CN100379875C - 制备α-糖化二肽的方法和测定α-糖化二肽的量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备α-糖化二肽的方法，其特征在于，使蛋白酶作用于N-末端糖化肽或N-末端糖化蛋白。本发明还涉及测定α-糖化二肽的方法，其特征在于，使果糖基肽氧化酶作用于通过上述方法获得的α-糖化二肽，然后测定由此产生的过氧化氢的量。本发明提供的制备α-糖化二肽的方法，能够简单、快速且高效地由糖化蛋白或糖化肽制备α-糖化二肽。本发明提供的制备测定α-糖化二肽的方法，能够以高度精确的方式在短时间内定量测定α-糖化二肽。

Description

制备α-糖化二肽的方法和测定α-糖化二肽的量的方法

技术领域

本发明涉及制备α-糖化二肽的方法以及测定由该制备方法获得的α-糖化二肽的量的方法。

发明背景

糖化蛋白是非酶促糖化蛋白。具体来说，糖化蛋白是作为糖侧上的醛基(就是说在醛糖(潜在具有醛基的单糖及其衍生物)侧上)与蛋白侧上的氨基非酶促共价键合的结果而产生的。此外，这样的糖化蛋白是在作为反应中间体产生的席夫碱进行阿马多里(Amadori)重排时形成的。因此，糖化蛋白也被称作阿马多里化合物。

糖化蛋白存在于体液例如体内血液或生物样本例如毛发中。存在于血液中的糖化蛋白的浓度，主要取决于溶解于血清中的糖类例如葡萄糖的浓度。在糖尿病情况下，糖化蛋白的产生提高。而且，存在于红细胞中的糖化血红蛋白的浓度或血清中的糖化白蛋白的浓度，在一定的时间内反映过去的平均血液葡萄糖水平。因此，测定这样的糖化蛋白的量对于诊断或控制糖尿病症状是很重要的。

糖化血红蛋白(下文缩写为HbA1c.)是果糖基蛋白，所述果糖基蛋白具有通过葡萄糖与血红蛋白β-亚单位的N-末端氨基酸的非醇促结合以形成席夫碱而产生的结构，从而导致通过阿马多里重排的果糖结合。这样的HbA1c能够临床反映过去1-2个月的平均葡萄糖水平。因此，HbA1c是控制糖尿病的重要指标，并且由此需要快速而准确的测定方法。

目前，作为测定HbA1c的量的方法，IFCC Practical StandardMethods(参见U.等人，Clin.Chem.43，1944-1951(1997))公开了一种测定方法，所述方法包括用内切蛋白酶Glu-C水解(于37℃处理18小时)HbA1c，用HPLC将得自其β链的N-末端的六肽片断分离，并用例如毛细管电泳法或质谱法测定所得物的量。然而，该方法是有问题的，因为需要专门的仪器和复杂的程序，并且是不经济的。

因此，酶促方法已被建议作为以简单的程序、低成本、高度准确的方式测定HbA1c的量的方法。这样的酶促方法包括用蛋白酶将糖化蛋白变性，使果糖基氨基酸氧化酶作用于释放的糖化氨基酸，然后测定由此产生的过氧化氢的量。已经公开用于这样的酶促测定方法的氧化酶的实例，包括棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌产生的氧化酶(参见JP专利公开(Kokoku)5-33997B(1993)和JP专利公开(Kokoku)6-65300B(1994))，曲霉属(Aspergillus)菌株产生的氧化酶(参见JP专利公开(Kokai)3-155780A(1991))，赤霉菌属(Gibberella)菌株产生的氧化酶(参见JP专利公开(Kokai)7-289253A(1995))，镰孢属(Fusarium)菌株产生的氧化酶(参见JP专利公开(Kokai)7-289253A(1995)和JP专利公开(Kokai)8-154672A(1996))，青霉属(Penicillium)菌株产生的氧化酶(参见JP专利公开(Kokai)8-336386A(1996))，和酮胺氧化酶(参见JP专利公开(Kokai)5-192193A(1993))。而且，下列方法(a)-(i)因此作为实例早已众所周知，其中α-糖化氨基酸(氨基酸的α-氨基已被糖化)从具有糖化N-末端氨基酸的血红蛋白中被释放出来：

方法(a)，所述方法包括将8M尿素加到糖化血红蛋白中，把混合物煮沸20分钟以变性，进行胰蛋白酶处理，然后用得自青霉属菌株的果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)来测定所得物的量(参见JP专利公开(Kokai)8-336386A(1996))；

方法(b)，所述方法包括用蛋白酶处理糖化血红蛋白，然后用得自曲霉属菌株的FAOD来测定所得物的量(参见JP专利公开(Kokai)10-33177A(1998)和JP专利公开(Kokai)10-33180A(1998))；

方法(c)，所述方法包括用内切蛋白酶和外切蛋白酶来测定糖化血红蛋白的量(参见国际专利公开97/13872pamphlet)；

方法(d)，所述方法包括用丝氨酸羧肽酶来酶促处理具有果糖基N-末端缬氨酸的肽或蛋白(参见JP专利公开(Kokai)2001-57897A)；

方法(e)，所述方法包括用能够将第三个亮氨酸的羧基侧从HbA1c的β链N-末端剪切的蛋白酶进行处理，用能够将组氨酰基亮氨酸从产生的果糖基缬氨酰基-组氨酰基-亮氨酸切除下来的蛋白酶处理所得物，然后测定血红蛋白A1c的量(参见JP专利公开(Kokai)2000-300294A)；

方法(f)，所述方法包括用得自棒状杆菌属和假单胞菌属(Pseudomonas)的新酶将糖化氨基酸释放(这样的酶能够从糖化蛋白释放具有糖化α-氨基的氨基酸)，然后测定所得物的量(参见国际专利公开00/50579pamphlet)；

