WO2021167011A1

WO2021167011A1 - 検体の状態を評価するためのデバイス、それを含むシステム、検体の状態を評価する方法及びそれに用いる乳酸デヒドロゲナーゼ

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Publication number: WO2021167011A1
Application number: PCT/JP2021/006153
Authority: WO
Inventors: 陽介鉞; 千晶稲本; 美月中村; 英一郎菅; 敦一柳; 遥香平口; 遼太鈴木
Original assignee: キッコーマン株式会社
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2021-02-18
Publication date: 2021-08-26
Also published as: US20230213499A1; KR20220143091A; EP4108678A1; EP4108678A4; JPWO2021167011A1

Abstract

本発明は、ヒトおよび非ヒト生物の間質液、血液、尿、涙、汗、唾液、飲食品、醸造物等の状態を評価するためのデバイス、システム、プログラム、それらを用いた評価方法を提供することを目的とする。　本発明は、検体に乳酸デヒドロゲナーゼを作用させるための作用部と、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知するセンサを含む、検体の状態を評価するためのデバイス、システム、プログラム、それらを用いた検体の状態を評価するための方法、それに用いる酵素を提供する。

Description

検体の状態を評価するためのデバイス、それを含むシステム、検体の状態を評価する方法及びそれに用いる乳酸デヒドロゲナーゼ

　本発明は、フラビン化合物を補酵素とするフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを用いたセンサを含む、検体の状態を評価するためのデバイス、前記デバイスがさらに出力部を含むシステム、前記デバイスまたはシステムを用いて検体の状態を評価する方法に関する。また、本発明は、前記デバイス、システムおよびそれらを用いて検体の状態を評価する方法に好適に用いることが可能なフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼに関する。

　血中乳酸濃度や汗中乳酸濃度は、疲労や身体状態を反映するマーカーとして知られている。乳酸は主要代謝産物であり、健康管理の指標のみならず、重篤な病気および／または外科患者を含む健康評価にとって重要であることが認識されており、体液中の乳酸値は循環不全、肝障害などの種々の病態に対する指標となり得る。乳酸監視は、敗血症、低酸素症、および癌組織の存在を検出するために使用され得る（非特許文献１）。

　疾病状態のヒトに限らない体調管理の目的に関しても、スポーツ選手や日常的に運動することに関心の高い人が行うトレーニングの適切性をモニタリングするための一指標として、乳酸監視が行われている（非特許文献２）。

　特許文献１～３には、ヒトの状態や姿勢等を一定の時間連続的にモニタリングする技術的な提案として、所定の情報処理装置が提案されている（特許文献１～３）。

　乳酸を基質とする酵素としては、乳酸オキシダーゼ（以下、ＬＯＤ）が知られている。ＬＯＤは、乾燥後の保管中に活性が失われていくという問題がある。そのため、特許文献４には、乾燥工程に際し特定の安定化剤と組み合わせて乾燥させる方法が提案されている。

　特許文献５には、過酸化水素によるＬＯＤ活性低下を回避する手段として、過酸化水素消去目的でカタラーゼを共存させた乳酸センサも提案されている。

　また、乳酸を基質とする酵素としては、ＦＭＮ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＦＭＮ－ＬＤＨ）が知られている。非特許文献３には、これまでに知られているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＦＭＮ－ＬＤＨは、安定性に課題があることが記載されている。

特開２０１９－１５０６４９号公報特開２０１７－１０００３９号公報国際公開第１７／１６３５２１号パンフレット特許第５５９３６８９号特表２０１８－５１９５０７号公報

日本版敗血症診療ガイドライン２０１６、ＰＮＡＳ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１５，　２０１５，　１１２　（３７），　１１６４２－１１６４７スポーツパフォーマンス研究，３，３１－４８，　２０１１Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５３，２３８－５６，１９７８

　食品中の乳酸値は品質管理等の指標となり得る。乳酸発酵工程を経て製造される各種の発酵飲食品、例えば日本酒やワイン、ウイスキー、チーズ、ヨーグルト、サワークラウト、くずもち、漬物、味噌、醤油、乳酸発酵酵母エキス等の製造現場においては、良好な品質の製品を安定的に製造するために、適切な乳酸発酵工程管理が行われることが好ましく、その工程管理において、乳酸量が製造工程管理の指標となりうる。

　さらに、乳酸の生成は、乳酸発酵させた飲食品に限らず、例えば化粧品原料である植物性素材を乳酸菌で発酵させて得られる乳酸発酵組成物や、化成品として生成される乳酸組成物においても進行しており、このような製品の製造工程管理、品質管理においても、乳酸量が指標となりうる。

　また、乳酸を含むオリゴマーやポリマー、例えばポリ乳酸を分解した際に、分解率を算出する際に、モノマーの乳酸量が指標となりうる。

　上記のような目的から行う乳酸量の測定は、日常生活あるいは毎回の飲食品等の製造工程の中で、頻回に簡便に実施できることが好ましく、できるだけ単純な工程で繰り返し行えることがより好ましく、自動的かつ連続的にモニタリングできることがさらに好ましい。

　現状では、検体中の乳酸量を、簡便に、連続的にモニタリング可能な乳酸測定用のデバイスは存在しておらず、検体から何らかの前処理を介して取得してきた乳酸を含有するであろう検体（例えば、穿刺により患者の身体から採取した血液）を、何らかの方法によりその都度測定するという手段で測定しているのが実情である。

　現状の測定方法における穿刺などの浸潤的なサンプリング方法は、生物検体にとっては痛みやストレスを与えるものであり、頻回なサンプリングを行うことの妨げとなっている。また、痛みやストレスという課題はない飲食品等の製造工程管理においても、製造中の乳酸含有組成物からその都度手動でサンプリングを行ってから乳酸を測定し、測定データをその都度手動で記録しなければならないため、現状の乳酸測定技術におけるこのような頻回なサンプリング作業は、煩雑さを伴う。

　ヒトの状態や姿勢等を一定の時間連続的にモニタリングする技術的な提案として、例えば、ヒトの身体や衣類、トレーニングマシーン等に複数のセンサを装着させ、それらのセンサにより取得した何らかの生体由来のデータや、そのヒトの年齢や性別などの入力情報に基づいてトレーニングプログラムを提案したり、ヒトの体調を推定したりするためのシステム、各種データに則したアプリケーションプログラムを起動する情報処理装置等が提案されている（特許文献１～３）。そして、このような提案の少数においては、乳酸測定という文言を含むものも見受けられる。しかし、それらの提案の中で、乳酸の量を現実の指標として具体的に測定でき、それにより検体の状態をモニタリングできる方法については、何ら開示されていない。

　例えば、特許文献１では、自転車をこぐトレーニング機器に取り付け可能であり、トレーニング時間中のヒト（運転者）から心拍計により取得した心拍情報を、当該運転者の安静時心拍やトレーニング中の心拍、年齢性別等情報および自転車の走行データ等に基づいて解析し、当該運転者の現時点の運動状態を理想的な状態に近づけるためのメッセージを出力できるシステムが提案されている。特許文献２では、ヒトの体調に応じて血流量が変動しない第１部位と、体調に応じて血流量が変動する第２部位のそれぞれにおける血流量をレーザースペックルカメラやレーザードップラー血流系等の非接触のカメラ技術を用いて測定し、必要に応じて追加的に入力・測定されうるその他の個別情報に基づいて、ヒトの眠気や酒酔い、空腹レベルや乗り物酔い、ストレスレベルや鬱レベルなどを推定するシステムが提案されている。特許文献３では、ヒトの下着や上着、帽子や眼鏡、耳栓やヘッドホンなどに装着させた１つ以上のウェアラブルセンサを用いて、ヒトの体温、加速度、心拍データ、ＧＰＳデータ、高度データ等を取得し、これらを身に着けているヒトの姿勢や、睡眠中か起床しているか歩行中かなどの動作の推定、登山中の場合高山病の予兆がないかなどを監視できる情報処理装置が提案されている。しかし、いずれの提案においても、既に簡便かつ連続的なデータ取得が技術的に実現されている心拍測定や血流測定、ＧＰＳデータ等取得と同様に乳酸データの取得までもが、簡便かつ連続的に実現でき、それにより乳酸監視とヒトの状態の評価が実現されるとの開示や、それを可能にするための技術的提案はなされていない。

　簡便な、かつ好ましくは連続的な乳酸監視の実現に対する技術的課題には、乳酸を測定する手段としての酵素法測定における、測定用酵素の性能的な課題も挙げられる。

　乳酸を基質とする酵素としては、乳酸オキシダーゼ（以下、ＬＯＤ）や、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素とするＮＡＤ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＮＡＤ－ＬＤＨ）、そして、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を補酵素とするＦＭＮ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＦＭＮ－ＬＤＨ）が知られている。ＬＯＤを用いた血中乳酸測定装置は市販されており、測定の都度、保管されているセンサ（ＬＯＤを含む血中乳酸測定用電極部分）を取り出して専用の計測装置に挿入し、穿刺によりヒト検体から絞り出した血液をセンサ内に吸引させて、計測装置に表示された測定値を読み取る。これにより、単発的に検体中の乳酸量を知ることができ、これを繰り返すことにより、その都度その都度の、検体中の乳酸量を測定することができる。

　しかしながら、上述の通り、生物の間質液、血液や汗、飲食品や化成品を含む乳酸含有組成物中の乳酸を、長期に渡り安定的に、精度良くかつ好ましくは連続的に簡便に測定したいと考えた場合には、公知の測定用酵素では十分に対応できない。

　ＬＯＤは、熱安定性が十分でないという課題を有し、ＬＯＤ製品を製造する際にも、乾燥工程あるいは乾燥後の保管中に活性が失われていく度合が大きい。その課題に対する提案として、乾燥工程に際し特定の安定化剤と組み合わせて乾燥させる方法も提案されている（特許文献４）が、その安定性改善効果は未だ不十分である。実際の酵素反応中の液体状態でのＬＯＤの安定性は粉末状態での安定性と比較してさらに低いことも考慮されるべきである。例えば、ＬＯＤを用いたセンサをヒトの身体に長期的に密着させて使用する場面や、乳酸菌発酵工程の発酵温度下に置かれ得る飲食品の製造工程などで長時間に渡り乳酸のモニタリングを行う場面を想定した時、室温付近からヒトの体温付近である３７℃付近での酵素の安定性という観点において、既存のＬＯＤでは十分な実用性を発揮できないことが懸念される。

　さらに、ＬＯＤには、反応生成物として過酸化水素を生じるという問題もある。特に、乳酸センサを皮膚に密着させたり、場合によっては皮下に埋め込んだりする使い方を想定する場合には、活性酸素種の１種であり酸化ストレスの原因物質でもある過酸化水素を連続的に生じ得る酵素を搭載したセンサを採用することは好ましくないということが懸念される。さらに、ＬＯＤの作用により生じる過酸化水素はＬＯＤ自身の安定化にも悪影響を与え、これによるＬＯＤ活性低下を回避する手段として、過酸化水素消去目的でカタラーゼを共存させた乳酸センサも提案されている（特許文献５）。

