WO2022071417A1 - フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法 - Google Patents

フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022071417A1
WO2022071417A1 PCT/JP2021/035929 JP2021035929W WO2022071417A1 WO 2022071417 A1 WO2022071417 A1 WO 2022071417A1 JP 2021035929 W JP2021035929 W JP 2021035929W WO 2022071417 A1 WO2022071417 A1 WO 2022071417A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid
ldh
genus
group
lactate dehydrogenase
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/035929
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
遼太 鈴木
陽介 鉞
Original Assignee
キッコーマン株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by キッコーマン株式会社 filed Critical キッコーマン株式会社
Priority to EP21875715.1A priority Critical patent/EP4223884A1/en
Priority to KR1020237011749A priority patent/KR20230078697A/ko
Priority to JP2022554051A priority patent/JPWO2022071417A1/ja
Priority to US18/246,060 priority patent/US20230365959A1/en
Publication of WO2022071417A1 publication Critical patent/WO2022071417A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/02—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a cytochrome as acceptor (1.1.2)
    • C12Y101/02003—L-Lactate dehydrogenase (cytochrome) (1.1.2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for improving the stability of a composition containing a flavin-dependent dehydrogenase and a composition obtained by using the method.
  • Lactate concentration and sweat lactate concentration are known as markers that reflect fatigue and physical condition. Lactic acid is a major metabolite and is recognized to be important not only for health management indicators but also for health assessments including serious illness and / or surgical patients, and lactate levels in body fluids are circulatory insufficiency, liver. It can be an index for various pathological conditions such as disorders. Lactate monitoring can be used to detect sepsis, hypoxia, and the presence of cancerous tissue (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 For the purpose of physical condition management not limited to sick people, lactate monitoring is performed as an index for monitoring the appropriateness of training conducted by athletes and those who are highly interested in exercising on a daily basis.
  • LDH flavin-dependent lactate dehydrogenase
  • Non-Patent Document 3 describes that LDH derived from Saccharomyces cerevisiae known so far has a problem in stability.
  • lactate dehydrogenase nicotinamide adenine dinucleotide-dependent lactate dehydrogenase is also known, but it is not included in flavin-dependent lactate dehydrogenase (LDH). Therefore, in the present specification, the term flavin-dependent lactate dehydrogenase, or LDH, does not include nicotinamide-dependent lactate dehydrogenase unless otherwise specified.
  • the present disclosures have found that the stability of LDH is improved by coexisting various compounds in a composition containing LDH, and further, electrodes. It has been found that the inactivation of LDH applied to can be suppressed, and the present disclosure including these embodiments has been completed.
  • the present disclosure provides the following embodiments.
  • a method for improving the thermal stability of a lactic acid dehydrogenase-containing composition which comprises the step of allowing one or more kinds of anions, monosaccharides, disaccharides, polyethylene glycols, or ionic polymers selected from the group to coexist.
  • Lactic dehydrogenases are genus Saccharomyces, genus Pikia, genus Candida, genus Ogataea, genus Bretanomyces, genus Cibellindonella, genus Hansenia spora, genus Kazatutania, genus Kruiwelomyces, genus Lachansea, genus Naumovodima, genus Tetrapicispora. The method according to 1.
  • Lactate dehydrogenase having an amino acid sequence having an amino acid sequence of 70% or more or 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 4 138 to 140, 186 to 194, 217 to 222, 243 to 245, 271 to 278, 280 to 283, 355 to 367, 398 to 401, 403 to 403.
  • Lactate dehydrogenase having 80% or more or 90% or more sequence identity between the amino acid sequence in the homology region consisting of the amino acid sequences at positions 406 and 425 to 433 and the amino acid sequence in the homology region at the corresponding position of the lactate dehydrogenase. .. [4]
  • the monocarboxylic acid is selected from the group consisting of gluconic acid, leucine acid, 3-phenyllactic acid, glycine, lysine, histidine and arginine.
  • Dicarboxylic acids are malic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, malonic acid, methylmalonic acid, oxaloacetic acid, tartaric acid, oxalic acid, succinic acid, glutaric acid, ⁇ -ketoglutaric acid, adipic acid, pimelic acid, sveric acid, Azelaic acid, sebasic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, glutaconic acid, tarthronic acid, muconic acid, mesaconic acid, citraconic acid, meconic acid, 3-3'dimethylglutaric acid, itaconic acid, glutamic acid, aspartic acid, and Selected from the group consisting of 3-hydroxyasparagine,
  • the tricarboxylic acid is selected from the group consisting of citric acid, isocitric acid, aconitic acid, trimesic acid, 1,2,3-propanetricarboxylic acid
  • Tetracarboxylic acid is selected from ethylenediaminetetraacetic acid
  • Phosphoric acid is selected from the group consisting of phosphates and pyrophosphates.
  • Sulfuric acid is selected from sulfates
  • Monosaccharides are selected from the group consisting of myo-inositol
  • the disaccharide is selected from the group consisting of sucrose, trehalose, and maltose, or polyethylene glycol
  • the ionic polymer is an anionic polymer or a cationic polymer
  • the anionic polymer is selected from the group consisting of polyacrylic acid, hyaluronic acid, and carboxymethyl cellulose or salts thereof, or
  • the method for improving the thermal stability of the lactate dehydrogenase-containing composition according to any one of 1 to 3, wherein the cationic polymer is selected from polylysine, polyethyleneimine, methylglycolchitosan, and poly (diallyldimethylammoni
  • lactic acid dehydrogenase having a flavine compound as a coenzyme monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, tricarboxylic acid, tetracarboxylic acid, polycarboxylic acid, phosphoric acid, sulfuric acid or salts thereof (excluding ammonium sulfate).
  • a composition for measuring lactic acid which comprises one or more compounds of anion, monosaccharide, disaccharide, polyethylene glycol, and ionic polymer.
  • Lactic dehydrogenases are genus Saccharomyces, genus Pikia, genus Candida, genus Ogataea, genus Bretanomyces, genus Cibellindonella, genus Hansenia spora, genus Kazatutania, genus Kluywellomyces, genus Lachansea, genus Naumovodima, genus Tetrapicispora, 6.
  • composition for measuring lactic acid according to 6, which is a lactic acid dehydrogenase derived from the genus Van der Waldjima, the genus Zigosaccharomyces, the genus Zigotorlapora, the genus Misserioftra, the genus Thermocellomyces, the genus Caetomium, or the genus Madurella.
  • lactate dehydrogenase is (i) and / or (ii) below.
  • Lactate dehydrogenase having an amino acid sequence having an amino acid sequence of 70% or more or 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 4 138 to 140, 186 to 194, 217 to 222, 243 to 245, 271 to 278, 280 to 283, 355 to 367, 398 to 401, 403 to 403.
  • Lactate dehydrogenase having 80% or more or 90% or more sequence identity between the amino acid sequence in the homology region consisting of the amino acid sequences at positions 406 and 425 to 433 and the amino acid sequence in the homology region at the corresponding position of the lactate dehydrogenase. .. [9]
  • the monocarboxylic acid is selected from the group consisting of gluconic acid, leucine acid, 3-phenyllactic acid, glycine, lysine, histidine and arginine.
  • Dicarboxylic acids are malic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, malonic acid, methylmalonic acid, oxaloacetic acid, tartaric acid, oxalic acid, succinic acid, glutaric acid, ⁇ -ketoglutaric acid, adipic acid, pimelic acid, sveric acid, Azelaic acid, sebasic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, glutaconic acid, tarthronic acid, muconic acid, mesaconic acid, citraconic acid, meconic acid, 3-3'dimethylglutaric acid, itaconic acid, glutamic acid, aspartic acid, and Selected from the group consisting of 3-hydroxyasparagine,
  • the tricarboxylic acid is selected from the group consisting of citric acid, isocitric acid, aconitic acid, trimesic acid, 1,2,3-propanetricarboxylic acid
  • Tetracarboxylic acid is selected from ethylenediaminetetraacetic acid
  • Phosphoric acid is selected from the group consisting of phosphates and pyrophosphates.
  • Sulfuric acid is selected from sulfates
  • Monosaccharides are selected from the group consisting of myo-inositol
  • the disaccharide is selected from the group consisting of sucrose, trehalose, and maltose, or polyethylene glycol
  • the ionic polymer is an anionic polymer or a cationic polymer
  • Anionic polymers are selected from the group consisting of polyacrylic acid, hyaluronic acid, and carboxymethyl cellulose or salts thereof. 6.
  • composition for measuring lactic acid according to any one of 6 to 8, wherein the cationic polymer is selected from polylysine, polyethyleneimine, methylglycolchitosan, and poly (diallyldimethylammonium chloride).
  • An electrode containing a composition containing one or more compounds of sugar, disaccharide, polyethylene glycol, and an ionic polymer [13] A lactate sensor comprising the electrode according to 12. [14] A fuel cell comprising the electrode according to 12. [15] A method for suppressing a decrease in activity or inactivation of lactate dehydrogenase in a method for producing an electrode, which comprises a step of applying lactate dehydrogenase to the electrode.
  • Steps to prepare a solution containing lactate dehydrogenase i) Steps to prepare a solution containing lactate dehydrogenase, ii) An anion, monosaccharide, disaccharide, polyethylene glycol selected from the group consisting of monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, tricarboxylic acid, tetracarboxylic acid, polycarboxylic acid, phosphoric acid, sulfuric acid or salts thereof in the solution.
  • a step of adding one or more stabilizers selected from the group consisting of ionic polymers iii)
  • a step of applying a solution containing the lactate dehydrogenase and the stabilizer to the electrode iv) The step of drying the applied solution, The method described above. [16] The production method according to 15, wherein the electrode coated with lactate dehydrogenase is included in the lactate sensor.
  • the present disclosure is characterized in that the thermal stability of the LDH-containing composition can be improved by coexisting any additive component with any LDH. Attempts to modify LDH itself to improve thermal stability are not known, and an effective thermal stability improver for LDH and LDH-containing compositions having improved thermal stability as a composition are not known. The knowledge was scarce.
  • the present disclosure provides a method of improving the stability of a composition comprising LDH. It has been found that anionic or sugar or ionic polymers are effective as compounds added to improve the stability of the composition containing LDH of the present disclosure. That is, the present disclosure provides, in certain embodiments, stabilizers that improve the stability of compositions containing LDH. Stabilizers that enhance the stability of compositions containing LDH may include anionic, sugar, and / or ionic (cationic, anionic, zwitterionic) polymers.
  • the anion of the present disclosure is not particularly limited as long as it improves the thermal stability of the LDH-containing composition of the present disclosure, and is, for example, a carboxyl group-containing compound, a halogen compound, a phosphate, a nitrate, a sulfate, or a protein. , Peptides, amino acids and the like.
  • the carboxyl group-containing compound include, but are not limited to, monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, tricarboxylic acid, tetracarboxylic acid, and polycarboxylic acid compound.
  • preferred anions used in the present invention are, but are not limited to, one or more dicarboxylic acids or tricarboxylic acids, tetracarboxylic acids, polycarboxylic acids or salts thereof.
  • a nonionic polymer polyethylene glycol may be used.
  • the ionic polymer may be a cationic polymer, an anionic polymer or a zwitterionic polymer. Examples of the cationic polymer include, but are not limited to, polylysine, polyethyleneimine, methylglycolchitosan, poly (diallyldimethylammonium chloride) and the like.
  • anionic polymer examples include hyaluronic acid, a cellulose derivative (for example, carboxymethyl cellulose), a polyacrylic acid derivative (for example, polyacrylic acid), a polymethacrylic acid derivative (for example, polymethylmethacrylate and hydroxymethylmethacrylate) and the like.
  • a cellulose derivative for example, carboxymethyl cellulose
  • a polyacrylic acid derivative for example, polyacrylic acid
  • a polymethacrylic acid derivative for example, polymethylmethacrylate and hydroxymethylmethacrylate
  • the zwitterionic polymer examples include, but are not limited to, the poly (carboxybetaine methacrylate) described in JP-A-2017-527669.
  • compounds added to improve the stability of a composition containing LDH may be referred to as LDH stabilizers, or simply stabilizers. However, this does not prevent the LDH stabilizer from containing other compounds.
  • the stabilizer added to improve the stability of the composition containing LDH comprises a compound that stabilizes LDH.
  • the stabilizer may contain other compounds.
  • ammonium sulphate in particular 50% by weight or more, is removed from the sulphate.
  • the monocarboxylic acid used in the present disclosure is not particularly limited as long as it improves the stability of the composition containing LDH of the present disclosure, and is, for example, gluconic acid, leucic acid, 3-phenyllactic acid. , Glycine, arginine, lysine, histidine are exemplified as preferred monocarboxylic acids. In certain embodiments, the monocarboxylic acid used in the present disclosure may have 7 or less carbon atoms in the backbone.
  • preferred dicarboxylic acids used in the present disclosure include malic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, malonic acid, methylmalonic acid, oxaloacetate, tartrate acid, oxalic acid, succinic acid, glutaric acid, ⁇ -.
  • glutaric acid, itaconic acid, glutamic acid, aspartic acid, 3-hydroxyaspartic acid and the like examples thereof include glutaric acid, itaconic acid, glutamic acid, aspartic acid, 3-hydroxyaspartic acid and the like.
  • preferred tricarboxylic acids used in the present disclosure include citric acid, isocitric acid, aconitic acid, trimesic acid, 1,2,3-propanetricarboxylic acid, 2-phosphonobutane-1,2,4-tricarboxylic acid and the like. Can be mentioned.
  • preferred tetracarboxylic acids used in the present disclosure include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and the like.
  • the preferred sugar used in the present disclosure is not particularly limited as long as it improves the stability of the composition containing LDH of the present disclosure, such as monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide, and is not particularly limited, but for example, sucrose. , Trehalose, maltose, myo-inositol and the like.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol preferably used in the present disclosure is not particularly limited, but for example, an average molecular weight of 300 to 100,000 is preferable, and 7,300 to 9,300 is particularly preferable.
  • preferred cationic polymers used in the present disclosure include, for example, polylysine, polyethyleneimine, methylglycolchitosan, and poly (diallyldimethylammonium chloride), and polylysine includes ⁇ -polylysine or ⁇ -polylysine. Be done.
  • the molecular weight of polylysine is not particularly limited, but for example, polylysine having an average molecular weight of 300 to 100,000 is preferable, and further 3,500 to 6,000, for example 3,000 to 5,000, for example 3,500 to 4, Polylysine of 500 is preferred, but not limited to.
  • Polyethyleneimine may be linear or branched.
  • the molecular weight of polyethyleneimine is not particularly limited, but for example, polyethyleneimine having an average molecular weight of 300 to 100,000, for example, 3000 to 20,000, for example, 3500 to 10,000 can be used.
  • preferred anionic polymers used in the present disclosure include polyacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, hyaluronic acid or salts thereof, and carboxymethyl cellulose or salts thereof.
  • the molecular weight of polyacrylic acid is not particularly limited, but for example, polyacrylic acid having an average molecular weight of 1000 to 1,250,000 is preferable, but not limited to this.
  • the molecular weight of polystyrene sulfonic acid is not particularly limited, but for example, polystyrene sulfonic acid having an average molecular weight of 1000 to 1,000,000 is preferable, but not limited to this.
  • preferred nitrates used in the present disclosure include sodium nitrate, ammonium nitrate, magnesium nitrate, potassium nitrate, calcium nitrate, lithium nitrate and the like.
  • preferred sulfates used in the present disclosure include sodium sulfate, ammonium sulfate, magnesium sulfate, potassium sulfate, calcium sulfate, lithium sulfate and the like.
  • preferred phosphates used in the present disclosure include sodium phosphate, ammonium phosphate, magnesium phosphate, potassium phosphate, calcium phosphate, lithium phosphate and the like.
  • the preferred anion or sugar used in the present disclosure is one or more carboxyl group-containing compounds, halogen compounds, phosphates, nitrates, sulfates, proteins, peptides, amino acids or salts thereof, or sugars. be.
  • gluconic acid in another embodiment, from the stabilizers of the present disclosure, gluconic acid, leucic acid, 3-phenyllactic acid, glycine, arginine, lysine, histidine, malic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, malonic acid, methylmalon.
  • Acid oxaloacetic acid, tartaric acid, oxalic acid, succinic acid, glutaric acid, ⁇ -ketoglutaric acid, adipic acid, pimelli acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, glutaconic acid, tartronic acid , Mucon acid, mesacon acid, citraconic acid, mecon acid, 3-3'dimethylglutaric acid, itaconic acid, glutamic acid, aspartic acid, 3-hydroxyaspartic acid, citric acid, isocitrate, aconitic acid, trimesic acid, 1, 2 , 3-Propanitricarboxylic acid, 2-phosphonobutane-1,2,4-tricarboxylic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), hyaluronic acid or a salt thereof, and carboxymethyl cellulose or a salt thereof, sucrose,
  • leucine acid may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic form.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-leucine acid can be of optical purity 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • 3-phenyllactic acid may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic form.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-3-phenyllactic acid can have an optical purity of 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of a compound.
  • arginine may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic form.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-arginine can be of optical purity 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • lysine may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic form.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-lysine can have an optical purity of 90-100% ee, such as 95-100% ee, such as 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • histidine may be provided as an L-form and a D-form, or a mixture of the L-form and the D-form, for example, a racemic form.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-histidine can have an optical purity of 90-100% ee, such as 95-100% ee, such as 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • malic acid may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic acid.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-malic acid can be of optical purity 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • tartaric acid may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic acid.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-tartaric acid can have an optical purity of 90-100% ee, such as 95-100% ee, such as 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • glutamic acid may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic acid.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-glutamic acid can have an optical purity of 90-100% ee, such as 95-100% ee, such as 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • aspartic acid may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic form.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-aspartic acid can be of optical purity 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • 3-hydroxyaspartic acid may be provided as L-form and D-form, or a mixture of L-form and D-form, for example, racemic form.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • L-3-hydroxyaspartic acid can be of optical purity 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the racemate is shown in this specification, it is described as DL- before the name of the compound.
  • the stabilizer added to improve the stability of the composition containing LDH of the present disclosure has a final concentration of the compound (active ingredient) of 0.1 mM to 1000 mM in the composition containing LDH, for example, 0. 1 mM-900 mM, 0.1 mM-800 mM, 0.1 mM-700 mM, 0.1 mM-600 mM, 0.1 mM-500 mM, 0.1 mM-400 mM, 0.1 mM-300 mM, 0.1 mM-200 mM, 0.1 mM- 100 mM, 0.1 mM to 90 mM, 0.1 mM to 80 mM, 0.1 mM to 70 mM, 0.1 mM to 60 mM, 0.1 mM to 50 mM, 0.1 mM to 40 mM, 0.1 mM to 30 mM, 0.2 mM to 20 mM, It can be incorporated into a lactate measuring reagent
  • an aqueous solution containing a stabilizer and LDH added to improve the stability of the present disclosure can be applied to the electrodes and dried.