方法(g)，所述方法包括用得自鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、Mucor和青霉菌属的新酶将糖化氨基酸释放(这样的酶能够从糖化蛋白释放具有糖化α-氨基的氨基酸)，然后测定所得物的量(参见国际专利公开0/61732pamphlet)；

方法(h)，所述方法包括在四唑化合物存在下，用蛋白酶处理包含蛋白的样本，使由此获得的蛋白水解所得物与FAOX反应，然后快速测定糖化蛋白的量(参见国际专利公开02/27012pamphlet)；和

方法(i)，所述方法包括使去封闭氨基肽酶、二肽基氨基肽酶、亮氨酸氨基肽酶、N-酰基氨基酰基-肽水解酶或半纤维素酶作用于含有N-末端糖化肽或蛋白的试验溶液，释放N-末端糖化氨基酸，然后测定由此产生的糖化氨基酸的量(参见JP专利公开(Kokai)2002-315600A)。

然而，按照本发明者们进行的实验，即通过使各种蛋白酶作用于HbA1c而释放α-糖化氨基酸的实例也是没有的。具体来说，各种蛋白酶不能将HbA1c切割成小于α-糖化肽的尺寸。几乎没有α-糖化氨基酸能够被这样的蛋白酶切割。只要使用上述果糖基氨基酸氧化酶，HbA1c的量就不能够用良好的敏感性来测定，这已经成为定论。如上面所述，对于HbA1c测定，以最高敏感性测定HbA1c的良好方法是涉及测定α-糖化肽或优选测定α-糖化二肽的测定方法，所述α-糖化肽或α-糖化二肽是用氧化酶作用于作为底物的这样的肽或二肽，通过蛋白醇处理释放出来的。这样的作用于α-糖化二肽的氧化酶和能够切除糖化二肽的蛋白酶已经被公开于JP专利公开(Kokai)2001-95598A和JP专利公开(Kokai)2003-235585A。然而，为了实现以较高敏感性进行快速的HbA1c测定，就需要具有较高的切除α-糖化二肽的活性的蛋白酶。

因此，本发明所要达到的目的是提供制备α-糖化二肽的方法，通过这种方法，α-糖化二肽(其中二肽的N-末端氨基酸的α-氨基已经被糖化的糖化二肽)通过一种蛋白酶处理被有效地从糖化蛋白或糖化肽中释放出来。本发明所要达到的另一目的是提供测定α-糖化二肽的量的方法。所述方法通过使用上述氧化酶测定释放的α-糖化肽的量，能够用简单的程序、以高度精确的方式、在短时间内测定糖化蛋白或糖化肽的量。

本发明公开

作为深入研究达到上述目的的结果，本发明者们发现，通过一种蛋白酶处理，α-糖化二肽(其中二肽的N-末端氨基酸的α-氨基已经被糖化的糖化二肽)能够被有效地从糖化蛋白或糖化肽中释放出来。本发明者们还发现，通过使用上述氧化酶测定释放的α-糖化肽的量，可以高度精确的方法、用简单的程序、在短时间内测定糖化蛋白或糖化肽。这样，本发明者们就完成了本发明。

本发明提供以下本发明：

(1)制备α-糖化二肽的方法，所述方法包括使蛋白酶作用于N-末端糖化肽或N-末端糖化蛋白；

(2)按照(1)制备α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化肽是果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；

(3)按照(1)制备α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化蛋白是糖化血红蛋白；

(4)按照(1)、(2)或(3)制备α-糖化二肽的方法，其中所述蛋白酶是一种或多种选自下列的蛋白酶：由曲霉属、芽孢杆菌属(Bacillus)、根霉属(Rhizopas)、Tritirachium、葡糖球菌属(Staphylococcus)、链酶菌属(Streptomyces)等微生物产生的蛋白酶，由动物例如猪和牛产生的蛋白酶，以及由植物例如番木瓜属、无花果和波萝产生的蛋白酶；

(5)按照(1)、(2)或(3)制备α-糖化二肽的方法，其中所述蛋白酶是一种或多种选自下列的蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶、链酶蛋白酶、分散酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰酶、Glu-C和组织蛋白酶；

(6)按照(1)至(5)制备α-糖化二肽的方法，其中所述α-糖化二肽是果糖基缬氨酰组氨酸；和

(7)测定α-糖化二肽的量的方法，所述方法包括使果糖基肽氧化酶作用于按照(1)至(6)的制备方法获得的α-糖化二肽，然后测定产生的过氧化氢的量。

下面将对本发明进行详细描述。本发明要求2003年9月18日提交的日本专利申请2003-326224和2003年11月19日提交的日本专利申请2003-421755的优先权，并且包括上述专利申请的说明书中的内容和/或附图。

只要是通过将蛋白与醛糖例如葡萄糖非酶促结合而产生的，N-末端糖化蛋白可以是任何蛋白。

由活体产生的糖化蛋白的实例包括糖化白蛋白和HbA1c。例如，可以将本发明适宜地用于测定HbA1c的量等。而且，本发明中N-末端糖化肽，不但包括通过将样本中所含肽与醛糖例如葡萄糖非酶促结合而产生的肽，而且包括通过酶促(例如蛋白酶和肽酶)或非酶促(例如物理摇晃和加热)切割上述N-末端糖化蛋白而产生的肽。这样的糖化蛋白或糖化肽通常也存在于食物例如果汁、糖果、调味品和粉状食物中。只要含有上述糖化蛋白或糖化肽，本发明含有糖化蛋白或糖化肽的样本可以是任何样本。这样的样本的实例可以包括体内样本例如体液(例如食物和唾液)和毛发。这样的样本的另外的实例包括上面所述食物等。可以将这些样本直接进行测定，或者在过滤、透析处理等后间接进行测定。而且，例如，可以将应当测定量的糖化蛋白或糖化肽进行适当的浓缩、萃取，然后用水、缓冲液等进行稀释。