　ＮＡＤ－ＬＤＨは過酸化水素を生じない酵素反応を触媒するため、過酸化水素の生成という課題は生じない。しかしながら、ＮＡＤ－ＬＤＨによる酵素反応系においては、乳酸とピルビン酸が可逆的に反応してしまうため、定量という用途に対しては、正確な測定値が得られないという問題点が存在し、センサへの採用は難しい。

　ＦＭＮ－ＬＤＨもまた、過酸化水素を生じない酵素反応を触媒するため、過酸化水素の生成という課題は生じない。また、可逆的反応の課題もないため、上述の３酵素の中では、乳酸監視目的での実用酵素としては最も有望であると考えられるが、これまでに知られているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＦＭＮ－ＬＤＨでは、やはり安定性に課題を有している（非特許文献３）。

　すなわち、生物検体の状態の評価や、飲食品の製造管理・品質管理等において簡便かつ好ましくは連続的な乳酸監視を実現したいという市場のニーズを満たす上での技術的課題として、上述のようなサンプリング方法における課題、単回測定毎のデータ処理に伴う記録処理の煩雑さの課題、さらに、乳酸を測定するために用いる酵素の性能面での課題が存在する。本発明は、上記の問題点の少なくとも一部を解決しうる、検体の状態をモニタリング若しくは評価するためのデバイス、検体の状態をモニタリング若しくは評価する方法及びそれに用いるＦＭＮ－ＬＤＨを提供することを目的とする。

　本発明者は、上記の問題点に鑑み、検体中の乳酸量を測定するにあたり、非侵襲的に検体中の乳酸を簡便に測定できる構成を備えた検体の状態を評価するためのデバイスを着想し、そのようなデバイスを用いて検体の状態を評価する方法及びそれに用いるシステムと、乳酸測定に好適に適用可能なＦＭＮ－ＬＤＨを見出し、本発明を完成させた。　

　本発明は以下の態様を包含する。
（１）
　検体の状態を評価するためのデバイスであって、
　検体に乳酸デヒドロゲナーゼを作用させるための作用部と、
　乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知するためのセンサであって、作用部での検体の状態を感知することが可能なように配置されるセンサと
を含む、デバイス。
（２）
　センサからの信号を出力するための出力部をさらに含む、（１）記載のデバイス。
（３）
　（２）記載のデバイスと、
　デバイスの出力部に接続され、センサからの信号を処理するためのデータ処理ユニットと
を含む、システム。
（４）
　検体の状態を、デバイス及びデータ処理ユニットを含むシステムによって評価するためのプログラムであって、
　デバイスが、
　検体に乳酸デヒドロゲナーゼを作用させるための作用部と、
　乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知するためのセンサであって、作用部での検体の状態を感知することが可能なように配置されるセンサと、
　センサからの信号を出力するための出力部と
を含み、
　データ処理ユニットが、デバイスの出力部に接続され、センサからの信号を処理するように構成され、
　プログラムが、デバイスに対して、
　センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた検体の状態を感知して測定し、信号に変換するための、測定処理と、
　前記測定処理で得られた信号を出力部からデータ処理ユニットに対して転送するための、転送処理と、を実行させ、
　プログラムが、前記データ処理ユニットに対して、前記測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするための、データ処理を実行させる、プログラム。
（５）
　（１）又は（２）記載のデバイス、又は（３）記載のシステムを用いる、検体の状態を評価する方法。
（６）
　検体が、ヒトおよび非ヒト生物の体液、間質液、血液、尿、涙、汗、唾液、皮膚、肉、眼球、角膜、胃液、飲食品、醸造物、化成品、水、土壌を含む乳酸含有組成物である、（５）記載の方法。
（７）
　検体の状態が、運動負荷に対する身体状態、疾病状態、乳酸量の変化を伴う醸造物の醸造状態、乳酸量の変化を伴う飲食品の熟成・追熟度合、乳酸量の変化を伴う化成品製造の乳酸含有割合、乳酸量の変化を伴う水、土壌中の乳酸量である、（５）又は（６）記載の方法。
（８）
　検体の状態をモニタリングするためのデバイスであって、デバイスは、検体に、
（Ａ）溶液中で、３７℃にて１０日間経過させた時に、初発活性の約２０％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、
（Ｂ）溶液中で、３７℃にて３日間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、又は
（Ｃ）溶液中で、３７℃にて１５時間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ
を作用させるための作用部を含む、デバイス。
（９）
　（８）記載のデバイスがさらに出力部を含み、その出力部がデータ処理ユニットに接続される、システム。
（１０）
　（８）記載のデバイスまたは（９）記載のシステムを用いる、検体の状態をモニタリングする方法。
（１１）
　配列番号４で示されるアミノ酸配列における１１０～５０２位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列における１１３～５０５位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、アミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１１２～５０３位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列における１０２～４９９位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、乳酸デヒドロゲナーゼ。
（１２）
　配列番号４、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はそれとの同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有する、（１１）記載の乳酸デヒドロゲナーゼ。
（１３）
　（１１）又は（１２）記載の乳酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸。
（１４）
　（１３）記載の核酸を有する、宿主細胞。
（１５）
　（１４）記載の宿主細胞を培養することを含む、乳酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
（１６）
　検体の状態を評価するための方法であって、
ｉ）（１１）又は（１２）記載の乳酸デヒドロゲナーゼと検体を接触させる工程、及び
ｉｉ）乳酸を測定する工程
を含む、方法。

　本発明により、検体の状態を評価するためのデバイス、検体の状態を評価する方法及びそれに用いるＦＭＮ－ＬＤＨを提供することができる。

図１は、（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサチップ１０の模式図であり、（ｂ）～（ｄ）はセンサチップ１０を構成する部材を示す模式図である。図２は、各温度で熱処理後のＰｋＬＤＨおよびＳｃＬＤＨの残存活性率を示す図である。図３Ａ及び図３Ｂは、３７℃で各時間保存した後のＰｋＬＤＨ、ＳｃＬＤＨ、ＣａＬＤＨおよびＯｇＬＤＨの残存活性率を示す図である。図４は、本発明の実施形態のデバイス及びシステムの一例を示す模式図である。図５は、本発明の実施形態のプログラムの一例を示すフロー図である。図６は、本発明の実施形態のトランスミッタを利用したデバイス及びシステムの一例を示す模式図である。図７は、実施例４で評価されたＰｋＬＤＨの安定ｐＨを示す図である。図８は、実施例４で評価されたＰｋＬＤＨの至適ｐＨを示す図である。図９は、実施例４で評価された乳酸濃度とＰｋＬＤＨの活性との関係を示す図である。図１０は、実施例８で評価された乳酸濃度と応答電流値との関係を示す図である。図１１－１は、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す。図１１－２は、図１１－１のつづきである。図１２は、実施例１１で評価された５５℃で１５分間処理されたＰｋＬＤＨ及びＰｋＬＤＨのＮ末端削除変異体の残存活性率を示す図である。図１３は、実施例１１で評価された５５℃で１５分間処理されたＰｋＬＤＨ及び一置換変異体の残存活性率を示す図である。

　以下、本発明の実施形態について、具体的に説明する。なお、以下の実施形態は、本発明を具体化する際の形態であって、本発明をその範囲内に限定するものではない。

　本発明でいう検体は、乳酸が含まれているか否かを測定する対象であればよく、ヒト及び非ヒト生物の体液、例えば間質液、血液、尿、涙、汗、唾液、皮膚、肉、眼球、角膜、胃液であってもよいし、乳酸発酵をしていない、乳酸発酵している又は乳酸発酵した飲食品、醸造物、化成品を含む乳酸含有組成物であってもよい。さらには、乳酸を含む水、土壌といった環境中に存在するものでもよい。

　本発明でいう乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、還元剤であるＮＡＤＨを用いて、ピルビン酸イオンを乳酸イオンに還元する可逆反応を触媒する酵素であればよく、ＮＡＤ依存性乳酸デヒドロゲナーゼとＦＭＮ依存性乳酸デヒドロゲナーゼが知られるが、好ましくは、ＦＭＮ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、さらに好ましくは配列番号４、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１２であらわされるアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。さらに好ましくは、配列番号４であらわされるアミノ酸配列における９７～５０２位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。または、配列番号７であらわされるアミノ酸配列における１００～５０５位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。または、配列番号１０であらわされるアミノ酸配列における９９～５０３位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。または、配列番号１２であらわされるアミノ酸配列における８９～４９９位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。さらに好ましくは、配列番号４であらわされるアミノ酸配列における１１０～５０２位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。または、配列番号７であらわされるアミノ酸配列における１１３～５０５位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。または、配列番号１０であらわされるアミノ酸配列における１１２～５０３位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。または、配列番号１２であらわされるアミノ酸配列における１０２～４９９位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。なお、配列番号４における９７～５０２位のアミノ酸配列に対し、配列番号４における１～９６位のアミノ酸配列、配列番号７における１～９９位のアミノ酸配列、配列番号１０における１～９８位のアミノ酸配列、配列番号１２における１～８８位のアミノ酸配列又はそれらと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を連結させることもできる。同様にして、配列番号７における１００～５０５位のアミノ酸配列、配列番号１０における９９～５０３位のアミノ酸配列又は配列番号１２における８９～４９９位のアミノ酸配列に対し、配列番号４における１～９６位のアミノ酸配列、配列番号７における１～９９位のアミノ酸配列、配列番号１０における１～９８位のアミノ酸配列、配列番号１２における１～８８位のアミノ酸配列又はそれらと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を連結させることもできる。また、配列番号４における１～９６位のアミノ酸配列、配列番号７における１～９９位のアミノ酸配列、配列番号１０における１～９８位のアミノ酸配列又は配列番号１２における１～８８位のアミノ酸配列を含む領域については、図１１－１に示す通り、配列同一性は低く、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼにおいては重要性が低いと言える。したがって、全長のアミノ酸配列のうち、配列番号４における９７～５０２位のアミノ酸配列、配列番号７における１００～５０５位のアミノ酸配列、配列番号１０における９９～５０３位のアミノ酸配列、配列番号１２における８９～４９９位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む乳酸デヒドロゲナーゼであることが好ましく、配列番号４における１～９６位のアミノ酸配列、配列番号７における１～９９位のアミノ酸配列、配列番号１０における１～９８位のアミノ酸配列又は配列番号１２における１～８８位のアミノ酸配列を含む領域については、配列同一性がそれぞれ４５％以上、５０％以上、６０％または７０％以上あればよく、またはこの領域は欠失されていても良い。または部分的に欠失されていても良く、例えば、Ｎ末端配列から１から２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１５個のアミノ酸が欠失されていても良い。例えば、配列番号４における２～１０位のアミノ酸が欠失されていても良い。欠失されている場合には、適宜、メチオニンを配列の最初に付加することができる。