  • the stabilizer (which may be contained in the composition) is concentrated at the time of drying, and the concentration becomes higher than the final concentration before drying.
  • Such a stabilizer for LDH at a high concentration after drying and an electrode coated with the stabilizer are also included in the present disclosure.
  • electrodes containing a composition containing a stabilizer are also provided by the present disclosure.
  • a composition containing a stabilizer is applied to the electrodes.
  • the stabilizer added to improve the stability of the present disclosure can be added at any time during the LDH manufacturing process.
  • the stabilizer may be added in the initial stage of the purification process, may be added in the middle of the extraction / purification process, and may be added in the latter half of the manufacturing process, for example, in the stage of freeze-drying / powdering / specification adjustment. It may be added.
  • various other components required in the production of compositions containing LDH such as buffers, surfactants, stabilizers, excipients, etc., as long as the stabilizing effect of LDH is not impaired. Can coexist.
  • These other components may be included in the stabilizer, may be included in a lactate measuring reagent other than the stabilizer, or may be separately added to the system when the lactate measuring reagent is used.
  • the present disclosure provides a composition for measuring lactate or a reagent for measuring lactate, which comprises a stabilizer and LDH added to improve the stability of the composition containing LDH.
  • the lactate measuring reagent can be in solution or dry form.
  • the LDH stabilizer in the lactate measurement reagent and LDH can be included as separate reagents.
  • the compound added to improve the stability of the composition containing LDH in the lactate measuring reagent and LDH can be contained in the same reagent.
  • the lactate measuring reagent does not contain LDH, in which case LDH can be added to the measurement solution at the time of lactate measurement.
  • the lactate measuring reagent does not contain a stabilizer for LDH, in which case the stabilizer can be added to the measurement solution at the time of lactate measurement.
  • the present disclosure provides a method for measuring lactic acid using a stabilizer added to improve the stability of a composition containing LDH and LDH.
  • the method for measuring lactic acid may be a method for measuring the concentration of lactic acid.
  • the method for measuring lactic acid may be a method for quantifying the concentration of lactic acid.
  • the sample to be measured can contain lactic acid.
  • the stabilizer added to improve the stability of the composition containing LDH may be included in the lactate measurement reagent in advance, or may be added to the measurement solution at the time of lactate measurement.
  • 0.001% by weight to 50% by weight for example, the compound contained in the stabilizer added to improve the stability of the composition containing LDH at the time of measurement is used.
  • 0.001% by weight to 25% by weight 0.001% by weight to 20% by weight, 0.001% by weight to 15% by weight, 0.001% by weight to 10% by weight, 0.001% by weight to 9% by weight, 0.001% by weight to 8% by weight, 0.001% by weight to 7% by weight, 0.001% by weight to 6% by weight, 0.001% by weight to 5% by weight, 0.001% by weight to 4% by weight, 0.001% by weight to 3% by weight, 0.1% by weight to 2.5% by weight, 0.001% by weight to 2% by weight, 0.001% by weight to 1% by weight, 0.001% by weight to 0.
  • the compound contained in the stabilizer added to improve the stability of the composition containing LDH at the time of measurement is 0.1 mM to 2,000 mM, for example, 0. 1 mM to 1,500 mM, 0.1 mM to 1,000 mM, 0.1 mM to 750 mM, 0.1 mM to 500 mM, 0.1 mM to 400 mM, 0.1 mM to 300 mM, 0.1 mM to 200 mM, 0.1 mM to 100 mM, 0.1 mM to 90 mM, 0.1 mM to 80 mM, 0.1 mM to 70 mM, 0.1 mM to 60 mM, 0.1 mM to 50 mM, 0.1 mM to 40 mM, 0.1 mM to 30 mM, 0.2 mM to 20 mM, 0. It can be included in the measurement solution at a final concentration of 25 mM to
  • the stabilizer in the lactic acid measurement method of the present disclosure, may be contained in the lactic acid measurement solution.
  • LDH and the sample may be added to the lactic acid measurement solution to start the measurement.
  • the LDH may be immobilized on the electrode, and the lactate measurement solution and the sample may be brought into contact with the electrode to measure lactate.
  • the stabilizer added to improve the stability of the composition containing LDH of the present disclosure may be contained in the lactate measuring reagent in advance.
  • This measurement reagent may or may not contain LDH. If the measurement reagent contains LDH, a sample can be added to it to start lactate measurement. If the measurement reagent does not contain LDH, the sample and LDH can be added thereto (in any order) to start the lactate measurement.
  • LDH may be immobilized on an electrode, and the measurement reagent and sample may be brought into contact with the electrode to measure lactic acid.
  • the compounds added to improve the stability of the composition containing LDH of the present disclosure do not precipitate LDH.
  • ammonium sulphate with a final concentration of 50-70% is excluded as a compound added to improve the stability of the composition containing LDH.
  • ammonium sulfate having a final concentration of 50% to 100% is excluded.
  • LDH to which this disclosure can be applied
  • the LDH applied to the present disclosure catalyzes the reaction of oxidizing the hydroxyl group of lactic acid to produce pyruvic acid in the presence of an electron acceptor, like the known wild-type or mutant LDH.
  • the substrate of LDH is lactic acid, which may be provided as a mixture of L-form and D-form, for example, racemic form, or as L-form.
  • the activity of LDH utilizes this principle of action, for example, using the following measurement system using phenazinemethsulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors as shown in FIG. Can be measured.
  • PMS phenazinemethsulfate
  • DCIP 2,6-dichloroindophenol
  • reaction 1 PMS (reduced form) is generated with the oxidation of L-lactic acid.
  • reaction 2 DCIP is reduced as PMS (reduced form) is oxidized.
  • the degree of disappearance of this "DCIP (oxidized type)" can be detected as the amount of change in absorbance at a wavelength of 520 nm, and the enzyme activity can be determined based on this amount of change.
  • the activity of LDH can be measured according to the following procedure.
  • the absorbance at the start of the reaction and over time is measured, the amount of decrease in the absorbance at 520 nm per minute ( ⁇ A 520 ) with the progress of the enzymatic reaction is determined, and the LDH activity is calculated according to Equation 1 of the following equation.
  • the LDH activity defines the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of L-lactic acid at a concentration of 10 mM at 37 ° C. as 1 U.
  • 1.5 is the solution volume (mL) of the reaction reagent + enzyme reagent
  • 6.8 is the mmol molecular absorbance coefficient of DCIP (mM -1 cm -1 ) under the present activity measurement conditions
  • 0.05 is the enzyme.
  • Solution volume (mL) 1.0 is cell optical path length (cm)
  • ⁇ A 520 blank is 0.15% (w / v) bovine serum albumin-containing 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • Is added instead of the enzyme sample solution to start the reaction the amount of decrease in absorbance at 520 nm per minute, and Df represents the dilution factor.
  • the thermal stability of LDH can be evaluated by heating LDH at a predetermined temperature for a predetermined time and comparing the activities before and after heating. Specifically, a 150 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.15% (w / v) bovine serum albumin as a final concentration containing LDH was allowed to stand on ice at a predetermined temperature (for example, 45). After heating for 15 minutes at ° C., 50 ° C., 55 ° C., and 60 ° C., respectively), LDH activity is measured. The activity of the LDH solution after heating can be calculated with the LDH activity of the LDH solution left on ice as 100 without heat treatment, and the residual activity rate (activity residual rate) (%) can be measured. ..
  • improved stability means not only “improvement of thermal stability in solution state” but also “improvement of thermal stability in dry state” or “improvement of thermal stability in drying process”. It also includes “improvement of storage stability (long-term stability) in a solution state” and “improvement of storage stability (long-term stability) in a dry state”. That is, “improved stability” as used in the present disclosure means that a composition containing LDH is coexistent with a specific stabilizer under certain temperature conditions, after heat treatment for a certain period of time, or after long-term storage. It means that the residual activity rate (%) of LDH that is maintained is increased as compared with the case where the above-mentioned stabilizer is not coexistent.
  • the residual activity rate (%) is measured by measuring the LDH activity value (a) of the solution before heat treatment or long-term storage and the LDH activity value (b) after heat treatment or long-term storage, respectively (((). It is obtained by calculating b) / (a) ⁇ 100).
  • the residual activity rate (%) after heat treatment or long-term storage in the state of coexistence with a specific stabilizer candidate compound was calculated, and this was designated as A, and the same treatment was performed without coexistence with the stabilizer candidate compound.
  • the residual activity rate (%) calculated in accordance with the above was B, it was evaluated that the stability of LDH was improved when A> B, and the compound coexisted at this time improved the stability of LDH. It is evaluated that it contributed to.
  • the effect of the stabilizer on improving the stability of LDH is, for example, that the residual activity rate (%) is 10% when it is not coexisted with the stabilizer candidate compound, whereas it is coexisted with the stabilizer candidate compound. If the residual activity rate (%) was 15%, it was said to have improved by 5%.
  • the effect of the stabilizer on improving the stability of LDH is preferably 2% or more, 3% or more, 4% or more, 5% or more, more preferably 10% or more, 15% or more, still more preferably 20% or more, and more. It can be preferably 30% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, 70% or more, and 80% or more.
  • the effect of the stabilizer on improving the stability of LDH is that it remains when the residual activity rate (%) is 100 when it does not coexist with the stabilizer candidate compound, and preferably when it coexists with the stabilizer candidate compound.
  • the relative value of activity is 110 or more, more preferably 130 or more, 150 or more, 200 or more, 250 or more, 300 or more, 350 or more.
  • the origin of LDH applicable to the method of the present disclosure is not particularly limited, and prokaryotic origin, eukaryotic origin, microbial origin, fungal origin, plant origin, or animal origin can be used.
  • the LDH to which the present disclosure is applicable is flavin-dependent, and the flavin compound which is a coenzyme can be a flavin mononucleotide (FMN) or a flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • LDH derived from microorganisms includes Ascomycota, preferably Saccharomyceta, more preferably Saccharomycetales, and more preferably Saccharomycetales derived from Pichia, Pichia.
  • Ascomycota preferably Saccharomyceta, more preferably Saccharomycetales, and more preferably Saccharomycetales derived from Pichia, Pichia.
  • Saccharomyces preferably Saccharomyceta
  • the genus Pichia the genus Candida
  • the genus Ogataea the genus
  • the genus Brettanomyces the genus Cyberlindnera
  • the genus Hansenasi the genus Hansenasi.
  • Examples of specific preferable microorganisms classified into the genus Pichia include Pichia quadriavzevi, Pichia membranifaciens, and Pichia capsulata.
  • Examples of specific preferable microorganisms classified into the genus Candida include Candida inconspirua and Candida boidinii.
  • Examples of specific preferable microorganisms classified into the genus Ogataea include Ogataea polymorpha and Ogataea parapolymorpha DL-1.
  • Examples of microorganisms classified into the genus Brettanomyces, which are particularly preferable, include Brettanomyces naardenensis and Brettanomyces bruxellensis.
  • LDHs derived from microorganisms include Ascomycota, Sordariomycetes, for example, Sordariales, for example, Chaetomiaceae, Chaetomiaceae, Chaetomium, for example, Ph.
  • the genus Thermotheromyces may be mentioned, but the present invention is not limited to this.
  • Examples of the family Chaetomium (Chaetomiaceae) include, but are not limited to, the genus Chaetomium (genus Chaetomium).
  • Examples of the order Sordariales include, but are not limited to, the genus Madurealla.
  • the present disclosure also includes a combination of domains constituting these LDHs.
  • microorganism classification is for convenience only, and specific microorganisms may be transferred from one classification to another. Also, one genus may be divided into two, or two genera may be integrated into one genus. Essential in the present disclosure are microorganisms that produce LDH, not necessarily modified academic names or classifications. Therefore, even if the scholarly classification of the above microorganisms is changed later, the above disclosure shall be judged based on the microbial classification at the time of filing of the present application. For example, if the family of the genus Madelara is not always clearly defined at the time of filing the application and the family is taxonomically determined after the filing, no matter which family it belongs to, Madurela is at the time of filing the application. Microorganisms belonging to the genus (Madurealla) shall be included in the genus (Madurealla) described above.
  • LDHs applicable to the methods of the present disclosure may have some of the other amino acid residues deleted or substituted in those exemplified above, as long as they have lactate dehydrogenase activity, and others. Amino acid residues may be added.
  • a gene encoding LDH obtained from LDH-producing organisms as exemplified above by a known genetic engineering method is used, and if necessary, it is partially modified and introduced into an appropriate host microorganism by various known methods.
  • the present disclosure can also be applied to recombinant LDH produced in the above-mentioned.
  • flavin-dependent lactate dehydrogenase As an example of LDH to which the present disclosure can be preferably applied, flavin-dependent lactate dehydrogenase, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10 or 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% thereof.
  • the region containing the amino acid sequence has low sequence identity and is of low importance in the reaction of lactic acid dehydrogenase with lactic acid. Therefore, among the full-length amino acid sequences, the amino acid sequence at positions 93 to 506 in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence at positions 97 to 502 in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence at positions 100 to 505 in SEQ ID NO: 7, and 99 in SEQ ID NO: 10.
  • a lactic acid dehydrogenase containing an amino acid sequence at position 503 or an amino acid sequence having 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more identity with the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of positions 1 to 92 in No. 1 the amino acid sequence of positions 1 to 96 in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of positions 1 to 99 in SEQ ID NO: 7, or the amino acid sequence of positions 1 to 98 in SEQ ID NO: 10. It suffices if the sequence identity is 45% or more, 50% or more, 60% or 70% or more, respectively, or this region may be deleted.
  • SEQ ID NO: 4 may be deleted.
  • methionine can be optionally added to the beginning of the sequence.
  • Pichia kudriavzevii-derived lactate dehydrogenase it is referred to as Pichia kudriavzevii-derived lactate dehydrogenase. The same applies to LDH derived from other microorganisms.
  • LDH generally has a signal sequence, a cytochrome domain and a catalytic domain. Since the signal sequence is usually cleaved and is not related to enzyme activity, it is not considered when comparing sequence identities unless otherwise specified. Cytochrome domains often have low sequence identity and are less important for lactate dehydrogenase to react with lactate. Therefore, when comparing sequence identities, cytochrome domains are not considered unless otherwise noted. However, this does not preclude LDH from containing cytochrome domains. In certain embodiments, LDH of the present disclosure has a cytochrome domain. In another embodiment, LDH of the present disclosure does not have a cytochrome domain or has only a partial sequence of cytochrome domains.
  • the present inventors have confirmed that the enzyme activity is exhibited even if the cytochrome domain is exchanged for LDHs of different origins. Therefore, with respect to LDH derived from the above-mentioned microorganisms, the catalytic domain from LDH derived from the first microorganism and the cytochrome domain from LDH derived from the second microorganism can also be linked.
  • the present disclosure includes such combinations and fusion proteins with respect to LDH derived from the above microorganisms.
  • the identity or similarity of the amino acid sequences can be found in GENETYX Ver. It can be calculated by a program such as maximum matching or search homology of 11 (manufactured by Genetics) or a program such as maximum matching or multiple alignment of DNASIS Pro (manufactured by Hitachi Solutions).
  • a program such as maximum matching or search homology of 11 (manufactured by Genetics) or a program such as maximum matching or multiple alignment of DNASIS Pro (manufactured by Hitachi Solutions).
  • the amino acid sequence identity when two or more LDHs are aligned, the positions of amino acids that are the same in the two or more LDHs can be examined. Based on this information, the same region in the amino acid sequence can be determined.
  • lactate dehydrogenase represented by SEQ ID NO: 4 138 to 140, 186 to 194, 217 to 222, 243 to 245, 271 to 278, 280 to 283, 355 to 367, 398.
  • the 401st position, the 403rd to the 406th position, the 425th to the 433rd position may correspond to the homology region.
  • the amino acid sequence in the homologous region of lactate dehydrogenase of the present disclosure is 75% or more, for example, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% with the amino acid sequence of the homologous region in SEQ ID NO: 4.
  • a known protein engineering method can be used based on the DNA information encoding each of them.
  • a method known as Site-Specific Mutagenesis can be generally used.
  • the Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Materials Enzymol., 154,350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)
  • the Eckstein method Nucleic Acids Res., 13, 8749). 1985: Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)
  • Kunkel method Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 82, 488 (1985).
  • the amino acid sequence of LDH may be modified artificially or randomly.
  • a conservative amino acid substitution may be introduced at a specific site.
  • Conservative amino acid substitution refers to the replacement of one amino acid residue with another amino acid residue having a similar side chain.
  • lysine, arginine, and histidine all have basic side chains.
  • aspartic acid and glutamic acid have acidic side chains.
  • glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine all have uncharged polar side chains.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan all have non-polar side chains.
  • threonine, valine, and isoleucine all have ⁇ -branched side chains.
  • tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine all have aromatic side chains. All of these can be subject to mutually conservative amino acid substitutions.
  • LDH's active center residues, residues involved in substrate recognition, residues that interact with coenzymes, etc. are important for the functioning of LDH.
  • Amino acid residues may or may not be substituted.
  • Amino acid residues and sequence motifs important for the function of LDH are known, and when SEQ ID NO: 1 is used as a reference, for example, tyrosine at position 139, tyrosine at position 249, histidine at position 368, and arginine at position 371. Includes alanine at position 193 and leucine at position 225 (see, eg, Biochem., 39, 3266-3275, 2000). These positions and motif sequences do not have to be replaced.
  • amino acid substitutions can be performed multiple times in batch units. For example, 1-5 or 1-10 artificial amino acid substitutions may be introduced into LDH as the first round. Then, optionally, 1-5 or 1-10 random amino acid substitutions can be introduced into LDH. This can be repeated multiple times.
  • LDH having different sequences at 60 or more, 70 or more, 80 or more, 90 or more, 100 or more, 110 or more, 120 or more, 130 or more, 140 or more, for example, 150 or more.
  • the mutant can be easily prepared by repeating the conventional method.
  • artificial amino acid substitutions and random amino acid substitutions may be introduced into a specific region of LDH as the first set, which may be repeated once or multiple times. Then, after confirming that the LDH mutant has activity, amino acid substitutions may be introduced once or multiple times into another region of LDH as a second set.