只要能够作用于上述糖化蛋白或糖化肽并且然后释放出α-糖化二肽，能够用于本发明的蛋白酶可以是任何酶。可以按照被切割的糖化蛋白或糖化肽的类型，对优选的蛋白酶进行适当地选择。这样的蛋白酶或肽酶的实例包括蛋白酶K、链酶蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶B、胰酶、组织蛋白酶、羧肽酶、内切蛋白酶Glu-C、木瓜蛋白酶、元花果蛋白酶、菠萝蛋白酶和氨肽酶。尤其是在本发明中，能够有效地释放α-糖化二肽的蛋白酶的实例包括：得自曲霉属的蛋白酶，例如“IP酶、AO蛋白酶、肽酶和molsin(全部由KIKKOMAN CORPORATION生产)”、“蛋白酶A5(由KYOWAKASEI CO.，LTD.生产)”、“umamizyme、蛋白酶A、蛋白酶M和蛋白酶P(全部由Amano Enzyme Inc.生产)”、“sumizymeMP、sumizyme LP-20、sumizyme LPL和sumizyme AP(全部由ShinNihon Chemical Co.Ltd.生产)”和“蛋白酶6(由Fluka生产)”；得自Rhizopas的酶，例如“肽酶R(由Amano Enzyme Inc生产)”；得自芽孢杆菌属的蛋白酶，例如“分散酶(由Roche生产)”，“枯草杆菌蛋白酶(由Boehringer Mannheim Corporation生产)”，“蛋白酶N(由Fluka生产)”，“蛋白酶类型VII(由Sigma-AldrichCorporation生产)”，“蛋白酶(细菌)(由Fluka生产)”，“蛋白酶N、proleather FG-F和蛋白酶S(全部由Amano Enzyme Inc.生产)”，“蛋白酶类型X(由Sigma-Aldrich Corporation生产)”，“嗜热菌蛋白酶(由DAIWA KASEI K.K.生产)”，“链酶蛋白酶E(由Kaken Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)”和“中性蛋白酶(由TOYOBO.，LTD.生产)”；得自链酶菌属的蛋白酶，例如“链醇蛋白酶(由Boehringer Mannheim Corporation生产)”，“蛋白酶XIV型(由Sigma-Aldrich Corporation生产)”和“碱性蛋白酶(由TOYOBO.，LTD.生产)”；得自Tritirachium的蛋白酶，例如“蛋白酶K(由Roche和Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)”；得自葡糖球菌属的蛋白酶，例如“Glu-C(由Boehringer MannheimCorporation生产)”；得自植物的蛋白酶，例如“木瓜蛋白酶(由Roche，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.、Sigma-AldrichCorporation、Amano Enzyme Inc.和ASAHI FOOD &HEALTHCARE，LTD.生产)”，“无花果蛋白酶(由Sigma-AldrichCorporation生产)”，“菠萝蛋白酶(由Enzyme Inc.和Sigma-AldrichCorporation生产)”和得自动物的蛋白酶，例如“胰酶(由Wako PureChemical Industries，Ltd.生产)”和“组织蛋白酶B(由Sigma-AldrichCorporation生产)。含有这些蛋白酶的样本是特别优选使用的。可以将上述蛋白酶单独使用，或者将它们的两种或多种类型组合使用。例如，对于HbA1c来说，已经证明使用内切蛋白酶Glu-C可以产生α-糖化六肽(果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)(Kobold U.等人，Clin.Chem.1997，43：1944-1951)。因此，对于由HbA1c制备糖化二肽，将Glu-C与上述蛋白酶组合是非常有效的方法。

样本的处理条件可以是任何条件，只要在这样的条件下本文所用的蛋白酶能够作用于糖化蛋白，测定其量，然后α-糖化二肽能够在短时间内被释放出来即可。本文所用蛋白酶的量的大体选择取决于样本中糖化蛋白的含量、处理条件等。在实例中，将得自曲霉属菌株的蛋白酶(例如由Amano Enzyme Inc.销售的蛋白酶P)以0.5mg/mL-50mg/mL而优选1mg/mL-20mg/mL的浓度加入。而且，如果需要也可以加入其它蛋白酶。使用于蛋白酶处理的pH可以是未调节的pH。或者，为了达到所使用的蛋白酶作用的适宜的pH，例如，可以用适宜的pH调节剂例如盐酸、乙酸、硫酸、氢氧化钠或氢氧化钾将pH调节至pH 2-pH 9而优选pH 3-pH 8。处理也可以在温度范围例如20℃-50℃之间进行。根据所使用的酶，处理也可以在45℃-70℃的较高温度范围进行。处理时间可以是足以使糖化蛋白变性的任何时间。具体来说，处理可以进行1-180分钟而优选2-60分钟。可以直接使用由此获得的处理溶液，或者如果需要，在进行适当的加热、离心、浓缩、稀释等后间接使用。

随后，可以对通过上述方法获得的α-糖化二肽的量进行测定。

只要能够测定α-糖化二肽的量，任何方法都是可以使用的。以高度精确的方式、用简单的程序、以低成本、在短时间内测定α-糖化二肽的量的优选方法的实例包括使氧化酶作用于α-糖化二肽的方法和使用HPLC的方法。

首先，描述使氧化酶作用于α-糖化二肽的方法。

使氧化酶作用于上述α-糖化二肽，然后测定由所述作用获得的产物或所消耗的产物的量，由此使得能够通过酶促方法测定糖化二肽的量。作为氧化酶，任何酶都是可以使用的，条件是其特异性地作用于α-糖化二肽以催化产生过氧化氢的反应。

这样的酶的实例包括由公开于JP专利公开(Kokai)2001-95598A的由大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(pFP1)(FERM P-17576)制备的果糖基肽氧化酶，和公开于JP专利公开(Kokai)2003-235585A的果糖基肽氧化酶。

