WO2004038035A1 - フルクトシルバリンの生産方法および該生産方法により得られたフルクトシルバリンの定量方法 - Google Patents

フルクトシルバリンの生産方法および該生産方法により得られたフルクトシルバリンの定量方法 Download PDF

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fructosyl valine
fructosylated
peptide
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Hiroyuki Ebinuma
Kumiko Yuki
Original Assignee
Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fructosyl valine and a method for quantifying fructosyl valine obtained by the production method.
  • the present invention relates to a method for producing fructosyl valine and a method for quantifying fructosyl valine obtained by the production method.
  • Hemoglobin (Hb) Ale is a product of the Amadori transfer, which is stabilized by the non-enzymatic formation of a Schiff base after the amino group of the N-terminal phosphine of three chains and the aldehyde group of Darcos form a Schiff base. As a result, it is a glycated protein having a structure in which fructose is bound to a palin residue. Since HbAlc clinically reflects the average blood glucose level in the past one to two months, it is important as an index for diabetes management, and a rapid, simple, accurate and practical quantification method is required.
  • the method of measuring HbAl c that is practically used is the HP LC method using a special hard gel having a hydrophobic group or a cation exchange group as a carrier. Latex immunoagglutination method using antibodies, etc., but did not necessarily satisfy rapidity, simplicity, and accuracy, such as requiring expensive equipment and multi-step immune reactions. .
  • examples of the use of proteases on glycated proteins include the following ( a) to (e).
  • proteases are exemplified, but it is described how these actually excise glycated amino acids or peptides containing saccharified amino acids from saccharified proteins. In other words, it was not clear from the meaning that the above description was practical.
  • peptides or proteins in which the N-terminal valine is fructosylated There is also known a method for producing fructosyl valine from cellulose using serine carboxypeptidase (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-57987).
  • the present invention has found a functional lipoxypeptidase that can specifically excise fructosyl valine from peptides or proteins in which the N-terminal palin is fructosyl aniline. It is intended to provide a method for producing phosphorus. Another object of the present invention is to provide a method for quantifying fructosyl valine obtained by such a production method, or a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosylated.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, newly obtained lipoxypeptidase, which is newly extracted from a plant belonging to the Apiaceae family, the ginger family, or the pineapple family, has a N-terminal valine of fructosyl.
  • the present inventors have found that fructosyl valine can be specifically excised from a modified peptide or protein, and thus completed the present invention.
  • the present invention provides a peptide or protein in which the N-terminal palin is fructosylated by using at least one kind of lipoxypeptidase extracted from a plant belonging to the Apiaceae family, the Ginger family or the Pineapple family.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing fructosyl valine, which is characterized by enzymatic treatment.
  • the present invention also relates to ketowa
  • An object of the present invention is to provide a method for quantifying fructosyl valine or a peptide or protein in which N-terminal valine is fructosylated, which is characterized by measuring the generated hydrogen peroxide by allowing minoxidase to act.
  • fructosyl valine can be specifically produced from a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosylated.
  • the fructosyl valine quantification method of the present invention enables highly accurate quantification of fructosyl valine.
  • Such a quantification method is particularly effective for quantification of peptides, proteins, protein subunits and the like, for example, HbA1c and the like, in which N-terminal palin is fructosylich.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of reaction solution 1 in which a crude enzyme derived from a Umbelliferae plant was allowed to act on a dipeptide (f-VH).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of Control Solution 1 in which purified water was allowed to act on a dipeptide (f_VH).
  • FIG. 3 shows the results of capillary electrophoresis after histidine was added to reaction solution 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of a reaction solution obtained by reacting a ginger plant-derived crude enzyme with a dipeptide (i-VH).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis of a reaction solution obtained by allowing a crude enzyme derived from a pineapple plant to act on a dipeptide (f-VH).
  • the enzyme used in the method for producing fructosyl valine of the present invention is not particularly limited as long as it is a carboxypeptidase extracted from a plant belonging to the Apiaceae family, the Ginger family or the Pineapple family.
  • plants belonging to the Apiaceae family include ginseng, agar, and trefoil.
  • Leafs, stems, flowers, rhizomes, roots, etc. are used.
  • plants belonging to the ginger family include ginger, myoga, and konkon, and parts such as leaves, stems, flowers, rhizomes, and roots are used.
  • plants belonging to the pineapple family include pineapple, and pulp, leaves, stems, flowers, rhizomes and roots are used.
  • carboxypeptidase in addition, if it contains carboxypeptidase, commercially available plant extracts and the like can be used.
  • carboxypeptidase of the present invention can be used even in a bromelain enzyme preparation (manufactured by Shidama) which is roughly purified from pineapple (stem), but it can be used.
