WO2004038033A1 - 脱フルクトシル化方法 - Google Patents

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WO2004038033A1
WO2004038033A1 PCT/JP2003/013547 JP0313547W WO2004038033A1 WO 2004038033 A1 WO2004038033 A1 WO 2004038033A1 JP 0313547 W JP0313547 W JP 0313547W WO 2004038033 A1 WO2004038033 A1 WO 2004038033A1
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protein
plant
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Hiroyuki Ebinuma
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Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for defructosylation of a fructosylylated peptide or protein by an enzyme, a novel enzyme having the action thereof, and a fructosylich by measuring a reaction product obtained by the method.
  • the present invention relates to a method for measuring a peptide or protein that has been used. Background art
  • Hemoglobin (Hb) Ale is an Amadori transfer product that is stabilized by the non-enzymatic formation of a Schiff base between the amino group of the / 3 chain N-terminal palin and the aldehyde group of Darcos, and then Amadori transfer. As a result, it is a glycated protein having a structure in which fructose is bound to a palin residue. Since HbAlc clinically reflects the average blood glucose level in the past one to two months, it is important as an index for diabetes management, and a rapid, simple, accurate and practical quantification method is required.
  • I FCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • G1u-C endoprotease G1u-C and suspects the presence of fructosylvaline / 3-chain N-terminal 6-peptide
  • HbA1c Keld U., et al; Candidate reference methods for hemoglob mAlc based on peptide map ing. Clin. Chem., 43, 1944-1951 (1997)).
  • this method requires special equipment, is complicated, is not economical, and is not suitable for practical use.
  • an object of the present invention is to provide a defructosyl effect on fructosylated proteins such as HbA1c and fructosylated peptides of various lengths which are cut out when the fructosylated protein is degraded by a protease.
  • An object of the present invention is to provide an enzyme having the following, a defructosylation method using the enzyme, and a method for measuring a fructosylated peptide or protein using the defructosylation reaction.
  • the present inventors have searched for enzymes from nature to achieve the above object, and found that enzymes having a defructosyl effect such as FA ⁇ D reported so far were derived from microorganisms. Therefore, there are enzymes that have a defructosyl effect in plants such as Rosaceae, Grapes, and Apiaceae, and enzymes derived from such plants are irrespective of the length of the fructosylpeptide peptide chain.
  • the present inventors have found that they exhibit fructosyl action and completed the present invention. That is, the present invention provides a method for defructosylation, which comprises causing an enzyme having a defructosyl action extracted from a plant to act on a fructosylated peptide or protein.
  • the present invention also provides an enzyme having a defructosyl effect on a fructosylated peptide or protein, which is derived from a plant.
  • the present invention further provides a method for measuring a fructosylated peptide or protein, which comprises measuring one or more reaction products obtained by the above defructosylation method. It is.
  • N-terminal valine can be defructosylated from a fructosylated peptide or protein. Furthermore, by quantifying the reaction product, peptides, proteins, protein subunits, etc., in which valine at the N-terminal is fructosylated, such as HbAlc, can be accurately quantified.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of reaction solution 1 in which a defructosylation enzyme derived from a Rosaceae plant was allowed to act on fructosyl dipeptide (f-VH).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of control solution 1 in which purified water was allowed to act on fructosyl dipeptide (f-VH).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of reaction solution 2 in which a defructosylation enzyme derived from a Rosaceae plant was allowed to act on fructosyl tripeptide (f—VHL).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of control solution 2 in which purified water was allowed to act on fructosyl tripeptide (f-VHL).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of Reaction Solution 3 in which a defructosylase derived from a Rosaceae plant was allowed to act on fructosyltetrapeptide (f-VHLT).
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of control solution 3 in which purified water was allowed to act on fructosyltetrapeptide (f-VHLT).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of reaction solution 4 in which a fructosyl pentapeptide (f-VHLTP) was reacted with a defructosylation enzyme derived from a Rosaceae plant.
  • f-VHLTP fructosyl pentapeptide
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of control solution 4 in which purified water was allowed to act on fructosyl pentapeptide (: f-VHLTP).
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of reaction solution 5 in which a defructosylation enzyme derived from a Rosaceae plant was allowed to act on fructosylhexapeptide (f-VHLTPE).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of Control Solution 5 in which purified water was allowed to act on fructosylhexapeptide (i-VHLTPE).
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of reaction solution 6 obtained by reacting a fructosyl dipeptide (f-VH) with a defructosylation enzyme derived from a plant of the family Pudaceae.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of control solution 6 in which purified water was allowed to act on fructosyl dipeptide (f-VH).
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of capillari electrophoresis of the reaction solution 7 in which a fructosyl dipeptide (f-VH) was acted on by a defructosylation enzyme derived from a Umbelliferae plant.
  • f-VH fructosyl dipeptide
  • de-fructosyl refers to a fructosyl amino acid or fructosyl amino acid. From a tosyl peptide (ie, a fructosylated amino acid or peptide), it means that the fructosyl moiety undergoes oxidative degradation, hydrolysis, etc., resulting in the production of a non-fructosylated amino acid or peptide. .
  • the enzyme used in the present invention (referred to as “defructosylase”) is not particularly limited as long as it has a defructosyl action on fructosylated peptides or proteins, but may be of various lengths.
  • a plant-derived defructosylation enzyme is preferred because it acts on the fructosyl peptide of
  • the plant containing the enzyme of the present invention is not particularly limited, but a plant belonging to the family Rosaceae, Podoaceae or Apiaceae is particularly preferred. Plants belonging to the family Rosaceae include apples, pears, peaches and plums. Grapes and ivy are examples of plants belonging to the grape family.
  • Plants belonging to the Apiaceae family include carrots, apis, and trefoil.