  • LDH can also be subjected to high-throughput screening to obtain functional variants.
  • a library of transformed or transduced strains carrying the mutated LDH gene may be prepared and used for high-throughput screening based on microtiter plates, or for ultra-high-throughput screening based on droplet microfluidics. May be served. Examples include constructing a combinatorial library of mutant genes encoding variants, followed by phage display (eg Chem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005), yeast display (eg Comb Chem High Throughput Screen. 2008;).
  • the library can be used to transform suitable cells, such as electrical competent EBY-100 cells, to obtain approximately 10-7 variants (10 7 ). By repeating this 10 times, a mutant of about 10 8th power can be obtained (10 8 ). Yeast cells transformed in the library can then be subjected to cell sorting. Polydimethoxylsiloxane (PDMS) microfluidic devices made using standard soft lithography methods may be used. A flow focus device can be used to form monodisperse droplets. The formed droplets containing the individual variants can be delivered to a suitable sorting device. The presence or absence of dehydrogenase activity can be used when selecting cells. Mutation introduction and selection may be repeated multiple times.
  • suitable cells such as electrical competent EBY-100 cells
  • LDH to which this disclosure is applicable is available based on publicly known literature. For example, by culturing the above-mentioned LDH-producing-derived microorganism, or by directly or after mutating the gene encoding natural LDH, it is inserted into an appropriate expression vector and an appropriate host (for example, Escherichia coli). , Yeast, Aspergillus) is cultured, the cells are recovered from the culture solution by centrifugation or the like, and then LDH is collected from the culture.
  • an appropriate host for example, Escherichia coli
  • the medium for culturing the host cells for example, one or more nitrogen sources such as yeast extract, trypton, peptone, meat extract, corn steep liquor, or soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, and monopotassium phosphate.
  • nitrogen sources such as yeast extract, trypton, peptone, meat extract, corn steep liquor, or soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, and monopotassium phosphate.
  • inorganic salts such as dipotassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferrous sulfate or manganese sulfate were added, and if necessary, sugar raw materials, vitamins and the like were added as appropriate. Things are used.
  • the initial pH of the medium is not limited, but can be adjusted to, for example, pH 6-9.
  • the culture is carried out at a culture temperature of 10 to 42 ° C., preferably a culture temperature of about 25 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably a culture temperature of about 25 ° C. for 4 to 8 hours, aeration-stirred deep culture, shaking culture, and standing. It may be carried out by culturing or the like.
  • LDH is collected from the culture.
  • a usual known enzyme collecting means may be used.
  • the cells are subjected to ultrasonic destruction treatment, grinding treatment, etc. by a conventional method, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or the bacillus is shaken or left to stand in the presence of toluene or the like. This enzyme can be excreted from the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate, etc., and then ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added thereto. Fractionate, and the precipitate is collected to obtain the crude enzyme of LDH.
  • the crude enzyme of LDH can be further purified by any known means.
  • a purified enzyme preparation for example, a gel filtration method using Sephadex, Ultrogel, biogel, etc.; an adsorption elution method using an ion exchanger; an electrophoresis method using a polyacrylamide gel, etc.; an adsorption method using hydroxyapatite. Elution method; Precipitation method such as vine sugar density gradient centrifugation method; Affinity chromatography method; Fractionation method using molecular sieve membrane or hollow yarn membrane, etc. was appropriately selected, or purified by carrying out a combination thereof.
  • the LDH enzyme preparation of the present disclosure can be obtained.
  • the expressed LDH can be secreted directly into the culture medium.
  • the concentration of LDH in the present disclosure is not particularly limited, but in solution, it is preferably 0.01 to 1,000 U / mL, more preferably 0.1 to 100 U / mL, and even more preferably 0. It is 1 to 10 U / mL.
  • a similar concentration is desirable even in powder or lyophilized products, but for the purpose of preparing powdered specimens, the concentration can be 100 U / mL or more.
  • the composition containing LDH of the present disclosure can be provided in a liquid state, but can be pulverized by freeze-drying, vacuum-drying, spray-drying or the like.
  • the composition of the buffer solution used for the extraction / purification / powdering of LDH and the stability test is not particularly limited, but is preferably one having a buffering capacity in the pH range of 4 to 9, for example, boric acid, tris hydrochloride, and the like.
  • Known commercially available buffers such as potassium phosphate and commercially available good products such as BES, Bicine, Bis-Tris, CHES, EPPS, HEPES, HEPPSO, MES, MOPS, MOPSO, PIPES, POPSO, TAPS, TAPSO, TES and Tricine.
  • buffers As the buffering agent as described above, any one type may be used, or two or more types may be used.
  • concentration of the buffering agent is not particularly limited as long as it has the required buffering capacity, but a preferable upper limit is 100 mM or less, more preferably 50 mM or less.
  • the preferred lower limit is 5 mM or more.
  • the content of the buffer in the powder or freeze-dried product is not particularly limited, but is preferably 0.1% (weight ratio) or more, and particularly preferably 0.1 to 30% (weight ratio). Used in range.
  • the present disclosure provides a method of screening a stabilizer that improves the stability of LDH.
  • This method i) The process of preparing LDH, ii) A step of heat-treating LDH at 35 to 70 ° C. for 5 to 60 minutes. iii) After the above ii), the step of determining the residual activity of LDH, iv) In ii), the step of determining the residual activity of LDH after heat-treating LDH instead of LDH alone in the presence of a candidate substance, and v) It may include a step of comparing the residual activity in iii) with the residual activity in the presence of the candidate substance in iv). When the residual activity in the presence of the candidate substance in iv) is increased more than the residual activity in iii), the candidate substance can be a stabilizer that improves the stability of LDH.
  • composition containing LDH By coexisting various stabilizers that improve the stability of LDH as described above with LDH, a composition with improved stability of LDH can be produced.
  • the composition containing the enzyme of the present disclosure is not limited to the freeze-dried product, and may be in a solution state in which the dried product is redissolved.
  • LDH and various stabilizers may coexist by any method. For example, when both are in a solution state, a composition can be produced by mixing them, and when both are in a powder state, they are mixed in a powder state to produce a composition. be able to. It is also possible to powder LDH and add a stabilizer in the subsequent granulation step. Further, a plurality of kinds of stabilizers can be coexisted in a part in the LDH manufacturing process and the rest in the preparation step of the lactate measuring reagent or the immobilization step on the lactate sensor.
  • the present disclosure provides a method of making a composition containing LDH.
  • This method i) The process of preparing LDH, ii) A step of heat-treating LDH at 35 to 70 ° C. for 5 to 60 minutes. iii) After the above ii), the step of determining the residual activity of LDH, iv) In ii), the step of determining the residual activity of LDH after heat-treating LDH in the presence of a candidate substance instead of LDH alone. v) The step of comparing the residual activity in iii) with the residual activity in the presence of the candidate substance in iv). vi) When the residual activity in the presence of the candidate substance in iv) is higher than the residual activity in iii) above, the composition is improved in the stability of LDH by coexisting the candidate substance with LDH.
  • the process of manufacturing things May include.
  • the present disclosure provides a method for suppressing a decrease in activity or inactivation of lactate dehydrogenase in a method for producing an electrode, which comprises a step of applying lactate dehydrogenase to the electrode.
  • This method i) Steps to prepare a solution containing lactate dehydrogenase, ii) An anion, monosaccharide, disaccharide, polyethylene glycol selected from the group consisting of monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, tricarboxylic acid, tetracarboxylic acid, polycarboxylic acid, phosphoric acid, sulfuric acid or salts thereof in the solution.
  • a step of applying a solution containing the lactate dehydrogenase and the stabilizer to the electrode, iv) The step of drying the applied solution, May include.
  • the electrode coated with lactate dehydrogenase may be included in the lactate sensor.
  • the mediator when the LDH is used immobilized on an electrode or when the LDH is used without immobilization, the mediator is known as a mediator such as 1-methoxy-5-methylphenazinenium methylsulfate (mPMS).
  • mPMS 1-methoxy-5-methylphenazinenium methylsulfate
  • Luthenium complexes such as hexaammine ruthenium, osmium complexes such as osmium-2,2'-bipyridine, and phenylenediamine compounds such as p-phenylenediamine and N-isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine can be used. ..
  • these mediators can also be used after being modified with a polymer such as polyvinyl imidazole, polyethyleneimine, or polyacrylic acid. Further, these mediators can also be immobilized on GDH using a cross-linking reagent or the like. All of these are incorporated herein by reference. Further, these mediators can also be immobilized on the electrode after the surface of the electrode is activated by acid treatment or the like. Materials such as carbon, gold, and platinum can be used for the electrodes.
  • the final concentration of the mediator added to the sample solution is not particularly limited, and is, for example, 1 pM to 1 M, 1 pM to 100 mM, 1 pM to 20 mM, 1 pM to 10 mM, 1 pM to 5 mM, 2 pM to 1 mM, 3 pM to 800 ⁇ M, 4 pM to 600 ⁇ M, 5 pM. It can be in the range of ⁇ 500 ⁇ M, 6 pM to 400 ⁇ M, 7 pM to 300 ⁇ M, 8 pM to 200 ⁇ M, 9 pM to 100 ⁇ M, 10 pM to 50 ⁇ M.
  • the order of addition of the mediator and other reagents is not limited, and simultaneous or sequential addition may be used.
  • composition containing LDH of the present disclosure a reagent for measuring lactic acid, a lactic acid assay kit, and a lactic acid sensor having improved stability of LDH can be produced, and lactic acid can be measured using the reagent. ..
  • the reagents for measuring lactate of the present disclosure typically include reagents necessary for measurement such as LDH, buffer solution, mediator, lactate standard solution for preparing a calibration curve, and instructions for use to improve the stability of LDH. Contains stabilizers that contribute to the improvement.
  • the reagent for measuring lactate of the present disclosure can be provided, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • the lactic acid measuring reagent of the present disclosure can measure lactic acid in the same manner as the conventional lactic acid measuring reagent, and the stability of LDH is improved when the lactic acid measuring reagent of the present disclosure is used. Therefore, the reagent for measuring lactate of the present disclosure exhibits better thermal stability and storage stability.
  • the lactate assay kits of the present disclosure typically include a sufficient amount of LDH for at least one lactate measurement and the buffer, mediator, and lactate standard solution for making the calibration curve required for the assay. Contains a stabilizer that contributes to improving the stability of LDH.
  • the lactate assay kit of the present disclosure can measure lactate in the same manner as the conventional lactate assay kit, and the stability of LDH is improved when the lactate assay kit of the present disclosure is used.
  • the kits for lactate assays of the present disclosure exhibit better thermal and storage stability.
  • the present disclosure also provides a lactate sensor with improved thermal stability of LDH.
  • the sensor has electrodes.
  • the sensor has a working electrode and a counter electrode as electrodes.
  • the sensor has a working electrode, a counter electrode and a reference electrode as electrodes.
  • LDH is immobilized on an electrode.
  • a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like can be used, and the enzyme of the present disclosure can be immobilized on the electrode.
  • Immobilization methods include a method using a cross-linking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a method of using a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, an oxidation-reduced polymer, or the like, or together with a mediator. It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode, or these may be used in combination. Typically, LDH of the present disclosure is immobilized on a carbon electrode with glutaraldehyde and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the composition or reagent containing the stabilizer of the present disclosure can be used for various electrochemical measurements using a potentiostat, a galvanostat, or the like, together with an electrode on which LDH is immobilized, an enzyme sensor, or the like.
  • Electrochemical measurement methods include various methods such as amperometry such as chronoamperometry, potential step chronoamperometry, voltammetry such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, potentialometry and coulometry.
  • amperometry such as chronoamperometry, potential step chronoamperometry, voltammetry such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, potentialometry and coulometry.
  • the lactic acid concentration in a sample can be calculated by measuring the current when lactic acid is reduced by the amperometry method.
  • the applied voltage may be, for example, -1,000 mV to +1,000 mV (vs. Ag / AgCl), although it depends on the conditions and the setting of the
  • Electrodes can be formed on an insulating substrate. Specifically, electrodes can be formed on a substrate by a photolithography technique or a printing technique such as screen printing, gravure printing, or flexographic printing. Examples of the material of the insulating substrate include silicon, glass, ceramic, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyester and the like, and those having strong resistance to various solvents and chemicals can be used. Further, carbon cloth, carbon paper, or buckypaper can be used as the base of the electrode. The area of the working electrode can be set according to the desired response current.
  • the area of the working electrode is 1 mm 2 or more, 1.5 mm 2 or more, 2 mm 2 or more, 2.5 mm 2 or more, 3 mm 2 or more, 4 mm 2 or more, 5 mm 2 or more, 6 mm 2 or more, 7 mm 2 or more, 8 mm. 2 or more, 9 mm 2 or more, 10 mm 2 or more, 12 mm 2 or more, 15 mm 2 or more, 20 mm 2 or more, 30 mm 2 or more, 40 mm 2 or more, 50 mm 2 or more, 1 cm 2 or more, 2 cm 2 or more, 3 cm 2 or more, 4 cm 2 or more , 5 cm 2 or more, for example 10 cm 2 or more.
  • the area of the working electrode can be 10 cm 2 or less, 5 cm 2 or less, for example 1 cm 2 or less.
  • the opposite pole can be similar.
  • carbon nanotubes, graphene, Ketjen black, etc. can be immobilized on the working surface to increase the apparent surface area.
  • the apparent area can be increased by 10 times or more, 50 times or more, 100 times or more, and 1000 times or more.
  • the lactic acid concentration can be measured by chronoamperometry, for example, as follows. Put buffer in a constant temperature cell and add mediator to keep it at a constant temperature. As the working electrode, the LDH-immobilized electrode of the present disclosure is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used. A constant voltage is applied to the carbon electrode, and after the current becomes steady, a sample containing lactic acid is added and the increase in current is measured. The lactic acid concentration in the sample can be calculated according to the calibration curve prepared with the standard concentration lactic acid solution.
  • a counter electrode for example, a platinum electrode
  • a reference electrode for example, Ag / AgCl electrode
  • the lactic acid sensor of the present disclosure can measure lactic acid by using the same as the conventional lactic acid sensor, and when the lactic acid sensor of the present disclosure is used, the stability of LDH is improved.
  • the kit for the lactate sensor shows better thermal stability and storage stability. Further, also in the step of immobilizing LDH on the sensor, the degree of deactivation due to heat at the time of immobilization can be reduced, so that the amount of LDH used for immobilization can be reduced.
  • the present disclosure provides an anode electrode comprising an LDH composition with improved thermal stability.
  • LDH may be immobilized on an electrode of the battery.
  • the anode electrodes of the present disclosure can provide a battery in combination with a cathode electrode and a resistor.
  • the present disclosure provides a power generation method using the above-mentioned battery.
  • a battery comprising the LDH composition with improved thermal stability of the present disclosure is provided.
  • the present disclosure provides an anode or cathode for a fuel cell and a fuel cell comprising the anode or cathode.
  • This fuel cell contains the LDH composition with improved thermal stability of the present disclosure.
  • the present disclosure relates to a power generation method using a battery containing the LDH composition having improved thermal stability, as well as an LDH immobilized on an anode electrode and fueled with a substrate corresponding to the LDH, for example, lactic acid. And provide a method of generating electricity.
  • the fuel cell of the present disclosure comprises an anode, a fuel tank, a cathode, and an electrolyte containing the LDH composition with improved thermal stability described above.
  • An artificial electron mediator may be adsorbed on the anode or cathode.
  • the artificial electronic mediator include, but are not limited to, the known mediators described above and the phenylenediamine compounds described in Japanese Patent No. 6484741 and Japanese Patent No. 6484742.
  • the fuel cell of the present disclosure can arrange a load resistance between the anode and the cathode, if necessary, and can be provided with wiring for that purpose. In certain embodiments, the load resistance is part of the fuel cell of the present disclosure.
  • the load resistance is not part of the fuel cell of the present disclosure, and the fuel cell of the present disclosure is configured to be connectable to a suitable load resistance.
  • oxidoreductase forms part of the anode.
  • the redox enzyme may be in close proximity to or in contact with the anode, may be immobilized, or may be adsorbed.
  • the fuel tank contains a compound that serves as a substrate for oxidoreductase immobilized on an electrode.
  • the fuel cell of the present disclosure may have an ion exchange membrane that separates the anode and cathode. The ion exchange membrane can have pores of 1 nm to 20 nm.
  • the anode can be a common electrode such as a carbon electrode.
  • a common electrode such as a carbon electrode.
  • an electrode made of a conductive carbon substance such as carbon black, graphite, or activated carbon, or an electrode made of a metal such as gold or platinum can be used. Specific examples thereof include carbon paper, carbon cloth, glassy carbon, and HOPG (highly oriented pyrolytic graphite).
  • an electrode catalyst generally used in a fuel cell such as platinum or platinum alloy is used as a carbonaceous material such as carbon black, graphite or activated carbon, or a conductive material made of gold, platinum or the like.
  • an electrode carried on the body or a conductor made of an electrode catalyst itself such as platinum or a platinum alloy as a cathode electrode, and supply an oxidizing agent (catalyst side substrate, oxygen, etc.) to the electrode catalyst. can.
  • a substrate-reducing enzyme electrode can be used as a cathode paired with an anode composed of the substrate-oxidizing enzyme electrode as described above.
  • the redox enzyme that reduces the oxidizing agent include known enzymes such as laccase and bilirubin oxidase.
  • a known electron transfer mediator may be used, if necessary.
  • the oxidizing agent include oxygen and the like.
  • an oxygen-selective membrane eg, a dimethylpolysiloxane membrane
  • impurities such as ascorbic acid and uric acid
  • the power generation method of the present disclosure includes a step of supplying a compound serving as a substrate for oxidoreductase as a fuel to an anode having oxidoreductase.
  • a compound serving as a substrate for oxidoreductase as a fuel to an anode having oxidoreductase.
  • the substrate is oxidized and the electrons generated at the same time are generated by the oxidoreductase, which is an electron transfer mediator that mediates the electron transfer between the oxidoreductase and the electrode, for example, phenylene. It is transferred to a diamine-based compound, and electrons are transferred to a conductive substrate (anode electrode) by the electron transfer mediator.
  • An electric current is generated when electrons reach the cathode electrode from the anode electrode through wiring (external circuit).
  • the protons (H + ) generated in the above process move in the electrolyte solution to the cathode electrode. Then, at the cathode electrode, the protons that have moved from the anode in the electrolyte solution, the electrons that have moved from the anode side through the external circuit, and the oxidizing agent (cathode side substrate) such as oxygen and hydrogen peroxide react with each other. Water is produced. This can be used to generate electricity.
