JPWO2016159384A1 - 比活性が向上したアマドリアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつ糖化ペプチドに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン(αF8P)に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化ペプチドまたはαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv) 前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつ糖化ペプチドまたはαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[2] 前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、以下の(z)および(a)から(h)、
(z)配列番号1の99位、
(a)配列番号1の62位、
(b)配列番号1の63位、
(c)配列番号1の102位、
(d)配列番号1の106位、
(e)配列番号1の110位、
(f)配列番号1の113位、
(g)配列番号1の355位、
(h)配列番号1の419位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に、1以上のアミノ酸残基の置換を有する1に記載のアマドリアーゼ。
[3] (z)配列番号1の99位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
(a)配列番号1の62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンである、
(b)配列番号1の63位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン又はグリシンである、
(c)配列番号1の102位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(d)配列番号1の106位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
(e)配列番号1の110位に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン又はチロシンである、(f)配列番号1の113位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、(g)配列番号1の355位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、および/あるいは
(h)配列番号1の419位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
2に記載のアマドリアーゼ。
[4] 前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸配列の以下(i)または(j)、
(i)配列番号1の68位、
(j)配列番号1の356位、
の位置に対応する位置で1つまたは2つのアミノ酸残基の置換を有する、1〜3のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[5](i) 配列番号1の68位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、および/または
(j) 配列番号1の356位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、4に記載のアマドリアーゼ。
[6] アマドリアーゼがさらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下の位置、
(i)262位、
(ii)257位、
(iii)249位、
(iv)253位、
(v)337位、
(vi)340位、
(vii)232位、
(viii)129位、
(ix)132位、
(x)133位、
(xi)44位、
(xii)256位、
(xiii)231位、及び
(xiv)81位、
に対応する位置で1以上のアミノ酸残基の置換を有しており、
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、1〜5のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[7] αF8Pに対する比活性が0.1U/mg以上である、1〜6のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[8] αF8Pに対する比活性が1U/mg以上である、1〜7のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[9] αF8Pに対する比活性が4U/mg以上である、1〜8のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[10] アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、1〜9のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[11] アマドリアーゼがコニオカエタ エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)由来である、1〜10のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[12] 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号211または213に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位、99位、62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位、および356位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv) 前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[13] 前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸配列の以下(l)から(q)よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼが1以上のアミノ酸残基の置換を有する1〜12のいずれかに記載のアマドリアーゼ、
(l)配列番号1の67位、
(m)配列番号1の72位、
(n)配列番号1の76位、
(o)配列番号1の96位、
(p)配列番号1の109位、
(q)配列番号1の116位。
[14](l)配列番号1の67位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
(m)配列番号1の72位に対応する位置のアミノ酸が、セリンである、
(n)配列番号1の76位に対応する位置のアミノ酸が、アラニンまたはフェニルアラニンである、
(o)配列番号1の96位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン酸である、
(p)配列番号1の109位に対応する位置のアミノ酸が、アルギニンまたはリジンである、および/あるいは
(q)配列番号1の116位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである13に記載のアマドリアーゼ。
[15] 1〜14のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、ヘモグロビンA1c測定用試薬キット。
[16] 1〜14のいずれかに記載のアマドリアーゼを用いる、試料中のヘモグロビンA1cの測定方法。
(糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c)
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンA1c(HbA1c)と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する(ポリ)ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド(α−フルクトシルペプチド)である。α−糖化ペプチドは、N末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼ等による限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンA1c(HbA1c)である場合、該当するα−糖化ペプチドは、N末端が糖化されているHbA1cのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。146残基のアミノ酸により構成されているHbA1cのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する。
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ2酢酸若しくはその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
本発明は、配列番号1、配列番号38、配列番号40、配列番号54、又は配列番号62、又は配列番号89、又は配列番号99に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき作製される、αF8Pに対して反応性を有し、かつHbA1cに直接作用するアマドリアーゼの改変体を提供する。本明細書において改変体とは変異体と交換可能に用いられ、アマドリアーゼのアミノ酸配列を野生型の配列と比較したときに、一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているものをいう。ここでいう付加には挿入も包含されるものとする。
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、HbA1cに直接作用するアマドリアーゼの改変体である。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のグルタミン
(f)113位のアラニン
(g)355位のアラニン
(h)419位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のヒスチジン
(l)配列番号1の67位、
(m)配列番号1の72位、
(n)配列番号1の76位、
(o)配列番号1の96位、
(p)配列番号1の109位、
(q)配列番号1の116位
場合により(l)配列番号1の67位に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号1の72位に対応する位置のアミノ酸はセリンでありうる。場合により(n)配列番号1の76位に対応する位置のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号1の96位に対応する位置のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号1の109位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号1の116位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のセリン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のグリシン
(f)113位のアラニン
(g)351位のアラニン
(h)416位のセリン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)352位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のヒスチジン
上記Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ(配列番号38)において、場合により(a)62位のセリンは置換されなくともよい。また、(a)62位のセリンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により(c)102位のリジンは置換されなくともよい。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のグリシンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは351位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)416位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)352位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において(l)99位のヒスチジンはセリンへと置換される。