  • the site is not particularly limited as long as it contains a defructosylase, and sites such as fruits, leaves, stems, flowers, rhizomes and roots can be used.
  • processed products of these plants for example, juices of extract liquids and freeze-dried preparations can also be used.
  • the above plant can be directly crushed and an extract can be obtained by a treatment such as squeezing.However, it is crushed after adding an appropriate buffer or the like. Can also be extracted.
  • a treatment such as squeezing.However, it is crushed after adding an appropriate buffer or the like. Can also be extracted.
  • a purification method a known method can be used, and a suitable combination of ammonium sulfate fractionation, column chromatography such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite gel, and gel filtration can be used.
  • glycated proteins can be Even if fructosyl peptides of various lengths are produced during digestion, the enzyme of the present invention acts on all of them, so that addition of another protease and processing time for shredding are required. This eliminates the need to spend, and improves the efficiency of saccharification protein measurement. In addition to clinical tests, it can be applied to various fields such as medical care.
  • the defructosylase of the present invention has the effect of deoxidizing and deoxidizing hydrogen peroxide and darcosone, as in FAOD, when defructosylating the fructosyl peptide as a substrate. May be. It is particularly preferable to have this action because the generated hydrogen peroxide can be led to an enzymatic assay system using a known peroxidase or the like.
  • an enzyme having an action of defructosylating a fructosyl peptide by hydrolysis can also be used, and glucose generated by this action can be measured using glucose oxidase or the like.
  • the fructosylidani peptide or fructosylidani protein used in the defructosylation method of the present invention is not particularly limited as long as the defructosylidari enzyme acts, but the / 3 chain N-terminal valine of hemoglobin is fructosylated. Especially preferred are fructosyl peptides and HbAlc.
  • the number of amino acids is not limited to the peptide in which the N-terminal valin is fructosylated, but those whose amino acid sequences are represented by SEQ ID NOS: 1 to 5 are particularly preferable.
  • the peptide in which the N-terminal valine is fructosylated is treated with a peptide or protein having such a sequence, for example, HbAlc by using an appropriate endoprotease or exoprotease, or the like.
  • a protee or protein having such a sequence for example, HbAlc
  • proteases include elastase, proteinase 1 :, pepsin, alkaline protease, trypsin, proline-specific endprotease, V8 protease, lipoxypeptidase A, lipoxypeptidase B, and the like.
  • the amount of activity of these proteases for the above preparation is preferably from 0.05 to: L 00 O UZml ⁇ , particularly preferably from 10 to 2000 UZmL.
  • the fructosylated peptide or protein can be
  • the treatment temperature is preferably from 20 to 50 ° C, particularly preferably from 30 to 40 ° C, among the conditions for the action of the enzyme.
  • the processing time is preferably from 3 minutes to 100 hours, particularly preferably from 5 minutes to 20 hours.
  • the generated defructosyl peptides are detected by separating and identifying them by HPLC or capillary electrophoresis.
  • the released amino acid may be detected and measured by reacting the defructosyl peptide with an appropriate lipoxypeptidase.
  • glutamic acid G 1 u
  • proline Pro
  • Threonine Th r
  • Leucine Leu
  • His histidine
  • Glu is a glutamate dehydrogenase
  • Leu is a leucine dehydrogenase
  • Va1 is a palin dehydrogenase, producing NADH or NADPH. It is also possible to detect and measure by measuring the amount. Further, with respect to dalcosone and glucose generated by defructosylation, the generated hydrogen peroxide can be detected and measured using glucose oxidase or the like using a peroxidase coloring system. One example is the following method.
  • the enzyme of the present invention is allowed to act on the fructosyl peptide as a substrate, and 300 L of the reaction solution heated for a certain period of time is prepared in advance at 750 L of 20 OmM acetate buffer (pH 6.0), 750 L, 4000 u / mL glucose oxidase. (Toyobo) 450 L, 0.15% 4-Aminoantipyrine 300 L, 0.3 TOOS (Dojin Chemical Add 300 L, 500 u / mL peroxidase (Toyobo Co., Type 111) 300 II L and 1% sodium azide 300 L, heat at 37 for 10 minutes, and absorbance at 55 Onm. Is measured. Perform the same operation as above except that purified water is added instead of the substrate, and use as a control. Enzyme reaction product of the amount of generated dye
  • the amount is converted from a calibration curve prepared by performing the above operation using a dilution series of glucose as a substrate and adding purified water instead of the enzyme of the present invention.
  • a defructosylase that generates hydrogen peroxide is used during the defructosyl reaction, directly generated hydrogen peroxide can be detected and measured using a known peroxidase coloring system. is there.
  • the peroxidase (POD) coloring system is not particularly limited, but a method of adding a chromogen and POD to the reaction system, oxidizing the chromogen to generate a color-forming substance, and measuring this is preferable. is there.
  • the chromogens include 4-aminoantipyrine, a phenolic compound, and naph! ⁇ Combination with a nitrile compound or an aniline compound, combination of MBTH (3-methyl_2-benzothiazolinone hydrazone) and an aniline compound, leucomethylene blue, or the like is used. Further, as described in Patent No.
  • trivalent cobalt ions generated by the reaction of hydrogen peroxide with divalent cobalt ion in the presence of POD are converted into specific trivalent cobalt ions.
  • an indicator such as TASBB (tri-sodium 2- (2-thiazolylazo) -5-disulfoptylaminobenzoate)
  • TASBB tri-sodium 2- (2-thiazolylazo) -5-disulfoptylaminobenzoate
  • a color-forming chelate compound can be generated, and a method for measuring this can be used. According to this method, measurement sensitivity 5 to 10 times that of the above method can be obtained.