  • Bromelain which is a gut, has no action to excise fructosyl valine from fructosyl peptides, and therefore cannot be used in the present invention.
  • the above plant can be directly crushed and an extract can be obtained by treatment such as squeezing.However, an appropriate buffer solution or the like is added, followed by crushing and extraction. You can also.
  • an extract can be used, but purification is more preferable.
  • a purification method a known method can be used, and purification can be performed by appropriately combining ammonium sulfate fractionation, column chromatography such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite gel, and gel filtration. It is also possible to combine the addition of a reducing agent and the treatment with a polymer absorber in order to eliminate the effects of polyphenol in the plant extract.
  • a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosylated is enzymatically treated using the above-mentioned lipoxypeptidase.
  • the peptide or protein is not particularly limited in amino acid sequence, the number of amino acid residues, and the like as long as the N-terminal palin is fructosylated, and among them, the protein in which the N-terminal palin is fructosylated Is preferably HbAlc.
  • the peptide in which the N-terminal palin is fructosylated is not limited to the number of amino acids, but preferably has an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 5. Good.
  • the peptide in which the N-terminal palin is fructosylated is prepared by treating a peptide or protein having such a sequence, for example, HbAlc with an appropriate endoprotease or exoprotease or the like. Can be done.
  • proteases include, for example, elastase, proteinase K, pepsin, alkaline protease, trypsin, proline-specific endoprotease, V8 protease, lipoxypeptide, and lipoxypeptide. And the like.
  • the amount of activity of these proteases for the above preparation is preferably from 0.05 to 1000 UZmL, particularly preferably from 10 to 2000 UZmL.
  • the treatment temperature is preferably 20 to 50 ° C, particularly preferably 30 to 40 ° C. .
  • the processing time is preferably from 3 minutes to 100 hours, particularly preferably from 5 minutes to 20 hours.
  • the enzymatic activity of the present invention can be confirmed by separating and identifying a specific amino acid from the produced fructosyl valine or fructosylated peptide or protein by HPLC or capillary electrophoresis. You can do this.
  • fructosyl valine is quantified by treating fructosyl valine produced by the reaction with ketoamine oxidase and measuring the produced hydrogen peroxide.
  • the fructosyl valine obtained as described above can be subjected to the quantification method of the present invention as it is or, if necessary, purified by ultrafiltration or the like.
  • the ketoamine oxidase used in the present invention is not particularly limited as long as it uses fructosyl valine as a substrate, but has high specificity for fructosyl valine. And those having low specificity for fructosyl lysine are preferred. By using such ketoamine oxidase, for example, the quantification method of the present invention
  • ketoamine oxidase examples include an enzyme derived from Corynebacterium (Kikkoman) and a recombinant fructosyl amino acid oxidase derived from Corynebacterium sp. (Sp.). .
  • the activity amount of ketoamine oxidase is 1 to: L 0000 UZL, and particularly preferably 10 to 5000 U / L.
  • the treatment temperature of ketoaminooxidase is preferably 10 to 50 ° C, particularly preferably 20 to 45 ° C.
  • the treatment time of keto-minoxidase is preferably from 0.1 minute to 1 hour, particularly preferably from 0.5 minute to 30 minutes.
  • the method for measuring hydrogen peroxide produced by treating fructosyl valine with ketoamine oxidase is not particularly limited, but a chromogen and peroxidase (POD) are added to the reaction system.
  • a method of oxidizing the chromogen to form a color-forming substance and measuring the color-forming substance is preferable.
  • the chromogen include a combination of 4-aminoantipyrine, a phenolic compound, a naphthol compound or an aniline compound, and MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) and an aniline compound. Combination with a substance, leucomethylene blue or the like is used. Also, as described in Patent No.
  • trivalent cobalt ions generated by the reaction of hydrogen peroxide and divalent cobalt ions in the presence of POD are converted to specific trivalent cobalt ions.
  • an indicator for example, TASBB (2- (2-thiazolylazo) -15-disulfoptylaminobenzoic acid trisodium salt
  • a color-forming chelate compound can be generated and measured. According to this, a measurement sensitivity 5 to 10 times that of the above method can be obtained.
  • TPM-PS N, N, N ', N', N ", N "-hexa (3-sulfopropyl) -1,4,4,4" -triaminotriphenylmethane (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) can also be used.
  • HbAlc a peptide or protein in which the N-terminal valine is fructosilylated, for example, HbAlc with extremely high accuracy.
  • examples of the test sample used for the quantification of HbAlc include whole blood, red blood cells, and the like.
  • the carrot rhizome was directly crushed with a juicer, and the solids were removed by centrifugation to obtain a crude extract.
  • the crude extract was filtered using a Myrex filter (0.45 ⁇ ) (Millipore) to obtain a clear extract.
