００％として算出した。
Figure 2015060431
Figure 2015060431
表２３では、試料２Ｄ〜２ＩのΔＡの相対値は、試料２Ｂの±５％以内の値を示した。このことは、本発明のアマドリアーゼを用いれば、プロテアーゼの作用でＨｂＡ１ｃからαＦ２Ｐを切り出す時に、αＦ２Ｐまで分解されなかったα−フルクトシルペプチドが残存していても、ＨｂＡ１ｃを正確に定量できることを示している。
それに対して、表２４では、試料２Ｄ〜２ＩのΔＡの相対値は、試料２Ｃの±２％以内の値を示した。このことは、従来のアマドリアーゼを用いると、プロテアーゼの作用でＨｂＡ１ｃからαＦ２Ｐを切り出す時に、αＦ２Ｐまで分解されなかったα−フルクトシルペプチドの残存量に依存して吸光度差（ΔＡ）が低値となり、ＨｂＡ１ｃを正確に定量できないことを示している。
従来のアマドリアーゼによるＨｂＡ１ｃの測定法では、プロテアーゼの作用によりＨｂＡ１ｃをαＦ２Ｐまで完全に分解する必要があった。ただし、ＨｂＡ１ｃが全てαＦ２Ｐまで分解されているか、検証されたことはなかった。表２４の結果からは、従来のアマドリアーゼを使用し、αＦ２Ｐまで分解されなかったα−フルクトシルペプチドが存在する場合、その残存量に依存して吸光度差（ΔＡ）が低値となり、ＨｂＡ１ｃを正確に定量できないことが分かる。しかしながら本発明のアマドリアーゼを用いれば、様々なα−フルクトシルペプチドが混在する試料でも、全てＨｂＡ１ｃ値に反映させることができる。したがって、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃ分解反応の進行度を考慮することなく、正確にＨｂＡ１ｃを測定できるため、産業利用上非常に有利である。
また、プロテアーゼと酵素（アマドリアーゼ、ペルオキシダーゼ）を同時に配合すると、プロテアーゼにより、アマドリアーゼやペルオキシダーゼも分解され、酵素活性を失うことになる。これまでの測定法では、ＨｂＡ１ｃをαＦ２Ｐまで分解することができるプロテアーゼしか選択の余地がなかった。しかしながら、本発明のアマドリアーゼを用いれば、様々なα−フルクトシルペプチドが混在する試料でも、全てＨｂＡ１ｃ値に反映させることができるため、アマドリアーゼやペルオキシダーゼには作用しにくいプロテアーゼを優先的に選択して測定試薬に組み込むことも可能となった。これは、産業利用上非常に有利なことである。
また、糖尿病診断を行うには、糖尿病の境界値であるＨｂＡ１ｃ ６．５％（ＮＧＳＰ値）を判別できる必要がある。ＮＧＳＰ値６．５％はＩＦＣＣ値４７ｍｍｏｌ／ｍｏｌに相当し、血中ヘモグロビン濃度が１３ｇ／ｄｌ、ＮＧＳＰ値６．５％の場合、アミノ末端が糖化されたヘモグロビンβ鎖の血中濃度はおよそ１９０μＭである。すなわち、少なくとも１９０μＭ以下の濃度範囲において糖化ペプチドを定量することができなければ、糖尿病診断のための実用化は難しく、産業利用上の課題を克服できているとは言い難い。その点、本発明のアマドリアーゼを用いれば、前述の血液を４７．５〜３８０倍希釈しても（すなわち測定溶液での終濃度が０．５μＭ〜４μＭであっても）ＨｂＡ１ｃβ鎖アミノ末端由来の各α−フルクトシルペプチドを検出することが可能であり、産業利用上非常に有利である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号１ Coniochaeta sp. NISL 9330アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号２ 配列番号１のアマドリアーゼの塩基配列
配列番号３−３３ PCRプライマー
配列番号３４ PCRプライマー
配列番号３５ PCRプライマー
配列番号３６ Aspergillus oryzae RIB40 （FAOAo2） アミノ酸配列
配列番号３７： FAOAo2塩基配列
配列番号３８ Phaeosphaeria nodorum（PnFX） アミノ酸配列
配列番号３９ PnFX塩基配列
配列番号４０ Eupenicillium terrenum（EFP-T5）アミノ酸配列
配列番号４１ EFP-T5塩基配列
配列番号４２−５３ PCRプライマー
配列番号５４ Neocosmospora vasinfecta（NvFX）アミノ酸配列
配列番号５５ NvFX塩基配列
配列番号５６−６１ PCRプライマー
配列番号６２ Ｓ５９Ｇ置換 Aspergillus nidulans（AnFX） アミノ酸配列
配列番号６３ AnFX塩基配列
配列番号６４−８８ PCRプライマー
配列番号８９ Cryptococcus neoformans （CnFX） アミノ酸配列
配列番号９０ CnFX塩基配列
配列番号９１−９８ PCRプライマー
配列番号９９ Curvularia clavataケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Cc95FX） アミノ酸配列
配列番号１００ Cc95FX塩基配列
配列番号１０１−１１２ PCRプライマー
配列番号１１３ Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１４ Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１５ Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１６ Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１７ Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１８ Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１９ Emericella nidulans(En)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２０ Emericella nidulans(En)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２１ Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２２ Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２３ Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２４ Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２５ Aspergillus fumigatus Amadoriase Iのアミノ酸配列
配列番号１２６ Amadoriase I塩基配列
配列番号１２７ Aspergillus oryzae FAOAo1アミノ酸配列
配列番号１２８ FAOAo1塩基配列
配列番号１２９ Aspergillus fumigatus Amadoriase IIアミノ酸配列
配列番号１３０ Amadoriase II塩基配列
配列番号１３１ Aspergillus terreus FAOD-Aアミノ酸配列
配列番号１３２ FAOD-A塩基配列
配列番号１３３ CFP-T7-H20（R62D、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１３４ CFP-T7-H20塩基配列
配列番号１３５ PnFPOX（S62D、D106K、G110L、A113K）Phaeosphaeria nodorum アミノ酸配列
配列番号１３６ 配列番号１３５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３７ (アマドリアーゼ２９)NvFX-62D/106K/110L（R62D、G106K、E110L）Neocosmospora vasinfectaアミノ酸配列
配列番号１３８ 配列番号１３７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３９ (アマドリアーゼ３０)AnFX-61D/105K/109L(S59G、R61D、G105K、K1091L）Aspergillus nidulans アミノ酸配列
配列番号１４０ 配列番号１３９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４１ （アマドリアーゼ２５）CFP-T7-H35（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355S）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１４２ CFP-T7-H35塩基配列
配列番号１４３ EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S Eupenicillium terrenumアミノ酸配列
配列番号１４４ 配列番号１４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４５ Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４６ Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４７ AnFX 野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４８ AnFX 野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４９ CnFX 野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１５０ CnFX 野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１５１ （アマドリアーゼ１）CFP-T7-H1（R62A）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５２ CFP-T7-H1塩基配列
配列番号１５３ （アマドリアーゼ２６）CFP-T7-62D（R62D)Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５４ CFP-T7-62D塩基配列