（相同性領域について）
　アミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のＬＤＨをアライメントしたときに、該２以上のＬＤＨにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
　また、２以上のＬＤＨにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてＢｌｏｓｕｍ６２を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
　例えば、配列番号４で示される乳酸デヒドロゲナーゼを基準として、１３８～１４０位、１５０～１５４位、１８５～１９４位、２１７～２２２位、２４３～２４５位、２７１～２７８位、２８０～２８３位、３５５～３６７位、３９８～４０１位、４０３～４０６位、４２５～４３３位、４４７～４５０位、４５５～４５７位は相同性領域に該当しうる。また、例えば、配列番号４で示される乳酸デヒドロゲナーゼを基準として、１３８～１４０位、１５０～１５４位、１８５～１８８位、１９１～１９４位、２１７～２１９位、２４３～２４５位、２７１～２７５位、２８０～２８３位、３５５～３６６位、３９８～４００位、４０５～４１０位、４２５～４３１位、４４７～４５０位、４５５～４５７位は相同性領域に該当しうる。さらに、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼの相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号４における相同性領域のアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。
　さらに、特に本発明の乳酸デヒドロゲナーゼが活性を保持するために重要なアミノ酸として、配列番号４で示される乳酸デヒドロゲナーゼにおける３６１位のヒスチジンや３６４位のアルギニンが挙げられる。図１１－１、１１－２に示される各乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のアライメントを用いることで、配列番号４以外の乳酸デヒドロゲナーゼにおける、これらの重要なアミノ酸位置に相当する位置を明らかにすることも可能である（図１１－２中の矢印で示された位置）。なお、図１１－１、１１－２には配列番号４、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１２で示される乳酸デヒドロゲナーゼに加え、Ｏｇａｔａｅａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列である５５８アミノ酸のうち、２～５１位を除去した配列番号４６で示される５０３アミノ酸（ＬＤＨ－１）、Ｃａｎｄｉｄａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列である５５８アミノ酸のうち、２～８６位を除去した配列番号４７で示される５０６アミノ酸（ＬＤＨ－２）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｇｌｏｂｏｓｕｍ由来乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列である配列番号４８で示される５０２アミノ酸（ＬＤＨ－３）、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ　ｍｙｃｅｔｏｍａｔｉｓ由来乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列である配列番号４９で示される４９９アミノ酸（ＬＤＨ－４）を含めたアライメントを示す。

　まず、本発明のデバイス及びシステムについて、説明する。

　図４に示すように、本発明における検体の状態を評価するためのデバイスは、検体に乳酸デヒドロゲナーゼを作用させるための作用部と、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知するセンサを含む。センサは、作用部での検体の状態を感知することが可能なように配置される。また、センサの作用部をゲル、好ましくは生体適合性ゲルにより包含させても良い。この場合には、ゲルを検体に接触させ、浸透圧等の効果により乳酸を含む水分を、ゲルを通じて採取し、センサに乳酸を接触させることで検体中の乳酸を感知することができる。生体適合性を有する成分（すなわち、ゲル構造を構成するゲルの素材）としては、細胞接着性や生体親和性を有し、透明性が高く、親水性を有するものであれば、特に限定されるものではなく、合成分子及び生体分子のいずれも用いることができる。
　上述した合成分子としては、例えば、ポリエチレングリコールやアクリルアミドなどの親水性アクリル系分子が挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコールジメタクリレートは、伸縮性高分子であり、細胞や生体組織への親和性だけでなく、伸縮性、粘弾性、堅牢性を向上することができるために好ましい。
　また、生体分子としては、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの多糖類、ゼラチンやシルクなどのタンパク質材料、コラーゲンなどの細胞外マトリクスなどが挙げられる。これらの中でも、タンパク質を多く含有する材料が好ましい。したがって、本実施形態の生体適合性ゲル材料としては、生体適合性を有する成分の一つとしてシルクフィブロインゲルを用いることが好ましい。タンパク質を多く含有するシルクフィブロインゲルを用いることにより、ゲル材料の表面では、生体適合性が高く、細胞の接着性の促進が観察されるほど、細胞毒性を少なくすることができる。
　上述した合成分子及び生体分子は、高分子であってもよいし、低分子であってもよい。ここで、高分子の分子量（Ｍｗ）としては、当該高分子がゲル構造を構成可能であれば特に限定されず、例えば分子量が５，０００～１，０００，０００Ｄａ程度の高分子を使用することができる。

　乳酸デヒドロゲナーゼを作用させるための作用部とは、作用に適した素材で構成されていればよく、金属、プラスティック、布、液体、紙、ナイロンといった素材で構成された酵素を作用させる部材をいう。また、検体の状態を感知するセンサは、酵素を作用させる部材と一体となっていても、離れていても、また直接的に又は間接的に接続されていてもよい。

　作用部には、検体及び本発明の乳酸デヒドロゲナーゼが配置される。また、必要に応じて、作用部に、電子受容体、及び／又は電子受容体（メディエータ）の変化を示すための試薬などを配置することができる。作用部（作用電極と表現することもある）を含むセンサは、本発明のＬＤＨを含む作用電極、参照電極及び対極を有する。作用電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＬＤＨを固定化する。さらに、又はこれとは別に、作用電極上に電子メディエータを固定化してもよい。対極は白金電極やＰｔ／Ｃ等の慣用の電極でありうる。参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌ電極などの慣用の電極でありうる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエータとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＬＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。グルタルアルデヒドの代わりにポリ(エチレングリコール)ジグリシジルエーテル等の架橋試薬を用いることもできる。

　本発明のデバイスに用いることのできるセンサとしては、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知することのできるものであれば、限定なく用いることができる。

［センサチップ］
　センサとして、センサチップを用いても良い。図１（ａ）は本発明の一実施形態に関するセンサチップ１０の模式図であり、図１（ｂ）～図１（ｄ）はセンサチップ１０を構成する部材を示す模式図である。センサチップ１０は、基材１１上に配置した２以上の電極を備える。基材１１は絶縁材料で構成される。図１（ａ）及び図１（ｂ）においては、一例として、作用極１、対極３及び参照極５が基材１１上に配置される。各電極は配線部７にそれぞれ電気的に接続し、配線部７は各電極とは配線方向の逆側に位置する端子９に電気的に接続する。作用極１、対極３及び参照極５は互いに離間して配置される。また、作用極１、対極３及び参照極５は、配線部７及び端子９と一体で構成されることが好ましい。また、対極３及び参照極５を一体型としてもよい。

　図１（ａ）及び図１（ｃ）に示すように、配線部７に平行な基材１１の端部には、スペーサ１３が配置され、作用極１、対極３、参照極５及びスペーサ１３を覆うカバー１５が配置される。スペーサ１３及びカバー１５は絶縁材料で構成される。スペーサ１３は作用極１、対極３及び参照極５と概略等しい厚みを有し、作用極１、対極３及び参照極５に密着することが好ましい。また、スペーサ１３とカバー１５は一体で構成されてもよい。カバー１５は、配線部７が外気に曝されて劣化したり、測定試料の滲み込みによる短絡を防止したりする保護層である。

　図１（ａ）及び図１（ｄ）に示すように、作用極１、対極３及び参照極５上には反応層１９が配置される。反応層１９は、乳酸と乳酸デヒドロゲナーゼとの反応の場を提供する。一実施形態において、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼはこれらの電極に塗布、吸着、又は固定化されていてもよい。好ましくは、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは作用極に塗布、吸着、又は固定化される。別の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼとともにメディエータも電極に塗布、吸着、又は固定化してもよい。電極としては炭素電極、白金、金、銀、ニッケル及びパラジウムなどの金属電極などを用いることができる。炭素電極の場合、材料としてパイロリティック・グラファイトカーボン（ＰＧ）、グラッシーカーボン（ＧＣ）、カーボンペースト及びプラスチックフォームドカーボン（ＰＦＣ）などが挙げられる。測定システムは二電極系であっても三電極系であってもよく、例えば作用電極上に酵素を固定することができる。参照電極としては、標準水素電極、可逆水素電極、銀－塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、パラジウム・水素電極及び飽和カロメル電極等が挙げられ、安定性や再現性の観点から、Ａｇ／ＡｇＣｌを用いることが好ましい。

　さらに、測定に必要な溶液量を低減するために、印刷電極を用いることもできる。この場合、電極は絶縁基板で構成された基材１１上に形成されることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷及びフレキソ印刷などの印刷技術により、基材１１上に電極が形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。

　例えば、電子受容体としてフェリシアン化カリウムが含まれている作用部において、検体に含まれる乳酸に対して乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた場合、フェリシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムへと変化する。フェリシアン化カリウムは波長４２０ｎｍに吸収を示すので、波長４２０ｎｍでの吸光度を分光光度計により測定することにより、検体中の乳酸の状態を感知することができる。また、乳酸に対して乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ、さらにフェリシアン化カリウムを作用させた際の酸化還元反応を電気化学的にセンサで測定することもできる。電気化学的な測定をするためのセンサとして、具体的には、例えば、アークレイ社製のラクテート・プロ２型番ＬＴ－１７３０のセンサを用いることができる。その他の電子受容体としては、キノン類、フェナジン類（例えば、フェナジンメトサルフェート）、ビオロゲン類、シトクロム類（例えば、シトクロムｂ、シトクロムｃ）、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、フェニレンジアミン類およびその誘導体等などを用いることができる。なお、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは酸素を電子受容体としない。

　例えば、乳酸濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極としてＬＤＨ及び電子受容体（例えばキノン付加ポリマー）を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、Ｌ－乳酸を含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度の乳酸溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中の乳酸濃度を計算することができる。

　具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の４ＵのＬＤＨを固定化し、乳酸濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ　ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ　Ｌ－乳酸溶液を終濃度が１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知の乳酸濃度（１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線を作成する。これにより本発明のＦＭＮ－ＬＤＨを使用した酵素固定化電極を用いた乳酸の定量が可能となる。

　ある実施形態において、本発明の乳酸センサチップに本発明の０．０１Ｕ～１０００Ｕ、０．１Ｕ～１０００Ｕ、より好ましくは０．５Ｕ～７００Ｕ、より好ましくは０．５Ｕ～５００Ｕ、より好ましくは１Ｕ～３００Ｕ、より好ましくは１Ｕ～１００ＵのＦＭＮ－ＬＤＨ溶液を塗布若しくは固定化する。

　ある実施形態において、本発明の乳酸センサを有する連続乳酸モニタリングデバイスが提供される。また、ある実施形態において、本発明のＬＤＨを用いる１４日の間、連続で乳酸をモニタリングする方法が提供される。測定する期間は、５秒、１分、５分、１時間、２時間、６時間、１２時間、１５時間、２４時間、２日、５日、７日、１０日、１４日など、目的に合わせて設定できる。

　ある実施形態において、連続乳酸モニタリングは、再キャリブレーション有りで又は無しで行うことができる。ある実施形態において、例えば再キャリブレーションを２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日毎に行うことができる。

　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分である。そのため、簡便かつ好ましくは連続的な乳酸監視を実現することができる。