除了上述实例以外，通过研究自然界中的微生物或通过研究得自由动物或植物的酶，可以获得特异性地作用于α-糖化二肽以催化产生过氧化氢的反应的酶。而且，通过研究获得的这样的酶可以用基因重组技术获得，并且由此获得的重组酶也可以适当的予以使用。而且，通过修饰已知的果糖基氨基酸氧化酶等也可以获得这样的酶。这样的已知的果糖基氨基酸氧化酶等的实例包括由棒状杆菌属细菌产生的氧化酶(JP专利公开(Kohyo)5-33997B(1993)和JP专利公开(Kohyo)6-65300B(1994))，由曲霉属菌株产生的氧化酶(JP专利公开(Kokai)3-155780A(1991))，由赤霉菌属菌株产生的氧化酶(JP专利公开(Kokai)7-289253A(1995))，由镰孢属菌株产生的氧化酶(JP专利公开(Kokai)7-289253A(1995)和JP专利公开(Kokai)8-154672A(1996))，由青霉菌属菌株产生的氧化酶(JP专利公开(Kokai)8-336386A(1996))，和酮胺氧化酶(JP专利公开(Kokai)5-192193A(1993))。

为了通过修饰已知的果糖基氨基酸氧化酶等获得作用于α-糖化二肽的氧化酶，将能够产生上述已知果糖基氨基酸氧化酶等的微生物暴露于紫外线、X射线、放射等。或者，使这样的氧化酶与突变剂例如甲磺酸乙酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸接触，以进行突变处理。产生作用于α-糖化二肽的氧化酶的微生物选自由此获得的突变微生物。然而，一般说来，作用于α-糖化二肽的氧化酶可以通过将突变引入基因(下文称作野生型基因)例如上述已知的果糖基氨基酸氧化酶的基因等获得。任何野生型基因同样可以被用于引入突变，条件是所述野生型基因是上述果糖基氨基酸氧化酶或所属氧化酶类似物的野生型基因，例如，所述野生型基因能够通过引入突变获得作用于α-糖化二肽的氧化酶。

通过下述方法，可以测定作用于α-糖化二肽的果糖基肽氧化酶的效价。这样的效价也可以通过其它方法加以测定。

(1)试剂的制备

试剂1(R1)：把1.0kU过氧化物酶(下文缩写为POD，由KIKKOMAN CORPORATION生产)和100mg 4-氨基安替比林(下文缩写为4AA，由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.生产)溶解于0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中。将所得溶液制备成1L的恒定体积。

试剂2(R2)：把500mg TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-间甲苯胺，由DOJINDO LABORATORIES生产)溶解于离子交换水中。将所得溶液制备成100mL的恒定体积。

试剂3(R3)：将1.25g果糖基Val-His(MW416，其制备将在下面描述)溶解于离子交换水中。将所得溶液制备成10mL的恒定体积。

(2)测定

把100μL R2加到2.7mL R1中。另外加入100μL含有果糖基肽氧化酶的酶溶液并将溶液充分混合，然后在37℃预热5分钟。

随后，加入100μL R3并与溶液充分混合。用分光光度计(U-2000A，由Hitachi，Ltd.生产)测量在555nm的吸收度变化(在37℃与R3反应前和反应5分钟后测定的吸收度之间的差异)。另外，进行对照溶液的类似程序，只是加入100μL离子交换水代替100μLR3。通过绘制反映在先前制备的过氧化氢标准溶液的各种浓度下产生的色素的量的吸收度，获得曲线图。以这样的曲线图为基础，获得与吸收度变化相对应的过氧化氢的量。这些数值被用作酶溶液中的活性单位。在1分钟产生1μmol过氧化氢的量被确定为1U。

通过使上述果糖基肽氧化酶作用于通过本发明蛋白酶处理而释放出的α-糖化肽，可以测定样本中α-糖化肽的量。而且，通过测定样本中α-糖化肽的量，可以比较蛋白酶切除α-糖化肽的效率。本文使用的果糖基肽氧化酶的量取决于处理溶液中所含的α-糖化肽的量。例如，可以将果糖基肽氧化酶以0.1U/mL-50U/mL，优选1U/mL-10U/mL的最终浓度加入。使氧化酶产生作用时所使用的pH例如可以为pH 3-pH 11，优选pH 5-pH 9。考虑到果糖基肽氧化酶的最适宜的pH，优选用缓冲液调节pH以达到适合用于测定的pH。然而，只要pH能够使这样的氧化酶产生作用，pH不限于这样的pH。调节pH的方法没有特别限制。这样的缓冲剂的实例包括N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、三(羟基甲基)-氨基甲烷、硼酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸二甲酯、三羟甲基甘氨酸和HEPES。而且，如果需要，也可以将蛋白酶处理后的处理溶液的pH调节在上述pH。

例如，作用时间范围在1-120分钟，优选1-30分钟之间，并且取决于被用作底物的糖化肽的量。只要足以使果糖基肽氧化酶作用于这样的肽，任何时间都是可以使用的。例如，作用温度范围在20℃-45℃之间。可以适宜地选择用于一般酶促反应的温度。

也可以用任何方法测定通过果糖基肽氧化酶的作用产生的过氧化氢的量。这样的方法的实例包括使用氧电极的电方法，和优选使用过氧化物酶和适当的生色底物的酶促方法。例如，在本发明中，优选使用程序简单且时间短的酶促方法进行测定。用酶促方法测定过氧化氢的量的试剂的实例是由5mM-500mM而优选50mM-100mM缓冲剂(优选pH 4-pH 10)、0.01mM-50mM而优选0.1mM-20mM作为生色底物的4-氨基安替比林、0.1U/mL-50U/mL而优选1U/mL-20U/mL过氧化物酶等组成的。