  • a DNA construct was prepared by inserting the ScLDH gene, which is the target gene, into the multi-cloning site of the plasmid pKK223-3 by a conventional method. Specifically, at the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pKK223-3, the ScLDH gene is ligated according to the plasmid attached to the kit using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech). Then, a plasmid for expression (pKK223-3-ScLDH) was obtained.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with these plasmids, and Escherichia coli JM109 (pKK223-3-ScLDH) strain was cultivated in 3 mL of LB-amp medium [1% (w / v) bactotripton, 0.5% (w). / V) Peptone, 0.5% (w / v) NaCl, 50 ⁇ g / mL ampicillin] was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours with shaking to obtain a culture. The culture was collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 1 minute to obtain bacterial cells. From this cell, a recombinant plasmid pKK223-3-ScLDH was obtained using GenElute Plasmamid Miniprep Kit (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • SEQ ID NO: 3 which is the amino acid sequence of Pichia kudriavzevii-derived lactic acid dehydrogenase (PkLDH)
  • PkLDH Pichia kudriavzevii-derived lactic acid dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 6 which is the amino acid sequence of Candida inconspica-derived lactic acid dehydrogenase (CaLDH)
  • SEQ ID NO: 7 the 505 amino acid represented by SEQ ID NO: 7 from which the 2-67 position has been removed is encoded by SEQ ID NO: 8.
  • the 1518 bp gene (including the stop codon TAA) shown in (1) was obtained as double-stranded DNA by PCR of a gene fragment, which is a routine method.
  • SEQ ID NO: 9 which is the amino acid sequence of Ogataea parapolymorpha-derived lactic acid dehydrogenase (OgLDH)
  • SEQ ID NO: 10 the 503 amino acids represented by SEQ ID NO: 10 with the 2-56 position removed are encoded by SEQ ID NO: 11.
  • the 1512 bp gene (including the stop codon TAA) shown in (1) was obtained as double-stranded DNA by PCR of a gene fragment, which is a routine method.
  • the target gene was inserted into the multi-cloning site of the plasmid pKK223-3 by a conventional method in the same manner as when preparing the plasmid for ScLDH expression, and the recombinant plasmids pKK223-3-PkLDH and pKK223-3-3 were inserted. CalDH and pKK223-3-OgLDH were obtained, respectively.
  • Escherichia coli BL21 strain was used as an LDH-producing bacterium.
  • Escherichia coli BL21 (pKK223-3-ScLDH) strain cultivated with pKK223-3-ScLDH was prepared by poking colonies of the strain previously cultured on an LB plate medium (containing 100 ⁇ g / mL ampicillin) with a pinch, and 2 mL (100 ⁇ g) of the LB medium. In a small test tube containing / mL ampicillin), the cells were shake-cultured at 25 ° C. and 160 rpm for 24 hours.
  • This culture medium is transferred to a 0.5 L Sakaguchi flask containing 250 mL of LB medium (50 ⁇ g / mL ampicillin, 1 mM isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (hereinafter referred to as IPTG)), and transferred to a 0.5 L volume Sakaguchi flask at 25 ° C. and 130 rpm for 30 hours. It was shake-cultured. Similarly, the Escherichia coli BL21 (pKK223-3-PkLDH) strain transduced with pKK223-3-PkLDH is shaken overnight at 30 ° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • Escherichia coli BL21 (pKK223-3-CaLDH) strain and Escherichia coli BL21 (pKK223-3-OgLDH) strain transduced with pKK223-3-CaLDH or pKK223-3-OgLDH were added to 2 mL (100 ⁇ g / mL ampicillin) of LB medium. ) was placed in a small test tube and cultured at 30 ° C. and 160 rpm with shaking overnight. The entire volume of this culture solution was transferred to a 0.5 L Sakaguchi flask containing 250 mL of LB medium (50 ⁇ g / mL ampicillin, 1 mM IPTG), and cultured at 30 ° C. and 130 rpm for 30 hours with shaking.
  • the culture solution was centrifuged at 6,000 rpm at 25 ° C. for 5 minutes to remove the supernatant, and the cells were collected. Then, the obtained cells were suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). The above cell suspension was ultrasonically crushed using an ultrasonic homogenizer US-150E (manufactured by Nissei Tokyo Office) until the suspension became translucent, and the distance was 10 minutes at 9,000 rpm and 4 ° C. The supernatant was collected with care. Anion exchange chromatography purification was performed on the supernatant of the cell disruption solution containing various LDHs excluding ScLDH.
  • a supernatant containing various LDHs was added to the resin to 10 mL of Q Sepharose Fast Flow (manufactured by Cytiva) equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). .. Next, 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0 to 500 mM NaCl was added, and a fraction having high LDH activity was recovered. The resulting fraction showing LDH activity was concentrated using Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel®-30K.
  • each of the recovered fractions was equilibrated with a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0 for PkLDH, pH 7.5 for CalDH and OgLDH) containing 150 mM sodium chloride, and the HiRoad 26/600 Superdex 200 pg column (Cytiva) was used.
  • the obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE, and the fraction showing a single band and showing LDH activity was recovered and used as a purified sample of various LDH.
  • the residual activity rate (%) with and without the addition of the LDH stabilizer is compared according to the above-mentioned method for evaluating the thermal stability of LDH. I searched for.
  • the thermal stability of LDH was evaluated by heating LDH at a predetermined temperature for a predetermined time and comparing the activities before and after heating. Specifically, a 150 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.15% (w / v) bovine serum albumin as a final concentration containing LDH was allowed to stand on ice at a predetermined temperature (for example, 45).
  • LDH activity was measured.
  • the LDH activity of the LDH solution that had been left to stand on ice without heat treatment was measured, the activity of the LDH solution after heating was calculated with the activity as 100, and the residual activity rate (%) was measured. .. Specifically, the residual activity rate (%) is measured by measuring the LDH activity value (a) of the solution before heat treatment or long-term storage and the LDH activity value (b) after heat treatment or long-term storage, respectively (((). b) / (a) ⁇ 100) was calculated.
  • LDH activity was measured according to the following procedure. 1M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 170 ⁇ L, 50 mM DL-lactic acid (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number 128-00056) 300 ⁇ L and 1.8 mM DCIP solution 250 ⁇ L, ultrapure water 680 ⁇ L were mixed. It was kept warm at 37 ° C. for 2 minutes or more.
  • 1.5 is the solution volume (mL) of the reaction reagent + enzyme reagent
  • 6.8 is the mmol molecular absorbance coefficient of DCIP (mM -1 cm -1 ) under the present activity measurement conditions
  • 0.05 is the enzyme.
  • Solution volume (mL) 1.0 is cell optical path length (cm)
  • ⁇ A 520 blank is 0.15% (w / v) bovine serum albumin-containing 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • Is added instead of the enzyme sample solution to start the reaction the amount of decrease in absorbance at 520 nm per minute, and Df represents the dilution factor.
  • an LDH solution (2 U / mL) containing 150 mM potassium phosphate buffer, 300 mM various compounds and 0.15% (w / v) bovine serum albumin (BSA) was used. , The residual activity rate of LDH was calculated. The pH of the PkLDH solution was adjusted to 7.5 after the addition of various compounds. The heat treatment was performed at 55 ° C. for 15 minutes. As a comparative example, the same test was conducted even when an LDH solution prepared without adding various compounds was used. Unless otherwise specified, the reagents purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. were used thereafter.
  • L- (+)-tartaric acid was added.
  • Table 2 LDH is stable when D-malic acid, DL-3-hydroxyaspartic acid, oxaloacetate, D- (-)-tartaric acid, and L- (+)-tartaric acid are added. It became clear that the sex was improved.
  • the active residual rate (%) without compound addition is 30%.
  • the activity residual rate (%) exceeded 50%, and high stability was confirmed.
  • DL-3-hydroxyaspartic acid, DL-leucine acid, and DL-phenyllactic acid had active residual rates (%) of 77%, 92%, and 87%, respectively. That is, the addition of DL-3-hydroxyaspartic acid, DL-leucine acid, and DL-phenyllactic acid revealed a remarkably high effect of improving the stability of LDH.
  • the heat treatment was carried out at 50 ° C. for 15 minutes.
  • an LDH solution prepared without adding various compounds containing 150 mM potassium phosphate buffer, 0.15% (w / v) BSA adjusted to pH 7.5
  • the test was conducted in the same manner.
  • the effect of improving the stability of LDH by maltose monohydrate was 5%
  • the effect of improving the stability of LDH by ethylenediaminetetraacetic acid was 56%. That is, it was clarified that the thermal stability of LDH was improved by adding maltose monohydrate or ethylenediaminetetraacetic acid.
  • the heat treatment was carried out at 50 ° C. for 15 minutes.
  • an LDH solution prepared without adding various compounds containing 150 mM potassium phosphate buffer, 0.15% (w / v) BSA adjusted to pH 7.5
  • the test was conducted in the same manner.
  • glycine has an effect of improving the stability of LDH by 11%
  • L-lysine hydrochloride has an effect of improving the stability of LDH by 66%
  • L-histidine has an effect of improving the stability of LDH by 27%
  • disodium malonate has an effect of improving the stability of LDH.
  • the effect of improving the stability of LDH was 96%.
  • the heat treatment was carried out at 40 ° C. for 15 minutes.
  • an LDH solution prepared without adding various compounds containing 150 mM potassium phosphate buffer, 0.15% (w / v) BSA adjusted to pH 7.5
  • the test was conducted in the same manner.
  • the effect of improving the stability of ScLDH by L-malic acid was 41%
  • the effect of improving the stability of ScLDH by disodium malonate was 26%
  • the effect of improving the stability of LDH by ammonium sulfate was 24%. That is, it was clarified that the thermal stability of ScLDH was improved by adding L-malic acid, disodium malonic acid, and ammonium sulfate as well as PkLDH, CaldH, and OgLDH.
  • the active residual rate (%) without compound addition is 27%, whereas the active residual rate (%) exceeds 70%, and the stability is remarkably high.
  • stabilizers found so far such as L-malic acid and disodium malonic acid, exert a stabilizing effect not only in the phosphate buffer solution but also when added to the HEPES buffer solution, and the buffer solution has a stabilizing effect. It was found to be effective as a stabilizer regardless of the type. This suggests that the various compounds found above that contribute to the improvement of stabilization can exert an effect regardless of the type of buffer solution.
  • the degree of the effect of improving the stability of LDH by adding various stabilizers is the condition that the residual activity rate (%) of LDH after addition of various stabilizers is measured and the stabilizer is not added. It was evaluated by comparing with the residual activity rate (%) in. Specifically, the relative value of the residual activity rate under the condition of adding the stabilizer when the residual activity rate when the stabilizer for comparison is not added is 100 is calculated, and this is more than 100. Larger ones were evaluated as having the effect of improving stability. For example, when the residual activity rate under the condition without the stabilizer to be compared is 30% and the residual activity rate under the condition with the stabilizer added is 45%, the relative value of the residual activity is 150. Will be.
  • the stability of LDH was improved when sodium hyaluronate, methyl glycol chitosan, sodium carboxymethyl cellulose, and poly (diallyldimethylammonium chloride) were added (Table 7).
  • the polymer that can function as a stabilizer may have any structure as long as the functional group of the side chain has an anionic substance such as a carboxy group or a cationic substance such as an amino group. It is suggested that it exerts a stabilizing effect regardless of the structure.