(l)配列番号38の67位、
(m)配列番号38の72位、
(n)配列番号38の76位、
(o)配列番号38の96位、
(p)配列番号38の109位、
(q)配列番号38の116位
場合により(l)配列番号38の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号38の72位のアミノ酸はセリンでありうる。場合により(n)配列番号38の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号38の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号38の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号38の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のグリシン
(e)110位のグルタミン酸
(f)113位のリジン
(g)355位のセリン
(h)420位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のセリン
上記Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ(配列番号54)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のグリシンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のグルタミン酸はロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。場合により113位のリジンは置換されなくともよいか又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により355位のセリンは置換されなくともよい。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)356位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
(l)配列番号54の67位、
(m)配列番号54の72位、
(n)配列番号54の76位、
(o)配列番号54の96位、
(p)配列番号54の109位、
(q)配列番号54の116位
場合により(l)配列番号54の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号54の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号54の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号54の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号54の109位のアミノ酸はアルギニンのままであるかまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号54の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)61位のアルギニン
(b)62位のロイシン
(c)101位のグルタミン酸
(d)105位のグリシン
(e)109位のリジン
(f)112位のセリン
(g)355位のアラニン
(h)420位のアラニン
(i)67位のアスパラギン酸
(j)356位のアスパラギン
(k)63位のアルギニン
(l)98位のセリン
上記Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ(配列番号62)において、好ましくは(a)61位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)62位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)101位のグルタミン酸はリジンと置換される。好ましくは(d)105位のグリシンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)109位のリジンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは112位のセリンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)67位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)356位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)63位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
(l)配列番号62の66位
(m)配列番号62の71位
(n)配列番号62の75位
(o)配列番号62の95位
(p)配列番号62の108位
(q)配列番号62の115位
場合により(l)配列番号62の66位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号62の71位のアミノ酸はセリンでありうる。場合により(n)配列番号62の75位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号62の95位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号62の108位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号62の115位のアミノ酸はアルギニンでありうる。配列番号147のAspergillus nidulans由来アマドリアーゼについても同様である。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン
(e)110位のリジン
(f)113位のスレオニン
(g)355位のアラニン
(h)419位のグリシン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアスパラギン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のセリン
上記Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ(配列番号40に示したEFP-T5、又は配列番号145)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のアスパラギンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のリジンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のスレオニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)419位のグリシンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)356位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
(l)配列番号40の67位、
(m)配列番号40の72位、
(n)配列番号40の76位、
(o)配列番号40の96位、
(p)配列番号40の109位、
(q)配列番号40の116位
場合により(l)配列番号40の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号40の72位のアミノ酸はセリンのままでもよい。場合により(n)配列番号40の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号40の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号40の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号40の116位のアミノ酸はアルギニンのままでもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のイソロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のセリン
(e)110位のセリン
(f)113位のアラニン
(g)355位のアラニン
(h)420位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアスパラギン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のヒスチジン
上記Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(CnFX、配列番号89又は149)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のイソロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のセリンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のセリンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)356位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において(l)99位のヒスチジンはセリンへと置換される。
(l)配列番号89又は149の67位、
(m)配列番号89又は149の72位、
(n)配列番号89又は149の76位、
(o)配列番号89又は149の96位、
(p)配列番号89又は149の109位、
(q)配列番号89又は149の116位
場合により(l)配列番号89又は149の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号89又は149の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号89又は149の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号89又は149の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号89又は149の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号89又は149の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のスレオニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)354位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のヒスチジン
上記Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号113)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により(c)102位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のアラニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のスレオニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)354位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において(l)99位のヒスチジンはセリンへと置換される。
(l)配列番号113の67位、
(m)配列番号113の72位、
(n)配列番号113の76位、
(o)配列番号113の96位、
(p)配列番号113の109位、
(q)配列番号113の116位
場合により(l)配列番号113の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号113の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号113の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号113の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号113の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号113の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアラニン
(e)110位のグルタミン
(f)113位のスレオニン
(g)356位のアラニン
(h)421位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)357位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のグリシン