  • TPM-PS N, N, ⁇ ', ⁇ ', N ", N" one-hexa (3-sulfopropyl) 1-4, 4 ,, 4 "-triaminotriphenylmethane
  • TPM-PS N, N, ⁇ ', ⁇ ', N ", N" one-hexa (3-sulfopropyl) 1-4, 4 ,, 4 "-triaminotriphenylmethane
  • a peptide or protein in which N-terminal valine is fructosylated for example, HbAlc can be quantified with extremely high accuracy.
  • the test sample used for the quantification of HbAlc includes, for example, whole blood, red blood cells, and the like.
  • the pulp portion was crushed with a mixer, and the solids were removed by centrifugation to obtain an extract. This was used as a crude purified enzyme.
  • the carrot rhizome was directly crushed with a juicer, and the solids were removed by centrifugation to obtain a crude extract.
  • the crude extract was filtered using a Myrex filter (0.45 m) (manufactured by Millipore) to obtain a clear extract.
  • 4 mL of cold ethanol was added to 3 mL of this extract, and the resulting precipitate was removed by centrifugation.
  • Cold ethanol was further added to the obtained supernatant, and the resulting precipitate was obtained by centrifugation.
  • a small amount of 2 OmM phosphate buffer (pH 7.0) was added to the resulting precipitate. And dissolved to obtain a crudely purified enzyme.
  • reaction solutions 1 to 5 were run on a capillary electrophoresis apparatus CAP I-3200 (manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.) using electrophoresis buffer: 15 OmM phosphate buffer (pH 2.0), voltage: 15 kv, detection wavelength: 210
  • electrophoresis buffer 15 OmM phosphate buffer (pH 2.0)
  • voltage 15 kv
  • detection wavelength 210
  • the analysis was performed under the condition of nm, and the peak position and the peak area were measured.
  • control solutions 1 to 5 As a control, purified water was added in place of the crude enzyme solution, and reacted under the same conditions to obtain a filtrate (control solutions 1 to 5). The analysis results of the control solutions 1 to 5 were compared with the results of the reaction solutions 1 to 5.
  • Each fructosyl peptide used in the enzyme reaction and the control test contained a non-fructosyl peptide, and the presence or absence of the enzyme activity was detected by a change in two peaks.
  • reaction solution 1 The results for reaction solution 1 are shown in FIG. 1, and the results for control solution 1 are shown in FIG.
  • FIG. 2 a peak derived from f-VH (area: 13 mABUXsec) and a peak derived from VH (area: 34 mABUXsec) are recognized, but in FIG. 1, the peak of f-VH decreases (area: 4 mABUXsec). The VH peak was increased (area: 38 mABUXsec).
  • FIG. 3 The result of the reaction solution 2 is shown in FIG. 3, and the result of the control solution 2 is shown in FIG.
  • f A peak derived from VHL (area: 32 niABUXsec) and a peak derived from VHL (area: 22 niABUXsec) are recognized.
  • the peak of f-VHL decreases (area: 7 mABUXsec), and the peak of VHL decreases.
  • Increase area: 34mABUXsec
  • the result of the reaction solution 3 is shown in FIG. 5, and the result of the control solution 3 is shown in FIG.
  • Fig. 6 peaks derived from f-VHLT (area: 38mABUXsec) and peaks derived from VHLT (area: 20mABUXsec) are recognized.
  • Fig. 5 peaks of f-VHLT are reduced (area : 5mABUXsec), and the peak of VHLT increased (area: 32mABUx sec).
  • the result of the reaction solution 4 is shown in FIG. 7, and the result of the control solution 4 is shown in FIG.
  • FIG. 8 peaks derived from f_VHLTP (area: 64 mABUXsec) and peaks derived from VHLTP (area: 23 mABUXsec) are recognized.
  • the peak of f-VHLTP decreases (area: SmABUXsec).
  • the peak of VHLTP increased (area: 57 mABUXsec).
  • FIG. 9 shows the results of the reaction solution 5 and FIG. 10 shows the results of the control solution 5.
  • a peak derived from f-VHLTP E (area: 54 mABUXsec) and a peak derived from VHLTP E (area: 21 mABUXsec) are recognized.
  • the peak of f—VHLTPE decreases ( Area: 9 mABI] Xsec) and the peak of VHLTPE increased (area: 48 mABUXsec).
  • Example 2 The crude purified enzyme obtained in Example 2 was tested under the same conditions as in Example 4. went. However, for peptides in which the N-terminal valine was fructosylated, f-VH was used without VH, and the reaction time was 16 hours at 37 ° C (reaction solution 6). The control test was performed according to Example 4 (control solution 6).
  • reaction solution 6 The results for reaction solution 6 are shown in FIG. 11, and the results for control solution 6 are shown in FIG. In Fig. 12 only peaks derived from f-VH (area 42 mABUX sec) were observed, but in Fig. 11 f-VH peaks decreased (area: 36 mABUX sec) and a new reaction occurred. A peak of the product (area: 4 mABUX sec) was observed. Further, a small amount of VH was added to the reaction solution, and peaks were again confirmed by capillary electrophoresis. The peak of the reaction product coincided with the peak of VH, indicating that the reaction product was VH. Was.
  • fructosyl peptides can be defructosylated by using a defructosylation enzyme derived from a grape plant.
  • the result of the reaction solution 7 is shown in FIG.
  • the result of the control solution was also used in FIG. 12 described above.
  • Fig. 12 only peaks derived from f-VH (area: 42 mABUX sec) are recognized, but in Fig. 13, f-VH peaks are reduced (area: 16 BUX sec), A reaction product peak (area: 16 mABUX sec) was observed. Further, a small amount of VH was added to this reaction solution, and peaks were again increased and confirmed by capillary electrophoresis. The peak of the reaction product coincided with the peak of VH, indicating that the reaction product was VH. It could be confirmed.