  • the prepared electrode was connected to the ALS electrochemical analyzer 814D (manufactured by BAS) using a dedicated connector (DRP-CAC, manufactured by Drop Sense). Next, 100 ⁇ L of 2 mM mPMS / PBS solution was added dropwise to dissolve the dried LDH. The applied voltage was +200 mV (vs Ag / Ag + ). A solution of L-sodium lactate was added, and the response current value 5 seconds after the start of measurement was recorded. As a result, as shown in Table 8, when any of the compounds was added, the current value was larger than that when the compound was not added.
  • LDH exhibits sufficient activity even when it coexists with the compound added when reacting with 0 to 10 mM lactic acid on the electrode. Although not shown in the table, the LDH stability improving effect was confirmed even when 10 mM of lactic acid was present, as in the case of 5 mM of lactic acid.
  • SEQ ID NO: 1 Lactate dehydrogenase (ScLDH) derived from Saccharomyces cerevisiae (however, wild-type positions 1 to 85 are removed)
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of lactic acid dehydrogenase (PkLDH) derived from Pichia kudriavzevii
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 3 from which the sequence at positions 2 to 77 of SEQ ID NO: 3 has been removed.
  • Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of 4 SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of lactic acid dehydrogenase (CaLDH) derived from Candida inconspica SEQ ID NO: 7 Sequence No. 6 from which positions 2 to 67 have been removed SEQ ID NO: 8 Encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • Nucleotide sequence SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of lactic acid dehydrogenase (OgLDH) derived from Ogataea parapolymorpha SEQ ID NO: 10 Sequence No. 9 from which positions 2 to 56 have been removed SEQ ID NO: 11 Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を含む組成物の熱安定性を向上させる方法を提供する。　ＬＤＨを含む組成物において、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、非イオン性ポリマー、イオン性ポリマーを１種類以上共存させる。　乳酸測定試薬、乳酸アッセイキット、乳酸センサー、燃料電池作製時および保存時におけるＬＤＨの失活を低減でき、ＬＤＨの使用量を低減できるとともに、測定試薬、アッセイキット、センサーの熱安定性や保存安定性の向上および測定精度の向上が可能となる。

Description

フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
　本開示は、フラビン依存性デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法および該方法を用いて得られる組成物に関する。
　血中乳酸濃度や汗中乳酸濃度は、疲労や身体状態を反映するマーカーとして知られている。乳酸は主要代謝産物であり、健康管理の指標のみならず、重篤な病気および／または外科患者を含む健康評価にとって重要であることが認識されており、体液中の乳酸値は循環不全、肝障害などの種々の病態に対する指標となり得る。乳酸監視は、敗血症、低酸素症、および癌組織の存在を検出するために使用され得る（非特許文献１）。
　疾病状態のヒトに限らない体調管理の目的に関しても、スポーツ選手や日常的に運動することに関心の高い人が行うトレーニングの適切性をモニタリングするための一指標として、乳酸監視が行われている（非特許文献２）。
　また、乳酸を基質とする酵素としては、フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨ）が知られている。非特許文献３には、これまでに知られているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＤＨは、安定性に課題があることが記載されている。なお、乳酸デヒドロゲナーゼには、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性乳酸デヒドロゲナーゼも知られているが、これはフラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に含まれない。したがって、本明細書において、フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、或いはＬＤＨというとき、特に断らない限りこれはニコチンアミド依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含まないものとする。
日本版敗血症診療ガイドライン２０１６、ＰＮＡＳ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１５，　２０１５，　１１２　（３７），　１１６４２－１１６４７ スポーツパフォーマンス研究，３，３１－４８，　２０１１ Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５３，２３８－５６，１９７８
　本開示は、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上する方法および該方法を用いて得られる充分な安定性を有する乳酸測定用組成物を提供することを目的とする。また、特定の実施形態において本開示は、ＬＤＨを電極に塗布する際の、乳酸デヒドロゲナーゼの活性低下又は失活を抑制する方法を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本開示者らは鋭意検討を重ねた結果、ＬＤＨを含む組成物において種々の化合物を共存させることにより、ＬＤＨの安定性が向上することを見出し、さらに、電極に塗布するＬＤＨの失活を抑制することができることを見出し、これらの実施形態を包含する本開示を完成した。
　すなわち、本開示は以下の実施形態を提供する。
[１]　フラビン化合物を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物に、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩（硫酸アンモニウムを除く）からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、若しくはイオン性ポリマーを１種類以上共存させる工程を含む、乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
[２]　乳酸デヒドロゲナーゼが、サッカロマイセス属、ピキア属、カンディダ属、オガタエア属、ブレタノマイセス属、シベルリンドネラ属、ハンセニアスポラ属、カザツタニア属、クルイウェロマイセス属、ラチャンセア属、ナウモヴォジマ属、テトラピシスポラ属、トルラスポラ属、ヴァンデルワルトジマ属、ジゴサッカロマイセス属、ジゴトルラスポラ属、ミセリオフトラ属、サーモセロマイセエス属、カエトミウム属、又はマドゥレラ属由来の乳酸デヒドロゲナーゼである、１に記載の方法。
[３]　乳酸デヒドロゲナーゼが以下の（ｉ）及び／または（ｉｉ）である、１に記載の乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法、
（ｉ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列との同一性が７０％以上又は８０％以上のアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼ、
（ｉｉ）配列番号４の第１３８～１４０位、１８６～１９４位、２１７～２２２位、２４３～２４５位、２７１～２７８位、２８０～２８３位、３５５～３６７位、３９８～４０１位、４０３～４０６位及び４２５～４３３位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該乳酸デヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが８０％以上又は９０％以上の配列同一性を有する乳酸デヒドロゲナーゼ。
[４]　モノカルボン酸がグルコン酸、ロイシン酸、３－フェニル乳酸、グリシン、リジン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群より選択され、
　ジカルボン酸がリンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、メチルマロン酸、オキサロ酢酸、酒石酸、シュウ酸、スクシン酸、グルタル酸、α－ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、タルトロン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３－３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、及び３－ヒドロキシアスパラギンからなる群より選択され、
　トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３－プロパントリカルボン酸、及び２－ホスホノブタン－１，２，４－トリカルボン酸からなる群より選択され、
　テトラカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸から選択され、
　リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、
　硫酸が硫酸塩から選択され、
　単糖がmyo-イノシトールからなる群より選択され、
　二糖がスクロース、トレハロース、及びマルトースからなる群より選択され、又は
　ポリエチレングリコール、
又は
　イオン性ポリマーがアニオン性ポリマーであるか、若しくはカチオン性ポリマーであり、
　アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ヒアルロン酸、及びカルボキシメチルセルロース若しくはこれらの塩からなる群より選択されるか、若しくは、
　カチオン性ポリマーがポリリジン、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、及びポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)から選択される、１～３のいずれかに記載の乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
[５]　モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、アニオン性ポリマー若しくはカチオン性ポリマーが溶液中において、０．０１重量％から３０重量％の範囲で含む、１～４のいずれかに記載の乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
[６]　フラビン化合物を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼ及び、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩（硫酸アンモニウムを除く）からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、イオン性ポリマーのいずれか１種類以上の化合物を含む乳酸測定用組成物。
[７]　乳酸デヒドロゲナーゼが、サッカロマイセス属、ピキア属、カンディダ属、オガタエア属、ブレタノマイセス属、シベルリンドネラ属、ハンセニアスポラ属、カザツタニア属、クルイウェロマイセス属、ラチャンセア属、ナウモヴォジマ属、テトラピシスポラ属、トルラスポラ属、ヴァンデルワルトジマ属、ジゴサッカロマイセス属、ジゴトルラスポラ属、ミセリオフトラ属、サーモセロマイセエス属、カエトミウム属、又はマドゥレラ属由来の乳酸デヒドロゲナーゼである、６に記載の乳酸測定用組成物。
[８]　乳酸デヒドロゲナーゼが以下の（ｉ）及び／または（ｉｉ）である、６に記載の組成物、
（ｉ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列との同一性が７０％以上又は８０％以上のアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼ、
（ｉｉ）配列番号４の第１３８～１４０位、１８６～１９４位、２１７～２２２位、２４３～２４５位、２７１～２７８位、２８０～２８３位、３５５～３６７位、３９８～４０１位、４０３～４０６位及び４２５～４３３位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該乳酸デヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが８０％以上又は９０％以上の配列同一性を有する乳酸デヒドロゲナーゼ。
[９]　モノカルボン酸がグルコン酸、ロイシン酸、３－フェニル乳酸、グリシン、リジン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群より選択され、
　ジカルボン酸がリンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、メチルマロン酸、オキサロ酢酸、酒石酸、シュウ酸、スクシン酸、グルタル酸、α－ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、タルトロン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３－３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、及び３－ヒドロキシアスパラギンからなる群より選択され、
　トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３－プロパントリカルボン酸、及び２－ホスホノブタン－１，２，４－トリカルボン酸からなる群より選択され、
　テトラカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸から選択され、
　リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、
　硫酸が硫酸塩から選択され、
　単糖がmyo-イノシトールからなる群より選択され、
　二糖がスクロース、トレハロース、及びマルトースからなる群より選択され、又は
　ポリエチレングリコール、
又は
　イオン性ポリマーがアニオン性ポリマーであるか、若しくはカチオン性ポリマーであり、
　アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ヒアルロン酸、及びカルボキシメチルセルロース若しくはこれらの塩からなる群より選択され、
　カチオン性ポリマーがポリリジン、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、及びポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)から選択される、６～８のいずれかに記載の乳酸測定用組成物。
[１０]　モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩（硫酸アンモニウムを除く）からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、若しくはアニオン性ポリマー又はカチオン性ポリマーが溶液中において、０．０１重量％から３０重量％の範囲で含む、６～９のいずれかに記載の乳酸測定用組成物。
[１１]　６～１０のいずれかに記載の組成物を含む乳酸測定用キット。
[１２]　フラビン化合物を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼ及び、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、イオン性ポリマーのいずれか１種類以上の化合物を含む組成物を含む電極。
[１３]　１２に記載の電極を含む乳酸センサー。
[１４]　１２に記載の電極を含む燃料電池。
[１５]　乳酸デヒドロゲナーゼを電極に塗布する工程を含む電極の製造方法において、乳酸デヒドロゲナーゼの活性低下又は失活を抑制する方法であって、
i) 乳酸デヒドロゲナーゼを含む溶液を用意する工程、
ii)前記溶液に、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、イオン性ポリマーからなる群より選択される１以上の安定化剤を添加する工程、
iii) 前記乳酸デヒドロゲナーゼ及び前記安定化剤を含む溶液を電極に塗布する工程、
iv)塗布した前記の溶液を乾燥させる工程、
を含む、前記方法。
[１６]　乳酸デヒドロゲナーゼを塗布した電極が乳酸センサーに含まれる、１５に記載の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-163631号の開示内容を包含する。
　本開示により、乳酸測定試薬、乳酸アッセイキットおよび乳酸センサー作製時および保存時におけるＬＤＨの失活を低減でき、それにより、製造に必要とするＬＤＨの使用量を低減できるとともに、製品として完成した試薬やキット、センサー等の保存安定性および測定精度を向上できる。
乳酸デヒドロゲナーゼのデヒドロゲナーゼ反応の一様態を示す図である。
　本開示は、任意のＬＤＨに対し、任意の添加成分を共存させることにより、ＬＤＨ含有組成物の熱安定性を向上できることを特徴とする。ＬＤＨ自体を改変して熱安定性を向上させる試みは公知ではなく、また、ＬＤＨに対して効果的な熱安定性向上剤や、組成物として熱安定性が向上しているＬＤＨ含有組成物の知見は乏しかった。ある実施形態において、本開示は、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させる方法を提供する。本開示のＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する化合物として、アニオン又は糖、イオン性ポリマーが有効であることを見出した。すなわち、本開示は、ある実施形態において、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させる安定化剤を提供する。ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させる安定化剤は、アニオン、糖、及び／又はイオン性（カチオン性、アニオン性、双性イオン）ポリマーを含み得る。
　本開示のアニオンとしては、本開示のＬＤＨ含有組成物の熱安定性を向上させるものであれば特に制限は無く、例えば、カルボキシル基含有化合物、ハロゲン化合物、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、タンパク質、ペプチド、アミノ酸などが挙げられる。カルボキシル基含有化合物としては、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸化合物などが挙げられるがこれに限らない。特に、本発明に用いる好ましいアニオンは、１種類以上のジカルボン酸もしくはトリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸またはこれらの塩であるがこれに限らない。非イオン性ポリマーとして、ポリエチレングリコールがありうる。イオン性ポリマーとして、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー若しくは双性イオン性ポリマーがありうる。カチオン性ポリマーとしては、ポリリジン、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、及びポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)等が挙げられるがこれに限らない。アニオン性ポリマーとしては、ヒアルロン酸、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース）、ポリアクリル酸誘導体（例えば、ポリアクリル酸））、ポリメタクリル酸誘導体（例えば、ポリメタクリル酸メチルやポリメタクリル酸ヒドロキシメチル）等が挙げられるがこれに限らない。双性イオンポリマーとしては、例えば特開２０１７－５２７６６９号記載のポリ（カルボキシベタインメタクリレート）等が挙げられるがこれに限らない。特定の実施形態において、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する化合物のことをＬＤＨの安定化剤、若しくは単なる安定化剤と表現することがある。ただし、これはＬＤＨ安定化剤が他の化合物を含むことを妨げない。すなわち、別の実施形態では、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤は、ＬＤＨを安定化させる化合物を含む。また、該安定化剤は他の化合物を含み得る。本開示の組成物に関し、特定の実施形態では、硫酸塩から、硫酸アンモニウム、特に５０重量％以上の硫酸アンモニウムは除かれる。
　ある実施形態において、本開示に用いるモノカルボン酸は、本開示のＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるものであれば特に制限はないが、例えば、グルコン酸、ロイシン酸、３－フェニル乳酸、グリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジンが好ましいモノカルボン酸として例示される。ある実施形態において、本開示に用いるモノカルボン酸は、主鎖炭素数が７以下でありうる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいジカルボン酸としては、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、メチルマロン酸、オキサロ酢酸、酒石酸、シュウ酸、スクシン酸、グルタル酸、α－ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、タルトロン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３－３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、３－ヒドロキシアスパラギン酸等が挙げられる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいトリカルボン酸としては、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３－プロパントリカルボン酸、２－ホスホノブタン－１，２，４－トリカルボン酸等が挙げられる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいテトラカルボン酸としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましい糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖など本開示のＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるものであれば特に制限はないが、例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、myo-イノシトール等が挙げられる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいポリエチレングリコールの分子量には特に制限はないが、例えば平均分子量が３００～１００，０００のものが好ましく、特に７，３００～９，３００のものが好ましい。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいカチオン性ポリマーとしては、例えばポリリジン、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、及びポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)が挙げられ、ポリリジンとしてはα－ポリリジン又はε－ポリリジンが挙げられる。ポリリジンの分子量には特に制限はないが、例えば平均分子量が３００～１００，０００のポリリジンが好ましく、さらに３，５００～６，０００、例えば３，０００～５，０００、例えば３，５００～４，５００のポリリジンが好ましいがこれに限らない。ポリエチレンイミンは直鎖型でも分岐型でもよい。ポリエチレンイミンの分子量には特に制限はないが、例えば平均分子量が３００～１００，０００、例えば３０００～２０，０００、例えば３５００～１０，０００のポリエチレンイミンを使用し得る。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいアニオン性ポリマーとしては、ポリアクリル酸やポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸若しくはその塩、及びカルボキシメチルセルロース若しくはその塩が挙げられる。ポリアクリル酸の分子量には特に制限はないが、例えば平均分子量が１０００～１，２５０，０００のポリアクリル酸が好ましいがこれに限らない。ポリスチレンスルホン酸の分子量には特に制限はないが、例えば平均分子量が１０００～１，０００，０００のポリスチレンスルホン酸が好ましいがこれに限らない。ある実施形態において、本開示に用いる好ましい硝酸塩としては、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、硝酸リチウム等が挙げられる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましい硫酸塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸リチウム等が挙げられる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいリン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸リチウム等が挙げられる。ある実施形態において、本開示に用いる好ましいアニオン若しくは糖は、１以上のカルボキシル基含有化合物、ハロゲン化合物、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、タンパク質、ペプチド、アミノ酸またはこれらの塩であり、若しくは糖である。