上記Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号115)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により(c)102位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは(d)106位のアラニンはリジンまたはアルギニンへと置換されるかまたはアラニンのままでよい。好ましくは(e)110位のグルタミンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のスレオニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは356位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)421位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)357位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において(l)99位のグリシンはセリンへと置換される。
(l)配列番号115の67位、
(m)配列番号115の72位、
(n)配列番号115の76位、
(o)配列番号115の96位、
(p)配列番号115の109位、
(q)配列番号115の116位
場合により(l)配列番号115の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号115の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号115の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号115の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号115の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号115の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のアラニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)354位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のヒスチジン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号117)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のアラニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)354位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において(l)99位のヒスチジンはセリンへと置換される。
(l)配列番号117の67位、
(m)配列番号117の72位、
(n)配列番号117の76位、
(o)配列番号117の96位、
(p)配列番号117の109位、
(q)配列番号117の116位
場合により(l)配列番号117の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号117の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号117の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号117の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号117の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号117の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のアラニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のセリン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)354位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のヒスチジン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号117)と95%のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ(配列番号99)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のアラニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)354位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において(l)99位のヒスチジンはセリンへと置換される。
(l)配列番号99の67位、
(m)配列番号99の72位、
(n)配列番号99の76位、
(o)配列番号99の96位、
(p)配列番号99の109位、
(q)配列番号99の116位
場合により(l)配列番号99の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号99の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号99の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号99の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号99の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号99の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)61位のアルギニン
(b)62位のロイシン
(c)101位のグルタミン酸
(d)105位のリジン
(e)109位のアルギニン
(f)112位のセリン
(g)355位のアラニン
(h)420位のアラニン
(i)67位のアスパラギン酸
(j)356位のアスパラギン
(k)63位のアルギニン
(l)98位のセリン
上記Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ(配列番号119)において、好ましくは(a)61位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)62位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)101位のグルタミン酸はリジンへと置換される。場合により(d)105位のリジンは置換されずともよいかまたはアラニンもしくはアルギニンへと置換され得る。好ましくは(e)109位のアルギニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは112位のセリンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)67位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)356位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)63位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
(l)配列番号119の66位
(m)配列番号119の71位
(n)配列番号119の75位
(o)配列番号119の95位
(p)配列番号119の108位
(q)配列番号119の115位
場合により(l)配列番号119の66位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号119の71位のアミノ酸はセリンでありうる。場合により(n)配列番号119の75位のアミノ酸は、アラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号119の95位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号119の108位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号119の115位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のアラニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)354位のアラニン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のヒスチジン
上記Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号121)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により(c)102位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のアラニンはロイシンへ、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)354位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において(l)99位のヒスチジンはセリンへと置換される。
(l)配列番号121の67位、
(m)配列番号121の72位、
(n)配列番号121の76位、
(o)配列番号121の96位、
(p)配列番号121の109位、
(q)配列番号121の116位
場合により(l)配列番号121の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号121の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号121の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号121の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号121の109位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号121の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のセリン
(e)110位のリジン
(f)113位のアスパラギン酸
(g)355位のアラニン
(h)419位のセリン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアスパラギン
(k)64位のアルギニン
(l)99位のセリン
上記Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号123)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のセリンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のリジンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは113位のアスパラギン酸はリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)419位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)356位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。Penicillium chrysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼについても同様である。好ましくは(k)64位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
(l)配列番号123の67位、
(m)配列番号123の72位、
(n)配列番号123の76位、
(o)配列番号123の96位、
(p)配列番号123の109位、
(q)配列番号123の116位
場合により(l)配列番号123の67位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号123の72位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により(n)配列番号123の76位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号123の96位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号123の109位のアミノ酸はアルギニンのままでよいかまたはリジンでありうる。場合により(q)配列番号123の116位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