  • the extract is added to DEAE Toyopearl column to adsorb the enzyme in the extract, and 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 50 OmM sodium chloride. 0), the enzyme was eluted from the column. This was used as a crude purified enzyme.
  • the ginger rhizome was directly crushed with a juicer, and after standing, solids were removed by centrifugation to obtain a crude extract.
  • Celite 545 (trade name, manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added as a filter aid, and the mixture was stirred, followed by suction filtration using filter paper. The filtrate was centrifuged again to obtain an extract. An equal amount of cold ethanol was added to the obtained extract to form a precipitate. The resulting precipitate is washed with a small amount of 2 OmM phosphate buffer.
  • the extract was dissolved in a liquid (pH 7.0) and added to a DEAE Toyopearl column (manufactured by Tosoichi) to adsorb the enzyme in the extract.
  • the P-immobilized enzyme was eluted from the column with a 2 OmM phosphate buffer (pH 7.0) containing 20 OmM sodium chloride. This was used as a crude purified enzyme.
  • a commercially available crude product of bromelain (product code B4882, manufactured by Sigma) is suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), stirred at room temperature for about 3 hours, centrifuged, and the supernatant is removed. Separation was performed to obtain an extract.
  • the extract was added to DEAE Toyoparum column to adsorb the enzyme in the extract, and the enzyme was eluted from the column with a 2 OmM phosphate buffer (pH 7.0) containing 20 OmM sodium chloride. Further, an equal amount of cold ethanol was added to the obtained eluted fraction to form a precipitate.
  • the obtained precipitate was dissolved in a small amount of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), and this was used as a crude purified enzyme.
  • This reaction solution was subjected to ultrafiltration with a molecular weight of 10,000, and the filtrate was separated (reaction solution 1).
  • control solution 1 As a control, purified water was added in place of the crude enzyme solution, and reacted under the same conditions to obtain a filtrate (control solution 1). The analysis result of this control solution 1 was compared with the result of the reaction solution 1.
  • reaction solution 1 The results of reaction solution 1 are shown in FIG. 1 (dashed lines (-) in the figure are peaks derived from the crude enzyme solution), and the results of control solution 1 are shown in FIG.