　別の実施形態では、本開示の安定化剤から、グルコン酸、ロイシン酸、３－フェニル乳酸、グリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、メチルマロン酸、オキサロ酢酸、酒石酸、シュウ酸、スクシン酸、グルタル酸、α－ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、タルトロン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３－３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、３－ヒドロキシアスパラギン酸、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３－プロパントリカルボン酸、２－ホスホノブタン－１，２，４－トリカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヒアルロン酸若しくはその塩、及びカルボキシメチルセルロース若しくはその塩、スクロース、トレハロース、マルトース、myo-イノシトール、ポリエチレングリコール、ポリリジン、α－ポリリジン、ε－ポリリジン、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、及びポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)、ポリアクリル酸若しくはその塩、ポリスチレンスルホン酸若しくはその塩、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、硝酸リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸リチウム、１以上のカルボキシル基含有化合物、ハロゲン化合物、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、タンパク質、ペプチド、アミノ酸またはこれらの塩からなる群より選択される１以上の化合物が除かれ得る。
　本開示の安定化剤が、ロイシン酸を含む場合、ロイシン酸はＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－ロイシン酸は、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、３－フェニル乳酸を含む場合、３－フェニル乳酸はＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－３－フェニル乳酸は、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は、化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、アルギニンを含む場合、アルギニンはＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－アルギニンは、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、リジンを含む場合、リジンはＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－リジンは、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、ヒスチジンを含む場合、ヒスチジンはＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－ヒスチジンは、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、リンゴ酸を含む場合、リンゴ酸はＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－リンゴ酸は、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、酒石酸を含む場合、酒石酸はＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－酒石酸は、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、グルタミン酸を含む場合、グルタミン酸はＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－グルタミン酸は、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、アスパラギン酸を含む場合、アスパラギン酸はＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－アスパラギン酸は、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示の安定化剤が、３－ヒドロキシアスパラギン酸を含む場合、３－ヒドロキシアスパラギン酸はＬ体及びＤ体、若しくはＬ体とＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてＬ体とは、例えば光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅにてＬ体が存在することをいう。例えばＬ－３－ヒドロキシアスパラギン酸は、光学純度９０～１００％ｅｅ、例えば９５～１００％ｅｅ、例えば９７～１００％ｅｅのものであり得る。なお、本明細書でラセミ体を示す際は化合物の名称の前にＤＬ－と表記している。
　本開示のＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤は、ＬＤＨを含む組成物中での化合物（有効成分）の終濃度が、０．１ｍＭ～１０００ｍＭ、例えば０．１ｍＭ～９００ｍＭ、０．１ｍＭ～８００ｍＭ、０．１ｍＭ～７００ｍＭ、０．１ｍＭ～６００ｍＭ、０．１ｍＭ～５００ｍＭ、０．１ｍＭ～４００ｍＭ、０．１ｍＭ～３００ｍＭ、０．１ｍＭ～２００ｍＭ、０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．１ｍＭ～９０ｍＭ、０．１ｍＭ～８０ｍＭ、０．１ｍＭ～７０ｍＭ、０．１ｍＭ～６０ｍＭ、０．１ｍＭ～５０ｍＭ、０．１ｍＭ～４０ｍＭ、０．１ｍＭ～３０ｍＭ、０．２ｍＭ～２０ｍＭ、０．２５ｍＭ～１０ｍＭ、例えば３００ｍＭとなるように、乳酸測定試薬又は乳酸測定組成物に配合され得る。ある実施形態において、本開示の安定性を向上させるために添加する安定化剤及びＬＤＨを含む水溶液を電極に塗布し、乾燥させることができる。この場合、乾燥時に安定化剤（組成物に含まれてもよい）は濃縮され、乾燥前の終濃度よりも高い濃度となることが想定される。このような乾燥後の高濃度でのＬＤＨの安定化剤及び、該安定化剤を塗布された電極も本開示に包含される。また、安定化剤を含有する組成物を含む電極も本開示により提供される。また、安定化剤を含有する組成物を電極に塗布する実施形態も提供される。ある実施形態において、本開示の安定性を向上させるために添加する安定化剤はＬＤＨの製造工程において任意の時期に添加することができる。例えば、安定化剤を、精製工程の初期段階に添加してもよく、抽出・精製工程の途中で添加してもよく、製造工程の後半、例えば、凍結乾燥・粉末化・規格調整の段階で添加してもよい。本開示においては、ＬＤＨの安定化効果を損なわない範囲で、例えば、緩衝剤、界面活性剤、安定化剤、賦形剤等、ＬＤＨを含む組成物の製造において必要とされるその他の各種成分を共存させることもできる。こうした他の成分は安定化剤に含めてもよく、安定化剤以外の乳酸測定試薬に含めてもよく又は、乳酸測定試薬の使用時に別途、系に添加してもよい。
　ある実施形態において、本開示は、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤及びＬＤＨを含む、乳酸測定用組成物又は乳酸測定試薬を提供する。ある実施形態において、乳酸測定試薬は溶液形態又は乾燥形態であり得る。ある実施形態において、乳酸測定試薬中のＬＤＨの安定化剤と、ＬＤＨとは、個別の試薬として含まれ得る。別の実施形態では、乳酸測定試薬中のＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する化合物と、ＬＤＨとは、同一試薬中に含まれ得る。さらなる実施形態では、乳酸測定試薬はＬＤＨを含まず、この場合、ＬＤＨは、乳酸測定時に測定溶液に添加され得る。別の実施形態では、乳酸測定試薬はＬＤＨの安定化剤を含まず、この場合、安定化剤は、乳酸測定時に測定溶液に添加され得る。
　ある実施形態において本開示は、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤及びＬＤＨを用いた、乳酸測定方法を提供する。ある実施形態では乳酸測定方法は乳酸の濃度を測定する方法であり得る。別の実施形態では乳酸測定方法は乳酸の濃度を定量する方法であり得る。測定される試料は、乳酸を含むものであり得る。ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤は、乳酸測定試薬に予め含まれてもよく、又は乳酸測定時に測定溶液に添加されてもよい。
　ある実施形態において、本開示の乳酸測定法では、測定時においてＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤に含まれる化合物が０．００１重量％～５０重量％、例えば０．００１重量％～２５重量％、０．００１重量％～２０重量％、０．００１重量％～１５重量％、０．００１重量％～１０重量％、０．００１重量％～９重量％、０．００１重量％～８重量％、０．００１重量％～７重量％、０．００１重量％～６重量％、０．００１重量％～５重量％、０．００１重量％～４重量％、０．００１重量％～３重量％、０．１重量％～２．５重量％、０．００１重量％～２重量％、０．００１重量％～１重量％、０．００１重量％～０．５重量％、０．０１重量％～１０重量％、０．１重量％～１０重量％、１重量％～１０重量％、２重量％～１０重量％、例えば３重量％～１０重量％の終濃度にて測定溶液に含まれ得る。
　ある実施形態において、本開示の乳酸測定法では、測定時においてＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤に含まれる化合物が０．１ｍＭ～２，０００ｍＭ、例えば０．１ｍＭ～１，５００ｍＭ、０．１ｍＭ～１，０００ｍＭ、０．１ｍＭ～７５０ｍＭ、０．１ｍＭ～５００ｍＭ、０．１ｍＭ～４００ｍＭ、０．１ｍＭ～３００ｍＭ、０．１ｍＭ～２００ｍＭ、０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．１ｍＭ～９０ｍＭ、０．１ｍＭ～８０ｍＭ、０．１ｍＭ～７０ｍＭ、０．１ｍＭ～６０ｍＭ、０．１ｍＭ～５０ｍＭ、０．１ｍＭ～４０ｍＭ、０．１ｍＭ～３０ｍＭ、０．２ｍＭ～２０ｍＭ、０．２５ｍＭ～１０ｍＭ、例えば３００ｍＭの終濃度にて測定溶液に含まれ得る。
　ある実施形態において、本開示の乳酸測定法では、前記の安定化剤は、乳酸測定溶液に含まれていてもよい。この場合、当該乳酸測定溶液に、ＬＤＨ及び試料を添加して、測定を開始してもよい。或いは、ＬＤＨを電極に固定化し、当該乳酸測定溶液及び試料を電極に接触させ、乳酸測定を行ってもよい。
　別の実施形態では、本開示のＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する安定化剤は、予め乳酸測定試薬に含まれていてもよい。この測定試薬はＬＤＨを含むものであってもよく、又は含まないものであり得る。測定試薬がＬＤＨを含む場合、そこに試料を添加して乳酸測定を開始しうる。測定試薬がＬＤＨを含まない場合、そこに試料及びＬＤＨを（任意の順で）添加して乳酸測定を開始しうる。或いは、ＬＤＨを電極に固定化し、当該測定試薬及び試料を電極に接触させ、乳酸測定を行ってもよい。
　ある実施形態において、本開示のＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する化合物は、ＬＤＨを沈殿させない。ある実施形態において、ＬＤＨを含む組成物の安定性を向上させるために添加する化合物として、終濃度５０～７０％硫酸アンモニウムは除かれる。また、終濃度５０％～１００％の硫酸アンモニウムは除かれる。ＬＤＨを含む溶液に対し、硫酸アンモニウムを高濃度で添加し、ＬＤＨを沈殿させた際には、該溶液の上清を用いて乳酸を測定することはできない。
（本開示を適用し得るＬＤＨ）
　本開示に適用するＬＤＨは、公知の野生型または変異型ＬＤＨ同様、電子受容体存在下で乳酸の水酸基を酸化してピルビン酸を生成する反応を触媒する。なお、特に断らない限りＬＤＨの基質は乳酸であり、これはＬ体及びＤ体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよく、又はＬ体として提供されてもよい。
　ＬＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、図１に示すように電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）　Ｌ－乳酸　＋　ＰＭＳ（酸化型）
　　　　　　　　→　ピルビン酸　＋　ＰＭＳ（還元型）
（反応２）　ＰＭＳ（還元型）　＋　ＤＣＩＰ（酸化型）
　　　　　　　　→　ＰＭＳ（酸化型）　＋　ＤＣＩＰ（還元型）
　具体的には、まず、（反応１）において、Ｌ－乳酸の酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。そして、続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長５２０ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
　具体的には、ＬＤＨの活性は、以下の手順に従って測定することができる。１Ｍ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）　１７０μＬ、５０ｍＭ　Ｌ－乳酸溶液　３００μＬおよび１．８ｍＭ　ＤＣＩＰ溶液　２５０μＬ、超純水６８０μＬを混合し、３７℃で２分間以上保温する。なお、Ｌ－乳酸としては、例えばＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製（製品番号Ｌ１７５０）を用いることができ、Ｌ－乳酸の代わりにＤＬ－乳酸（例えば、富士フイルム和光純薬社製、製品番号１２８－０００５６）を用いることもできる。次いで、３０ｍＭ　ＰＭＳ溶液　５０μＬおよび酵素サンプル溶液５０μＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う５２０ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ５２０）を求め、次式の数１に従い、ＬＤＨ活性を算出する。この際、ＬＤＨ活性は、３７℃において濃度１０ｍＭのＬ－乳酸存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、式中の１．５は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、６．８は本活性測定条件におけるＤＣＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ５２０，ｂｌａｎｋは０．１５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５２０ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、Ｄｆは希釈倍数を表す。
（ＬＤＨの熱安定性の評価方法）
　ＬＤＨの熱安定性は、所定の温度で所定の時間だけＬＤＨを加熱し、加熱前後の活性を比較することで評価することができる。具体的には、ＬＤＨを含んだ終濃度として０．１５％（ｗ／ｖ）　ウシ血清アルブミンを含む１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を氷上に静置し、所定の温度（例えば４５℃、５０℃、５５℃、６０℃で有り得る）で１５分間それぞれ加熱した後、ＬＤＨ活性を測定する。加熱処理をせず、氷上に静置しておいたＬＤＨ溶液のＬＤＨ活性を１００として加熱後のＬＤＨ溶液の活性を算出し、残存活性率（活性残存率）（％）を測定することができる。
（ＬＤＨの安定性の向上）
　本開示でいう「安定性の向上」とは、「溶液状態における熱安定性の向上」のみならず、「乾燥状態における熱安定性の向上」、または「乾燥工程における熱安定性の向上」、または「溶液状態における保存安定性（長期安定性）の向上」や、「乾燥状態における保存安定性（長期安定性）の向上」をも含む。
　すなわち、本開示でいう「安定性が向上した」とは、ＬＤＨを含む組成物を、特定の安定化剤と共存させた状態において、一定の温度条件下、一定時間熱処理後、あるいは長期保存後に維持されているＬＤＨの残存活性率（％）が、前記の安定化剤を共存させない場合と比較して増大していることをいう。
　具体的には、残存活性率（％）は、熱処理前あるいは長期保存前の溶液のＬＤＨ活性値（ａ）と、熱処理後あるいは長期保存後のＬＤＨ活性値（ｂ）をそれぞれ測定し、（（ｂ）／（ａ）×１００）を計算することによって得られる。特定の安定化剤候補の化合物と共存させた状態における熱処理後あるいは長期保存後の残存活性率（％）を算出し、これをＡとし、安定化剤候補の化合物と共存させずに同様の処理に供して算出した残存活性率（％）をＢとした場合に、Ａ＞Ｂとなった場合、ＬＤＨの安定性が向上したと評価し、このとき共存させた化合物はＬＤＨの安定性の向上に寄与したと評価する。
　安定化剤によるＬＤＨの安定性向上効果は、例えば、安定化剤候補の化合物と共存させない場合の残存活性率（％）が１０％であるのに対し、安定化剤候補の化合物と共存させた場合の残存活性率（％）が１５％であった場合、５％向上したという。安定化剤によるＬＤＨの安定性の向上効果は好ましくは、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、さらに好ましくは１０％以上、１５％以上、さらに好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上であり得る。
　安定化剤によるＬＤＨの安定性向上効果は、安定化剤候補の化合物と共存させない場合の残存活性率（％）を１００としたとき、好ましくは安定化剤候補の化合物と共存させた場合の残存活性の相対値が１１０以上であり、さらに好ましくは１３０以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上でありうる。
（本開示を適用し得るＬＤＨの由来）
　本開示の方法に適用することができる、ＬＤＨの由来は特に限定されず、原核生物由来、真核生物由来、微生物由来、真菌由来、植物由来、又は動物由来のものを使用し得る。本開示を適用し得るＬＤＨはフラビン依存性であり、補酵素であるフラビン化合物はフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）若しくはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）で有り得る。
　例えば、微生物由来のＬＤＨとしては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、好ましくはサッカロマイセス綱（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａ）、より好ましくはサッカロマイセス目（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、さらに好ましくはサッカロマイセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ピキア科（Ｐｉｃｈｉａｃｅａｅ）に由来するものが挙げられるがこれに限らない。例えば、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロマイセス属）、Ｐｉｃｈｉａ（ピキア）属、Ｃａｎｄｉｄａ（カンディダ）属、Ｏｇａｔａｅａ（オガタエア）属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（ブレタノマイセス）属、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ（ハンセニアスポラ）属、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ（カザツタニア）属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（クルイウェロマイセス）属、Ｌａｃｈａｎｃｅａ属、Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ属、Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ（トルラスポラ）属、Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（ジゴサッカロマイセス）属、Ｚｙｇｏｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属などの微生物に由来するＬＤＨが挙げられるがこれに限らない。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｕｂａｙａｎｕｓを挙げることができる。Ｐｉｃｈｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｃａｐｓｕｌａｔａを挙げることができる。Ｃａｎｄｉｄａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉを挙げることができる。Ｏｇａｔａｅａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｏｇａｔａｅａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｏｇａｔａｅａ　ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＤＬ－1を挙げることができる。Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓを挙げることができる。例えば、微生物由来のＬＤＨとしては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ソルダリオマイセテス網（Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、例えばソラダリアレス目(Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ)、例えばカエトミアセアエ科(Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ、ケタマカビ科)、例えばミセリオフトラ属属(Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ)、又はサーモセロマイセエス属(ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ)が挙げられるがこれに限らない。カエトミアセアエ科(Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ、ケタマカビ科)としては例えばカエトミウム属(Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ、ケタマカビ属）が挙げられるがこれに限らない。ソラダリアレス目(Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ)としては例えばマドゥレラ属（Ｍａｄｕｒｅａｌｌａ）が挙げられるがこれに限らない。本開示は、これらのＬＤＨを構成するドメインの組み合わせも包含する。
　なお、微生物分類はあくまで便宜的なものであり、特定の微生物が、ある分類から別の分類に移されることがある。また、１つの属が２つに分けられたり、２つの属が１つの属に統合されることもある。本開示において本質的であるのはＬＤＨを産生する微生物であり、必ずしも、変更された学術上の名称や分類ではない。したがって、後に上記の微生物の学術分類が変更された場合であっても、上記の開示は、本願の出願時の微生物分類を基準として判断されるものとする。例えばマドゥレラ属（Ｍａｄｕｒｅａｌｌａ）の科が本願の出願時に必ずしも明確に定まっておらず出願後に科が分類学的に決定された場合、いずれの科に属することとなったとしても、本願の出願時にマドゥレラ属（Ｍａｄｕｒｅａｌｌａ）に属するとされた微生物は、上記に記載のマドゥレラ属（Ｍａｄｕｒｅａｌｌａ）に含まれるものとする。
　本開示の方法に適用することができるＬＤＨは、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。上記に例示されるようなＬＤＨ生産生物から公知の遺伝子工学的手法によって取得したＬＤＨをコードする遺伝子を利用し、必要によりそれを一部改変して、適当な宿主微生物に各種公知の手法により導入して生産された組換えＬＤＨにも、本開示を適用できる。
　本開示を好ましく適用できるＬＤＨの一例として、フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼ、さらに好ましくは配列番号１、４、７、１０に示されるアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有する乳酸デヒドロゲナーゼが挙げられるがこれに限らない。なお、配列番号１、４、７、１０はシグナル配列を切断した後のアミノ酸配列である。また、配列番号１における１～９２位のアミノ酸配列、配列番号４における１～９６位のアミノ酸配列、配列番号７における１～９９位のアミノ酸配列又は配列番号１０における１～９８位のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む領域については、配列同一性は低く、乳酸デヒドロゲナーゼが乳酸と反応することにおいては重要性が低いと言える。したがって、全長のアミノ酸配列のうち、配列番号１における９３～５０６位のアミノ酸配列、配列番号４における９７～５０２位のアミノ酸配列、配列番号７における１００～５０５位のアミノ酸配列、配列番号１０における９９～５０３位のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む乳酸デヒドロゲナーゼであることが好ましく、配列番号１における１～９２位のアミノ酸配列、配列番号４における１～９６位のアミノ酸配列、配列番号７における１～９９位のアミノ酸配列又は配列番号１０における１～９８位のアミノ酸配列を含む領域については、配列同一性がそれぞれ４５％以上、５０％以上、６０％または７０％以上あればよく、またはこの領域は欠失されていても良い。または部分的に欠失されていても良く、例えば、Ｎ末端配列から１から２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１５個のアミノ酸が欠失されていても良い。例えば、配列番号４における２～１０位のアミノ酸が欠失されていても良い。欠失されている場合には、適宜、メチオニンを配列の最初に付加することができる。このように、配列番号４の上流部分を改変、欠失したとしても、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ由来乳酸デヒドロゲナーゼと呼ぶものとする。他の微生物由来のＬＤＨについても同様とする。
　ＬＤＨは、一般的にシグナル配列、シトクロムドメイン及び触媒ドメインを有する。シグナル配列は通常、切断され、酵素活性に関係しないため、配列同一性を比較する場合には、特に断らない限り考慮しないものとする。シトクロムドメインは、配列同一性が低い場合が多く、乳酸デヒドロゲナーゼが乳酸と反応することにおいては重要性が低い。したがって、配列同一性を比較する場合には、特に断らない限り、シトクロムドメインを考慮しない。しかしながら、これはＬＤＨがシトクロムドメインを含むことを排除するものではない。ある実施形態において、本開示のＬＤＨはシトクロムドメインを有する。別の実施形態において、本開示のＬＤＨはシトクロムドメインを有しないか、又はシトクロムドメインの部分配列しか有しない。さらに、由来の異なるＬＤＨについて、シトクロムドメインを交換しても、酵素活性が発揮されることを本発明者らは確認した。したがって、上記の微生物に由来するＬＤＨに関し、第１微生物由来ＬＤＨからの触媒ドメインと第２微生物由来ＬＤＨからのシトクロムドメインとを連結することもできる。本開示は、上記の微生物に由来するＬＤＨに関し、かかる組み合わせや融合タンパク質を包含する。
（相同性領域について）
　アミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のＬＤＨをアライメントしたときに、該２以上のＬＤＨにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
　また、２以上のＬＤＨにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてＢｌｏｓｕｍ６２を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本開示の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
　例えば、配列番号４で示される乳酸デヒドロゲナーゼを基準として、１３８～１４０位、１８６～１９４位、２１７～２２２位、２４３～２４５位、２７１～２７８位、２８０～２８３位、３５５～３６７位、３９８～４０１位、４０３～４０６位、４２５～４３３位は相同性領域に該当しうる。さらに、本開示の乳酸デヒドロゲナーゼの相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号４における相同性領域のアミノ酸配列と７５％以上、例えば７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有し得る。
　上記のようなＬＤＨを人為的に取得しようとする場合には、それぞれをコードするＤＮＡ情報に基づいて、公知の蛋白質工学的手法を用いることができる。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，　ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
　ＬＤＨのアミノ酸配列は、人為的に改変してもよく、ランダムに改変してもよい。人為的にアミノ酸配列を改変する場合は、特定の部位に保存的アミノ酸置換を導入してもよい。保存的アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基を、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基へと置換することをいう。例えばリシン、アルギニン、及びヒスチジンはいずれも塩基性側鎖を有する。例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸は酸性側鎖を有する。例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステインはいずれも非荷電極性側鎖を有する。例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンはいずれも非極性側鎖を有する。例えばスレオニン、バリン、及びイソロイシンはいずれもβ分岐側鎖を有する。例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンはいずれも芳香族側鎖を有する。これらはいずれも相互に保存的アミノ酸置換の対象とし得る。
　人為的にアミノ酸配列を改変する場合、特定の実施形態では、ＬＤＨの活性中心残基や、基質の認識に関与する残基、補酵素と相互作用する残基など、ＬＤＨが機能する上で重要なアミノ酸残基は置換せずともよい、又は置換しない。ＬＤＨが機能する上で重要なアミノ酸残基や配列モチーフは公知であり、配列番号１を基準とした場合は、例えば１３９位のチロシン、２４９位のチロシン、３６８位のヒスチジン、３７１位のアルギニン、１９３位のアラニン、及び２２５位のロイシンが挙げられる（例えばＢｉｏｃｈｅｍ．，３９，３２６６－３２７５，２０００を参照のこと。）。これらの位置やモチーフ配列は置換せずともよい。
　また、人為的アミノ酸置換と無作為のアミノ酸置換とを組み合わせることもできる。さらに、アミノ酸置換の導入を、バッチ単位に分けて複数回行うこともできる。例えば、第１ラウンドとして１～５個又は１～１０個の人為的アミノ酸置換をＬＤＨに導入し得る。次いで場合により１～５個又は１～１０個の無作為アミノ酸置換をＬＤＨに導入し得る。これを複数回繰り返しうる。各ラウンドごとに、ＬＤＨ変異体の活性を確認することにより、活性を失うことなく、元の配列と多くの位置において、例えば１０箇所以上、２０箇所以上、３０箇所以上、４０箇所以上、５０箇所以上、６０箇所以上、７０箇所以上、８０箇所以上、９０箇所以上、１００箇所以上、１１０箇所以上、１２０箇所以上、１３０箇所以上、１４０箇所以上、例えば１５０箇所以上の位置において異なる配列を有するＬＤＨ変異体を、慣用法を繰り返すことにより簡便に作製し得る。また、人為的アミノ酸置換や無作為のアミノ酸置換は、第１セットとしてＬＤＨの特定の領域に導入してもよく、これを単回又は複数回繰り返しうる。次いでＬＤＨ変異体が活性を有することを確認した後、第２セットとしてＬＤＨの別の領域にアミノ酸置換を単回又は複数回、導入してもよい。
　（ハイスループットスクリーニング）
　ＬＤＨはさらに、機能性変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したＬＤＨ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異ＬＤＨの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。アマドリアーＬＤＨバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンＰＣＲ法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の位置又はそれに対応する位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる(107)。これを１０回繰り返せば約１０の８乗の変異体を取得しうる(108)。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはデヒドロゲナーゼ活性の有無を利用しうる。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
（本開示を適用し得るＬＤＨの入手）
　本開示を適用し得るＬＤＨは、公知文献に基づいて入手可能である。例えば、上記のＬＤＨを生産する由来微生物を培養することにより、あるいは、天然のＬＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、適当な発現用ベクターに挿入し、適当な宿主（例えば大腸菌、酵母、麹菌）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、該培養物よりＬＤＨを採取する方法が挙げられる。
　上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ６～９に調整することができる。
　培養は、１０～４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４～８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
　培養終了後、該培養物よりＬＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、もしくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、ＬＤＨの粗酵素を得る。
　ＬＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本開示のＬＤＨ酵素標品を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＬＤＨを直接培養液中に分泌させることができる。
（ＬＤＨの濃度）
　本開示におけるＬＤＨの濃度には特に制約がない。用いる酵素の特性等によって適切な範囲は異なるが、実用上、当該酵素を用いて乳酸を十分な信頼性をもって測定できると当業者が判断できる濃度であればよい。
　例えば、本開示におけるＬＤＨの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、好ましくは、０．０１～１，０００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．１～１００Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１～１０Ｕ／ｍＬである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、１００Ｕ／ｍＬ以上の濃度にすることができる。
　本開示のＬＤＨを含む組成物は液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空乾燥あるいはスプレードライ等により粉末化することができる。ＬＤＨの抽出・精製・粉末化、および安定性試験に用いる緩衝液の組成は特に限定しないが、好ましくはｐＨ４～９の範囲で緩衝能を有するものであればよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等、公知の市販の緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといった市販のグッド緩衝剤が挙げられる。上記のような緩衝剤は、いずれか１種を用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
　緩衝剤の濃度は、必要とされる緩衝能を有する範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。粉末あるいは凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１～３０％（重量比）の範囲で使用される。
　ある実施形態において、本開示はＬＤＨの安定性を向上させる安定化剤のスクリーニング方法を提供する。この方法は、
i)　ＬＤＨを用意する工程、
ii)　ＬＤＨに３５～７０℃において熱処理を５～６０分間行う工程、
iii)　前記ii)の後、ＬＤＨの残存活性を決定する工程、
iv)　 ii)においてＬＤＨ単独ではなく、代わりにＬＤＨを候補物質の存在下で熱処理を行った後、ＬＤＨの残存活性を決定する工程、及び
v) 前記iii)における残存活性と、iv)における候補物質の存在下での残存活性とを比較する工程
を含み得る。前記iii)における残存活性よりも、iv)における候補物質の存在下での残存活性が増加している場合には、候補物質は、ＬＤＨの安定性を向上させる安定化剤とすることができる。
（ＬＤＨを含有する組成物の製造）
　上述のようなＬＤＨの安定性を向上させる各種の安定化剤を、ＬＤＨと共存させることにより、ＬＤＨの安定性が向上した組成物を製造することができる。本開示の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。具体的には、本開示の組成物は、ＬＤＨと各種安定剤とを任意の方法で共存させればよい。例えば、両者が溶液状態である場合には、それを混合することにより組成物を製造することができ、両者が粉末状態である場合には粉末状態でそれらを混合することにより組成物を製造することができる。ＬＤＨを粉末化し、その後の造粒工程において安定化剤を添加することもできる。また、複数種の安定化剤を、一部はＬＤＨの製造工程において共存させ、残りは乳酸測定試薬の調整段階や乳酸センサーへの固定化工程において共存させることもできる。
　ある実施形態において、本開示はＬＤＨを含有する組成物の製造方法を提供する。この方法は、
i)　ＬＤＨを用意する工程、
ii)　ＬＤＨに３５～７０℃において熱処理を５～６０分間行う工程、
iii)　前記ii)の後、ＬＤＨの残存活性を決定する工程、
iv)　 ii)においてＬＤＨ単独ではなく、代わりにＬＤＨを候補物質の存在下で熱処理を行った後、ＬＤＨの残存活性を決定する工程、
v)　前記iii)における残存活性と、iv)における候補物質の存在下での残存活性とを比較する工程、
vi)　前記iii)における残存活性よりも、iv)における候補物質の存在下での残存活性が増加している場合には、候補物質をＬＤＨと共存させることにより、ＬＤＨの安定性が向上した組成物を製造する工程、
を含み得る。
　ある実施形態において、本開示は乳酸デヒドロゲナーゼを電極に塗布する工程を含む電極の製造方法において、乳酸デヒドロゲナーゼの活性低下又は失活を抑制する方法を提供する。この方法は、
i) 乳酸デヒドロゲナーゼを含む溶液を用意する工程、
ii)前記溶液に、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、及びイオン性ポリマーからなる群より選択される１以上の安定化剤を添加する工程、
iii) 前記乳酸デヒドロゲナーゼ及び前記安定化剤を含む溶液を電極に塗布する工程、
iv)塗布した前記の溶液を乾燥させる工程、
を含み得る。ある実施形態において、乳酸デヒドロゲナーゼを塗布した電極は乳酸センサーに含まれ得る。
（メディエータ）
　ある実施形態では、ＬＤＨを電極に固定化して用いる場合、又はＬＤＨを固定化することなく用いる場合、メディエータとして、公知のメディエータ、例えば１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）、５－メチルフェナジニウムメチルスルファート（ＰＭＳ）、５－エチルフェナジニウムメチルスルファート（ＰＥＳ）等のフェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェリシアン化カリウム等のフェリシアン化物、フェロセン、ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸等のフェロセン系化合物、ナフトキノン、アントラキノン、ヒドロキノン、ピロロキノリンキノン等のキノン系化合物、シトクロム系化合物、ベンジルビオロゲンやメチルビオロゲン等のビオロゲン系化合物、ジクロロフェノールインドフェノール等のインドフェノール系化合物、塩化ヘキサアンミンルテニウム等のルテニウム錯体、オスミウム－２，２’－ビピリジン等のオスミウム錯体、ｐ－フェニレンジアミン、Ｎ－イソプロピル－Ｎ’－フェニル－ｐ－フェニレンジアミン等のフェニレンジアミン系化合物を用いることができる。
　また、これらのメディエータはポリビニルイミダゾール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸などのポリマーに修飾されて用いることもできる。また、これらのメディエータはＧＤＨに架橋試薬等を用いて固定化することもできる。参照によりこれらの全内容を本明細書に組み入れる。また、これらのメディエータは電極表面を酸処理等して活性化させた後に、電極に固定化することもできる。電極は炭素、金、白金等の素材等を用いることができる。
　試料溶液に添加するメディエータの終濃度は特に限定されず、例えば、１ｐＭ～１Ｍ、１ｐＭ～１００ｍＭ、１ｐＭ～２０ｍＭ、１ｐＭ～１０ｍＭ、１ｐＭ～５ｍＭ、２ｐＭ～１ｍＭ、３ｐＭ～８００μＭ、４ｐＭ～６００μＭ、５ｐＭ～５００μＭ、６ｐＭ～４００μＭ、７ｐＭ～３００μＭ、８ｐＭ～２００μＭ、９ｐＭ～１００μＭ、１０ｐＭ～５０μＭの範囲であり得る。なお、メディエータと他の試薬との添加順序は制限されず、同時でも逐次添加でもよい。
（乳酸測定用試薬、乳酸アッセイキット、乳酸センサー）
　本開示のＬＤＨを含有する組成物を用いて、ＬＤＨの安定性が向上した乳酸測定用試薬、乳酸アッセイキット、乳酸センサーを製造することができ、これを用いて乳酸の測定を行うことができる。
　本開示の乳酸測定用試薬は、典型的には、ＬＤＨ、緩衝液、メディエータなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のための乳酸標準溶液、ならびに使用説明書を含み、ＬＤＨの安定性を向上させることに寄与する安定化剤を含む。
　本開示の乳酸測定用試薬は、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。本開示の乳酸測定用試薬は従来の乳酸測定用試薬と同様に用いて乳酸を測定することができ、本開示の乳酸測定用試薬を用いた場合には、ＬＤＨの安定性が向上していることから、本開示の乳酸測定用試薬は、より優れた熱安定性および保存安定性を示す。
（乳酸アッセイキット）
　本開示の乳酸アッセイキットには、典型的には、少なくとも１回の乳酸測定に十分な量のＬＤＨと、アッセイに必要な緩衝液、メディエータ、キャリブレーションカーブ作製のための乳酸標準溶液を含み、ＬＤＨの安定性を向上させることに寄与する安定化剤を含む。本開示の乳酸アッセイキットは従来の乳酸アッセイキットと同様に用いて乳酸を測定することができ、本開示の乳酸アッセイキットを用いた場合には、ＬＤＨの安定性が向上していることから、本開示の乳酸アッセイ用キットは、より優れた熱安定性および保存安定性を示す。
（乳酸センサー）
　ある実施形態において本開示はまた、ＬＤＨの熱安定性が向上している乳酸センサーを提供する。ある実施形態においてセンサーは電極を有する。ある実施形態においてセンサーは電極として作用極、対極を有する。ある実施形態においてセンサーは電極として作用極、対極及び参照極を有する。ある実施形態においてＬＤＨは電極に固定化されている。作用極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本開示の酵素を固定化することができる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーを用いる方法などがあり、あるいはメディエータとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本開示のＬＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。本開示の安定化剤を含む組成物又は試薬は、ＬＤＨを固定化した電極、又は酵素センサー等と共に、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いて、種々の電気化学的測定に用いることができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、例えばクロノアンペロメトリー、ポテンシャルステップ・クロノアンペロメトリー、ボルタンメトリー、例えばサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えば乳酸測定では、アンペロメトリー法により、乳酸が還元される際の電流を測定することで、試料中の乳酸濃度を算出することができる。印加電圧は条件や装置の設定にもよるが、例えば－１，０００ｍＶ～＋１，０００ｍＶ（ｖｓ．　Ａｇ／ＡｇＣｌ）などとすることができる。
　電極として印刷電極を用いることもできる。これにより測定に必要な溶液量を低減することができる。電極は絶縁基板上に形成しうる。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成させ得る。絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いることができる。また、電極の基盤としてカーボンクロスやカーボンペーパー、バッキーペーパーを用いることもできる。作用極の面積は、所望の応答電流に応じて設定することができる。例えばある実施形態では、作用極の面積を1mm2以上、1.5mm2以上、2mm2以上、2.5mm2以上、3mm2以上、4mm2以上、5mm2以上、6mm2以上、7mm2以上、8mm2以上、9mm2以上、10mm2以上、12mm2以上、15mm2以上、20mm2以上、30mm2以上、40mm2以上、50mm2以上、1cm2以上、2cm2以上、3cm2以上、4cm2以上、5cm2以上、例えば10cm2以上とすることができる。ある実施形態では、作用極の面積を10cm2以下、5cm2以下、例えば1cm2以下、とすることができる。対極も同様でありうる。また、作用極上にカーボンナノチューブやグラフェン、ケッチェンブラック等を固定化し、みかけの表面積を大きくすることも出来る。この場合、見かけの面積は10倍以上、50倍以上、100倍以上、1000倍以上増え得る。
　乳酸濃度の測定は、例えば以下のようにしてクロノアンペロメトリーにより行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエータを加えて一定温度に維持する。作用電極として本開示のＬＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、乳酸を含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度の乳酸溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中の乳酸濃度を計算することができる。
　本開示の乳酸センサーは従来の乳酸センサーと同様に用いて乳酸を測定することができ、本開示の乳酸センサーを用いた場合には、ＬＤＨの安定性が向上していることから、本開示の乳酸センサー用キットは、より優れた熱安定性および保存安定性を示す。また、センサーにＬＤＨを固定化する工程においても、固定化の際の熱による失活の程度を低減できるため、固定化に用いるＬＤＨの量を低減できるという効果を奏する。
（本開示のアノード電極）
　ある実施形態において本開示は、熱安定性が向上しているＬＤＨ組成物を含むアノード電極を提供する。ある実施形態においてＬＤＨは電池の有する電極に固定化されていてもよい。ある実施形態において、本開示のアノード電極はカソード電極と抵抗を組み合わせて電池を提供することができる。ある実施形態において本開示は、前記の電池を用いる発電方法を提供する。別の実施形態では、本開示の熱安定性が向上しているＬＤＨ組成物を含む電池が提供される。
（本開示の燃料電池）
　ある実施形態において本開示は、燃料電池用のアノード又はカソード及び当該アノード又はカソードを備えた燃料電池を提供する。この燃料電池は本開示の熱安定性が向上しているＬＤＨ組成物を含む。ある実施形態において本開示は、前記の熱安定性が向上しているＬＤＨ組成物を含む電池を使用した発電方法、並びに、ＬＤＨをアノード電極に固定化し、ＬＤＨに対応した基質、例えば乳酸を燃料とし、発電を行う方法を提供する。
　ある実施形態において、本開示の燃料電池は、前記の熱安定性が向上しているＬＤＨ組成物を含むアノード、燃料槽、カソード、及び電解質を備えている。アノード又はカソードには、人工電子メディエータを吸着させてもよい。人工電子メディエータとしては上記に記載の公知のメディエータや、特許第6484741号及び特許6484742号に記載のフェニレンジアミン系化合物が挙げられるがこれに限らない。また本開示の燃料電池は、必要に応じて、アノードとカソードとの間に負荷抵抗を配置することができ、そのための配線を備えうる。ある実施形態において負荷抵抗は、本開示の燃料電池の一部である。ある実施形態において、負荷抵抗は、本開示の燃料電池の一部ではなく、本開示の燃料電池は、適当な負荷抵抗に接続できるよう構成されている。本開示の燃料電池において酸化還元酵素（ＬＤＨ）はアノードの一部を構成する。例えば酸化還元酵素はアノードに近接若しくは接触していてもよく、固定化されていてもよく、又は吸着していてもよい。燃料槽は電極に固定化された酸化還元酵素の基質となる化合物を含む。ある実施形態において本開示の燃料電池はアノードとカソードを分離するイオン交換膜を有し得る。イオン交換膜は1nm～20nmの孔を有し得る。アノードは炭素電極のような一般的な電極であり得る。例えば、カーボンブラック、グラファイト、活性炭等の導電性炭素質からなる電極や、金、白金等の金属からなる電極を用いることができる。具体的には、カーボンペーパー、カーボンクロス、グラッシーカーボン、HOPG（高配向性熱分解グラファイト）等が挙げられる。対をなすカソードとしては、例えば、白金や白金合金等、燃料電池において一般的に用いられている電極触媒を、カーボンブラック、グラファイト、活性炭のような炭素質材料、又は金、白金等からなる導電体に担持させた電極や、白金や白金合金等の電極触媒そのものからなる導電体をカソード電極として用い、酸化剤（カソード側基質、酸素等）を電極触媒に供給するような形態とすることができる。
　別の実施形態では、上記のような基質酸化型酵素電極からなるアノードと対をなすカソードとして、基質還元型酵素電極を使用しうる。酸化剤を還元する酸化還元酵素としては、ラッカーゼやビリルビンオキシターゼなど公知の酵素が挙げられる。酸化剤を還元する触媒として酸化還元酵素を用いる場合には、必要に応じて、公知の電子伝達メディエータを用いてもよい。酸化剤としては、酸素等が挙げられる。
　ある実施形態において、カソードにおける電極反応を妨害する不純物（アスコルビン酸や尿酸等）による影響を回避するために、酸素選択性の膜（例えばジメチルポリシロキサンの膜）をカソード電極の周囲に配置することができる。
　本開示の発電方法は、酸化還元酵素を有するアノードに燃料となる酸化還元酵素の基質となる化合物を供給する工程を含む。酸化還元酵素を有するアノードに燃料が供給されると、基質が酸化され、同時に生成した電子を、酸化還元酵素は、該酸化酵素と電極との間の電子伝達を仲介する電子伝達メディエータ、例えばフェニレンジアミン系化合物へと受け渡し、該電子伝達メディエータによって導電性基材（アノード電極）へ電子が受け渡される。アノード電極から配線（外部回路）を通って電子がカソード電極に到達することで、電流が発生する。
　上記過程において発生するプロトン(H+)は、電解質溶液内をカソード電極まで移動する。そして、カソード電極では、電解質溶液内をアノードから移動してきたプロトンと、外部回路を経てアノード側から移動してきた電子と、酸素や過酸化水素等の酸化剤（カソード側基質）とが反応して水が生成される。これを利用し発電を行うことができる。
　以下、実施例により、本開示をさらに具体的に説明する。ただし、本開示の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
１．ＬＤＨ発現用プラスミドの作製
各種組換え体プラスミドの調製　
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２５８，　２５５－２５９（１９８９）に記載されているように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＳｃＬＤＨ）のアミノ酸配列である５９１アミノ酸のうち、１～８５位のアミノ酸を除去した配列番号１に示す５０６アミノ酸をコードする配列番号２で示される１５２１ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、２本鎖ＤＮＡとして取得した。プラスミドｐＫＫ２２３－３のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＳｃＬＤＨ遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製した。具体的には、ｐＫＫ２２３－３のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅにて、ＳｃＬＤＨ遺伝子を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ）を得た。さらにこれらのプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ）株を、３ｍLのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨを得た。
　続いて、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＰｋＬＤＨ）のアミノ酸配列である配列番号３で示される５７８アミノ酸とＳｃＬＤＨを比較し、２～７７位を除去した配列番号４で示される５０２アミノ酸をコードする、配列番号５で示される１５０９ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、２本鎖ＤＮＡとして取得した。同様にして、Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＣａＬＤＨ）のアミノ酸配列である配列番号６で示される５７１アミノ酸のうち、２～６７位を除去した配列番号７で示される５０５アミノ酸をコードする、配列番号８で示される１５１８ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、２本鎖ＤＮＡとして取得した。同様にして、Ｏｇａｔａｅａ　ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＯｇＬＤＨ）のアミノ酸配列である配列番号９で示される５５８アミノ酸のうち、２～５６位を除去した配列番号１０で示される５０３アミノ酸をコードする、配列番号１１で示される１５１２ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲにより、２本鎖ＤＮＡとして取得した。これら３種の遺伝子は、ＳｃＬＤＨ発現用プラスミド作製時と同様の手法でプラスミドｐＫＫ２２３－３のマルチクローニングサイトに対象遺伝子を常法により挿入させ、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ、ｐＫＫ２２３－３－ＣａＬＤＨ、ｐＫＫ２２３－３－ＯｇＬＤＨをそれぞれ得た。