用于本发明的缓冲剂的实例包括N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、三(羟基甲基)-氨基甲烷、硼酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸二甲酯、三羟甲基甘氨酸和HEPES.生色底物的实例，除了4-氨基安替比林以外，包括ADOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-间茴香胺)、ALOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)苯胺)、10-(羧基甲基-氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(DA-67)、N-(羧基甲基-氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯基胺(DA-64)。而且，如果需要，在不损害本发明目的的范围内，可以适当地加入各种添加剂，包括增溶剂、稳定剂、表面活性剂(例如triton X-100、bridge 35、Tween80或胆酸盐)、还原剂例如(例如二硫苏糖醇、巯基乙醇或L-半胱氨酸)、牛血清白蛋白、糖类(例如甘油、乳糖或蔗糖)等。

当进行过氧化氢的量的测定时，一般情况下，优选同时进行通过氧化酶的作用产生过氧化氢的步骤.在本发明中，例如，优选将果糖基肽氧化酶以0.1U/mL-50U/mL，优选1U/mL-10U/mL的量加到上述测定过氧化氢的量的试剂中。

这些试剂可以干燥的形式或以溶解状态使用，或者也可以薄膜上的载体例如浸渍以试剂的纸(例如可浸渍的纸片)的形式使用。也可以通过标准方法将用于测定试剂中的酶固定然后重复使用。例如，用于测定的温度范围在20℃-45℃之间。这样的温度可以适宜地选自用于一般酶促反应的温度。测定所要求的时间可以根据各种测定条件适宜地加以选择。例如，用于测定的这样的时间范围可在0.1-60分钟，优选1-10分钟之间。用分光光度计测定上述测定试剂的颜色显色程度(吸收度的变化量)。将结果与标准吸收度对比。如此，样本中所含的糖化肽或糖化蛋白的量就得以测定。也可以将通用的自动分析仪用于测定。

随后，将描述通过HPLC测定释放的糖化肽的量的方法。

如果需要，在将处理溶液离心过滤或薄膜过滤，然后适当地浓缩和/或稀释之后，将含有释放的糖化肽的处理溶液直接或间接地用于HPLC测定。只要能够测定上述糖化肽的量，本发明中使用的HPLC可以是任何HPLC。

本文使用的反相HPLC柱的实例包括CAPCEL-PAK C-18(由Shiseido Co.，Ltd.生产)、TSKgel ODS80Ts(由TOSOHCORPORATION生产)、和Shodex RSpak RP18-415(由SHOWADENKO K.K.生产)。本文使用的离子交换HPLC柱包括TSKgelSP-2SW和TSKgel CM-2SW(由TOSOH CORPORATION生产)。在蛋白酶处理溶液被吸附到这样的柱上后，将目标糖化肽用洗脱剂洗脱。只要在本发明中适合于测定，洗脱剂可以是任何洗脱剂。用于反相柱的这样的洗脱剂的实例，包括含有三氟乙酸的乙腈与水的混合溶液、磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液以及氨水溶液与乙腈的混合溶液。用于离子交换柱的这样的洗脱剂的实例，包括磷酸盐缓冲液与NaCl溶液的混合溶液以及乙酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液。通过使用这样的洗脱液，可以进行分段或梯度洗脱。优选的洗脱剂的实例包括0.1％TFA(三氟乙酸)/水至0.1％TFA/30％乙腈的梯度洗脱剂等。用于本发明的柱、洗脱剂、洗脱条件(例如洗脱方法、洗脱剂的流速和温度)等是适当组合的。因此，优选对条件进行这样的设置，以便在所述条件下目标α-糖化肽的洗脱峰与其它组分的峰尽可能的远。

只要能够测定糖化肽，可以使用任何方法测定用洗脱剂洗脱的糖化肽。本文使用的这样的方法的实例包括探测在210nm、215nm等的波长的吸收度的方法，抽样每一探测峰然后将所得物进行质谱分析以确定目标分子量的峰的方法，将洗脱的产物进行薄层色谱分析的方法，和按时间取样洗脱级分然后用茚三酮法或糖染色法进行比色分析的方法。例如，当使用探测吸收度的方法时，计算由监测器探测的糖化肽的洗脱峰面积。将结果与标准物质的洗脱峰面积进行比较，然后可以测定糖化肽和糖化蛋白的量。

实施本发明的最佳方式

通过参考制备实施例和实施例，对本发明进行进一步的具体描述。然而，本发明的范围并不受这些实施例的限制。

(制备实施例)制备糖化二肽

通过下面方法制备用于本发明的α-糖化二肽。

把7.0g(27.6mmol)市售二肽(缬氨酰基组氨酸(Val-His)，由BACHEM，Switzerland生产)溶解于14mL水中。将5.8mL乙酸加到该溶液中，然后在约50℃溶解，继之让其澄清。随后，加入120mL乙醇并与溶液混合，然后加入14g(77.8mmol)葡萄糖并与溶液充分混合。

随后，将溶液在封闭的容器中于80℃加热6小时，在此过程中将溶液偶尔搅拌。反应溶液随时间而变成棕色。将反应溶液随时间抽样。适当稀释后，将溶液进行反相高效液相色谱法分析、薄层色谱法分析或质谱分析。由此检测目标糖化二肽的产生。一般情况下，通过6-10小时的热处理可以以较好的产率获得糖化二肽。随后，收集反应溶液然后用旋转蒸发仪将其浓缩15-30倍。将浓缩物吸附到用99.5％乙醇平衡的硅胶柱(体积：2000mL)上。将柱用二倍柱体积的99.5％乙醇洗涤，以便除去混杂的组分例如未反应的葡萄糖。然后相继用3倍柱体积的95％乙醇、3倍柱体积的90％乙醇、3倍柱体积的85％乙醇以及3倍柱体积的80％乙醇进行洗脱。将每一洗脱级分用薄层色谱法、反相高效液相色谱法等进行分析。收集含有目标果糖基Val-His的95％-90％乙醇洗脱的级分。将收集的产物用旋转蒸发仪浓缩并干燥，由此获得大约3g部分纯化的产物。作为质谱分析的结果，发现纯化的产物的分子量为MW 416，其与果糖基Val-His的分子量一致。而且，产物的结构为核磁共振光谱法分析所确认。通过标准方法，用离子交换树脂提高纯化度，将部分纯化的产物吸附并脱吸。将所得物用于随后的试验。而且，通过与上述使用Val的类似方法，获得果糖基Val的部分纯化的产物。