  • Fig. 2 only peaks derived from f_VH (area: 40 mABUXsec) are recognized, but in Fig. 1, peaks per fVH decrease (area: 17 mABUXsec), and peaks derived from crude enzyme solution ( Although it overlapped with the area (16 mABUX sec), generation of a peak different from f_VH (area: 29 mABUXsec) was confirmed.
  • the slight shift in the transfer time of f-VH and other peaks is due to the reproducibility problem with the instrument and the change in the liquid property due to the addition of the crude enzyme solution.
  • fructosyl valine can be produced by using pineapple family-derived lipoxypeptidase as described above.

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Abstract

本発明は、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又はタンパク質を、ショウガ科、セリ科又はパイナップル科の植物由来のカルボキシペプチダーゼの１つ以上を用いて酵素処理することを特徴とするフルクトシルバリンの生産方法に関する。

Description

フルクトシルバリンの生産方法および該生産方法により得られたフルクトシルバ リンの定量方法 技術分野
本発明は、 フルクトシルバリンの生産方法および該生産方法により得られたフ ルクトシルバリンの定量方法に関する。 背景技術
ヘモグロビン （Hb) Al eは、 その ;3鎖 N末端パリンのァミノ基とダルコ一 スのアルデヒド基が、 非酵素的にシッフ塩基を形成した後、 アマドリ転移を生じ て安定化したアマドリ転移生成物であり、 結果的にパリン残基にフルクトースが 結合した構造を有する糖化タンパク質である。 かかる HbAl cは、 臨床的に過 去 1〜 2ヶ月の平均血糖値を反映することから、 糖尿病管理の指標として重要で あり、 迅速、 簡便かつ正確で実用的な定量法が求められている。
I F C C (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) は、 ヘモグロビンをエンドプロテア一ゼ G 1 u— Cによ り加水分解して得られる、 フルクトシルバリンの存在が疑われる ]3鎖 N末端の 6
Figure imgf000002_0001
り分離した後、 キヤピラリ一電気泳動法又 は質量分析法で定量する方法を HbA 1 cの実用基準法 （Kobold U. , et al ； Candidate reference methods for emoglobinAlc based on peptide map ing. Clin,. Chem. , 43, 1944-1951 (1997)) としているが、 この方法は、 特別な装置 を必要とするため、 操作が煩雑で経済性が悪く、 実用には不向きな方法'である。 現在、 実用に供されている HbAl cの測定方法は、 疎水基あるいは陽イオン 交換基をもった特殊な硬質ゲルを担体として使用する HP L C法ゃ抗 HbA 1 c 抗体を使用するラテツクス免疫凝集法などであるが、 高価な機器を必要とした り、 多段階の免疫反応を必要とするなど、 迅速性、 簡便性、 正確性を必ずしも満 足する方法ではなかった。
近年、 フルクトシルバリンなどの糖ィヒアミノ酸に特異的に作用するフルクトシ ルアミノ酸ォキシダーゼ （FAOD) などの酵素を使用して、 HbAl cやダリ コアルブミンなどの糖化タンパク質を酵素法により測定しょうとする方法が報告 されているが、 HbAl cであってもグリコアルブミンであっても、 糖化タンパ ク質のままでは FAODなどが作用することが困難であるため、 それぞれの特徴 的な糖化アミノ酸 （HbAl cにおけるフルクトシルバリン、 グリコアルブミン におけるフルクトシルリジン） を糖ィ匕ペプチドあるいは糖化タンパク質より切り 出す必要がある。
上記の目的のため、 糖化アミノ酸に作用する酵素を使用して糖化アミノ酸 （あ るいは糖化アミノ酸を含むペプチド） を測定するに先立ち、 糖化タンパク質にプ 口テアーゼを作用させた例としては以下の （a) 〜 （e) がある。
(a) 人工的に調製した糖化アルブミンあるいは市販の糖化ヒト血清アルブミン をプロティナ一ゼ Kおよびプロナ一ゼ Eで処理 （特開平 5— 192193号、 特 開平 7— 289253号） 。
(b) 市販の糖化ヒト血清アルブミンを、 トリプシンで処理 （特開平 7— 289253号） 。
(c) 市販の糖化ヒト血清アルブミンを、 プロテアーゼ XIVで処理 （特開平 8— 154672号） 。
(b) 血清試料を、 プロナーゼで処理 （特開平 6— 46846号） 。