配列番号１５５（アマドリアーゼ２７）EFP-T5-R62D（R62D) Eupenicillium terrenum アミノ酸配列
配列番号１５６ EFP-T5-R62D塩基配列
配列番号１５７ （アマドリアーゼ２）CFP-T7-H2（R62A、Q110L）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５８ CFP-T7-H2塩基配列
配列番号１５９ （アマドリアーゼ４）CFP-T7-H4（R62A、Q110Y）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６０ CFP-T7-H4塩基配列
配列番号１６１ （アマドリアーゼ５）CFP-T7-H2-62N（R62N、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６２ CFP-T7-H2-62N塩基配列
配列番号１６３ （アマドリアーゼ６）CFP-T7-H6（R62D、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６４ CFP-T7-H6塩基配列
配列番号１６５ （アマドリアーゼ１２）CFP-T7-H10（R62D、D106A、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６６ CFP-T7-H10塩基配列
配列番号１６７ （アマドリアーゼ１３）CFP-T7-H11（R62D、D106K、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６８ CFP-T7-H11塩基配列
配列番号１６９ （アマドリアーゼ１４）CFP-T7-H12（R62D、D106R、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７０ CFP-T7-H12塩基配列
配列番号１７１ （アマドリアーゼ１５）CFP-T7-H13（R62D、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７２ CFP-T7-H13塩基配列
配列番号１７３ （アマドリアーゼ１６）CFP-T7-H14（R62D、Q110L、A113R）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７４ CFP-T7-H14塩基配列
配列番号１７５ （アマドリアーゼ１８）CFP-T7-H21(R62D、D106K、Q110L、A113R)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７６ CFP-T7-H21塩基配列
配列番号１７７ （アマドリアーゼ１９）CFP-T7-H24（R62D、L63A、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７８ CFP-T7-H24塩基配列
配列番号１７９ （アマドリアーゼ２１）CFP-T7-H26（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８０ CFP-T7-H26塩基配列
配列番号１８１ （アマドリアーゼ２３）CFP-T7-H28（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K） Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８２ CFP-T7-H28塩基配列
配列番号１８３ （アマドリアーゼ２４）CFP-T7-H29（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419K） Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８４ CFP-T7-H29塩基配列
配列番号１８５ （アマドリアーゼ３１）（AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S）Aspergillus nidulansアミノ酸配列
配列番号１８６ 配列番号１８５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８７ （アマドリアーゼ３３）（PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S）Phaeosphaeria nodorumアミノ酸配列
配列番号１８８ 配列番号１８７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８９ （アマドリアーゼ３４）（CnFX-62D/106K/110L/113K）Cryptococcus neoformansアミノ酸配列
配列番号１９０ 配列番号１８９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９１ （アマドリアーゼ３５）（Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S）Curvularia clavataアミノ酸配列
配列番号１９２ 配列番号１９１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９３ ヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列

Claims (19)

  1. 以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法。
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  2. (a)〜(f)のいずれか１以上を含む試料に、(a)〜(f)のいずれか１以上のα−フルクトシルペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルペプチドの測定方法。
    （ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    （ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    （ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    （ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    （ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    （ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  3. 試料がさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を含み、アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）に作用するものであり、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素も測定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 試料をプロテアーゼで処理して、以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を含むα−フルクトシルオリゴペプチドを遊離させ、これに遊離したα−フルクトシルオリゴペプチドのいずれか１以上を酸化するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  5. 試料をプロテアーゼで処理して、(a)〜(f)のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを遊離させ、遊離した(a)〜(f)のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを酸化するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
    （ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    （ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    （ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    （ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    （ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    （ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  6. 試料をプロテアーゼで処理することによりさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）が遊離し、アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）に作用するものであり、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素も測定することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
  7. アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
  8. アマドリアーゼがコニオカエタ エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
  9. アマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
    (i) 配列番号１４１に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。
    (ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