实施例

(实施例1)由糖化六肽释放糖化二肽

为了筛选能够有效切除α-糖化二肽的蛋白酶，使表1所列蛋白酶作用于α-糖化六肽(果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；由PEPTIDEINSTITUTE，INC.生产)。使用果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶测定由此产生的产物的量。

<制备蛋白酶反应样本>

1.8mMα-糖化六肽：12μl

20mg/ml蛋白酶溶液(当该浓度不能够达到时，以尽可能高的浓度制备该溶液，或者当蛋白酶是液体状态时使用同样的浓度)：8μl

100mM磷酸钾缓冲液pH 8.0(将pH按照最佳蛋白酶pH进行适当地改变)：4μl

将上述组分充分混合，然后使其在37℃反应2小时。将所得物在90℃加热处理3分钟，然后离心，由此获得被分离成蛋白酶反应样本的上清液。此外，用蒸馏水代替底物进行类似的程序，由此制备空白样本。

<用于测定蛋白酶反应样本中的糖化二肽和糖化氨基酸的反应的溶液>

100mM磷酸钾缓冲液pH 8.0

45mM 4AA

0.5mM TOOS

1U/ml POD(由KIKKOMAN CORPORATION生产)

0.1U/ml果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶

把145μl用于测定糖化二肽和糖化氨基酸的量的上述反应溶液分配到微量滴定板的孔中。加入5μl上述蛋白酶反应样本并与该溶液充分混合。将所得物在555nm(A₀)进行测定。随后，在30℃温育20分钟，然后将所得物在555nm(A₁)进行测定。用空白样本代替蛋白酶反应样本进行类似的程序，由此获得A₀空白和A₁空白。下式表示作为吸收变化的蛋白酶对α-糖化六肽的作用。

ΔA＝(A₁-A₀)-(A₁空白-A₀空白)

另外，下面四种氧化酶被用于测定糖化产物的量的上述反应中：作为果糖基肽氧化酶的FPOX-C和FPOX-E(两者皆由KIKKOMANCORPORATION生产)；作为果糖基氨基酸氧化酶的FAOX(由KIKKOMAN CORPORATION生产)；和FLOD(由Asahi KaseiCorporation生产)。这些氧化酶在底物特异性方面是不同的。具体说来，FPOX-C和FPOX-E作用于果糖基Val-His和果糖基Val，而FAOX和FLOD只作用于果糖基Val。因此，可以断定，当果糖基Val-His通过上述蛋白酶处理被切除时，将会观察到FPOX-C和FPOX-E的吸收度变化。还可以断定，如果果糖基Val被切除，将会观察到FPOX-C、FPOX-E、FAOX和FLOD的吸收度变化。

表1显示结果(单位；mAbs)

当用FAOX或FLOD通过探测产生的产物来评估蛋白酶的活性时(探测果糖基Val)，获得的所有蛋白酶情况的吸收度变化大约都是0。这表明，被认为从糖化蛋白或糖化肽切除果糖基Val的各种蛋白酶具有非常弱的切除果糖基Val活性。这样的各种蛋白酶是亮氨酸氨肽酶、脱封闭氨肽酶、N-酰基氨基酰基-肽水解酶和组织蛋白酶C(全部公开于JP专利公开(Kokai)2002-315600A)；氨肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B、胃蛋白醇、嗜热菌蛋白酶、赖氨酰内肽酶、proleather和菠萝蛋白酶(全部公开于国际专利公开97/13872单行本)；和丝氨酸羧肽酶(公开于JP专利公开(Kokai)2001-57897A)。

相反，当用FPOX-C或FPOX-E进行探测时(探测果糖基Val-His)，在下列酶的情况下观察到强烈的吸收度变化：作为得自曲霉属的酶的IP酶、AO蛋白酶、肽酶、蛋白酶A5、umamizyme、蛋白酶A、蛋白酶M、蛋白酶P、sumizyme MP、sumizyme LP-20和蛋白酶6；作为得自Rhizopas的酶的肽酶R；作为得自芽孢杆菌属的酶的分散酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶N、蛋白酶VII型、蛋白酶(Bacterial)、蛋白酶N、蛋白酶X型、嗜热菌蛋白酶、链酶蛋白酶E和中性蛋白酶；作为得自链酶菌属的酶的链酶蛋白酶、蛋白酶XIV型和碱性蛋白酶；作为得自Tritirachium的酶的蛋白酶K；作为得自植物的酶的木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶；和得自动物的酶的胰酶和组织蛋白酶B。

在下列酶的情况下，观察到较弱的吸收度变化：作为得自曲霉属的酶的molsin、sumizyme LPL和sumizyme AP；作为得自芽孢杆菌属的酶的proleather FG-F；作为得自葡糖球菌属的酶的Glu-C；和作为得自植物的酶的菠萝蛋白酶。如上面所述，证明通过上述蛋白酶处理，α-糖化二肽能够被有效地从α-糖化六肽切除。

(实施例2)蛋白酶以较短的反应时间切除糖化二肽的活性

为了筛选在较短的反应时间内能够有效地切除α-糖化二肽的蛋白酶，进行与实施例1类似的不改变其各种条件的试验。然而，将蛋白酶的反应时间由2小时缩短至5分钟。反应后测定α-糖化二肽和α-糖化氨基酸的量。结果由下列等式表示(类似于实施例1)

ΔA＝(A₁-A₀)-(A₁空白-A₀空白)