(d) 市販の糖化ヘモグロビンあるいは HbAl c分画を、 アミノぺプチダ一ゼ で処理 （特開平 8— 289253号、 特開平 8— 336386号） 。
(e) 市販の糖ィ匕アルブミンあるいは HbAl cを阻害剤の存在下に、 各種プロ テア一ゼで処理 （特開 2001— 54398号） 。 さらに、 八木らは、 糖ィ匕ヒトアルブミン、 HbAl cの各種プロテアーゼによ る処理について検討し、 内部リジン残基が糖化されている糖ィ匕アルブミンではェ ンド型プロテア一ゼが、 /3鎖 N末端のパリン残基が糖化されている HbAlじで はェキソ型のプロテア一ゼが効率良く処理できることを報告している （W〇 97/13872) 。 また、 米原らは、 HbAl cの選択的な断片化にはブロメ ライン、 パパイン、 ブ夕塍臓由来トリプシン、 メタ口プロテアーゼ、 Bacillus subtillis由来のプロテア一ゼが好適であることを報告している (WOO 2/ 06519) 。
このほかにも、 多数のプロテアーゼが例示されているが、 これらが実際に、 糖 化アミノ酸あるいは糖ィ匕アミノ酸を含むペプチドをどのように糖ィ匕タンパク質か ら切り出しているかについては記載がされておらず、 その意味から、 前記記載が 実用的なものであるかは不明であった。
一方、 N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドを使用した検討報 告もいくつか存在する。 関口らは、 被検試料を、 HbAl cの )3鎖 N末端から 3 番目のロイシンの力ルポキシル基を特異的に切断できるプロテアーゼと、 当該プ 口テア一ゼによる切断で生成するフルクトシルバリルヒスチジルロイシンよりヒ スチジルロイシンを切り出すジぺプチジルカルポキシぺプチダーゼの組み合わせ により、 フルクトシルバリンを切り出す方法を報告している （特開 2000— 300294号） 。 また、 石丸らは、 コリネパクテリゥム属又はシユードモナス 属由来の新規なプロテアーゼにより、 N末端のパリンがフルクトシル化されてい るジペプチド、 トリペプチド、 ペン夕ペプチドより、 フルクトシルパリンを切り 出すことができたと報告している （WO00Z50579) 。 さらに、 スフイン ゴバクテリウム属、 スフインゴモナス属、 コマモナス属、 ムコー属又はべニシリ ゥム属由来の新規な酵素もジぺプチド、 トリべプチドについて同様な作用を有し ていたことを報告している （WO00Z61732) 。
またさらに、 N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又はタンパ ク質から、 セリンカルポキシぺプチダ一ゼを用いて、 フルクトシルバリンを生産 する方法 （特開 2 0 0 1— 5 7 8 9 7号） も知られている。
本方法によれば、 H b A 1 c由来の β鎖 Ν末端がフルクトシル化されたぺプチ ドカ、ら、 特異的にフルクトシル化されたパリンを切り出すことが可能であり、 切 り出されたフルクトシルバリンにケトァミンォキシダ一ゼを作用させることによ り、 H b A l cの定量に応用しうる方法である。
しかしながら、 該公報には、 小麦由来のセリンカルポキシぺプチダーゼが記載 されているのみで、 他のプロテアーゼについては記載されていない。 発明の開示
したがって、 本発明は、 かかる N末端のパリンがフルクトシルイ匕されているぺ プチド又はタンパク質から、 フルクトシルバリンを特異的に切り出すことができ る力ルポキシぺプチダーゼを見出し、 これを用いてフルクトシルバリンを生産す る方法を提供することを目的とする。 本発明はまた、 かかる生産方法によって得 られたフルクトシルバリン、 又は N末端のバリンがフルクトシル化されているべ プチドもしくは夕ンパク質を定量する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、 新たに、 セリ科、 シ ヨウガ科又はパイナップル科に属する植物から抽出された力ルポキシぺプチダ一 ゼが、 N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又はタンパク質か ら、 フルクトシルバリンを特異的に切り出すことができることを見出し、 本発明 を完成した。
すなわち、 本発明は、 N末端のパリンがフルクトシル化されているペプチド又 はタンパク質を、 セリ科、 ショウガ科又はパイナップル科に属する植物から抽出 された 1種以上の力ルポキシぺプチダ一ゼを用いて酵素処理することを特徴とす るフルクトシルバリンの生産方法を提供するものである。
本発明はまた、 かかる生産方法により得られたフルクトシルバリンに、 ケトァ ミンォキシダーゼを作用させ、 生成する過酸化水素を測定することを特徴とする フルクトシルバリン、 又は N末端のバリンがフルクトシルイ匕されているペプチド もしくはタンパク質の定量方法を提供するものである。
本発明のフルクトシルバリンの生産方法により、 N末端のバリンがフルクトシ ル化されているペプチド又はタンパク質からフルクトシルバリンを特異的に生産 することができる。 本発明のフルクトシルバリンの定量方法により、 高精度でフ ルクトシルバリンを定量することができる。 かかる定量方法は、 N末端のパリン がフルクトシルイヒされているペプチド、 タンパク質、 タンパク質のサブユニット 等、 例えば H b A 1 c等の定量に特に有効である。 図面の簡単な説明
図 1は、 セリ科植物由来粗精製酵素をジペプチド （f 一 VH) に作用させた反 応液 1のキヤピラリー電気泳動結果を示す図である。
図 2は、 精製水をジペプチド （f _ VH) に作用させた対照液 1のキヤビラリ 一電気泳動結果を示す図である。