基質としてヘモグロビンA1cのβ鎖を認識し、
作用としてヘモグロビンA1cのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成し、
至適pH範囲をpH6〜8の範囲に有し、
作用pH範囲をpH5〜9の範囲に有し、
作用温度が25〜40℃であり、
SDS−PAGE上での分子量が約45〜55KDa、例えば約48〜50KDaであるものであり得る。
これらのアマドリアーゼをコードする遺伝子(以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう)を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(Stratagene社製)等が好ましい。
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体DNAを用いて、例えば、大腸菌K−12株、好ましくは大腸菌JM109株、大腸菌DH5α株(ともにタカラバイオ社製)等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、GENETYX(GENETYX社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該2以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで2以上のアミノ酸配列について、同一性%とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して2以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、2以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばC末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性%の算出には利用されない。
(i) 配列番号211または配列番号213に示すアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼであるか、または(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号211または配列番号213のアミノ酸配列と70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、80%以上または85%以上の配列同一性を有し、配列番号211または配列番号213の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、前記(ii)に規定される相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。
(i)68位、及び
(ii)356位、
に対応する位置で1以上のアミノ酸残基の置換を有する。
(i)262位、
(ii)257位、
(iii)249位、
(iv)253位、
(v)337位、
(vi)340位、
(vii)232位、
(viii)129位、
(ix)132位、
(x)133位、
(xi)44位、
(xii)256位、
(xiii)231位、及び
(xiv)81位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に1以上のアミノ酸残基の置換を有する。さらなる実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい。
(l)配列番号1の67位、
(m)配列番号1の72位、
(n)配列番号1の76位、
(o)配列番号1の96位、
(p)配列番号1の109位、
(q)配列番号1の116位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に1以上のアミノ酸残基の置換を有してもよい。場合により(l)配列番号1の67位に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により(m)配列番号1の72位に対応する位置のアミノ酸はセリンでありうる。場合により(n)配列番号1の76位に対応する位置のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により(o)配列番号1の96位に対応する位置のアミノ酸は、グルタミン酸でありうる。場合により(p)配列番号1の109位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンでありうる。場合により(q)配列番号1の116位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンでありうる。
本明細書において、ある基準となるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置という。本明細書では便宜上、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列を基準として説明する。この場合、アミノ酸配列における「対応する位置」とは、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
(a)配列番号1の62位、
(b)配列番号1の63位、
(c)配列番号1の102位、
(d)配列番号1の106位、
(e)配列番号1の110位、
(f)配列番号1の113位、
(g)配列番号1の355位、
(h)配列番号1の419位、
(i) 配列番号1の68位、
(j) 配列番号1の356位、
(k) 配列番号1の64位、及び
(l) 配列番号1の99位
からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が1つまたはそれ以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、例えば10、置換されたものであり得る。なお、「配列番号1に示されるアミノ酸配列の62位に対応する位置」のアミノ酸は、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ(配列番号38)では62位のセリンである。これは配列番号1のアミノ酸配列から見れば62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンとなった、すなわちセリンに置換されたものと同等である。したがって天然のアマドリアーゼとして、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ(配列番号38)のような、配列番号1のアミノ酸配列の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンであるアマドリアーゼも便宜上、本明細書では、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに(a)配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置にアミノ酸置換を有するアマドリアーゼに含めるものとする。
(a)配列番号1の62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンである、
(b)配列番号1の63位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン又はグリシンである、
(c)配列番号1の102位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(d)配列番号1の106位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
(e)配列番号1の110位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンである、
(f)配列番号1の113位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
(g)配列番号1の355位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
(h)配列番号1の419位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号1の68位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号1の356位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
(k) 配列番号1の64位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンである、
(l) 配列番号1の99位に対応する位置のアミノ酸がセリンである。
アマドリアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列の第60位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これをグリシンへと置換することによって、置換前にαFVH活性を示さなかった酵素が、置換後にαFVH活性を示すようになることが報告されている(特開2010−35469号公報、国際公開第2012/018094号参照)。したがって、本発明に用いるアマドリアーゼの配列番号1の第60位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これを予めグリシンへと置換しておくこともできる。あるいは、野生型において配列番号1の60位に対応する位置がグリシンであるアマドリアーゼを用いて、上記配列番号1の第64位、62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位及び419位に対応する位置並びに68位及び356位に変異を導入してもよい。本発明のアマドリアーゼ変異体は、特に断らない限り、配列番号1の第60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであるものを包含する。例えば、Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼは、配列番号1の60位に対応する配列番号147中の第59位のアミノ酸が野生型ではセリンであるが、これをグリシンに置換したもの(配列番号62)を本発明の変異体のための基となるアマドリアーゼとして用いてもよい。Penicillium janthinellum(Pj)由来アマドリアーゼ(配列番号123)についても同様である。
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその界面活性剤に対する耐性を向上させることができることを確認している。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有しうる。
(1)262位のアスパラギンの置換、例えば、ヒスチジンへの置換。
(2)257位のバリンの置換、例えば、システイン、セリン、スレオニンへの置換。 (3)249位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(4)253位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(5)337位のグルタミンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(6)340位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。
(7)232位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(8)129位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(9)132位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(10)133位のグルタミン酸の置換、例えば、アラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換。
(11)44位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。
(12)256位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(13)231位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(14)81位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、3アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した(国際公開第2013/100006号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい。