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Abstract

本発明は、植物由来の脱フルクトシル化酵素、これを用いたフルクトシル化ペプチド又はタンパク質からの脱フルクトシル化方法、及びフルクトシル化ペプチド及びタンパク質の測定方法に関する。

Description

脱フルク卜シル化方法 技術分野
本発明は、 フルクトシルイ匕されているペプチド又はタンパク質から、 酵素によ り脱フルクトシル化する方法及びその作用を有する新規酵素、 並びに該方法によ り得られた反応生成物を測定することによる、 フルクトシルイヒされているべプチ ド又はタンパク質の測定方法に関する。 背景技術
ヘモグロビン （Hb) Al eは、 その /3鎖 N末端パリンのァミノ基とダルコ一 スのアルデヒド基が、 非酵素的にシッフ塩基を形成した後、 アマドリ転移を生じ て安定化したアマドリ転移生成物であり、 結果的にパリン残基にフルクト一スが 結合した構造を有する糖化タンパク質である。 かかる HbAl cは、 臨床的に過 去 1〜 2ヶ月の平均血糖値を反映することから、 糖尿病管理の指標として重要で あり、 迅速、 簡便かつ正確で実用的な定量法が求められている。
I FCC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) は、 ヘモグロビンをエンドプロテアーゼ G 1 u— Cによ り加水分解して得られる、 フルク卜シルバリンの存在が疑われる /3鎖 N末端の 6 ぺプチドフラグメントを H P L Cにより分離した後、 キヤビラリ一電気泳動法又 は質量分析法で定量する方法を Hb A 1 cの実用基準法 （Kobold U. , et al ； Candidate reference methods for hemoglobmAlc based on peptide map ing. Clin. Chem. , 43， 1944-1951 (1997)) としているが、 この方法は、 特別な装置を 必要とするため、 操作が煩雑で経済性が悪く、 実用には不向きな方法である。 現在、 実用に供されている HbAl cの測定方法は、 疎水基あるいは陽イオン 交換基をもった特殊な硬質ゲルを担体として使用する HP L C法ゃ抗 Hb A 1 c 抗体を使用するラテックス免疫凝集法などであるが、 高価な機器を必要とした り、 多段階の免疫反応を必要とするなど、 迅速性、 簡便性、 正確性を必ずしも満 足する方法ではなかった。
近年、 糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、 糖化アミノ酸に作用するフル クトシルアミノ酸ォキシダーゼ （FAOD) などの酵素を使用して、 HbAl c ゃグリコアルブミンなどの糖化タンパク質を酵素法により測定しょうとする方法 が報告されている （特開平 5—192193号、 特開平 7— 289253号、 特 開平 8— 154672号、 特開平 6— 046846号、 特開平 8— 336386 号、 W 09 7 / 1 3 8 7 2、 WO 0 2 /0 6 5 1 9 , 特開 2 0 0 1— 054398号） 。
これらの方法は、 糖化タンパク質が Hb A 1 c及びグリコアルブミンのいずれ の場合であっても、 FAODなどの酵素が、 糖化タンパク質のままでは作用する ことが困難であるため、 それぞれの糖化タンパク質に特徴的な糖化アミノ酸 (HbAl cにおけるフルクトシルバリン、 グリコアルブミンにおけるフルクト シルリジン） を糖化ペプチドあるいは糖化タンパク質より切り出して、 FAOD などの基質とする方法である。 したがって、 FAODなどの基質となりうるよう に糖化ァミノ酸を効率的に切り出す必要がある。
上記の目的のため、 糖化タンパク質から糖化アミノ酸を効率的に切り出すプロ テア一ゼの探索が試みられ、 多数のプロテアーゼが報告されているが、 これらが 実際に、 糖化アミノ酸あるいは糖化アミノ酸を含むペプチドをどのように糖化夕 ンパク質から切り出している力、、 例えば、 糖化タンパク質から、 どのような長さ のペプチド鎖が切り出されているかについては記載がなく、 その意味から、 前記 記載が実用的なものであるか否かは不明であつた。
一方、 試料をプロテアーゼ処理し、 遊離した糖化ペプチドに、 糖化ペプチドォ キシダーゼを作用させて、 糖化タンパク質を測定しょうとする方法が報告されて いる （特開 2 0 0 1 - 0 9 5 5 9 8号） 。 しかしながら、 この方法に使用されて いる糖化ペプチドォキシダーゼは、 実質的には、 フルクトシルジペプチドに対し て作用するものであり、 ジペプチドよりも長いフルクトシルペプチドに対しては 有効でなく、 従来の F AODなどを使用する場合と同様、 基質となりうるフルク トシルジぺプチドを効率よく切り出す必要があるという課題が残っていた。 また、 F AODを他の酵素と組み合わせて使用した報告もある （特開 2 0 0 0 一 3 3 3 6 9 6号） 。 し力、し、 この方法は、 プロテアーゼで切り出した糖化アミ ノ酸に F AO Dを作用させた時に発生する過酸化水素と、 同時に生成する糖化ァ ミノ酸分解産物であるダルコソンにグルコースォキシダーゼを作用させて生成す る過酸化水素の両方の過酸化水素を測定することによって、 測定感度を向上させ るものであり、 長さの異なる糖化ペプチドについて、 脱フルクトシル化を図るも のではない。 発明の開示
したがって、 本発明の目的は、 H b A 1 c等のフルクトシル化タンパク質や当 該フルクトシル化タンパク質をプロテアーゼにより分解させた時に切り出される 種々の長さのフルクトシル化されたペプチドに対して、 脱フルクトシル作用を有 する酵素、 当該酵素を用いた脱フルクトシル化方法及び当該脱フルクトシル化反 応を利用したフルクトシル化されたペプチド又はタンパク質の測定方法を提供す ることにある。