図 3は、 ヒスチジンを反応液 1に添加した後のキヤピラリー電気泳動結果を示 す図である。
図 4は、 ショウガ科植物由来粗精製酵素をジペプチド （i— VH) に作用させ た反応液のキヤピラリー電気泳動結果を示す図である。
図 5は、 パイナップル科植物由来粗精製酵素をジペプチド （f — VH) に作用 させた反応液のキヤピラリ一電気泳動結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のフルクトシルバリンの生産方法に用いる酵素は、 セリ科、 ショウガ科 又はパイナツプル科に属する植物から抽出されたカルボキシぺプチダーゼであれ ば特に限定されない。 セリ科に属する植物としては、 人参、 セリ、 三つ葉などが 挙げられ、 葉、 茎、 花、 根茎、 根などの部位が利用される。 ショウガ科に属する 植物としては、 生姜、 茗荷、 ゥコンなどが挙げられ、 葉、 茎、 花、 根茎、 根など の部位が利用される。 パイナップル科に属する植物としては、 パイナップルなど が挙げられ、 果肉、 葉、 茎、 花、 根茎、 根などの部位が利用される。 また、 カル ポキシぺプチダーゼを含有すれば市販の前記植物抽出物なども利用することが出 来る。 例えば、 パイナップル (stem)から粗精製されたブロメライン酵素製剤 （シ ダマ社製） 中にも、 本発明のカルボキシぺプチダーゼが混入しており、 利用する ことが可能であるが、 パイナップル由来のプロテア一ゼであるブロメラインにつ いては、 フルクトシルペプチドからフルクトシルバリンを切り出す作用はないの で、 本発明には利用できない。
上記植物から、 カルボキシぺプチダーゼを抽出する方法としては、 上記植物を 直接破碎して、 圧搾等の処理により抽出液を得ることもできるが、 適当な緩衝液 等を加えてから破碎し、 抽出することもできる。 本発明においては、 抽出液を用 いることも可能であるが、 精製した方がより好ましい。 精製方法としては、 公知 の方法が利用でき、 硫安分画やイオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグ ラフィ一、 ハイドロキシアパタイトゲル、 ゲル濾過等のカラムクロマトグラフィ 一を適宜組み合わせて精製することが出来る。 また、 植物抽出液中のポリフエノ ールの影響を除く為に、 還元剤の添加や高分子吸収体での処理などを組み合わせ ることも可能である。
本発明においては、 N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は タンパク質を、 上記力ルポキシぺプチダーゼを用いて酵素処理する。 該ペプチド 又はタンパク質は、 N末端のパリンがフルクトシル化されていれば、 アミノ酸配 列、 アミノ酸残基の数等に特に制限はないが、 このうち、 N末端のパリンがフル クトシル化されているタンパク質としては、 H b A l cが好ましい。 また、 N末 端のパリンがフルクトシル化されているペプチドとしては、 アミノ酸数には限定 されないが、 そのアミノ酸配列が配列番号 1〜 5のいずれかで表されるものが好 ましい。
上記 N末端のパリンがフルクトシルイ匕されているペプチドは、 かかる配列を有 するペプチド又はタンパク質、 例えば H b A l cを、 適当なエンドプロテアーゼ 又はェキソプロテア一ゼ等を用いて処理することにより、 調製することができ る。 これらプロテアーゼとしては、 例えばエラス夕一ゼ、 プロティナ一ゼ K、 ぺ プシン、 アルカリプロテアーゼ、 トリプシン、 プロリン特異エンドプロテア一 ゼ、 V 8プロテアーゼ、 力ルポキシぺプチダ一ゼ八、 力ルポキシぺプチダ一ゼ Β 等が挙げられる。 上記調製のためのこれらプロテァ一ゼの活性量としては、 0 . 0 5〜 1 0 0 0 0 UZmL、 特に 1 0〜 2 0 0 0 UZmLが好ましい。
N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又はタンパク質に、 本発 明のカルボキシぺプチダーゼを作用させる条件として、 処理温度は、 2 0〜 5 0 °C、 特に 3 0〜4 0 °Cが好ましい。 また、 処理時間は、 3分〜 1 0 0時間、 特に 5分〜 2 0時間が好ましい。 かかる処理により、 フルクトシルバリンを特異 的に切り出すことができる。
また、 本発明の酵素活性の確認としては、 生成したフルクトシルバリン又はフ ルクトシル化されているペプチド又はタンパク質から、 特定のアミノ酸の生成 を、 H P L Cやキヤビラリ一電気泳動により分離同定することによって行なうこ とが出来る。
次に、 本発明のフルクトシルバリン、 又は N末端のバリンがフルクトシル化さ れているペプチド又はタンパク質の定量方法について説明する。 本発明の定量方 法は、 前記反応により生成したフルクトシルバリンをケトァミンォキシダーゼで 処理し、 生成した過酸化水素を測定することにより、 フルクトシルバリンを定量 するものである。 上記で得られたフルクトシルバリンは、 そのまま、 又は必要に 応じて限外濾過等により精製して本発明の定量方法に供することができる。 本発 明において用いるケトァミンォキシダーゼとしては、 フルクトシルバリンを基質 とするものであれば特に制限はないが、 フルクトシルバリンに対して高い特異性 を有し、 フルクトシルリジンに対して特異性の低いものが好ましい。 かかるケト アミンォキシダ一ゼを用いれば、 例えば本発明の定量方法を用いて血液中の