　本発明は、ｉ）乳酸デヒドロゲナーゼと検体を接触させる工程、及びｉｉ）乳酸を測定する工程、を含む、乳酸を測定する方法にも関する。具体的には、工程ｉ）の乳酸デヒドロゲナーゼはＦＭＮ依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、さらに好ましくは配列番号４、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１２であらわされるアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼである。また、具体的には、工程ｉ）の乳酸デヒドロゲナーゼは０．０１Ｕ～１０００Ｕ、０．１Ｕ～１０００Ｕ、より好ましくは０．５Ｕ～７００Ｕ、より好ましくは０．５Ｕ～５００Ｕ、より好ましくは１Ｕ～３００Ｕ、より好ましくは１Ｕ～１００Ｕの乳酸デヒドロゲナーゼである。また、工程ｉ）の乳酸デヒドロゲナーゼは、（Ａ）溶液中で、約３０、３５℃又は３７℃にて１０日間経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ；（Ｂ）溶液中で、約３０、３５℃又は３７℃にて３日間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、又は（Ｃ）溶液中で、約３０、３５℃又は３７℃にて１５時間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼであってよい。また、工程ｉ）の乳酸デヒドロゲナーゼと検体を接触させるときの温度は、２０～６０℃であればよく、好ましくは３０～５５℃の範囲内であればよく、好ましくは３０～４０℃の範囲内であればよい。また、工程ｉ）の乳酸デヒドロゲナーゼと検体を接触させるときのｐＨは３～１０の範囲内であればよく、好ましくは５～９の範囲内であればよく、好ましくは６～８の範囲内であればよい。
　また、工程ｉｉ）の乳酸を測定する工程は単回測定でもよいし、連続測定でも良い。工程ｉｉ）の測定する期間は、５秒、１分、５分、１時間、２時間、６時間、１２時間、１５時間、２４時間、２日、５日、７日、１０日あるいは１４日でもよい。

　図４に示すように、本発明における検体の状態を評価するためのデバイスは、さらに出力部を含むことができる。出力部は、センサからの信号を外部に出力することができる。また、その出力部がデータ処理ユニットに接続して、システムを構成していてもよい。すなわち、システムは、デバイス及びデータ処理ユニットを含む。データ処理ユニットは、センサからの信号を処理することができる。

　本明細書において、「データ処理ユニット」とは、単体のコンピュータ等の装置を意味するだけでなく、ローカルネットワークやインターネット等の通信回線により接続された他の装置を連結した形態の情報処理をするためのネットワークの概念を含む。

　出力部とデータ処理ユニットとの接続は、センサからの信号を出力部から出力し、データ処理ユニットに入力することが可能なように、電気的、電子的手法により接続することを意味する。例えば、接続のための物理的な接続方法としては、有線による接続の他、無線ＬＡＮなどの無線通信により接続することもできる。

　データ処理ユニットは、制御部を含むことができる。制御部は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）であることができる。後述するプログラムは、制御部に読み込まれることができる。

　データ処理ユニットは、記憶部を含むことができる。本明細書において、「記憶部」とは、メモリー及びハードディスク等のように、入力された情報を読み出し可能なように書き込むことのできるものをいう。記憶部は、所定の装置の内部に配置することができる。また、記憶部は、ローカルネットワークやインターネット等の通信回線により接続された他の装置の内部に存在することができる。記憶部を含むことにより、センサにより測定された信号を記憶することができ、また、データ処理ユニットにより処理された結果を記憶することができる。

　データ処理ユニットは、データ処理ユニットにより処理した結果を表示するための表示部を有する、表示部に接続する、又は表示部に転送することができる。表示部としては、ディスプレイ、印刷装置、音声出力装置及びローカルネットワークやインターネット等の通信回線による外部への出力等、公知の表示をするための手段を用いることができる。すなわち、表示部は、データ処理ユニットが表示装置を物理的に有していることのみならず、他の情報処理装置へのデータ（結果）の転送により、他の情報処理装置に対して結果を表示することを含む。

　また、データ処理ユニットにトランスミッタを備えることもでき、表示部や記憶部を備えた別個の測定装置と無線で送受信することもできる。トランスミッタは、デバイスが測定した電流値を測定部１００で測定し、その電流値を制御部１０１へ送る。制御部１０１では、温度センサ１０２によって、デバイスの近傍の温度を測定し、温度補正を行った上で電流値から乳酸濃度を演算する。制御部１０１では、この乳酸濃度の演算は、所定のサンプリング時間間隔おきに実行している。

　そして、制御部１０１では、演算した乳酸濃度を、所定の記録時間間隔ごとに、積算平均を行って、記憶部１０３に対して記録する。制御部１０１は、記憶部１０３に記憶された値を、測定装置１０６からの指示に応じて、通信部１０４を経由して、測定装置１０６に送信する。

　本実施形態でのトランスミッタは、電池１０５を内蔵している。この電池１０５のバッテリ残量が不足となった時点で、トランスミッタは廃棄される構成になっている。電池１０５のバッテリ残量は、測定装置１０６を通してモニタされている。そして、デバイスを交換した時点で、測定装置１０６は、トランスミッタの電池１０５のバッテリ残量に対して、次のデバイスの交換までに電池１０５の残量が十分であるか否かを確認する。そして、もし、残量が十分でない場合には、トランスミッタを交換するように、使用者に対して指示を出すとともに、そのトランスミッタを使用できないようにする。

　本発明におけるシステムによれば、検体の状態、例えば、運動負荷に対する身体状態、疾病状態、乳酸量の変化を伴う醸造物の醸造状態、乳酸量の変化を伴う飲食品の熟成・追熟度合、乳酸量の変化を伴う化成品製造の乳酸含量割合、乳酸量の変化を伴う水や土壌の状態等を評価することができる。

　本発明のデバイスにおいて使用する乳酸デヒドロゲナーゼは、（Ａ）溶液中で、約３０、３５℃又は３７℃にて１０日間経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ；（Ｂ）溶液中で、約３０、３５℃又は３７℃にて３日間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、又は（Ｃ）溶液中で、約３０、３５℃又は３７℃にて１５時間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼであってよい。また、本発明のデバイスにおいて使用する乳酸デヒドロゲナーゼは、使用に供してから１５時間後を起点としても、７０％以上活性を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼであってよい。

　上記デバイスは、さらに出力部を含んでいてもよく、その出力部がデータ処理ユニットに接続して、システムを構成していてもよい。

　本発明のデバイス及びシステムによれば、評価又はモニタリングは、検体に対して非浸潤的におこなうことができ、サンプリングのステップがなく直接測定することができ、すなわちテスト試験紙をセンサに挿入してボタンを押すような使い捨ての測定ではなく、貼り付けたまま、差し込んだままで長期に渡り使い続けることができる点で、非常に有利である。

　次に、本発明のプログラムについて、説明する。本発明のプログラムは、検体の状態を、デバイス及びデータ処理ユニットを含むシステムによって評価するためのプログラムである。

　本明細書において、プログラムとは、所定のデバイスを作動させるために、所定の情報処理装置に対して所定の処理を実行させるアプリケーションソフトウェアであることができる。また、本発明のプログラムは、モバイルアプリケーション（アプリ）であることもできる。

　本発明のプログラムは、上述の図４に示すようなシステムを作動させるためのプログラムである。システムは、デバイス及びデータ処理ユニットを含む。

　デバイスは、作用部と、センサと、出力部とを含む。作用部、センサ及び出力部については、上述の説明の通りである。すなわち、作用部は、検体に乳酸デヒドロゲナーゼを作用させることができるように構成される。センサは、作用部での、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知することが可能なように配置されるように構成される。出力部は、センサからの信号を出力することができるように構成される。

　データ処理ユニットは、デバイスの出力部に接続され、センサからの信号を処理するように構成される。データ処理ユニットは、制御部、記憶部及び表示部を含むことができる。制御部、記憶部及び表示部については、上述の説明の通りである。

　本発明のプログラムは、システムに対して、測定処理Ｓ０１と、転送処理Ｓ０２と、データ処理Ｓ０３とを実行させる。本発明のプログラムは、更に、システムに対して、結果表示処理Ｓ０４を実行させることができる。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた検体の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　転送処理Ｓ０２では、測定処理で得られた信号を出力部からデータ処理ユニットに対して転送するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　本プログラムは、具体的には、以下のような用途のプログラムとして用いることができる。

　本発明のプログラムは、食品及び飲料の用途のプログラムとして用いることができる。具体的には、以下の通りである。

（食品及び飲料のためのプログラムの実施形態１）
　本実施形態のプログラムは、牛肉の鮮度管理のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は牛肉である。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた牛肉の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、牛肉の鮮度管理のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、牛肉の鮮度管理のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、本実施形態では、乳酸値の他に、温度、湿度をモニタリングすることにより、牛肉の消費期限を予測することができる。また、肉の部位をパラメータとして入力することにより、肉の価値を算出し、販売価格の指標とすることができる。また、本実施形態では、料理に合わせて、肉の熟成度の提案をすることができる。本実施形態では、牛肉に直接、作用部を貼り、センサにより肉の状態を感知することができる。

　従来、牛肉の鮮度管理は、温度により管理することが主流であった。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、乳酸を指標とした鮮度管理にすることができる。そのため、牛肉の輸送条件や保管条件を適切にできる。本実施形態のプログラムを用いることにより、牛肉の価値を客観的に示す指標にもなり、消費者の判断を支援することができる。

（食品及び飲料のためのプログラムの実施形態２）
　本実施形態のプログラムは、牛肉の熟成の管理と制御指標のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は牛肉である。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、牛肉の熟成の管理と制御指標のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、牛肉の熟成の管理と制御指標のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、本実施形態では、乳酸値の他に、温度、湿度、ｐＨをモニタリングすることにより、牛肉の消費期限を予測することができる。また、肉の部位をパラメータとして入力することにより、肉の価値を算出し、販売価格の指標とすることができる。また、本実施形態では、料理に合わせて、肉の熟成度の提案をすることができる。本実施形態では、牛肉に直接、作用部を貼り、センサにより肉の状態を感知することができる。

　従来、牛肉の熟成管理は、温度により管理することが主流であった。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、乳酸を指標とした鮮度管理にすることができる。そのため、牛肉の輸送条件や保管条件を適切にできる。本実施形態のプログラムを用いることにより、牛肉の価値を客観的に示す指標にもなり、消費者の判断を支援することができる。

（食品及び飲料のためのプログラムの実施形態３）
　本実施形態のプログラムは、マグロ等の魚の鮮度管理のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体はマグロ等の魚である。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させたマグロ等の魚の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、マグロ等の魚の鮮度管理のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、マグロ等の魚の鮮度管理のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、本実施形態では、乳酸値の他に、温度、湿度、Ｋ値をモニタリングすることにより、マグロ等の魚の新鮮さの度合いや消費期限を予測することができる。本実施形態では、魚の種類をパラメータとして入力することにより、魚の価値を算出し、販売価格の指標とすることができる。また、本実施形態では、料理に合わせて、魚の新鮮度の提案をすることができる。本実施形態では、例えば魚の目に直接、作用部を貼り、センサによりマグロ等の魚の状態を感知することができる。