本発明者らは、 上記目的を達成すべく、 酵素を自然界から探索した結果、 今ま でに報告されている F A〇 Dなどの脱フルクトシル作用を有する酵素が微生物由 来であったのに対して、 バラ科、 ブドウ科、 セリ科等の植物中にも脱フルクトシ ル作用を有する酵素が存在し、 かつ当該植物由来の酵素は、 フルクトシルぺプチ ドのべプチド鎖の長さに係わらず脱フルクトシル作用を発揮することを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は、 フルクトシル化されているペプチド又はタンパク質に、 植物から抽出された脱フルク卜シル作用を有する酵素を作用させることを特徴と する脱フルクトシル化方法を提供するものである。
また本発明は、 フルクトシル化されているペプチド又はタンパク質に対して、 脱フルクトシル作用を有する酵素であって、 植物由来である酵素を提供するもの である。
さらに本発明は、 前記の脱フルク卜シル化方法により得られた反応生成物の 1 種又は 2種以上を測定することを特徴とするフルクトシル化されているペプチド 又はタンパク質の測定方法を提供するものである。
本発明の脱フルクトシル化酵素により、 N末端のバリンがフルクトシル化され ているペプチド又はタンパク質から脱フルクトシル化することができる。 さら に、 反応生成物を定量することによって、 N末端のバリンがフルクトシル化され ているペプチド、 タンパク質、 タンパク質のサブユニット等、 例えば H b A l c 等が正確に定量できる。 図面の簡単な説明
図 1は、 バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素をフルクトシルジペプチド ( f - VH) に作用させた反応液 1のキヤビラリ一電気泳動結果を示す図であ る。
図 2は、 精製水をフルクトシルジペプチド （f — VH) に作用させた対照液 1 のキヤビラリ一電気泳動結果を示す図である。
図 3は、 バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素をフルクトシルトリペプチド ( f — VH L) に作用させた反応液 2のキヤビラリ一電気泳動結果を示す図であ る。
図 4は、 精製水をフルクトシルトリペプチド （f 一 VH L) に作用させた対照 液 2のキヤピラリー電気泳動結果を示す図である。 図 5は、 バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素をフルクトシルテトラペプチド (f -VHLT) に作用させた反応液 3のキヤピラリ一電気泳動結果を示す図で ある。
図 6は、 精製水をフルクトシルテトラペプチド （f — VHLT) に作用させた 対照液 3のキヤピラリ一電気泳動結果を示す図である。
図 7は、 バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素をフルクトシルペンタぺプチド (f -VHLTP) に作用させた反応液 4のキヤビラリ一電気泳動結果を示す図 である。
図 8は、 精製水をフルクトシルペンタペプチド （： f 一 VHLT P) に作用させ た対照液 4のキヤピラリー電気泳動結果を示す図である。
図 9は、 バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素をフルクトシルへキサペプチド (f -VHLTPE) に作用させた反応液 5のキヤビラリ一電気泳動結果を示す 図である。
図 10は、 精製水をフルクトシルへキサペプチド （i— VHLTPE) に作用 させた対照液 5のキヤビラリ一電気泳動結果を示す図である。
図 11は、 プドゥ科植物由来脱フルクトシル化酵素をフルク卜シルジぺプチド (f -VH) に作用させた反応液 6のキヤピラリー電気泳動結果を示す図であ る。
図 12は、 精製水をフルクトシルジペプチド （f一 VH) に作用させた対照液 6のキヤビラリ一電気泳動結果を示す図である。
図 13は、 セリ科植物由来脱フルクトシル化酵素をフルクトシルジぺプチド ( f -VH) に作用させた反応液 7のキヤビラリ一電気泳動結果を示す図であ る。 発明を実施するための最良の形態
本明細書において 「脱フルクトシル」 とは、 フルクトシルアミノ酸又はフルク トシルペプチド （即ち、 フルクトシル化されているアミノ酸又はペプチド） か ら、 フルク卜シル部分が酸化分解や加水分解等を起こし、 その結果、 フルクトシ ル化されていないアミノ酸又はペプチドを生成することを意味する。
本発明に用いられる酵素 （ 「脱フルクトシル化酵素」 という） としては、 フル クトシルイ匕されているペプチド又はタンパク質に対して、 脱フルクトシル作用を 有する酵素であれば、 特に制限されないが、 様々な長さのフルクトシルペプチド に作用することから、 植物由来の脱フルクトシル化酵素が好ましい。 さらに、 本 発明酵素が含まれている植物としては、 特に制限はないが、 バラ科、 プドウ科又 はセリ科に属する植物が、 特に好ましい。 バラ科に属する植物としては、 林檎、 梨、 桃、 梅などが挙げられる。 ブドウ科に属する植物としては、 葡萄、 蔦などが 挙げられる。 セリ科に属する植物としては、 人参、 セリ、 三つ葉などが挙げられ る。 また、 本発明酵素の植物からの抽出に際しては、 脱フルクトシル化酵素が含 まれている部位であれば特に制限されず、 果実、 葉、 茎、 花、 根茎、 根などの部 位が利用できる。 また、 これらの植物の加工品、 例えば、 抽出液のジュースや凍 結乾燥製剤なども利用できる。