HbAl cを定量する場合、 被験試料中に混在する可能性のある、 ヘモグロビン の a鎖及び iS鎖由来のフルクトシルリジンの影響を排除し、 高い精度で HbAl cを定量することができる。 かかるケトァミンォキシダーゼとしては、 例えばコリネバクテリゥム （Corynebacterium) 属菌由来の酵素 （キッコーマン 社製） 、 コリネバクテリウム ·スピシ一ズ （sp.) 由来の遺伝子組換えフルクト シルアミノ酸ォキシダーゼが挙げられる。 ケトアミンォキシダーゼの活性量は、 1〜： L 0000UZL、 特に 10〜5000U/Lが好ましい。 また、 ケトアミ ンォキシダーゼの処理温度は、 10〜50°C、 特に 20〜45°Cが好ましい。 ま た、 ケトァミンォキシダ一ゼの処理時間は、 0. 1分〜 1時間、 特に 0. 5分〜 30分間が好ましい。
フルクトシルバリンをケトアミンォキシダ一ゼで処理することによつて生成す る過酸化水素の測定方法は、 特に制限はないが、 反応系に色原体及びパーォキシ ダーゼ （POD) を添加し、 該色原体を酸化して発色物質を生成させ、 これを測 定する方法が好適である。 この色原体としては、 4ーァミノアンチピリンと、 フ エノ一ル系化合物、 ナフトール化合物又はァニリン系化合物との組み合わせ、 MBTH (3—メチルー 2—べンゾチアゾリノンヒドラゾン） とァニリン系化合 物との組み合わせ、 ロイコメチレンブルー等が用いられる。 また > 特許第 2516381号に記載されているように、 POD存在下にて過酸化水素と 2価 のコバルトイオンとの反応により生じた 3価のコバルトイオンを、 3価のコバル トイオンに特異的な指示薬、 例えば TASBB (2- (2—チアゾリルァゾ) 一 5—ジスルフォプチルァミノ安息香酸三ナトリゥム塩） と組み合わせ、 発色キレ —ト化合物を生成させ、 これを測定する方法も利用できる。 これによれば、 上記 方法の 5〜10倍の測定感度を得ることができる。 また、 過酸化水素を検出する 試薬として、 高感度に測定可能な TPM—PS (N, N, N' ， N' ， N" , N" —へキサ (3—スルフォプロピル) 一 4， 4， ， 4" —トリアミノトリフエ ニルメタン） （同仁化学社製） 等も利用できる。
かかるフルクトシルパリンの定量方法を用いれば、 N末端のバリンがフルクト シルイ匕されているペプチド又はタンパク質、 例えば HbAl cを極めて高精度で 定量することができる。 ここで HbAl cの定量に使用される被験試料として は、 例えば全血、 赤血球等が挙げられる。 実施例
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は以下の実施例 に限定されるものではない。
実施例 1
セリ科の植物由来力ルポキシぺプチダーゼの調製
人参の根茎部分を、 直接ジューサーにて破砕した後、 遠心分離により固形物を 除去し、 粗抽出液を得た。 この粗抽出液を、 マイレックスフィルター （0. 45 βΐ ) (ミリポア社製） を用いて濾過を行い、 澄明な抽出液を得た。 この抽出液 を 20mMリン酸緩衝液 （pH7. 0) にて透析した後、 DEAEトヨパール力 ラムに添加して抽出液中の酵素を吸着させ、 塩化ナトリウムを 50 OmM含む 20mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) により、 酵素をカラムより溶出させた。 こ れを粗精製酵素とした。
実施例 2
ショウガ科の植物由来力ルポキシぺプチダーゼの調製
生姜根茎を、 直接ジューサーにて破碎し、 放置の後、 遠心分離により固形物を 除去し、 粗抽出液を得た。 この粗抽出液に、 濾過助剤としてセライト 545 (商 標名、 ナカライテスク社製） を添加して攪拌後、 濾紙を用いて吸引濾過を行つ た。 濾液を再度、 遠心分離し、 抽出液を得た。 得られた抽出液に、 冷エタノール を等量添加し、 沈殿を形成させた。 得られた沈殿を、 少量の 2 OmMリン酸緩衝 液 （pH7. 0) に溶解させ、 DEAEトヨパールカラム （東ソ一社製） に添加 して抽出液中の酵素を吸着させた。 塩化ナトリウムを 20 OmM含む 2 OmMリ ン酸緩衝液 (pH7. 0) により、 P及着させた酵素をカラムより溶出させた。 こ れを粗精製酵素とした。
実施例 3
パイナップル科の植物由来力ルポキシぺプチダーゼの調製
市販のブロメライン粗精製品 （シグマ社製、 商品コード B 4882) を 20 mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) に懸濁させ、 室温で約 3時間攪拌した後、 遠心 分離を行い、 上清を分取し、 抽出液を得た。 この抽出液を DEAEトヨパ一ルカ ラムに添加して抽出液中の酵素を吸着させ、 塩化ナトリウムを 20 OmM含む 2 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 0) により、 酵素をカラムより溶出させた。 さ らに、 得られた溶出画分に、 等量の冷エタノールを添加し、 沈殿を形成させた。 得られた沈殿を、 少量の 20 mMリン酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) に溶解させ、 これ を粗精製酵素とした。
実施例 4
フルクトシルバリンの生産方法
1. セリ科由来粗精製酵素の使用