「配列番号1に示すアミノ酸配列のカルボキシル末端からの3アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの3アミノ酸残基に対応する位置をいう。Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の3残基の配列は、435位のプロリン、436位のリジン及び437位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
上記のようにして得られたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
上記のような手段で得られるアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、HbA1cに直接作用しうる。
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
(アマドリアーゼのαF8P、αF6P、αFVHまたはαFVに対する活性の測定用試薬の調製例)
(試薬1):5U/ml パーオキシダーゼ、0.49mM 4−アミノアンチピリンを含む0.1M リン酸緩衝液 pH6.5
5.0kUのパーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(和光純薬工業社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に溶解し、1000mlに定容する。
(試薬2):15mM TOOS溶液
500mgのTOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製)をイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
(試薬3):基質溶液(30mM; 終濃度1mM)
αF8P(ペプチド研究所製) 334mg、若しくはαF6P(ペプチド研究所製) 257.1mg、若しくはαFVH(キッコーマン社製) 124.9mg、若しくはαFV(キッコーマン社製) 83.8mgをイオン交換水に溶解し、10mlに定容する。
(アマドリアーゼのαF8P、αF6P、αFVHまたはαFVに対する活性の測定方法の例)
2.7mlの試薬1、100μlの試薬2、および100μlの酵素液を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、試薬3を100μl加えて良く混ぜた後、分光光度計(U−3010A、日立ハイテクノロジーズ社製)により、555nmにおける吸光度の経時変化を観測し、555nmにおける吸光度の1分間あたりの変化量(ΔAs)を測定する。なお、対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、555nmにおける吸光度の1分間あたりの変化量(ΔA0)を測定する。37℃で1分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出する。
活性(U/ml)={(ΔAs−ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs:反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0:対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2:反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5:1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df:希釈係数。
以下のHbA1c測定用試薬を調製する。
試料:HbA1c溶液
HbA1c認証実用標準物質JCCRM423(検査医学標準物質機構製)
総ヘモグロビン濃度133g/l、
HbA1c濃度3レベル(NGSP値 約5.6%、約7.7%、約10.5%)
試薬A1:試料前処理液
5.0% n−ドデシル−β−D−マルトシド(同仁化学研究所製)
試薬A2:試料前処理液
5.0% n−テトラデシル−β−D−マルトシド(シグマアルドリッチ社製)
試薬B:ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
150mM リン酸カリウム緩衝液 pH6.5
0.30mM N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′− ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64、和光純薬工業製)
15U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
試薬C1:アマドリアーゼ溶液
120mM リン酸カリウム緩衝液 pH6.5
120U/mlの本発明のアマドリアーゼ。
試薬A1もしくは試薬A2で30倍希釈した試料(本明細書において試料希釈液と表記することがある)を高温で所定時間、例えば98℃で2分間インキュベートした後、試料希釈液25μlを50μlの試薬Bに添加して37℃で5分間インキュベートし、その後、25μlの試薬C1を添加してHbA1cのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を37℃で5分間進行させる。溶液中に過酸化水素が生じる場合、パーオキシダーゼの作用によりロイコ色素が発色し、751nmの光の吸光度が増加する。試料のHbA1c濃度に応じて得られた結果を基に、試料のHbA1c濃度(NGSP値)と、過酸化水素の定量反応前後の751nmの光の吸光度差ΔAとをグラフにプロットすることができる。
ΔA=(試薬C1添加5分後の吸光度)−(試薬C1添加直前の吸光度×0.75)
以下の組成を有するHbA1c測定用試薬を調製し、Bio Majesty JCA−BM1650(日本電子製)を利用してHbA1cを測定する。
試料:HbA1c溶液
HbA1c認証実用標準物質JCCRM423(検査医学標準物質機構製)
総ヘモグロビン濃度133g/l、
HbA1c濃度3レベル(NGSP値 約5.6%、約7.7%、約10.5%)
試薬D:試料前処理液
8.3% n−ドデシル−β−D−マルトシド(同仁化学研究所製)またはポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(Brij58、和光純薬工業製)
0.1M 塩酸
試薬E:ロイコ色素溶液
30mM Tris−リン酸カリウム緩衝液 pH9.0
290mM リン酸カリウム緩衝液 pH6.5
0.16mM N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′− ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64、和光純薬工業製)
試薬F1:パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
100mM リン酸カリウム緩衝液 pH6.5
40U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
180U/mlの本発明アマドリアーゼ(例えばCFP−T7−H35等)
ΔA=(試薬F1添加5分後の吸光度)−(試薬F1添加直前の吸光度×0.75)
以下の組成を有するHbA1c測定用試薬を調製し、Bio Majesty JCA−BM1650(日本電子製)を利用してHbA1cを測定する。
試料:HbA1c溶液
HbA1c認証実用標準物質JCCRM423(検査医学標準物質機構製)
総ヘモグロビン濃度133g/l、
HbA1c濃度3レベル(NGSP値 約5.6%、約7.7%、約10.5%)
試薬G1:試料前処理液
0.80% テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(東京化成工業製)
試薬G2:試料前処理液
0.70% ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(東京化成工業製)
試薬H1:ロイコ色素溶液
120mM MOPS−NaOH緩衝液 pH6.5
1.6% n−ドデシル−β−D−マルトシド(同仁化学研究所製)
0.16mM N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′− ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64、和光純薬工業製)
試薬H2:ロイコ色素溶液
120mM PIPES−NaOH緩衝液 pH6.5
1.6% n−ドデシル−β−D−マルトシド(同仁化学研究所製)
0.16mM N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′− ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64、和光純薬工業製)
試薬I1:パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
100mM MOPS−NaOH緩衝液 pH6.5
40U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
160U/ml 本発明のアマドリアーゼ(例えばCFP−DH2等)
試薬I2:パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
100mM PIPES−NaOH緩衝液 pH6.5
40U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
160U/ml 本発明のアマドリアーゼ
ΔA=(試薬I1またはI2添加5分後の吸光度)−(試薬I1またはI2添加直前の吸光度×0.75)
HbA1cを含む試料にHbA1cオキシダーゼ(アマドリアーゼ)を作用させる。作用時間は例えば、5秒以上、10秒以上、20秒以上、30秒以上、1分以上、180分未満、150分未満、120分未満、60分未満、50分未満、40分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、例えば5分未満、例えば0.5分以上〜120分未満、0.5分以上〜60分未満、1分以上〜30分未満、1分以上〜20分未満、1分以上〜15分未満、例えば1分以上〜10分未満、例えば1分以上〜5分未満とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中のHbA1cを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。HbA1cオキシダーゼ作用時間を0.5〜60分間、好ましくは1〜50分間、1〜40分間、1〜30分間、1〜20分間、1〜15分間、例えば1〜10分間、例えば1〜5分間とすることにより、迅速かつ良好にHbA1cを測定できる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、20〜45℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
本発明のHbA1c測定方法は、定性的であってもよいが、定量的な測定方法とすることもできる。ここでHbA1cの定量的測定方法とは、試料中のHbA1cの濃度を決定する方法をいう。すなわち本発明の一実施形態は、アマドリアーゼを使用することを含む、試料中のHbA1cの定量法を提供する。この定量法は、HbA1cを含む試料と本発明のアマドリアーゼとを接触させる工程、及び該アマドリアーゼのHbA1cに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程を含む。ここでのHbA1cは天然の状態であってもよく、または変性した状態であってもよい。該定量法について用いる接触とは、本発明のアマドリアーゼがHbA1cの酸化反応を触媒しうるように、該アマドリアーゼと試料とを物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とHbA1cを混合する場合のみならず、固相担体に担持された本発明のアマドリアーゼにHbA1cを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