　従来、マグロ等の魚の鮮度管理は、温度やＫ値により管理することが主流であった（「海―自然と文化」東海大学紀要海洋学部第４巻第２号３１－４６頁（２００６）参照）。しかしながら、先の文献には、Ｋ値が低く鮮度が高いと判定された場合でも、筋肉中の乳酸量が増加したために酸変性が起こった結果、鮮度が低いこともあると記載されている。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、乳酸を指標とした鮮度管理にすることができる。乳酸量とＫ値と組み合わせて管理することもできうる。そのため、マグロ等の魚の輸送条件や保管条件を適切にできる。本実施形態のプログラムを用いることにより、マグロ等の魚の価値を客観的に示す指標にもなり、消費者や卸業者の判断を支援することができる。

（食品及び飲料のためのプログラムの実施形態４）
　本実施形態のプログラムは、マグロ等の魚の熟成の管理と制御指標のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体はマグロ等の魚である。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、マグロ等の魚の熟成の管理と制御指標のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、マグロ等の魚の熟成の管理と制御指標のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、本実施形態では、乳酸値の他に、温度、湿度をモニタリングすることにより、マグロ等の魚の適切な熟成状態を予測することができる。本実施形態では、魚の種類をパラメータとして入力することにより、熟成された魚の価値を算出し、販売価格の指標とすることができる。また、本実施形態では、料理に合わせて、魚の熟成度の提案をすることができる。本実施形態では、例えば魚の目に直接、作用部を貼り、センサによりマグロ等の魚の状態を感知することができる。

　従来、マグロ等の魚の熟成管理は、温度や熟成時間、解凍する温塩水の温度や水温により管理することが主流であった。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、乳酸を指標とした熟成管理にすることができる。そのため、マグロ等の魚の熟成条件を適切にできる。本実施形態のプログラムを用いることにより、マグロ等の魚の価値を客観的に示す指標にもなり、消費者や卸業者の判断を支援することができる。

（食品及び飲料のためのプログラムのその他の実施形態）
　本実施形態のプログラムは、上記以外の食品及び飲料のためのプログラムとして、例えば、ワインのマロラクティック発酵管理、日本酒やベーグルなどのパン、くずもちの発酵管理、ウイスキーの乳酸発酵管理、お茶の発酵管理、食品の安全性の指標等のためのプログラムであることができる。本実施形態のプログラムによれば、経験と勘に頼っていた、ワインや日本酒などの醸造酒の発酵管理を、乳酸値の他に、ｐＨ値、溶存酸素値などを指標にすることによって、適切な温度制御や発酵期間を得ることができる。

　本発明のプログラムは、動物の用途のプログラムとして用いることができる。具体的には、以下の通りである。

（動物のためのプログラムの実施形態１）
　本実施形態のプログラムは、競走馬の管理のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は競走馬である。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた競走馬の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、競走馬の管理のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、競走馬の管理のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、競走馬の調教において、血中乳酸を指標としてトレーニングプログラムが組まれている。運動強度に応じて、乳酸量が変化し、運動時の酸素需要量と供給量のバランスが維持されていれば血中乳酸は蓄積せず、需要供給のバランスが崩れると上昇することが知られている（ＪＲＡ育成場日誌、乳酸地を指標とした調教負荷より）。したがって、本実施形態では、競走馬の調教負荷の適性度を評価することができる。また、得られた乳酸値を用いて馬のトレーニング方法を提案することも可能である。

　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、競走馬の調教管理、及び健康管理を行うことができる。センサを馬に直接装着し、あるいは皮膚と接触する鞍等の馬具の表面等に装着し、血中、皮膚もしくは間質液、汗等に含まれる乳酸をモニタリングすることで、調教のたびに馬から採血を実施し、測定・分析するという調教師の負担や馬のストレスを軽減することも可能となる。

（動物のためのプログラムの実施形態２）
　本実施形態のプログラムは、競走馬の疲労度測定のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は競走馬である。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、競走馬の疲労度測定のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、競走馬の疲労度測定のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、本実施形態では、競走馬の疲労度に応じて、乳酸量が変化するので、乳酸量の変化から、競走馬の疲労度を予測することができる。

　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、競走馬の筋肉疲労度を示す指標を得ることができるので、初心者でも競走馬の筋肉疲労度の判断をすることができる。

（動物のためのプログラムの実施形態３）
　本実施形態のプログラムは、牛の健康管理、出荷時判定管理または肉牛の肉質制御のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は牛である。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた牛の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、牛の健康管理、出荷時判定管理または肉牛の肉質制御のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、牛の健康管理、出荷時判定管理または肉牛の肉質制御のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、本実施形態では、作用部を耳として、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ、センサにより、牛の状態を感知して測定することができる。耳には血管が通っており、耳タグに作用部及びセンサを仕込んで配置することにより、耳の血液を具体的な検体として測定することが可能である。汗や皮膚を検体とすることもできる。また、本実施形態では、胃を作用部とすることも可能である。例えば、血液中の乳酸量を測定することにより、急性アシドーシスになる前に乳酸菌もしくは乳酸入りの穀物投与を抑制することができる。

　本実施形態では、飲み込み型センサで健康管理、出荷時判定管理または肉牛の肉質制御を行うこともできる。すなわち、作用部を胃などの消化器官として、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ、センサにより、牛の状態を感知して測定することができる。本実施形態では、牛の乳酸量に応じて、胃の中に存在する微生物の乳酸資化量が結果として変化し、その乳酸資化量に応じて揮発性脂肪酸が発生し、その揮発性脂肪酸を牛が吸収して栄養分（炭素源）とし得る。したがって、乳酸量の変化から、養分の吸収効率を予測することができ、牛の健康状態予測、出荷時判定管理または肉牛の肉質制御を行うこともできる。

　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、牛の健康管理、出荷時判定管理、または肉牛の肉質制御をすることができる。

（動物のためのプログラムの実施形態４）
　本実施形態のプログラムは、乳牛の健康管理のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は乳牛である。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた乳牛の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、乳牛の健康管理のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、乳牛の健康管理のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　なお、本実施形態では、作用部を耳として、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ、センサにより、乳牛の状態を感知して測定することができる。耳には血管が通っており、耳タグに作用部及びセンサを仕込んで配置することにより、耳の血液を具体的な検体として測定することが可能である。汗や皮膚を検体とすることもできる。また、本実施形態では、胃を作用部とすることも可能である。例えば、血液中の乳酸量を測定することにより、急性アシドーシスになる前に乳酸菌もしくは乳酸入りの穀物投与を抑制することができる。

　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、乳牛の健康管理をすることができる。また、搾乳した乳の成分値も合わせて分析することにより、得られた乳製品の価値を、最終製品および乳牛の健康状態の観点から評価することもでき、消費者や卸業者の判断の支援となる。

　本発明のプログラムは、植物の用途のプログラムとして用いることができる。具体的には、以下の通りである。

（植物のためのプログラムの実施形態１）
　本実施形態のプログラムは、植物管理のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は植木や土壌である。検体として、具体的には、植物の葉、根、樹液、果実、種子等がありえ、鉢植えの植木であってもよい。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた植物の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、植物管理のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、植物管理のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　土壌に乳酸があると、植物の吸水が促進される。したがって、土壌の乳酸量に応じて、植物の吸水が変化する。したがって、本実施形態では、植木の吸水の状態を評価することができる。

　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、植木鉢の植物に対する栄養剤の添加や水やりのタイミングを提案することができる。さらに、ｐＨが低いと植物の雑菌繁殖を抑制することが可能になる。したがって、乳酸量と共にｐＨを測定することにより、雑菌繁殖を抑制することが可能になる。

（植物のためのプログラムの実施形態２）
　本実施形態のプログラムは、土壌管理、及び水耕栽培管理の指標のためのプログラムであることができる。すなわち、本実施形態では、検体は土壌又は水である。

　測定処理Ｓ０１では、センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた土壌の状態を感知して測定し、信号に変換するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。

　データ処理Ｓ０３では、データ処理ユニットに対して、測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。本実施形態の所定の処理とは、土壌管理、及び水耕栽培管理の指標のために適したデータ形式にするための処理である。

　結果表示処理Ｓ０４では、データ処理ユニットにより処理した結果を所定の表示部が表示するように、プログラムが、システムに対して処理を実行させる。この結果、表示部に、土壌管理、及び水耕栽培管理の指標のために適したデータ形式のデータを表示することができる。

　土壌及び水耕用水に乳酸があると、植物の吸水が促進される。したがって土壌及び水耕用水の乳酸量に応じて、植物の吸水が変化する。したがって、本実施形態では、土壌及び水耕用水に存在する植物の吸水の状態を評価することができる。

　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。そのため、本実施形態のプログラムにより、植物に対する栄養剤の添加や水やりのタイミング、追肥のタイミングを提案することができる。さらに、ｐＨが低いと植物の雑菌繁殖を抑制することが可能になる。したがって、乳酸量と共にｐＨを測定することにより、雑菌繁殖を抑制することが可能になる。

　従来、植物の管理は季節など時間に応じて追肥したり、植物の状態が悪くなった際に水や栄養剤を添加したりするなど、データに基づかない管理が主流であった。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、熱安定性が十分なので、簡便かつ連続的な乳酸監視を実現することができる。土壌に含まれる乳酸値が低くなった際には、土壌内の抗菌性を高めるために、乳酸菌が資化可能な糖類や乳酸の添加量を算出するシステムを提供できる。反対に乳酸値が高くなった際には、アルカリ性肥料の種類や添加量を算出するシステムを提供する。併せて、ｐＨや電気伝導度、日照量、温度、湿度、アミノ酸量を測定することで、正確な植物育種プログラムを構築、提供することができうる。また、トマトなど最終生産物の成分値（例えば、糖度、酸度）を分析することにより、得られた最終生産物の価値について、最終製品および植物がどのような経過で育てられてきたかという消費者から見えない観点から客観的な評価をすることができ、消費者や卸業者の判断の支援となる。

　本発明は、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列と同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列を有する、乳酸デヒドロゲナーゼ、それをコードする核酸にも関する。ある実施形態において本発明は、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、又は配列番号１３に示す塩基配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、乳酸活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。

（ＬＤＨ遺伝子）
　ＬＤＨをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、ＬＤＨ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、上記ＬＤＨのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成し、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからＬＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、ＬＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＬＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。

　これらのＬＤＨ遺伝子は、各種ベクターに連結または挿入してもよく、染色体やゲノムに組み入れてもよい。ベクターを用いる場合、ベクターへのクローニングには、ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社）やＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販のキット；ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌　ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌　ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製する。大量生産するにあたり、ＬＤＨ生産させる宿主は、ＬＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いて形質転換された宿主生物、例えば、大腸菌、酵母、カビ細胞、糸状菌等を用いることが好ましい。

　本発明は、上記核酸を有する宿主細胞、それを培養することを含む、乳酸デヒドロゲナーゼの製造方法にも関する。上記のようにして得られた安定性の優れたＬＤＨの生産能を有する菌株を用いて、当該ＬＤＨを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
　また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７～９に調整するのが適当である。
　また、培養は任意の条件を用いることができるが、例えば、２０～４２℃の培養温度、好ましくは３０℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは３０℃前後の培養温度で８～１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施することができる。
　培養終了後、該培養物よりＬＤＨを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩または硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、ＬＤＨの粗酵素を得る。