( i) 10 OmM酢酸緩衝液 （pH6. 0) 100 Lに、 配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列を有する N末端のバリンがフルクトシル化されているジぺプチ ド （f — VH、 バイオクェスト社製） の 500 /zM水溶液 40 L、 精製水 20 Lおよび実施例 1で得られた人参由来の粗精製酵素の溶液 40 Lを加え、 混 和後、 37°Cで一晩 （約 16時間） 反応させた。 この反応液について、 分子量 10000の限外濾過を行い、 濾液を分取した （反応液 1) 。' この反応液 1を、 キヤピラリー電気泳動装置 CAP I— 3200 (大塚電子社製） にて、 泳動緩衝 液： 1 50 mMリン酸緩衝液 （pH2. 0) 、 電圧： 1 5 kv、 検出波長： 210 nmの条件で分析を行い、 ピーク位置およびピーク面積を測定した。 (ii) 対照試験
対照として、 粗精製酵素溶液の代わりに、 精製水を加え、 同じ条件にて反応さ せ濾液を得た （対照液 1)。 この対照液 1の分析結果を反応液 1の結果と比較し た。
反応液 1の結果を図 1 (図中の破線 （〜） は、 粗酵素液由来のピークである） に、 対照液 1の結果を図 2に示した。 図 2では、 f _VHに由来するピーク （面 積： 40mABUXsec) のみが認められているが、 図 1では、 f 一 VHのピークが減 少 （面積： 17mABUXsec) し、 粗酵素液由来のピーク （面積： 16mABUX sec) と 重なっているが、 f _VHとは異なるピークの生成 （面積： 29mABUXsec) が確 認された。 尚、 f 一 VHやその他ピークの移動時間に若干ずれが生じているの は、 機器による再現性の問題及び粗酵素液添加による液性の変化によるものであ る。
(iii) 新たなピークの同定と確認
新たなピークについて、 粗精製酵素とジペプチドとの酵素反応によって生じる と考えられるフルクトシルバリンおよびヒスチジンの内、 210 nmの波長に吸 収を有するヒスチジンを、 反応液 1に添加し、 ピークの位置および面積の変化を 観察することにより同定 ·確認した。 結果を図 3に示した。
反応液 1に少量のヒスチジンを添加したところ、 図 1で観察された粗精製酵素 由来のピークに、 新たに生成された物質のピークが重なったピーク （破線
(〜） ） の高さが、 さらに増加 （面積で 7mABUXsec) した。 これより、 酵素反 応で生じたピークはヒスチジン由来のものであることが分かり、 フルクトシルバ リンが同時に生成していることが推測された。 これより、 セリ科の植物由来カル ボキシぺプチダーゼを使用することにより、 フルクトシルバリンを生産できるこ とが分かった。
2. ショゥガ科およびパイナップル科の植物由来粗精製酵素の使用
実施例 2および 3で得られた粗精製酵素についても、 実施例 4と同じ条件下で 試験を行った。
それぞれの結果を図 4および図 5に示した。 対照である図 2と比較して、 図 4 では、 f —V Hのピークがほとんど消失 （面積： 4mABU X sec) し、 新たな生成 物のピーク （面積： 18mABU X sec) が認められ、 そのピークはヒスチジンのピ一 クと一致した。 従って、 上記同様、 ショウガ科由来力ルポキシぺプチダーゼを用 いることにより、 フルクトシルバリンを生産できることが分かった。
図 5では、 f 一 V Hが減少 （面積： 15mABU X sec) し、 新たな生成物のピーク (面積： 12mABU X sec) が認められ、 そのピークはヒスチジンのピークと一致し た。 従って、 上記同様、 パイナップル科由来力ルポキシぺプチダーゼを用いるこ とにより、 フルクトシルバリンを生産できることが分かった。
実施例 5
N末端にフルクトシル化されたバリンを有するペプチド （アミノ酸の数 3〜 6 ) からのフルクトシルバリンの産生方法
配列番号 2〜 5で表されるアミノ酸配列を有する N末端のバリンがフルクトシ ル化されているペプチド （すべてバイオクェスト社製） を用いて、 実施例 4と同 じ反応条件で各粗精製酵素液を作用させた結果、 すべての配列において、 ヒスチ ジンの生成ピークが検出され、 前記のフルクトシルペプチドからも、 フルクトシ ルバリンが生産されることが分かった。

Claims

請求の範.囲
1 . N末端のバリンがフルクトシルイ匕されているペプチド又はタンパク質を、 ショゥガ科、 セリ科又はパイナツプル科の植物由来の力ルポキシぺプチダ一ゼの 1つ以上を用いて酵素処理することを特徴とするフルクトシルバリンの生産方 法。
2 . N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドのアミノ酸配列が、 配列番号 1〜 5のいずれかで表されるものである請求項 1記載のフルクトシルバ リンの生産方法。
3 . N末端のバリンがフルクトシル化されているタンパク質が、 ヘモグロビン A l cである請求項 1又は 2記載のフルクトシルバリンの生産方法。
4. 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の生産方法により得られたフルクトシル パリンに、 ケトァミンォキシダーゼを作用させ、 生成する過酸化水素を測定する ことを特徴とするフルクトシルバリンの定量方法。 '
5 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の生産方法により得られたフルク卜シル バリンに、 ケトァミンォキシダ一ゼを作用させ、 生成する過酸化水素を測定する ことを特徴とする N末端のバリンがフルクトシル化されているべプチド又は夕ン パク質の定量方法。
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