上記植物から、 脱フルクトシル化酵素を抽出する方法としては、 上記植物を直 接破砕して、 圧搾等の処理により抽出液を得ることもできるが、 適当な緩衝液等 を加えてから破碎し、 抽出することもできる。 本発明においては、 抽出液を用い ることも可能であるが、 精製した方がより好ましい。 精製方法としては、 公知の 方法が利用でき、 硫安分画やイオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラ フィ一、 ハイドロキシアパタイトゲル、 ゲル濾過等のカラムクロマトグラフィー を適宜組み合わせて使用することが出来る。 また、 植物抽出液中のポリフエノー ルの影響を除く為に、 還元剤の添加や高分子吸収体での処理などを組み合わせる ことも可能である。 本発明の脱フルクトシル化酵素によれば、 例えば糖化タンパク質をプロテア一 ゼ分解した際に、 様々な長さのフルクトシルペプチドが生成されたとしても、 本 発明酵素はこれらのすべてに作用する為、 細断するための別のプロテア一ゼの追 加や処理時間を費やすことがなくなり、 糖化夕ンパク質測定の効率化が図れる。 また、 臨床検査だけでなく、 医療など様々な分野に応用が可能である。 尚、 本発 明の脱フルクトシル化酵素は、 基質であるフルクトシルペプチドから脱フルクト シル化する際に、 F AODのように酸化分解を行い、 過酸化水素やダルコソン等 を発生させる作用を有していてもよい。 この作用を有している場合は、 生成する 過酸化水素を、 公知のペルォキシダーゼ等を用いた酵素的測定系に導けるので、 特に好ましい。 また、 フルクトシルペプチドを加水分解による脱フルクトシル化 する作用を有する酵素も利用することができ、 この作用で生成するグルコース を、 グルコースォキシダーゼ等を用いて測定することも可能である。
本発明の脱フルクトシル化方法に用いるフルクトシルイ匕ペプチド又はフルクト シルイ匕タンパク質は、 脱フルクトシルイ匕酵素が作用するものであれば特に制限さ れないが、 ヘモグロビンの /3鎖 N末端バリンがフルクトシル化されているフルク トシルペプチド及び H b A l cであることが特に好ましい。 また、 N末端のバリ ンがフルクトシル化されているペプチドとしては、 アミノ酸数には限定されない が、 そのアミノ酸配列が配列番号 1〜 5で表されるものが特に好ましい。
上記 N末端のバリンがフルクトシルイ匕されているぺプチドは、 かかる配列を有 するペプチド又はタンパク質、 例えば H b A l cを、 適当なエンドプロテア一ゼ 又はェキソプロテア一ゼ等を用いて処理することにより、 調製することができ る。 これらプロテア一ゼとしては、 例えばエラスターゼ、 プロティナ一ゼ1：、 ぺ プシン、 アルカリプロテアーゼ、 トリプシン、 プロリン特異ェンドプロテア一 ゼ、 V 8プロテアーゼ、 力ルポキシぺプチダーゼ A、 力ルポキシぺプチダーゼ B 等が挙げられる。 上記調製のためのこれらプロテァーゼの活性量としては、 0 . 0 5〜： L 0 0 0 O UZml^ 特に 1 0〜 2 0 0 0 UZmLが好ましい。 フルクトシル化されているペプチド又はタンパク質に、 本発明の脱フルクトシ ル化酵素を作用させる条件のうち処理温度は、 20〜50°C、 特に 30〜40°C が好ましい。 また、 処理時間は、 3分〜 100時間、 特に 5分〜 20時間が好ま しい。 かかる処理により、 ダルコソンやグルコース及び脱フルクトシルペプチド を含む反応生成物を得ることができる。 従って、 当該生成物の 1種又は 2種以上 を測定すれば、 フルクトシル化されているペプチド又はタンパク質を測定するこ とができる。
また、 本発明の脱フルクトシル化酵素活性の確認並びにフルクトシル化されて いるペプチド又はタンパク質の測定方法としては、 生成した脱フルクトシルぺプ チドを、 H P L Cやキヤビラリ一電気泳動により分離同定することによって検出 してもよいが、 脱フルクトシルペプチドに適当な力ルポキシぺプチダーゼを作用 させ、 遊離してくるアミノ酸を検出、 測定してもよい。 例えば、 N末端のバリン がフルクトシル化された配列番号 5のペプチドを使用した場合には、 カルポキシ ぺプチダーゼの作用により、 グルタミン酸 （G 1 u) 、 プロリン （P r o) 、 ス レオニン （Th r ) 、 ロイシン (L e u) 、 ヒスチジン (H i s) 、 バリン
(Va 1) を生成させることが出来るが、 その中で、 G l uはグルタミン酸脱水 素酵素、 L e uはロイシン脱水素酵素、 Va 1はパリン脱水素酵素を用いて、 N ADH又は NAD P Hの生成量を測定することによって検出、 測定することも 可能である。 さらに、 脱フルクトシル化により生成するダルコソンやグルコース に関しては、 グルコースォキシダーゼ等を使用して、 発生する過酸化水素を、 ぺ ルォキシダーゼ発色系を用いて、 検出、 測定することが出来る。 その一例として は、 以下の様な方法が挙げられる。
(酵素反応生成物の測定）
基質であるフルクトシルペプチドに本発明酵素を作用させ、 一定時間加温した 反応液 300 Lに、 予め用意した、 20 OmM酢酸緩衝液 （pH6. 0) 75 0 L、 4000 u/mLグルコースォキシダーゼ (東洋紡社) 450 L、 0. 15%4—ァミノアンチピリン 300 L、 0. 3 TOOS (同仁化学 社） 300 L、 500 u/mLパーォキシダ一ゼ （東洋紡社、 Type 111) 300 II L及び 1 %アジ化ナトリウム 300 Lを混和した液を加え、 37 で 10分 間加温後、 55 Onmにおける吸光度を測定する。 基質の代わりに精製水を加え る以外は、 上記と同様の操作を行い対照とする。 生成色素量の酵素反応生成物