　上記ＬＤＨの粗酵素よりさらにＬＤＨ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたＬＤＨ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の安定性が改善されたＬＤＨを得ることができる。
　本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、（Ａ）溶液中で、約３０～３７℃にて１０日間経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ；（Ｂ）溶液中で、約３０～３７℃にて３日間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、又は（Ｃ）溶液中で、約３０～３７℃にて１５時間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼであってよい。また、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼは、使用に供してから１５時間後を起点としても、７０％以上活性を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼであってよい。
　ＬＤＨの反応溶液に用いることができる緩衝材（緩衝液）としては、例えば、ホウ酸及び／又はその塩を含むホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸及び／又はその塩を含むリン酸緩衝剤、例えばリン酸カリウム緩衝剤又はリン酸ナトリウム緩衝剤、有機酸緩衝剤及び／又はその塩を含む有機酸緩衝剤、例えばトリカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むトリカルボン酸緩衝剤、例えばクエン酸及び／又はその塩を含むクエン酸緩衝剤、モノカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むモノカルボン酸緩衝剤、例えば酢酸緩衝剤及び／又はその塩を含む酢酸緩衝剤等の緩衝剤が挙げられる。また、本発明のキット等に用いることのできる緩衝剤としては、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、ＣＨＥＳ（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）及び／又はそれらの塩等を含むグッド緩衝剤が挙げられる。ＬＤＨを反応させる温度としては、２０～６０℃であればよく、好ましくは３０～５５℃の範囲内であればよい。ＬＤＨを反応させるｐＨは３～１０の範囲内であればよく、好ましくは６～１０の範囲内であればよい。

　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製する。

　本発明において、ＦＭＮ－ＬＤＨの熱処理後の安定性評価及び各種保存条件下での安定性試験の評価は、特に記載がない限り、以下の試験例の方法に従い行った。

実施例１
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ　ＤＮＡ及びｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ　ＤＮＡの調製
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２５８，　２５５－２５９（１９８９）に記載されているように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＳｃＬＤＨ）のアミノ酸配列である５９１アミノ酸のうち、２～８５位のアミノ酸を除去した配列番号１に示す５０６アミノ酸をコードする配列番号２で示される１５２１ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、ｃＤＮＡとして取得した。続いて、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＰｋＬＤＨ）のアミノ酸配列である配列番号３で示される５７８アミノ酸とＳｃＬＤＨを比較し、２～７７位を除去した配列番号４で示される５０２アミノ酸をコードする、配列番号５で示される１５０９ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、ｃＤＮＡとして取得した。プラスミドｐＫＫ２２３－３のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＳｃＬＤＨ遺伝子若しくはＰｋＬＤＨ遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製した。具体的には、ｐＫＫ２２３－３のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅにて、ＳｃＬＤＨ遺伝子若しくはＰｋＬＤＨ遺伝子を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ及びｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ）を得た。さらにこれらのプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ）株と大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ）株を、３ｍｌのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、それぞれ培養物を得た。

　これらの培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ及びｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ及びｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ　ＤＮＡを得た。

（２）ＬＤＨの生産
　ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で２４時間培養した。同様にして、ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３７℃で２４時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＳｃＬＤＨまたはＰｋＬＤＨを含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。　

（３）ＬＤＨの活性測定
　上述のＳｃＬＤＨまたはＰｋＬＤＨを含む粗酵素液を用いて、下記の活性測定法に示した方法により、Ｌ－乳酸に対する酸化活性を測定した。本発明のＬＤＨは、Ｌ－乳酸を酸化してピルビン酸を生成する反応を触媒する。これを便宜上、ＬＤＨ活性と呼ぶことがある。
　本発明のＰｋＬＤＨのＬＤＨ活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェリシアン化カリウムを用いた以下の測定系を用いて測定することができる。

（反応）　Ｌ－乳酸　＋　フェリシアン化カリウム
　　　　　　　　→　ピルビン酸　＋　フェロシアン化カリウム

　上記の「フェリシアン化カリウム」の消失度合を波長４２０ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。

　具体的には、ＬＤＨ活性は、以下の手順に従って測定することができる。１Ｍ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）　０．１５ｍＬ、０．１Ｍ　Ｌ－乳酸溶液　０．１５ｍＬ及び３０ｍＭフェリシアン化カリウム　溶液　０．０７５ｍＬ、超純水　１．０７５ｍＬを混合し、３０℃で５分間保温する。次いで、酵素サンプル溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、及び、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う４２０ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ４２０）を求め、次式に従いＬＤＨ活性を算出する。この際、ＬＤＨ活性は、３０℃において濃度１０ｍＭのＬ－乳酸存在下で１分間に１μｍｏｌのフェリシアン化カリウムを還元する酵素量を１Ｕと定義する。

　なお、式中の１．５は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１．０１は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／μｍｏｌ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ４２０ｂｌａｎｋは１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の４２０ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。

実施例２
（温度安定性）
　終濃度として０．０７％ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）となるよう上記の粗酵素液を希釈し、温度安定性を調べた。具体的には、実施例１の（２）で調製したＬＤＨ酵素液を６Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、各温度（３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃）で１０分間処理した後、ＬＤＨ活性を測定し、処理前のＬＤＨ活性と比較して残存活性率を測定した。また、比較のため、ＳｃＬＤＨについても同様の試験を行った。結果を図２に示す。
　結果から、ＳｃＬＤＨは、４５℃で不安定であるが、ＰｋＬＤＨは、５５℃熱処理後でも安定であることがわかった。

　続いて、３７℃における長期安定性を調べた。具体的には、上記と同様にＬＤＨ酵素液を、温度安定性の試験と同様に緩衝液で６Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、各時間保存した。その後、各時間経過後の残存活性率を測定した。また、比較のため、ＳｃＬＤＨについても同様の試験を行った。結果を図３（Ａ及びＢ）に示す。図３Ａは、経過時間がゼロ時間である時の残存活性率を１００％とした各時間経過後の残存率のグラフである。これにより、ある程度（本実施例では３７℃）に加温されたＰｋＬＤＨは、保存中の一定期間迄に残存活性率が向上することがわかった（図３Ａ）。図３Ｂは、保存開始から１５時間を基準時間とした場合に、基準時間における活性率を１００％とした各時間経過後の残存活性率のグラフである。ＰｋＬＤＨは、保存開始から２４５時間経過後（基準時間から２３０時間後）にも９９％の活性を保持しており、１５時間経過後からは、残存活性率は一定となり、３７℃で約１０日間保存しても失活せず、非常に安定であった（図３Ｂ）。一方、ＳｃＬＤＨは、保存開始から残存活性率が顕著に低下し始め、２１時間後（基準時間から６時間後）の活性残存率は６２％、６５時間後（基準時間から５０時間後）の活性残存率は０％となり、不安定であった。また、ＳｃＬＤＨの酵素量を２０Ｕ／ｍｌとなるようにして評価しても安定性が大きく向上するということは無かった。

実施例３
（酵素の精製）
　実施例１の（２）で得られたＰｋＬＤＨの粗酵素液を２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した１ｍｌのＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に供し、樹脂に吸着させた。同緩衝液で樹脂に吸着しないタンパク質を溶出させた。続いて、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、洗浄した。次に５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、吸着したＰｋＬＤＨを溶出した。得られたＰｋＬＤＨの粗酵素液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に供し、１カラム分の体積の緩衝液を流して、目的タンパク質を含む画分を回収した。
　さらに回収した酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し、同緩衝液で平衡化したＨｉｓｃｒｅｅｎ　Ｃａｐｔｏ　Ｑカラム（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に５００ｍＭ　ＮａＣｌ／１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）までグラディエントで徐々にＮａＣｌ濃度を高めることで樹脂に吸着していたＰｋＬＤＨを溶出させ回収した。
　得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＰｋＬＤＨの精製標品とした。なお、熱安定性については、粗酵素液と同等であった。

実施例４
（ｐＨ安定性）
　実施例３で得られた精製ＰｋＬＤＨ酵素液（１０Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０－ｐＨ７．５）を用い、５５℃、１５分間の熱処理後、各緩衝液中で酵素を維持し、この各々の酵素を用いる他は実施例１の（３）に記載の活性測定法に従って、活性を測定した。処理後の活性値において最も活性が高かった条件を１００％とし、その他の条件における活性値について相対値を求めた。結果を図７に示す。その結果、ｐＨ６．５において最も安定であり、次いでｐＨ６．０において９２％の相対活性（％）であった。

（至適活性ｐＨ）
　実施例３で得られた精製ＰｋＬＤＨ酵素液（１０Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適活性ｐＨを調べた。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０－ｐＨ７．５）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３０℃にて酵素反応を行い、相対活性（％）を比較した。結果を図８に示す。その結果、本発明のＦＭＮ依存性乳酸デヒドロゲナーゼの至適活性ｐＨは、ｐＨ６．５～７．５の範囲で最も高い活性が示された。なお、ｐＨ８．０においても良好な活性を維持している可能性はあると考えられる。

（Ｌ－乳酸の定量）
　実施例３で得られた精製ＰｋＬＤＨ酵素液（１７Ｕ／ｍｌ）を用いて、０．２～５ｍＭのＬ－乳酸を測定した。結果を図９に示す。その結果、乳酸濃度依存的に４２０nmにおける１分間当たりの吸光度変化量が向上し、Ｌ－乳酸を定量できることが示された。

（オキシダーゼ活性）
　国際公開２０１５／０２０２００に記載の活性測定方法を参照し、酵素としてＰｋＬＤＨ、基質として終濃度１０ｍＭのＬ－乳酸となるようにし、測定ｐＨを７．５として活性測定を行った。オキシダーゼ活性は、濃度１０ｍＭの基質存在下で１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。用いる酵素量は、デヒドロゲナーゼ活性として６００Ｕ／ｍｌを示す量とした。その結果、ＰｋＬＤＨのオキシダーゼ活性は検出されなかった。したがって、ＰｋＬＤＨは酸素を電子受容体としない酵素であった。

実施例５
（印刷電極によるＬ－乳酸の定量）
　実施例３で得られた精製ＰｋＬＤＨ酵素液を用いて、印刷電極測定によるＬ－乳酸の定量を行う。具体的には、カーボンの作用電極、銀の参照電極が印刷されてなる、ＳＣＲＥＥＮ－ＰＲＩＮＴＥＤ　ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ（ＤｒｏｐＳｅｎｓ社製、製品番号ＤＲＰ－１１０）を、専用コネクター（ＤｒｏｐＳｅｎｓ社製、ＤＲＰ－ＣＡＣ）を用いて、ＡＬＳ　電気化学アナライザー　８１４Ｄ（ＢＡＳ社製）に接続し、ＰｋＬＤＨ酵素液５μｌ、１．５Ｍの塩化カリウムを含有した１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２０μｌ、フェリシアン化カリウム水溶液２５μｌを電極上に載せる。そして、＋４００ｍＶ（ｖ．ｓ．　Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して、所定濃度の乳酸溶液５μＬをそれぞれ電極上に載せて反応を行い、１２０秒後の電流値を測定する。その結果、乳酸を電気化学的測定においても定量できる。