ある実施形態において、上記の(アマドリアーゼ活性の測定方法)に記載の方法を用いて、あるアマドリアーゼがαF8Pに対する反応性を示すかや、当該アマドリアーゼのαF8P対する比活性が向上しているか否かを、決定することができる。候補となるアマドリアーゼとしては、種々の天然アマドリアーゼまたはそれらの改変体における配列番号1に示すアミノ酸配列の64位に対応する位置のアミノ酸をグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンとしたものが挙げられる。アマドリアーゼの、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位に対応する位置のアミノ酸が、グリシンではないものと比較して、あるいは、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンではないものと比較して、前記の候補アマドリアーゼのαF8Pに対する比活性が向上しているか測定することができる。こうした改変体の作製に当たっては、配列番号1のアミノ酸配列の(a)62位に対応する位置のアミノ酸を、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換すること、(b)63位に対応する位置のアミノ酸をヒスチジン又はアラニン又はグリシンへと置換すること、(c)102位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること、(d)106位に対応する位置のアミノ酸をアラニン、リジン、又はアルギニンへと置換すること、(e)110位に対応する位置のアミノ酸をロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換すること、(f)113位に対応する位置のアミノ酸をリジン又はアルギニンへと置換すること、(g)355位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、(h)419位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること、(i)68位に対応する位置のアミノ酸をアスパラギンへと置換すること、(j)356位に対応する位置のアミノ酸をスレオニンへと置換すること、(k)99位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、場合により67位に対応する位置のアミノ酸をヒスチジンへと置換すること、72位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、76位に対応する位置のアミノ酸をアラニンまたはフェニルアラニンへと置換すること、96位に対応する位置のアミノ酸をグルタミン酸へと置換すること、109位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジンへと置換すること、116位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンへと置換することを参考にしてもよい。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子(配列番号142)の組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H35)株(国際公開第2013/162035号参照)を、3mlのLB−amp培地[1%(w/v)バクトトリプトン、0.5%(w/v)ペプトン、0.5%(w/v)NaCl、50μg/ml アンピシリン]に接種して、37℃で16時間振とう培養し、培養物を得た。
得られた組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7−H35を鋳型として、配列番号193、194の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7ーH37)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7ーH38−G)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−A)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−V)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−I)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−L)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−M)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−S)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−T)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−GY)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−GF)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−GH)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H38−GYS)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−DH2)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−DH3)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地200mlに植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液40mlを調製した。大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−DH2)および大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−DH3)の培養菌体のみ、2mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液40mlを調製した。
本発明の知見は、まずConiochaeta属由来のアマドリアーゼを用いて検証されたが、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様な効果を奏することが期待できるという示唆を与え得る。そこで、実際に本発明の知見を、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも導入して、この検証を行った。
配列番号187はフルクトシルヘキサペプチドに対して作用する、Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ(以降PnFXと称する)の改変体のアミノ酸配列であり、配列番号188のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドpET22b−PnFX−62D/63H/106K/110L/113K/351Sを保持する大腸菌BL21(DE3)株により生産できる(国際公開第WO2013/162035号参照)。
配列番号137はフルクトシルヘキサペプチドに対して作用する、Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ(以降NvFXと称する)の改変体のアミノ酸配列であり、配列番号138のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドpET22b―NvFX−62D/106K/110Lを保持する大腸菌BL21(DE3)株により生産できる(国際公開第WO2013/162035号参照)。
配列番号117はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ(以降CcFXと称する)のアミノ酸配列であり、配列番号240のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドpKK223−3−CcFXを保持する大腸菌JM109株により生産できる(国際公開第WO2013/162035号参照)。
(Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製)
上記のようにして得られたPnFX生産能を有する大腸菌BL21(DE3)(pET22b−PnFX−62D/63H/106K/110L/113K/351S)株、大腸菌BL21(DE3)(pET22b−PnFX−62D/63H/106K/110L/113K/351S−64S)株を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
大腸菌JM109(pKK223−3−NvFX−62D/63H/106K/110L)、大腸菌JM109(pKK223−3−NvFX−62D/63H/106K/110L−64M)、大腸菌JM109(pKK223−3−NvFX−62D/63H/106K/110L−64S)、大腸菌JM109(pKK223−3−NvFX−62D/63H/106K/110L−64T)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
大腸菌JM109(pKK223−3−CcFX−62D/63H/102K/106K)、大腸菌JM109(pKK223−3−CcFX−62D/63H/102K/106K−64L)、大腸菌JM109(pKK223−3−CcFX−62D/63H/102K/106K−64T)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
精製した改変型Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ、改変型Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ、改変型Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼのタンパク質濃度は、それぞれのタンパク質が有するFADに基づき、以下の方法で測定した。
配列番号1 Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ(CFP-T7)のアミノ酸配列配列番号2 配列番号1のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号3−33 PCRプライマー
配列番号34 PCRプライマー
配列番号35 PCRプライマー
配列番号36 Aspergillus oryzae RIB40由来アマドリアーゼ(FAOAo2)のアミノ酸配列配列番号37: 配列番号36のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号38 Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ(PnFX)のアミノ酸配列
配列番号39 配列番号38のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号40 Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ(EFP-T5)のアミノ酸配列
配列番号41 配列番号40のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号42−53 PCRプライマー
配列番号54 Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ(NvFX)のアミノ酸配列
配列番号55 配列番号54のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号56−61 PCRプライマー
配列番号62 S59Gのアミノ酸置換を導入したAspergillus nidulans由来アマドリアーゼ(AnFX)のアミノ酸配列
配列番号63 配列番号62のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号64−88 PCRプライマー
配列番号89 Cryptococcus neoformans由来アマドリアーゼ(CnFX)のアミノ酸配列
配列番号90 配列番号89のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号91−98 PCRプライマー
配列番号99 Curvularia clavataケトアミンオキシダーゼと95%の配列同一性を示すアマドリアーゼ(Cc95FX)のアミノ酸配列
配列番号100 配列番号99のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号101−112 PCRプライマー
配列番号113 Pyrenochaeta sp.(Py)由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号114 配列番号113のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号115 Arthrinium sp.(Ar) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号116 配列番号115のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号117 Curvularia clavata(Cc) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号118 配列番号117のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号119 Emericella nidulans(En) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号120 配列番号119のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号121 Ulocladium sp.(Ul) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号122 配列番号121のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号123 Penicillium janthinellum(Pj) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号124 配列番号123のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号125 Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ(Amadoriase I)のアミノ酸配列