(ダルコソンやグルコース） 量への換算は、 グルコースの希釈系列を基質とし、 本発明酵素の代わりに精製水を加えて上記操作を行い作成した検量線より行う。 また、 脱フルクトシル反応の際に、 過酸化水素が生成する脱フルクトシル化酵素 を用いた場合は、 直接生成した過酸化水素を、 公知のペルォキシダーゼ発色系を 用いて、 検出、 測定することも可能である。
ペルォキシダーゼ (POD) 発色系は、 特に制限はないが、 反応系に色原体及 び PODを添加し、 該色原体を酸化して発色物質を生成させ、 これを測定する方 法が好適である。 この色原体としては、 4—ァミノアンチピリンと、 フエノール 系化合物、 ナフ！ ^一ル化合物又はァニリン系化合物との組み合わせ、 MBTH ( 3—メチル _ 2—ベンゾチアゾリノンヒドラゾン） とァニリン系化合物との組 み合わせ、 ロイコメチレンブルー等が用いられる。 また、 特許第 2516381 号に記載されているように、 POD存在下にて過酸化水素と 2価のコバルトィォ ンとの反応により生じた 3価のコバルトイオンを、 3価のコバルトイオンに特異 的な指示薬、 例えば TASBB (2- (2—チアゾリルァゾ） 一 5—ジスルフォ プチルァミノ安息香酸三ナトリウム塩） と組み合わせ、 発色キレート化合物を生 成させ、 これを測定する方法も利用できる。 これによれば、 上記方法の 5〜 10 倍の測定感度を得ることができる。 また、 過酸化水素を検出する試薬として、 高 感度に測定可能な TPM— P S (N, N, Ν' , Ν' , N" ， N" 一へキサ （3 ースルフォプロピル) 一 4， 4， , 4" —トリアミノトリフエニルメタン） （同 仁化学社製） 等も利用できる。
本発明方法を用いれば、 N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド 又はタンパク質、 例えば HbAl cを極めて高精度で定量することができる。 こ こで HbAl cの定量に使用される被験試料としては、 例えば全血、 赤血球等が 挙げられる。 実施例
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は以下の実施例 に限定されるものではない。
実施例 1
バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素の調製
梨の表皮及ぴ種子周辺を除いた果肉部分 100 g当り、 300 mM塩化ナトリ ゥムを含む 10 OmM酢酸ナトリウム （pH4. 5) を l O OmL加え、 直接ミ キサ一にて破砕した後、 遠心分離により固形物を除去し、 粗抽出液を得た。 この 粗抽出液に、 PVPP (ポリビニルポリピロリドン：ナカライテスク社製） を 2%分添加し、 室温で 30分攪拌した。 その後、 遠心分離により P VP Pを除去 し処理液を得た。 これを粗精製酵素とした。
実施例 2
ブドウ科植物由来脱フルクトシル化酵素の調製
ブドウの表皮を除いて、 果肉部分をミキサーで破砕した後、 遠心分離により固 形物を除去し、 抽出液を得た。 これを粗精製酵素とした。
実施例 3
セリ科植物由来脱フルクトシル化酵素の調製
人参の根茎部分を、 直接ジューサーにて破砕した後、 遠心分離により固形物を 除去し、 粗抽出液を得た。 この粗抽出液を、 マイレックスフィルター （0. 45 m) (ミリポア社製） を用いて濾過を行い、 澄明な抽出液を得た。 この抽出液 3mLに対して、 冷エタノールを 4mL添加し、 生じた沈殿を遠心分離によって 除いた。 得られた上清に、 さらに冷エタノールを添加し、 生じた沈殿を遠心分離 により得た。 得られた沈殿に、 少量の 2 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 0) を加 えて溶解させ、 これを粗精製酵素とした。
実施例 4
フルクトシルペプチドの脱フルクトシル化方法
(バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素の使用）
(i) 10 OmM酢酸緩衝液 （pH6. 0) 100 / Lに、 配列番号 1〜 5で表 されるアミノ酸配列を有する N末端のパリンがフルクトシル化されているべプチ ド （f — VH〜： f 一 VHLTPE：バイオクェスト社製） の各 500 M水溶液 40 L、 精製水 20 Lおよび実施例 1で得られた梨由来の粗精製酵素の溶液 40 Lを加え、 混和後、 37でで 64時間反応させた。 この反応液を、 分子量 10000の限外濾過を行い、 濾液を分取した （反応液 1〜5) 。 この反応液 1 〜5を、 キヤピラリー電気泳動装置 CAP I— 3200 (大塚電子社製） にて、 泳動緩衝液： 15 OmMリン酸緩衝液 （pH2. 0) 、 電圧： 15kv、 検出波 長： 210 nmの条件で分析を行い、 ピーク位置およびピーク面積を測定した。
(ii) 対照試験
対照として、 粗精製酵素溶液の代わりに、 精製水を加え、 同じ条件にて反応さ せ濾液を得た （対照液 1〜5)。 この対照液 1〜 5の分析結果を反応液 1〜5の 結果と比較した。
尚、 酵素反応及び対照試験に用いた各フルクトシルペプチドには、 非フルクト シルペプチドが含まれており、 2種のピークの変化で、 酵素活性の有無を検出し た。
反応液 1の結果を図 1に、 対照液 1の結果を図 2に示した。 図 2では、 f 一 VHに由来するピーク （面積： 13mABUXsec) 及び VHに由来するピーク （面 積： 34mABUXsec) が認められているが、 図 1では、 f 一 VHのピークが減少 (面積： 4mABUXsec) し、 VHのピークが増加 （面積： 38mABUXsec) している のが確認された。
反応液 2の結果を図 3に、 対照液 2の結果を図 4に示した。 図 4では、 f — VHLに由来するピーク （面積： 32niABUXsec) 及び VHLに由来するピーク (面積： 22niABUXsec) が認められているが、 図 3では、 f 一 VHLのピークが 減少 （面積： 7mABUXsec) し、 VHLのピークが増加 （面積： 34mABUXsec) し ているのが確認された。