同时将结果概括于表2(单位；mAbs)。

表2

作为与JP专利公开(Kokai)2003-235585A中公开的得自曲霉属的蛋白酶(AO蛋白酶、肽酶和molsin)比较的结果，得自曲霉属的蛋白酶(蛋白酶P和sumizyme MP)显示比AO蛋白酶情况下高大约5倍的吸收度变化，得自芽孢杆菌属的蛋白酶(分散酶、蛋白酶N和蛋白酶S)显示比AO蛋白酶情况下高4-5倍的吸收度变化，得自Tritirachium的蛋白酶(蛋白酶K)显示几乎与AO蛋白酶情况下相等的吸收度变化，而得自植物的蛋白酶(木瓜蛋白酶)显示比AO蛋白酶情况下高大约4倍的吸收度变化。因此，证明使用上述蛋白酶能够在较短的时间内有效地切除糖化二肽。这表明以较高的敏感性在较短的时间内测定糖化蛋白或糖化肽的量是可能的。

(实施例3)用HPLC确认糖化二肽的释放

把上述α-糖化六肽溶解于水中以制备5mM溶液。加入0.01mL蛋白酶溶液(木瓜蛋白酶(由Roche生产)、无花果蛋白酶(由Sigma-Aldrich Corporation生产)或分散酶(由Roche生产))和0.09mL缓冲液(0.1M)并与0.1mL每一种上述溶液混合。这样，进行蛋白酶处理。将上述混合物在37℃反应60分钟。随后，将每一处理的溶液适当浓缩并稀释，然后进行HPLC测定。为了进行HPLC(反相高效液相色谱法)，使用CAPCEL-PAK C-18(由Shiseido Co.，Ltd.生产)。将所得物用0.1％TFA(三氟乙酸)/水至0.1％TFA/30％乙腈作为洗脱剂进行梯度洗脱。作为标准物质，使用α-糖化二肽(果糖基Val-His)。作为结果，确认通过用处理溶液中的每一种蛋白酶(木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或分散酶)处理，α-糖化二肽(果糖基Val-His)已经被释放出来。

(实施例4)用蛋白酶和氧化酶测定糖化六肽的量

通过下面的试验，确定是否能够用实施例1和2中筛选的蛋白酶和果糖基肽氧化酶测定糖化六肽的量。

<蛋白酶反应>

1.8mMα-糖化六肽

3U/ml木瓜蛋白酶(由Roche生产)：8μl

水(至总体积24μl)

用于反应的上述α-糖化六肽的量分别为0、1、2、3、4、5、6和7μl样本。加入8μl木瓜蛋白酶和水至总体积为24μl。让溶液在37℃反应10分钟，在90℃进行热处理5分钟，然后进行离心，由此获得作为蛋白酶反应样本的上清液。此外，用蒸馏水代替底物进行类似的程序，由此制备空白样本。

<用于测定蛋白酶反应样本中糖化二肽的反应的溶液>

100mM磷酸钾缓冲液pH 8.0

45mM 4AA

0.5mM TOOS

1U/ml POD(由KIKKOMAN CORPORATION生产)

0.1U/ml果糖基肽氧化酶，FPOX-C(由KIKKOMANCORPORATION生产)

把145μl用于测定上述糖化二肽的反应的溶液分配到微量滴定板的孔中。将5μl上述蛋白酶反应样本加到每一孔中。充分混合后，将所得物在555nm(A₀)进行测定。随后，在30℃温育20分钟，继之在555nm(A₁)进行测定。此外，用空白样本代替蛋白酶反应样本进行类似的程序，由此获得A₀空白和A₁空白。当将蛋白酶对α-糖化六肽的作用用吸收度变化表示时，获得下式。

ΔA＝(A₁-A₀)-(A₁空白-A₀空白)

图1显示在每一浓度α-糖化六肽的量的测定结果。如图1所示，在ΔA与α-糖化六肽的浓度之间存在线性关系。具体说来，表明通过上述蛋白酶处理切除α-糖化二肽，能够以高度精确的方式在短时间内测定α-糖化六肽的量。

如上所述，表明关于已知通过对HbA1c进行内切蛋白酶Glu-C处理获得的α-糖化六肽，通过对α-糖化六肽进行本发明蛋白酶处理而不用进行毛细电泳或质谱法分析，使酶促更方便的HbA1c测定成为可能。

(实施例5)通过用Glu-C和中性蛋白酶处理HbA1c来制备α-糖化二肽

通过下面的试验证明通过使Glu-C和中性蛋白酶作用于HbA1c是否能够产生α-糖化二肽。

<蛋白酶反应>

14.4％HbA1c溶液(由KYOWA MEDEX CO.，LTD.生产)：44μl

0.5mg/ml Glu-C(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)：36μl

150Mm乙酸铵(pH 4.0)：8μl

将混合的溶液在37℃温育过夜。随后，把352μl中性蛋白酶(2.4U/ml分散酶；由Roche生产)加到溶液中，然后将溶液搅拌。而且，将溶液在37℃温育过夜。然后将溶液在92℃加热处理5分钟，之后以12,000rpm离心5分钟，由此获得作为样本的上清液。此外，用蒸馏水代替Glu-C或分散酶进行类似的程序，由此制备空白样本。

<测定蛋白酶反应样本中所含α-糖化二肽的反应>

如下制备用于测定反应的溶液。另外，使用R1中的FAOX和过氧化氢酶以除去掺杂在样本中的糖化氨基酸。

R1：

50mM POPSO缓冲液(pH 7.5)(由DOJINDO LABORATORIES生产)

5U/ml FAOX(由KIKKOMAN CORPORATION生产)

300U/ml过氧化氢酶(由KIKKOMAN CORPORATION生产)

R2：

100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)由Nacalai Tesque，Inc.生产)

0.1mM DA-64(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)

10mM Ca-EDTA(由DOJINDO LABORATORIES生产)

150U/ml POD(由KIKKOMAN CORPORATION生产)

0.15％NaN₃(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)

40U/ml果糖基肽氧化酶，FPOX-E(由KIKKOMANCORPORATION生产)