  10. さらに、α−フルクトシルバリンまたはα−フルクトシルバリルヒスチジンを酸化するアマドリアーゼを用いる、請求項１、２、４、５及び７〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 以下の成分（１）及び（２）を含むことを特徴とする、試料中のα−フルクトシルペプチド測定用試薬キット。
    （１）以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
    （２）過酸化水素を測定するための試薬。
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  12. 以下の成分（１）及び（２）を含むことを特徴とする、試料中のα−フルクトシルペプチド測定用試薬キット。
    （１）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
    （２）過酸化水素を測定するための試薬。
    （ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    （ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    （ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    （ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    （ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    （ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  13. アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するものである、請求項１１または１２に記載のキット。
  14. 以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
    （１）ＨｂＡ１ｃのβ鎖を加水分解し、以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を含む糖化ペプチドを遊離するプロテアーゼ、
    （２）以下のαＦ３Ｐ〜αＦ１６Ｐのいずれか１以上を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
    （３）過酸化水素を測定するための試薬。
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  15. 以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
    （１）ＨｂＡ１ｃのβ鎖を加水分解し、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを遊離するプロテアーゼ、
    （２）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１以上を含む糖化ペプチドを酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ、及び
    （３）過酸化水素を測定するための試薬。
    （ａ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    （ｂ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    （ｃ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    （ｄ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    （ｅ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    （ｆ）α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）
  16. （１）プロテアーゼがさらに、ＨｂＡ１ｃのβ鎖を加水分解してα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を遊離するものであり、（２）アマドリアーゼがさらにα−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）またはα−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）を酸化して、過酸化水素を生成する作用を有するものである、請求項１４または１５に記載のキット。
  17. アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のキット。
  18. アマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のキット。
    (i) 配列番号１４１に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。
    (ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
  19. 以下のαＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐのいずれか１以上を含む試料に、αＦ１Ｐ〜αＦ３２Ｐのいずれか１以上のα−フルクトシルオリゴペプチドに作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素または消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のα−フルクトシルオリゴペプチドの測定方法。
    α−フルクトシルバリン（αＦ１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジン（αＦ２Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシン（αＦ３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニン（αＦ４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリン（αＦ５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミン酸（αＦ７Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリン（αＦ９Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニン（αＦ１０Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリン（αＦ１１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニン（αＦ１２Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニン（αＦ１３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシン（αＦ１４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトファン（αＦ１５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシン（αＦ１６Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジン（αＦ１７Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリン（αＦ１８Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギン（αＦ１９Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリン（αＦ２０Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルラギン酸（αＦ２１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミン酸（αＦ２２Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリン（αＦ２３Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシン（αＦ２４Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシン（αＦ２５Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミン酸（αＦ２６Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニン（αＦ２７Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシン（αＦ２８Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシン（αＦ２９Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニン（αＦ３０Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニルロイシン（αＦ３１Ｐ）、
    α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジルセリルアラニルバリルスレオニルアラニルロイシルトリプトフィルグリシルリジルバリルアスパラギニルバリルアスパルチルグルタミルバリルグリシルグリシルグルタミルアラニルロイシルグリシルアルギニルロイシルロイシン（αＦ３２Ｐ）
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