配列番号126 配列番号125のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号127 Aspergillus oryzae由来アマドリアーゼ(FAOAo1)のアミノ酸配列
配列番号128 配列番号127のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号129 Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ(Amadoriase II)のアミノ酸配列
配列番号130 配列番号129のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号131 Aspergillus terreus由来アマドリアーゼ(FAOD-A)のアミノ酸配列
配列番号132 配列番号131のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号133 CFP-T7-H20のアミノ酸配列
配列番号134 配列番号133のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号135 S62D、D106K、G110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したPnFPOX の アミノ酸配列
配列番号136 配列番号135のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号137 R62D、G106K、E110Lのアミノ酸置換を導入したNvFX(NvFX-62D/106K/110L)のアミノ酸配列
配列番号138 配列番号137のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号139 R61D、G105K、K1091Lのアミノ酸置換を導入したAnFX(AnFX-61D/105K/109L)のアミノ酸配列
配列番号140 配列番号139のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号141 R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355Sのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H35)のアミノ酸配列
配列番号142 配列番号141のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号143 R62D、L63H、D106K、K110L、T113K、A355Sのアミノ酸置換を導入したEFP-T5(EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S)のアミノ酸配列
配列番号144 配列番号143のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号145 Eupenicillium terrenum由来野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号146 配列番号145のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号147 Aspergillus nidulans由来野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号148 配列番号147のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号149 Cryptococcus neoformans由来野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号150 配列番号149のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号151 R62Aのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H1)のアミノ酸配列
配列番号152 配列番号151のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号153 R62Dのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-62D)のアミノ酸配列
配列番号154 配列番号153のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号155R62Dのアミノ酸置換を導入したEFP-T5(EFP-T5-R62D)のアミノ酸配列
配列番号156 配列番号155のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号157 R62A、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H2)のアミノ酸配列
配列番号158 配列番号157のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号159 R62A、Q110Yのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H4)のアミノ酸配列
配列番号160 配列番号159のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号161 R62N、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H2-62N)のアミノ酸配列
配列番号162 配列番号161のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号163 R62D、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H6)のアミノ酸配列
配列番号164 配列番号163のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号165 R62D、D106A、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H10)のアミノ酸配列
配列番号166 配列番号165のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号167 R62D、D106K、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H11)のアミノ酸配列
配列番号168 配列番号167のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号169 R62D、D106R、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H12)のアミノ酸配列
配列番号170 配列番号169のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号171 R62D、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H13)のアミノ酸配列
配列番号172 配列番号171のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号173 R62D、Q110L、A113Rのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H14)のアミノ酸配列
配列番号174 配列番号173のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号175 R62D、D106K、Q110L、A113Rのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H21)のアミノ酸配列
配列番号176 配列番号175のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号177 R62D、L63A、D106K、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H24)のアミノ酸配列
配列番号178 配列番号177のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号179 R62D、L63H、D106K、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H26)のアミノ酸配列
配列番号180 配列番号179のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号181 R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H28)のアミノ酸配列
配列番号182 配列番号181のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号183 R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H29)のアミノ酸配列
配列番号184 配列番号183のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号185 R61D、L62H、E101K、G105K、K109L、S112K、A355Sのアミノ酸置換を導入したAnFX(AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)のアミノ酸配列
配列番号186 配列番号185のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号187 S62D、L63H、D106K、G110L、A113K、A351Sのアミノ酸置換を導入したPnFX(PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S)のアミノ酸配列
配列番号188 配列番号187のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号189 R62D、S106K、S110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCnFX(CnFX-62D/106K/110L/113K)のアミノ酸配列
配列番号190 配列番号189のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号191 R62D、L63H、D106K、A110L、A113K、A353Sのアミノ酸置換を導入したCc95Fx(Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S)のアミノ酸配列
配列番号192 配列番号191のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号193−198 PCRプライマー
配列番号199 E44P、D68N、E133A、E253K、V257C、N262H、Q337K、E340Pのアミノ酸置換を導入し、P435、K436、L437を欠失させたCFP-T7-H35(CFP-DH1)のアミノ酸配列
配列番号200 配列番号199のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号201−202 PCRプライマー
配列番号203 A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-DH1(CFP-DH2)のアミノ酸配列
配列番号204 配列番号203のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
配列番号205−208 PCRプライマー
配列番号209 D68N、A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-T7-H35(CFP-T7-H37)のアミノ酸配列