反応液 3の結果を図 5に、 対照液 3の結果を図 6に示した。 図 6では、 f 一 VHLTに由来するピーク （面積： 38mABUXsec) 及び VHL Tに由来するピー ク （面積： 20mABUXsec) が認められているが、 図 5では、 f 一 VHLTのピー クが減少 （面積： 5mABUXsec) し、 VHLTのピークが増加 （面積： 32mABUx sec) しているのが確認された。
反応液 4の結果を図 7に、 対照液 4の結果を図 8に示した。 図 8では、 ： f _ VHLTPに由来するピーク （面積： 64mABUXsec) 及び VHLTPに由来する ピーク （面積： 23mABUXsec) が認められているが、 図 7では、 f 一 VHLTP のピークが減少 （面積： SmABUXsec) し、 VHLTPのピークが増加 （面積： 57mABUXsec) しているのが確認された。
反応液 5の結果を図 9に、 対照液 5の結果を図 10に示した。 図 10では、 f 一 VHL TP Eに由来するピーク （面積： 54mABUXsec) 及び VHLTP Eに由 来するピーク （面積： 21mABUXsec) が認められているが、 図 9では、 f — VHLTPEのピークが減少 （面積： 9mABI]Xsec) し、 VHLTPEのピーク が増加 （面積： 48mABUXsec) しているのが確認された。
これらの結果から、 バラ科植物由来脱フルクトシル化酵素を使用することによ り、 フルクトシルペプチドから脱フルクトシル化することができることが分かつ た。
実施例 5
フルクトシルペプチドの脱フルクトシル化方法
(ブドウ科植物由来脱フルクトシル化酵素の使用）
実施例 2で得られた粗精製酵素についても、 実施例 4と同様の条件下で試験を 行った。 但し、 N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドは、 VHを 含まない f 一 VHを使用し、 反応時間は 3 7 °Cで 1 6時間とした （反応液 6 ) 。 また、 対照試験は、 実施例 4に準じて行った （対照液 6 ) 。
反応液 6の結果を図 1 1に、 対照液 6の結果を図 1 2に示す。 図 1 2では、 f 一 VHに由来するピーク （面積 ·· 42mABUX sec) のみが認められたが、 図 1 1で は、 f 一 VHのピークが減少 （面積： 36mABUX sec) し、 新たに反応生成物のピ ーク （面積： 4mABUX sec) が認められた。 さらに、 この反応液に VHを少量添 加し、 再度キヤピラリー電気泳動でピークの増減を確認したところ、 反応生成物 と VHのピークが一致したことから、 反応生成物は V Hであることが確認でき た。
この結果から、 ブドウ科植物由来脱フルクトシル化酵素を使用することによ り、 フルクトシルぺプチドから脱フルクトシル化することができることが分かつ た。
実施例 6
'フルクトシルペプチドの脱フルクトシル化方法
(セリ科植物由来脱フルクトシル化酵素の使用）
実施例 3で得られた粗精製酵素については、 実施例 5と同様の条件下で試験を 行った （反応液 7 ) 。
反応液 7の結果を図 1 3に示す。 対照液の結果は、 上記の図 1 2で兼用した。 図 1 2では、 f 一 VHに由来するピーク （面積： 42mABUX sec) のみが認められ ているが、 図 1 3では、 f 一 VHのピークが減少 （面積： 16 BUX sec) し、 新 たに反応生成物のピーク （面積： 16mABUX sec) が認められた。 さらに、 この反 応液に V Hを少量添加し、 再度キャビラリ一電気泳動でピークの増減を確認した ところ、 反応生成物と VHのピークが一致したことから、 反応生成物は VHであ ることが確認できた。
この結果から、 セリ科植物由来脱フルクトシル化酵素を使用することにより、 フルクトシルペプチドから脱フルクトシル化する

Claims

請求の範囲
1 . フルクトシル化されているペプチド又はタンパク質に、 植物から抽出され た脱フルクトシル作用を有する酵素を作用させることを特徴とする脱フルクトシ ル化方法。
2 . 植物から抽出された脱フルクトシル作用を有する酵素が、 バラ科、 ブドウ 科又はセリ科に属する植物から抽出されたものである請求項 1記載の脱フルクト シル化方法。
3 . フルクトシル化されているべプチドのアミノ酸配列が、 配列番号 1〜 5の いずれかで表されるものである請求項 1又は 2記載の脱フルクトシル化方法。
4. フルクトシル化されているタンパク質が、 ヘモグロビン A 1 cである請求 項 1〜 3のいずれか 1項記載の脱フルクトシル化方法。
5 . フルク卜シル化されているペプチド又はタンパク質に対して、 脱フルクト シル作用を有する酵素であって、 植物由来である酵素。
6 . 植物が、 バラ科、 ブドウ科又はセリ科に属する植物である請求項 5記載の 酵素。
7 . 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の脱フルクトシル化方法により得られた 反応生成物の 1種又は 2種以上を測定することを特徴とするフルク卜シル化され ているペプチド又はタンパク質の測定方法。
8 . 脱フルクトシル化方法により得られた反応生成物が、 過酸化水素、 ダルコ ソン、 グルコース及び脱フルクトシルペプチドである請求項 7記載のフルクトシ ル化されているペプチド又はタンパク質の測定方法。
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