実施例６
（４）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣａＬＤＨ　ＤＮＡ及びｐＫＫ２２３－３－ＯｇＬＤＨ　ＤＮＡの調製と各ＬＤＨの生産　
　Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＣａＬＤＨ）のアミノ酸配列である配列番号６で示される５７１アミノ酸のうち、２～６７位を除去した配列番号７で示される５０５アミノ酸をコードする、配列番号８で示される１５１８ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、ｃＤＮＡとして取得した。同様にして、Ｏｇａｔａｅａ　ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＯｇＬＤＨ）のアミノ酸配列である配列番号９で示される５５８アミノ酸のうち、２～５６位を除去した配列番号１０で示される５０３アミノ酸をコードする、配列番号１１で示される１５１２ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、ｃＤＮＡとして取得した。実施例１と同様にして、プラスミドｐＫＫ２２３－３のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＣａＬＤＨ遺伝子若しくはＯｇＬＤＨ遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製し、発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣａＬＤＨ及びｐＫＫ２２３－３－ＯｇＬＤＨ）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣａＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＣａＬＤＨ）株及びｐＫＫ２２３－３－ＯｇＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＯｇＬＤＨ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で２４時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＣａＬＤＨまたはＯｇＬＤＨを含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。

実施例７
（温度安定性）
　実施例２と同様に、３７℃における長期安定性を調べた。ただし、終濃度として０．０７％ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、ＣａＬＤＨまたはＯｇＬＤＨを約２０Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、各時間保存した。その後、各時間経過後の残存活性率を測定した。結果を図３（Ａ）に示す。ＣａＬＤＨは、保存開始から１４０時間経過後にも７２％の活性を保持しており、ＯｇＬＤＨは、保存開始から１４０時間経過後にも７７％の活性を保持しており、ＳｃＬＤＨと比較して非常に安定であった。

（ｐＨ安定性）
　ＰｋＬＤＨと同様の手法で、ＣａＬＤＨとＯｇＬＤＨの精製を行った。得られた精製酵素液（１０Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ＣａＬＤＨとＯｇＬＤＨは共にｐＨ６．５において最も安定であり、ｐＨ６．０～７．０の範囲において８０％以上の相対活性（％）を示した。

（オキシダーゼ活性）
　ＣａＬＤＨとＯｇＬＤＨのオキシダーゼ活性測定を行ったところ、いずれもオキシダーゼ活性は検出されなかった。したがって、ＣａＬＤＨとＯｇＬＤＨは酸素を電子受容体としない酵素であった。

実施例８
（５）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＴｈＬＤＨ　ＤＮＡの調製と各ＬＤＨの生産
　Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＴｈＬＤＨ）のアミノ酸配列である配列番号１２で示される４９９アミノ酸をコードする、配列番号１３で示される１５００ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、ｃＤＮＡとして取得した。実施例１と同様にして、プラスミドｐＫＫ２２３－３のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＴｈＬＤＨ遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製し、発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＴｈＬＤＨ）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＴｈＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＴｈＬＤＨ）株を、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で２４時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＴｈＬＤＨを含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。

実施例９
（温度安定性）
　実施例２と同様に、３７℃における長期安定性を調べた。終濃度として０．０７％ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、ＴｈＬＤＨを約２０Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、各時間保存した。その後、各時間経過後の残存活性率を測定した。ＴｈＬＤＨは、保存開始から８９時間経過後にも７４％の活性を保持しており、ＳｃＬＤＨと比較して非常に安定であった。つまり、ＴｈＬＤＨは、３７℃にて少なくとも３日間以上経過させた時に、初発活性の７０％以上を維持しているといえる。

実施例１０
（６）ＰｋＬＤＨ変異体の作製
　ＰｋＬＤＨのＮ末端領域をさらに削除した変異体の構築を行った。まず、配列番号４における２～９５位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－９６）を作製するために、実施例１で得た組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを鋳型として、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。すなわち、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを１０μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを２０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ６ｐｍｏｌ加えて、滅菌水により全量を２０μｌとした。調製した反応液を、サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて、「９８℃、１０秒」－「５５℃、５秒」－「６８℃、３５秒」のサイクルを７回繰り返した。

　得られたＰＣＲ産物を含む溶液に、制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢＩＯＬＡＢＳ社製）を１μｌ添加して混合し、３７℃で３０分処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した。続いて、得られたＤｐｎＩ処理液を２μｌ、滅菌水を７μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を５μｌ、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社製）を１μｌ、イオン交換水を７μｌ混合し、１６℃で１時間反応させた。反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。実施例１と同様の手法で組換え体プラスミドを抽出して精製し、ＤＮＡ２．５μｇを得た。該プラスミド中のＰｋＬＤＨ－９６をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、ＰｋＬＤＨ－９６をコードするＤＮＡコンストラクトを得た。

　同様にして、配列番号４における２～９６位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－９７）を作製するために、配列番号１４、１６の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～９７位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－９８）を作製するために、配列番号１４、１７の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～９８位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－９９）を作製するために、配列番号１４、１８の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～９９位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１００）を作製するために、配列番号１４、１９の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～１００位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１０１）を作製するために、配列番号１４、２０の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～１０１位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１０２）を作製するために、配列番号１４、２１の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～１０２位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１０３）を作製するために、配列番号１４、２２の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～１０３位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１０４）を作製するために、配列番号１４、２３の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～７５位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－７６）を作製するために、配列番号１４、５０の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～８３位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－８４）を作製するために、配列番号１４、５１の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～９１位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－９２）を作製するために、配列番号１４、５２の合成オリゴヌクレオチド、配列番号４における２～１０９位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１１０）を作製するために、配列番号１４、５３の合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－７６～ＰｋＬＤＨ－１１０をコードするＤＮＡコンストラクトを得た。

　また、ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを鋳型として、配列番号２４、２５、２６、２７の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。具体的には、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを鋳型として、配列番号２４、２５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。すなわち、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを１０μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを２０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ６ｐｍｏｌ加えて、滅菌水により全量を２０μｌとした。調製した反応液を、サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて、「９８℃、１０秒」－「５５℃、５秒」－「６８℃、３５秒」のサイクルを１５回繰り返した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。実施例１と同様の手法で組換え体プラスミドを抽出して精製し、ＤＮＡ２．５μｇを得た。該プラスミド中のＰｋＬＤＨ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定した。同様にして、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ／Ｌ３８６Ｒを鋳型として、配列番号２６、２７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用い、同様の条件でＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ２．５μｇを得た。該プラスミド中のＰｋＬＤＨ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、配列番号４記載のアミノ酸配列の３８６位のロイシンをアルギニンに、４６１位のスレオニンをアルギニンに、及び４６４位のアスパラギン酸をアルギニンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ／Ｌ３８６Ｒ／Ｔ４６１Ｒ／Ｄ４６４ＲをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。なお、例えば「Ｌ３８６Ｒ／Ｔ４６１Ｒ／Ｄ４６４Ｒ」は配列番号４のアミノ酸配列の３８６位のロイシンをアルギニンに、４６１位のスレオニンをアルギニンに、及び４６４位のアスパラギン酸をアルギニンにそれぞれ置換することを意味し、さらに「／」記号はそれぞれの置換を全て有することを意味する。
　また、ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを鋳型として、配列番号２８、２９の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、配列番号４記載のアミノ酸配列の１６１位のフェニルアラニンをロイシンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ／Ｆ１６１ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを鋳型として、配列番号３０、３１の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、配列番号４記載のアミノ酸配列の１８７位のフェニルアラニンをロイシンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ／Ｆ１８７ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを鋳型として、配列番号３２、３３の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、配列番号４記載のアミノ酸配列の４２８位のフェニルアラニンをロイシンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ－９７を鋳型として、配列番号３２、３３の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－９７における配列番号４記載のアミノ酸配列の４２８位に対応する位置のフェニルアラニンをロイシンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号３４、３５の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌにおける配列番号４記載のアミノ酸配列の１９４位に対応する位置のロイシンをアラニンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｌ１９４ＡをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号３６、３７の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌにおける配列番号４記載のアミノ酸配列の２２２位に対応する位置のロイシンをチロシンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｌ２２２ＹをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号３８、３９の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌにおける配列番号４記載のアミノ酸配列の２７４位に対応する位置のアラニンをセリンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ａ２７４ＳをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号４０、４１の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌにおける配列番号４記載のアミノ酸配列の２７７位に対応する位置のロイシンをセリンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｌ２７７ＳをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号４２、４３の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌにおける配列番号４記載のアミノ酸配列の３１３位に対応する位置のフェニルアラニンをアラニンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｆ３１３ＡをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号４４、４５の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌにおける配列番号４記載のアミノ酸配列の３１４位に対応する位置のイソロイシンをセリンに置換した変異体であるＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｉ３１４ＳをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、ＰｋＬＤＨ－９７をコードするＤＮＡコンストラクトを作製した時と同様に、配列番号４における２位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－３／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、５４の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－３／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～３位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－４／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、５５の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－４／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～４位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－５／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、５６の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－４／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～５位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－６／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、５７の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－６／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～６位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－７／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、５８の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－７／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～７位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－８／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、５９の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－８／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～８位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－９／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、６０の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－９／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～９位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１０／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、６１の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－１０／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
　また、配列番号４における２～１０位のアミノ酸を欠失させた変異体（ＰｋＬＤＨ－１１／Ｆ４２８Ｌ）を作製するために、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌを鋳型として、配列番号１４、６２の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＰｋＬＤＨ－１１／Ｆ４２８ＬをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。

　得られた各種ＰｋＬＤＨ変異体をコードするプラスミドを形質導入した大腸菌ＢＬ２１株を、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で２４時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、各種ＰｋＬＤＨ変異体を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。なお、Ｎ末端を削除した１３種類の変異体（ＰｋＬＤＨ－７６～ＰｋＬＤＨ－１１０）について、ＰｋＬＤＨ野生型と比較して、粗酵素液の活性は０．３倍から６倍であった。また、Ｎ末端を削除した９種類の変異体（ＰｋＬＤＨ－３／Ｆ４２８Ｌ～ＰｋＬＤＨ－１１／Ｆ４２８Ｌ）について、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌと比較して、粗酵素液の活性は２倍から１１倍であった。