配列番号210 配列番号209のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号211 R64G、D68N、A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-T7-H35(CFP-T7-H38)のアミノ酸配列
配列番号212 配列番号211のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号213 R64G、A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-DH1(CFP-DH3)のアミノ酸配列
配列番号214 配列番号213のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号215−239 PCRプライマー
配列番号240 配列番号117のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号241−248 PCRプライマー
Claims (16)
- 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつ糖化ペプチドに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン(αF8P)に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化ペプチドまたはαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv) 前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつ糖化ペプチドまたはαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。 - 前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、以下の(z)および(a)から(h)、
(z)配列番号1の99位、
(a)配列番号1の62位、
(b)配列番号1の63位、
(c)配列番号1の102位、
(d)配列番号1の106位、
(e)配列番号1の110位、
(f)配列番号1の113位、
(g)配列番号1の355位、
(h)配列番号1の419位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に、1以上のアミノ酸残基の置換を有する請求項1に記載のアマドリアーゼ。 - (z)配列番号1の99位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
(a)配列番号1の62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンである、
(b)配列番号1の63位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン又はグリシンである、
(c)配列番号1の102位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(d)配列番号1の106位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
(e)配列番号1の110位に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン又はチロシンである、(f)配列番号1の113位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、(g)配列番号1の355位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、および/あるいは
(h)配列番号1の419位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
請求項2に記載のアマドリアーゼ。 - 前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸配列の以下(i)または(j)、
(i)配列番号1の68位、
(j)配列番号1の356位、
の位置に対応する位置で1つまたは2つのアミノ酸残基の置換を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。 - (i) 配列番号1の68位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、および/または
(j) 配列番号1の356位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、請求項4に記載のアマドリアーゼ。 - アマドリアーゼがさらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下の位置、
(i)262位、
(ii)257位、
(iii)249位、
(iv)253位、
(v)337位、
(vi)340位、
(vii)232位、
(viii)129位、
(ix)132位、
(x)133位、
(xi)44位、
(xii)256位、
(xiii)231位、及び
(xiv)81位、
に対応する位置で1以上のアミノ酸残基の置換を有しており、
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。 - αF8Pに対する比活性が0.1U/mg以上である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
- αF8Pに対する比活性が1U/mg以上である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
- αF8Pに対する比活性が4U/mg以上である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
- アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項1〜9のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
- アマドリアーゼがコニオカエタ エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)由来である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
- 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号211または213に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における64位、99位、62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位、および356位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv) 前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつαF8Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。 - 前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸配列の以下(l)から(q)よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼが1以上のアミノ酸残基の置換を有する請求項1〜12のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ、
(l)配列番号1の67位、
(m)配列番号1の72位、
(n)配列番号1の76位、
(o)配列番号1の96位、
(p)配列番号1の109位、
(q)配列番号1の116位。 - (l)配列番号1の67位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
(m)配列番号1の72位に対応する位置のアミノ酸が、セリンである、
(n)配列番号1の76位に対応する位置のアミノ酸が、アラニンまたはフェニルアラニンである、
(o)配列番号1の96位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン酸である、
(p)配列番号1の109位に対応する位置のアミノ酸が、アルギニンまたはリジンである、および/あるいは
(q)配列番号1の116位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである請求項13に記載のアマドリアーゼ。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載のアマドリアーゼを含む、ヘモグロビンA1c測定用試薬キット。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のアマドリアーゼを用いる、試料中のヘモグロビンA1cの測定方法。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP4231668B2 (ja) | 2001-09-04 | 2009-03-04 | キッコーマン株式会社 | 新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ |
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JP4227820B2 (ja) | 2003-03-12 | 2009-02-18 | 旭化成ファーマ株式会社 | 新規な酵素 |
JP4248900B2 (ja) | 2003-03-14 | 2009-04-02 | イチビキ株式会社 | 新規なフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子及びそれを用いての該フルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法 |
DE602004030328D1 (de) | 2003-05-21 | 2011-01-13 | Asahi Kasei Pharma Corp | Verfahren zur messung von glykoliertem hämoglobin a1c, dafür zu verwendendes enzym und verfahren zur herstellung davon |
ATE509119T1 (de) | 2003-11-19 | 2011-05-15 | Sekisui Medical Co Ltd | Verfahren zum testen von glykosyliertem protein |
JP5442432B2 (ja) | 2007-03-05 | 2014-03-12 | キッコーマン株式会社 | 糖化ヘキサペプチドの測定方法 |
JP5350762B2 (ja) | 2008-08-04 | 2013-11-27 | 東洋紡株式会社 | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、およびその利用法 |
JP5243878B2 (ja) | 2008-08-04 | 2013-07-24 | 東洋紡株式会社 | フルクトシルバリルヒスチジン測定用酵素、およびその利用法 |
CN102232111B (zh) | 2008-10-09 | 2014-12-03 | 协和梅迪克斯株式会社 | 果糖基肽氧化酶 |
US8993255B2 (en) | 2008-10-10 | 2015-03-31 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Protein having fructosyl valyl histidine oxidase activity, modified protein, and use of the protein or the modified protein |
EP2281900A1 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-09 | Roche Diagnostics GmbH | Fructosyl peptidyl oxidase and sensor for assaying a glycated protein |
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JP2014183786A (ja) * | 2013-03-25 | 2014-10-02 | Kikkoman Corp | 改変アマドリアーゼ |
WO2015005258A1 (ja) * | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 協和メデックス株式会社 | 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとその利用 |
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