把216μl R1加到30μl样本中。反应5分钟后，加入80μl R2并与溶液混合。让溶液在37℃反应5分钟。用Hitachi自动分析仪(型号7070)测定在750nm的增加的吸收度(ΔAbs)(与R2反应前和反应后测定的吸收度之间的差别)。这样，增加的吸收度发现为0.007。相反，在空白样本的情况下ΔAbs为0。此外，甚至当将FPOX-C(由KIKKOMAN CORPORATION生产)用作果糖基肽氧化酶时也获得类似的结果。

因此，证明通过用Glu-C和中性蛋白酶处理HbA1c能够产生α-糖化二肽。同时还证明用FPOX-E和-C能够测定产生的α-糖化二肽的量。

(实施例6)通过用中性蛋白酶处理HbA1c来制备α-糖化二肽

使Glu-C和中性蛋白酶作用于实施例5中的HbA1c。在本实施例中，用下面的实验来检验通过使中性蛋白酶单独作用于HbA1c是否能够产生α-糖化二肽。

<蛋白酶反应>

14.4％HbA1c溶液(由KYOWA MEDEX CO.，LTD.生产)：88μl

2.4U/ml中性蛋白酶(分散酶；由Roche生产)：352μl

将混合的溶液在37℃温育过夜。然后将溶液在92℃加热处理5分钟，然后以12,000rpm离心5分钟，由此获得作为样本的上清(此中所用HbA1c的量是实施例5中所用量的2倍)。此外，用蒸馏水代替中性蛋白酶进行类似的试验，由此制备空白样本。

<测定蛋白酶反应样本中所含α-糖化二肽的反应>

此中所用R1和R2与实施例5中所用相同。

把216μl R1加到30μl样本中。处理5分钟后，加入80μl R2并与溶液混合。让溶液在37℃反应5分钟。结果，发现在750nm测定的增加的吸收度(ΔAbs)(与R2反应前和反应后所测定的吸收度之间的差别)为0.007。相反，在空白样本的情况下ΔAbs为0。该蛋白酶处理中所用HbA1c的量是实施例5中所用量的2倍。然而，观察到ΔAbs(＝0.007)与实施例5中的ΔAbs相等。而且，甚至当FPOX-C(由KIKKOMAN CORPORATION生产)被用作果糖基肽氧化酶时也观察到类似的结果。因此，证明通过单独使用中性蛋白酶处理HbA1c能够产生α-糖化二肽。同时还证明用FPOX-E和-C能够探测产生的α-糖化二肽。

(实施例7)用FPOX测定HbA1c的量

把HbA1c对照(用于测定因子HbA1c的量的校准物；由KYOWAMEDEX CO.，LTD.生产)溶解于标本(specimen)(由KYOWAMEDEX CO.，LTD.生产)的稀释的溶液中。制备不同浓度(0.0％、4.1％、7.8％、11.3％和14.4％)的五种HbA1c溶液。用这些溶液进行下面的步骤。

<蛋白酶反应>

每一HbA1c溶液：44μl

2.4U/ml中性蛋白酶(分散酶；由Roche生产)：176μl

把混合的溶液在37℃温育过夜。将溶液在92℃热处理5分钟，然后以12,000rpm离心5分钟，由此获得作为样本的上清液。此外，用蒸馏水代替中性蛋白酶进行类似的步骤，由此制备空白样本。

<测定蛋白酶反应样本中所含α-糖化二肽的反应>

此中所用R1和R2与实施例5中所用相同。

把216μl R1加到30μl每一样本中。处理5分钟后，加入80μl R2并与溶液混合。让该溶液在37℃反应5分钟。作为结果，在750nm测定增加的吸收度(ΔAbs)(与R2反应前和反应后所测定的吸收度之间的差别)。图2显示HbA1c的浓度与通过该方法获得的ΔAbs之间的关系。图2显示HbA1c浓度与产生的过氧化氢的量之间存在相关性。另外，在空白样本中通过类似步骤获得的ΔAbs总是0，在空白样本中是将蒸馏水代替中性蛋白酶加到不同浓度的HbA1c溶液中。

本文引用的全部公开、专利和专利申请都全文引用做参考。

工业实用性

按照本发明，提供了制备α-糖化二肽的方法，所述方法能够简单、快速且高效地由糖化蛋白或糖化肽制备α-糖化二肽。而且，按照本发明，提供了测定α-糖化二肽的量的方法，所述方法能够以高度精确的方式在短时间内测定α-糖化二肽的量。这样的测定方法在N-末端糖化肽、蛋白、蛋白亚单位等例如HbA1c的量的测定方面是特别有效的。

附图的简要描述

图1显示了测定α-糖化六肽的量的结果。

图2显示了测定HbA1c的量的结果。

Claims (5)

1.制备α-糖化二肽的方法，所述方法包括使选自下列一种或多种类型的蛋白酶作用于N-末端糖化肽或N-末端糖化蛋白：得自曲霉属的蛋白酶P、Sumizyme MP、蛋白酶M、Sumizyme LP-20、蛋白酶6，得自芽孢杆菌属的分散酶、蛋白酶N、蛋白酶S、蛋白酶X型、嗜热菌蛋白酶，得自根菌属(Rhizopas)的肽酶R，得自链霉菌属的蛋白酶XIV型，得自Tritirachium的蛋白酶K和得自番木瓜的木瓜蛋白酶。

2.权利要求1的制备α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化肽是果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu。

3.权利要求1的制备α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化蛋白是糖化血红蛋白。

4.权利要求1-3的制备α-糖化二肽的方法，其中所述α-糖化二肽是果糖基缬氨酰组氨酸。

5.根据权利要求1的制备α-糖化二肽的方法，所述方法还包括使果糖基肽氧化酶作用于制备的α-糖化二肽，从而产生过氧化氢，然后测定产生的过氧化氢的量。

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