実施例１１
（温度安定性）
　終濃度として０．１５％ＢＳＡを含む１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）となるよう実施例１０で作製した粗酵素液（ＰｋＬＤＨ－９６～ＰｋＬＤＨ－１０４）を希釈し、温度安定性を調べた。具体的には、実施例１０で調製したＮ末端削除変異体であるＬＤＨ酵素液を６Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、５５℃で１５分間処理した後、ＬＤＨ活性を測定し、処理前のＬＤＨ活性と比較して残存活性率を測定した。また、比較のため、ＰｋＬＤＨについても同様の試験を行った。結果を図１２に示す。ＰｋＬＤＨ－９６～ＰｋＬＤＨ－１０４はいずれもＰｋＬＤＨよりも残存活性率が高く、熱安定性が高いことが分かった。また、その他のＮ末端削除変異体（ＰｋＬＤＨ－７６、ＰｋＬＤＨ－８４、ＰｋＬＤＨ－９２、ＰｋＬＤＨ－１１０、ＰｋＬＤＨ－３／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－４／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－５／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－６／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－７／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－８／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－９／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－１０／Ｆ４２８Ｌ、ＰｋＬＤＨ－１１／Ｆ４２８Ｌ）について、同様にして５０℃で１５分間処理した。続いて、ＬＤＨ活性測定用試薬として、終濃度０．０９ｍＭの２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、終濃度０．５ｍＭのフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、終濃度１０ｍＭのＬ－乳酸及び終濃度１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を準備した。９６穴プレート中に、熱処理後の酵素液を５μＬ、ＬＤＨ活性測定用試薬を１４５μＬ添加し、３７℃で５分間、インキュベートしたところ、明らかに活性測定試薬の色が黄色へと変化した。したがって、５０℃の熱処理で完全に失活するＳｃＬＤＨと比較して、これらの変異体は安定性が高いことが分かった。
　続いて、終濃度として０．１５％ＢＳＡを含む１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）となるよう実施例１０で作製した粗酵素液（ＰｋＬＤＨ／Ｆ１６１Ｌ、ＰｋＬＤＨ／Ｆ１８７Ｌ、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌ）を希釈し、温度安定性を調べた。具体的には、実施例１０で調製した一置換変異ＬＤＨ酵素液を６Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、５５℃で１５分間処理した後、ＬＤＨ活性を測定し、処理前のＬＤＨ活性と比較して残存活性率を測定した。また、比較のため、ＰｋＬＤＨについても同様の試験を行った。結果を図１３に示す。ＰｋＬＤＨ／Ｆ１６１Ｌ、ＰｋＬＤＨ／Ｆ１８７Ｌ、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８ＬはいずれもＰｋＬＤＨよりも残存活性率が高く、熱安定性が高いことが分かった。
　また、実施例１０で作製した粗酵素液（ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｌ１９４Ａ、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｌ２２２Ｙ、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ａ２７４Ｓ、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｌ２７７Ｓ、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｆ３１３Ａ、ＰｋＬＤＨ－９７／Ｆ４２８Ｌ／Ｉ３１４Ｓ）を用いて、５０℃で１５分間処理した。続いて、ＬＤＨ活性測定用試薬として、上記のＤＣＩＰ及びＰＭＳによる系を用い、熱処理後の酵素液を５μＬ、ＬＤＨ活性測定用試薬を１４５μＬ添加し、３７℃で５分間、インキュベートしたところ、明らかに活性測定試薬の色が黄色へと変化した。したがって、５０℃の熱処理で完全に失活するＳｃＬＤＨと比較して、これらの変異体は安定性が高いことが分かった。なお、ＰＭＳの代わりに、１－メトキシフェナジンメトサルフェートを用いて同様に活性測定を行っても同様の結果であった。

　次に、実施例２と同様に、３７℃における長期安定性を調べた。終濃度として０．０７％ＢＳＡを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、各種ＬＤＨ変異体（ＰｋＬＤＨ－９６、ＰｋＬＤＨ－９７、ＰｋＬＤＨ－１０４、ＰｋＬＤＨ／Ｌ３８６Ｒ／Ｔ４６１Ｒ／Ｄ４６４Ｒ、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌ）を約２０Ｕ／ｍｌとなるよう希釈し、各時間保存した。その結果、ＰｋＬＤＨ－９６は、保存開始から８９時間経過後にも９５％の活性を保持しており、ＰｋＬＤＨ－９７は、保存開始から４３時間経過後に１１４％、７２時間経過後に１１４％、１７１間経過後にも１１１％の活性を保持しており、ＰｋＬＤＨ－１０４は、保存開始から４３時間経過後に９７％、７２時間経過後に９９％、１７１間経過後にも８８％の活性を保持しており、ＰｋＬＤＨ／Ｌ３８６Ｒ／Ｔ４６１Ｒ／Ｄ４６４Ｒは、保存開始から８９時間経過後にも９６％の活性を保持しており、ＰｋＬＤＨ／Ｆ４２８Ｌは、４３時間経過後に９９％、７２時間経過後に１０７％、１７１間経過後にも９４％の活性を保持しており、ＳｃＬＤＨと比較して非常に安定であった。つまり、これらの変異体は、３７℃にて少なくとも３日間以上経過させた時に、初発活性の７０％以上を維持しているといえる。また、ＰｋＬＤＨ－９８、ＰｋＬＤＨ－９９、ＰｋＬＤＨ－１００、ＰｋＬＤＨ－１０１、ＰｋＬＤＨ－１０２、ＰｋＬＤＨ－１０３、ＰｋＬＤＨ／Ｆ１６１Ｌ及びＰｋＬＤＨ／Ｆ１８７Ｌについても、ＰｋＬＤＨと比較して５５℃における熱安定性が高いことから、３７℃における長期安定性においてもＳｃＬＤＨと比較して非常に安定である蓋然性が高い。

実施例１２
（ＰｋＬＤＨ固定化電極によるＬ－乳酸の定量）
　実施例３で得られた精製ＰｋＬＤＨ酵素液を固定化した電極を用いてＬ－乳酸の定量を行った。具体的には、カーボンの作用電極が印刷されてなる、ＳＣＲＥＥＮ－ＰＲＩＮＴＥＤ　ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ（ＤｒｏｐＳｅｎｓ社製、製品番号ＤＲＰ－Ｃ１１０）の作用電極上に１２Ｕ分のＰｋＬＤＨを塗布・乾燥させた。続いて、２％のポリ(エチレングリコール)ジグリシジルエーテル（Ｍｎ：６０００、シグマ社製）を３μL塗布し、４℃にて２２時間反応させた。超純水で洗浄し、ＰｋＬＤＨ固定化電極とした。専用コネクター（ＤｒｏｐＳｅｎｓ社製、ＤＲＰ－ＣＡＣ）を用いて、ＡＬＳ　電気化学アナライザー　８１４Ｄ（ＢＡＳ社製）に接続し、さらに銀塩化銀参照電極と白金電極と接続し、０．１ｍｇ／ｍｌのＢｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒ‘ｓ　Ｇｒｅｅｎ　Ｌｅｕｃｏ　Ｂａｓｅ（東京化成社製）を含有したＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０ｍｌ中に３つの電極を浸漬させた。＋２００ｍＶ（ｖｓ　Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加し、一定時間ごとにＬ－乳酸溶液を添加した際の応答電流値を記録した。その結果を図８に示す。１～７ｍＭのＬ－乳酸を添加した際に、乳酸濃度依存的に応答電流が増加することが示され、Ｌ－乳酸を定量できた。

　本発明の検体にＦＭＮ－ＬＤＨを作用させるための作用部と、ＦＭＮ－ＬＤＨを作用させた検体の状態を感知するセンサを含む、検体の状態を評価するためのデバイス及び、それを用いた検体の状態を評価するための方法によれば、ヒト及び非ヒト生物の間質液、血液、尿、涙、汗、唾液、皮膚、肉、眼球、角膜、胃液、飲食品、醸造物、化成品、水、土壌を含む乳酸含有組成物中の乳酸を長期に渡り安定的に、精度良く簡便に測定できるので、人や動物の健康管理、あるいは、飲食品や醸造物、化成品等の製造工程管理、品質管理等において有用である。

　１　　　作用極
　３　　　対極
　５　　　参照極
　７　　　配線部
　９　　　端子
　１０　　センサチップ
　１１　　基盤
　１３　　スペーサ
　１５　　カバー
　１９　　反応層
　１００　測定部
　１０１　制御部
　１０２　温度センサ
　１０３　記憶部
　１０４　通信部
　１０５　電池
　１０６　測定装置

Claims

　検体の状態を評価するためのデバイスであって、
　検体に乳酸デヒドロゲナーゼを作用させるための作用部と、
　乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知するためのセンサであって、作用部での検体の状態を感知することが可能なように配置されるセンサと
を含む、デバイス。
　センサからの信号を出力するための出力部をさらに含む、請求項１記載のデバイス。
　請求項２記載のデバイスと、
　デバイスの出力部に接続され、センサからの信号を処理するためのデータ処理ユニットと
を含む、システム。
　検体の状態を、デバイス及びデータ処理ユニットを含むシステムによって評価するためのプログラムであって、
　デバイスが、
　検体に乳酸デヒドロゲナーゼを作用させるための作用部と、
　乳酸デヒドロゲナーゼを作用させた検体の状態を感知するためのセンサであって、作用部での検体の状態を感知することが可能なように配置されるセンサと、
　センサからの信号を出力するための出力部と
を含み、
　データ処理ユニットが、デバイスの出力部に接続され、センサからの信号を処理するように構成され、
　プログラムが、デバイスに対して、
　センサにより、乳酸デヒドロゲナーゼを作用部において作用させた検体の状態を感知して測定し、信号に変換するための、測定処理と、
　前記測定処理で得られた信号を出力部からデータ処理ユニットに対して転送するための、転送処理と、
を実行させ、
　プログラムが、前記データ処理ユニットに対して、前記測定処理で得られた信号に対して所定の処理をするための、データ処理を実行させる、プログラム。
　請求項１又は２記載のデバイス、または請求項３記載のシステムを用いる、検体の状態を評価する方法。
　検体が、ヒトおよび非ヒト生物の体液、間質液、血液、尿、涙、汗、唾液、皮膚、肉、眼球、角膜、胃液、飲食品、醸造物、化成品、水、土壌を含む乳酸含有組成物である、請求項５記載の方法。
　検体の状態が、運動負荷に対する身体状態、疾病状態、乳酸量の変化を伴う醸造物の醸造状態、乳酸量の変化を伴う飲食品の熟成・追熟度合、乳酸量の変化を伴う化成品製造の乳酸含有割合、乳酸量の変化を伴う水、土壌中の乳酸量である、請求項５又は６記載の方法。
　検体の状態をモニタリングするためのデバイスであって、デバイスは、検体に、
（Ａ）溶液中で、３７℃にて１０日間経過させた時に、初発活性の約２０％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、
（Ｂ）溶液中で、３７℃にて３日間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、又は
（Ｃ）溶液中で、３７℃にて１５時間以上経過させた時に、初発活性の約２０％以上を維持しているフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ
を作用させるための作用部を含む、デバイス。
　請求項８記載のデバイスがさらに出力部を含み、その出力部がデータ処理ユニットに接続される、システム。
　請求項８記載のデバイスまたは請求項９記載のシステムを用いる、検体の状態をモニタリングする方法。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列における１１０～５０２位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列における１１３～５０５位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、アミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１１２～５０３位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列における１０２～４９９位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、乳酸デヒドロゲナーゼ。
　配列番号４、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はそれとの同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有する、請求項１１記載の乳酸デヒドロゲナーゼ。
　請求項１１又は１２記載の乳酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸。
　請求項１３記載の核酸を有する、宿主細胞。
　請求項１４記載の宿主細胞を培養することを含む、乳酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
　検体の状態を評価するための方法であって、
ｉ）請求項１１又は１２記載の乳酸デヒドロゲナーゼと検体を接触させる工程、及び
ｉｉ）乳酸を測定する工程
を含む、方法。