２．各種ＬＤＨ標品の精製
　ＬＤＨ生産菌として、大腸菌ＢＬ２１株を用いた。まず、ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＳｃＬＤＨ）株は予めＬＢプレート培地（１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン入り）上で培養した株のコロニーをつまようじでつつき、ＬＢ培地２ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン入り）を入れた小試験管で、２５℃、１６０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。この培養液全量を、ＬＢ培地２５０ｍＬ（５０μｇ／ｍＬ　アンピシリン、１ｍＭ　イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（以下ＩＰＴＧ）入り）を入れた０．５Ｌ容坂口フラスコに移し、２５℃、１３０ｒｐｍで３０時間振とう培養した。同様にして、ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＰｋＬＤＨ）株を、ＬＢ培地２ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン）を入れた小試験管で、３０℃、１６０ｒｐｍで終夜振とう培養した。この培養液全量を、ＬＢ培地２５０ｍＬ（５０μｇ／ｍＬ　アンピシリン、１ｍＭ　ＩＰＴＧ入り）を入れた０．５Ｌ容坂口フラスコに移し、３７℃、１３０ｒｐｍで３０時間振とう培養した。同様にして、ｐＫＫ２２３－３－ＣａＬＤＨ若しくはｐＫＫ２２３－３－ＯｇＬＤＨを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＣａＬＤＨ）株、大腸菌ＢＬ２１（ｐＫＫ２２３－３－ＯｇＬＤＨ）株を、ＬＢ培地２ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン）を入れた小試験管で、３０℃、１６０ｒｐｍで終夜振とう培養した。この培養液全量を、ＬＢ培地２５０ｍＬ（５０μｇ／ｍＬ　アンピシリン、１ｍＭ　ＩＰＴＧ入り）を入れた０．５Ｌ容坂口フラスコに移し、３０℃、１３０ｒｐｍで３０時間振とう培養した。
　培養終了後、培養液を６，０００ｒｐｍ、２５℃で５分遠心して上清を除去し、菌体を回収した。次いで、得られた菌体を２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。
　上記の菌体懸濁液を、超音波ホモジナイザーＵＳ－１５０Ｅ（日本精機製作所製）を用いて、懸濁液が半透明になるまで超音波破砕を行い、９，０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心して上清を回収した。ＳｃＬＤＨを除く各種ＬＤＨを含む菌体破砕液の上清について、陰イオン交換クロマトグラフィー精製を行った。具体的にはまず、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 （ｐＨ ７．５）を用いて平衡化した１０ｍＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｃｙｔｉｖａ社製）に対し、各種ＬＤＨを含む上清液を樹脂に添加した。次に、０～５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）を添加し、ＬＤＨ活性が高い画分を回収した。得られたＬＤＨ活性を示す画分をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）　Ｕｌｔｒａ－１５　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒｓ　Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）－３０Ｋを用いて濃縮した。続いて、Ｈｉｓｃｒｅｅｎ　Ｃａｐｔｏ　Ｑ　ＩｍｐＲｅｓ　カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）に吸着させ、ＰｋＬＤＨは２５０ｍＭから４５０ｍＭ　ＮａＣｌ／２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）のグラディエントによりＬＤＨ活性を示す画分を回収した。ＣａＬＤＨ、ＯｇＬＤＨの精製においては、１５０ｍＭから３５０ｍＭ　ＮａＣｌ／２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）までのグラディエントによりＬＤＨ活性を示す画分を回収した。続いて、回収した画分をそれぞれ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ＰｋＬＤＨはｐＨ７．０、ＣａＬＤＨ、ＯｇＬＤＨはｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇカラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）に供し、得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、単一なバンドを示し、かつ、ＬＤＨ活性を示す画分を回収し、各種ＬＤＨの精製標品とした。
４．種々の化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証１
　上記で取得したＰｋＬＤＨ精製標品を用いて、前述のＬＤＨの熱安定性の評価方法に準じて、ＬＤＨの安定化剤の添加有無における残存活性率（％）を比較することで、安定化剤の探索を行った。
　ＬＤＨの熱安定性は、所定の温度で所定の時間だけＬＤＨを加熱し、加熱前後の活性を比較することで評価した。具体的には、ＬＤＨを含んだ終濃度として０．１５％（ｗ／ｖ）　ウシ血清アルブミンを含む１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を氷上に静置し、所定の温度（例えば４５℃、５０℃、５５℃、６０℃で有り得る）で１５分間それぞれ加熱した後、ＬＤＨ活性を測定した。また、加熱処理をせず、氷上に静置しておいたＬＤＨ溶液のＬＤＨ活性を測定し、その活性を１００として加熱後のＬＤＨ溶液の活性を算出し、残存活性率（％）を測定した。具体的には、残存活性率（％）は、熱処理前あるいは長期保存前の溶液のＬＤＨ活性値（ａ）と、熱処理後あるいは長期保存後のＬＤＨ活性値（ｂ）をそれぞれ測定し、（（ｂ）／（ａ）×１００）を計算することによって算出した。
　種々の化合物を添加することによるＬＤＨの安定性向上効果の程度は、種々の化合物をＬＤＨとそれぞれ共存させた状態でＬＤＨ溶液を調製し、加熱処理に供してそれぞれの残存活性率（％）を測定し、それを、化合物同士で、あるいは、化合物を添加しない場合の活性残存率（％）と比較することにより評価した。
　ＬＤＨの活性は、以下の手順に従って測定した。１Ｍ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）　１７０μＬ、５０ｍＭ　ＤＬ－乳酸（富士フイルム和光純薬社製、製品番号１２８－０００５６）溶液　３００μＬおよび１．８ｍＭ　ＤＣＩＰ溶液　２５０μＬ、超純水６８０μＬを混合し、３７℃で２分間以上保温した。次いで、３０ｍＭ　ＰＭＳ溶液　５０μＬおよび酵素サンプル溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う５２０ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ５２０）を求め、次式の数２に従い、ＬＤＨ活性を算出した。この際、ＬＤＨ活性は、３７℃において濃度１０ｍＭのＬ－乳酸存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　なお、式中の１．５は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、６．８は本活性測定条件におけるＤＣＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ５２０，ｂｌａｎｋは０．１５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５２０ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、Ｄｆは希釈倍数を表す。
　上記の熱安定性の評価方法に従い、１５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、３００ｍＭの各種化合物と０．１５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＬＤＨ溶液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ＬＤＨの残存活性率を算出した。前記のＰｋＬＤＨ溶液は、各種化合物をそれぞれ添加した後にｐＨ７．５となるよう調整を行った。加熱処理は５５℃、１５分間行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液を用いた場合でも、同様に試験を行った。なお、以降特に断らない限り、試薬は東京化成工業社から購入したものを用いた。
　これらの検討の結果、表１に示す通り、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、トレハロース二水和物、スクロース、Ｄ－（－）－酒石酸、Ｌ－リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アルギニン塩酸塩を添加することにより、ＬＤＨの熱安定性が向上することが明らかとなった。これらの安定化剤によるＬＤＨの安定性向上効果は１０％以上となり、高い安定性向上効果が確認された。
　特に、硫酸アンモニウム、Ｌ－リンゴ酸、グルコン酸ナトリウム、コハク酸、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アルギニン塩酸塩を添加した場合には、安定化剤添加無しのＰｋＬＤＨの活性残存率（％）が３０％であるのに対し、活性残存率（％）が５０％以上となった。つまり、これらの安定化剤によるＬＤＨの安定性向上効果は２０％以上となり、高い安定性向上効果が確認された。特に、Ｌ－リンゴ酸を添加した際には、ＬＤＨの活性残存率（％）は７８％となった。すなわち、Ｌ－リンゴ酸によるＬＤＨの安定性は大幅に向上し、顕著に高い安定性向上効果が明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
５．リンゴ酸の類似化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証２
　Ｌ－リンゴ酸と構造が類似している化合物についても同様に、上記４．に記載の方法に従い、安定性評価試験を行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＰｋＬＤＨ溶液（ｐＨを７．５に調整した１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含む）を用いた場合でも、同様に試験を行った。Ｌ－リンゴ酸類似化合物としては表２に示すように、Ｄ－リンゴ酸、ＤＬ－ロイシン酸、ＤＬ－３－ヒドロキシアスパラギン酸、ＤＬ－３－フェニル乳酸、オキサロ酢酸、Ｄ－（－）－酒石酸、Ｌ－（＋）－酒石酸を添加した。
　これらの検討の結果、表２に示す通り、Ｄ－リンゴ酸、ＤＬ－３－ヒドロキシアスパラギン酸、オキサロ酢酸、Ｄ－（－）－酒石酸、Ｌ－（＋）－酒石酸を添加した時にＬＤＨの安定性が向上することが明らかとなった。特に、ＤＬ－３－ヒドロキシアスパラギン酸、Ｄ－（－）－酒石酸、Ｌ－（＋）－酒石酸を添加した場合には、化合物添加なしの活性残存率（％）が３０％であるのに対し、活性残存率（％）が５０％を越え、高い安定性が確認された。それらの中でも、ＤＬ－3－ヒドロキシアスパラギン酸、ＤＬ－ロイシン酸、ＤＬ－フェニル乳酸は活性残存率（％）がそれぞれ７７％、９２％、８７％となった。つまり、ＤＬ－３－ヒドロキシアスパラギン酸、ＤＬ－ロイシン酸、ＤＬ－フェニル乳酸を添加することによって、顕著に高いＬＤＨの安定性向上効果が明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
６．リンゴ酸添加による種々のＬＤＨの安定性向上効果の検証３
　種々のＬＤＨに対するリンゴ酸の安定性向上効果に関しての安定性評価試験を行った。上記で取得したＬＤＨ標品（ＰｋＬＤＨ、ＣａＬＤＨ、ＯｇＬＤＨ）を、各々、酵素濃度が２Ｕ／ｍＬとなるように、酵素希釈液（１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液中、終濃度３００ｍＭとなるようＬ－リンゴ酸を添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整した後、終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）となるようウシ血清アルブミンを添加して調製）を用いて希釈した。このそれぞれの希釈された酵素溶液（酵素とＬ－リンゴ酸の混合組成物、ＬＤＨ濃度：２Ｕ／ｍＬ、Ｌ－リンゴ酸濃度：３００ｍＭ）を用いて、上記４．に記載の熱安定性の評価方法に従い、ＰｋＬＤＨは５５℃で、ＣａＬＤＨとＯｇＬＤＨは５０℃で１５分加熱処理後の活性残存率（％）を、加熱前の活性を１００として算出した。比較例として、酵素希釈液中にＬ－リンゴ酸を添加しないものについて、同様の試験を行い、両者の活性残存率を比較した。
　その結果、表３に示す通り、３種のＬＤＨ全てにおいて、Ｌ－リンゴ酸を添加することによってＬＤＨの安定性が向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
７．リンゴ酸添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証４
　リンゴ酸添加による安定化効果の濃度依存性を調べた。上記で取得したＬＤＨ標品（ＰｋＬＤＨ）を、酵素濃度が２Ｕ／ｍＬとなるように、酵素希釈液（１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液中、終濃度１０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭとなるようＬ－リンゴ酸を添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整した後、終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）となるようウシ血清アルブミンを添加して調製）を用いて希釈した。この希釈された酵素溶液（酵素とＬ－リンゴ酸の混合組成物、ＬＤＨ濃度：２Ｕ／ｍＬ、Ｌ－リンゴ酸濃度：１０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ）について、上記４．に記載の方法に従って５５℃で１５分加熱処理した。加熱処理後の活性残存率（％）を、加熱前の活性を１００として算出した。
　その結果、表４に示す通り、添加するリンゴ酸の濃度を高めることにより、ＬＤＨの安定性が向上する傾向が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
８．種々の化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証２
　上記で取得したＣａＬＤＨ精製標品を用いて、上記４．に記載のＬＤＨの熱安定性の評価方法に従い、ＬＤＨの安定化剤の添加有無における残存活性率を比較することで、安定化剤の探索を行った。
　１５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、３００ｍＭの各種化合物（マルトース一水和物、エチレンジアミン四酢酸）と０．１５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＬＤＨ溶液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ＬＤＨの残存活性率を算出した。前記の各種ＬＤＨ溶液は、各種化合物をそれぞれ添加した後にｐＨ７．５となるよう調整を行った。加熱処理は５０℃、１５分間行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液（ｐＨを７．５に調整した１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含む）を用いた場合でも、同様に試験を行った。
　その結果、マルトース一水和物によるＬＤＨの安定性向上効果は５％であり、エチレンジアミン四酢酸によるＬＤＨの安定性向上効果は５６％であった。すなわち、マルトース一水和物やエチレンジアミン四酢酸を添加することにより、ＬＤＨの熱安定性が向上することが明らかとなった。
９．種々の化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証３
　上記で取得したＯｇＬＤＨ精製標品を用いて、上記４．に記載のＬＤＨの熱安定性の評価方法に従い、ＬＤＨの安定化剤の添加有無における残存活性率を比較することで、安定化剤の探索を行った。
　１５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、３００ｍＭの各種化合物（グリシン、Ｌ－リジン塩酸塩、Ｌ－ヒスチジン、マロン酸二ナトリウム）と０．１５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＬＤＨ溶液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ＬＤＨの残存活性率を算出した。前記の各種ＬＤＨ溶液は、各種化合物をそれぞれ添加した後にｐＨ７．５となるよう調整を行った。加熱処理は５０℃、１５分間行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液（ｐＨを７．５に調整した１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含む）を用いた場合でも、同様に試験を行った。
　その結果、グリシンによるＬＤＨの安定性向上効果は１１％、Ｌ－リジン塩酸塩によるＬＤＨの安定性向上効果は６６％、Ｌ－ヒスチジンによるＬＤＨの安定性向上効果は２７％、マロン酸二ナトリウムによるＬＤＨの安定性向上効果は９６％であった。つまり、グリシン、Ｌ－リジン塩酸塩、Ｌ－ヒスチジンやマロン酸二ナトリウムを添加することにより、ＬＤＨの熱安定性が向上することが明らかとなった。その中でも特に、マロン酸二ナトリウムのＬＤＨの安定性向上効果が高かった。
１０．種々の化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証４
　上記で取得したＳｃＬＤＨの菌体破砕液上清を用いて、上記４．に記載のＬＤＨの熱安定性の評価方法に従い、ＬＤＨの安定化剤の添加有無における残存活性率を比較することで、安定化剤の探索を行った。
　１５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、３００ｍＭの各種化合物（Ｌ－リンゴ酸、マロン酸二ナトリウム、硫酸アンモニウム）と０．１５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＬＤＨ溶液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ＬＤＨの残存活性率を算出した。前記の各種ＬＤＨ溶液は、各種化合物をそれぞれ添加した後にｐＨ７．５となるよう調整を行った。加熱処理は４０℃、１５分間行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液（ｐＨを７．５に調整した１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含む）を用いた場合でも、同様に試験を行った。
　その結果、Ｌ－リンゴ酸によるＳｃＬＤＨの安定性向上効果は４１％、マロン酸二ナトリウムによるＳｃＬＤＨの安定性向上効果は２６％、硫酸アンモニウムによるＬＤＨの安定性向上効果は２４％であった。つまり、ＰｋＬＤＨ、ＣａＬＤＨ、ＯｇＬＤＨと同様にＳｃＬＤＨもＬ－リンゴ酸やマロン酸二ナトリウム、硫酸アンモニウムを添加することで熱安定性が向上することが明らかとなった。
１１．種々の化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証５
　上記で取得したＰｋＬＤＨ精製標品を用いて、さらに同様に、上記４．に記載のＬＤＨの熱安定性の評価方法に準じて、安定化剤の探索を行った。ただし緩衝液をリン酸カリウム緩衝液から、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に変えて実施した。表５記載の３００ｍＭの各種化合物と０．１５％（ｗ／ｖ）　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、ＬＤＨ溶液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、上記の熱安定性の評価方法に従いＬＤＨの残存活性率を算出した。ただし、ポリエチレングリコール、ポリリジンの場合のみ、終濃度を２％となるよう添加した。前記の各種ＬＤＨ溶液は、各種化合物をそれぞれ添加した後にｐＨ７．５となるよう調整を行った。加熱処理は５５℃、１５分間行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液（ｐＨを７．５に調整した１５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含む）を用いた場合でも、同様に試験を行った。
　その結果、リン酸カリウム、ポリエチレングリコール、εポリリジンを添加した時にＬＤＨの安定性が向上することが明らかとなった（表５）。特に、リン酸カリウム、ポリリジンを添加した場合には、化合物添加なしの活性残存率（％）が２７％であるのに対し、活性残存率（％）が７０％を越え、顕著に高い安定性が確認された。また、Ｌ－リンゴ酸やマロン酸二ナトリウムのようなこれまで見出した安定化剤は、リン酸緩衝液中だけではなくＨＥＰＥＳ緩衝液に添加した場合においても安定化効果を発揮し、緩衝液の種類によらず安定化剤として有効であることがわかった。このことから、上記で見出した各種の安定化向上に寄与する化合物が、緩衝液の種類によらず効果を奏しうることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
１２．種々の化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証６
　上記で取得したＰｋＬＤＨ精製標品を用いて、さらに同様に、上記４．に記載のＬＤＨの熱安定性の評価方法に準じて、安定化剤の探索を行った。表６記載の２％（ｗ／ｖ）の各種化合物と０．１５％（ｗ／ｖ）　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、ＬＤＨ溶液（３Ｕ／ｍＬ）を用いて、上記の熱安定性の評価方法に従いＬＤＨの残存活性率を算出した。前記の各種ＬＤＨ溶液は、各種化合物をそれぞれ添加した後にｐＨ７．５となるよう調整を行った。加熱処理は５５℃、１５分間行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液（ｐＨを７．５に調整した１５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含む）を用いた場合でも、同様に試験を行った。
　種々の安定化剤を添加することによるＬＤＨの安定性向上効果の程度は、種々の安定化剤を添加後のＬＤＨの残存活性率（％）を測定し、安定化剤を添加していない条件での残存活性率（％）と比較することにより評価した。具体的には、比較とする安定化を添加していないときの残存活性率を１００とした時の、安定化剤を添加した条件での残存活性率の相対値を算出し、これが１００よりも大きいものを安定性向上効果があると評価した。例えば、比較とする安定化剤を添加していない条件の残存活性率が３０％であり、安定化剤を添加した条件の残存活性率が４５％であった場合、残存活性の相対値は１５０となる。
　試験の結果、αポリリジンや平均分子量や側鎖の構造が異なる２種類のポリエチレンイミンを添加した時にＬＤＨの安定性が向上することが明らかとなった（表６）。特に、分岐型ポリエチレンイミンを添加した場合には、化合物添加なしの残存活性の相対値を１００としたときに、残存活性の相対値が２９０を越え、顕著に高い安定性が確認された。また、ポリリジンやポリエチレンイミンのようなカチオンポリマーは、その分子量によらず安定化効果を発揮し、カチオン性の側鎖が異なっても安定化剤として有効であることがわかった。このことから、上記で見出した各種安定化向上に寄与するポリマー化合物が、分子量によらず効果を奏しうることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
１３．種々の化合物添加によるＬＤＨの安定性向上効果の検証７
　上記で取得したＰｋＬＤＨ精製標品を用いて、さらに同様に、上記４．に記載のＬＤＨの熱安定性の評価方法に準じて、安定化剤の探索を行った。表７記載の質量パーセント濃度またはモル濃度の各種化合物と０．１５％（ｗ／ｖ）　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、ＬＤＨ溶液（３Ｕ／ｍＬ）を用いて、上記の熱安定性の評価方法に従いＬＤＨの残存活性率を算出した。前記の各種ＬＤＨ溶液は、各種ポリマー化合物をそれぞれ添加した後にｐＨ７．５となるよう調整を行った。加熱処理は５５℃、１５分間行った。比較例として、各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液（ｐＨを７．５に調整した１５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液、０．１５％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含む）を用いた場合でも、同様に試験を行った。
　その結果、ヒアルロン酸ナトリウム、メチルグリコールキトサン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）を添加した時にＬＤＨの安定性が向上することが明らかとなった（表７）。また、安定化剤として機能し得るポリマーは、側鎖の官能基にカルボキシ基などのアニオン性のものや、アミノ基などのカチオン性のものを有していればどのような構造でもよく、その構造によらず安定化効果を発揮することが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
１４．ＬＤＨを塗布した印刷電極を用いた電流測定における安定化剤添加効果の検証１
　上記で取得したＰｋＬＤＨ精製標品を用いて酵素電極を作製し、クロノアンペロメトリ測定を行った。各種化合物を酵素溶液に予め添加することによって、乾燥工程において酵素の安定化効果がみられるか検討した。表８記載の濃度（０．２％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）または５０ｍＭ）の各種化合物を含む１ＵのＬＤＨ溶液をスクリーン印刷カーボン電極Ｃ１１０（Ｍｅｔｒｏｈｍ－Ｄｒｏｐｓｅｎｓ社製）に４μＬ塗布し、４０℃、６０分間乾燥させた。各種化合物を添加せずに調製したＬＤＨ溶液を用いた場合でも、同様に行った。作製した電極は専用コネクター（Ｄｒｏｐ　Ｓｅｎｓｅ社製、ＤＲＰ－ＣＡＣ）を用いて、ＡＬＳ　電気化学アナライザー　８１４Ｄ（ＢＡＳ社製）に接続した。次に、１００μＬの２ｍＭ　ｍＰＭＳ／ＰＢＳ溶液を滴下し、乾燥させたＬＤＨを溶解させた。印加電圧は＋２００ｍＶ（ｖｓ　Ａｇ／Ａｇ＋）とした。Ｌ－乳酸ナトリウム溶液を添加し、測定開始から５秒後の応答電流値を記録した。その結果、表８に示す通り、いずれの化合物を添加した場合に、化合物を添加しなかった場合と比較して電流値が大きくなった。また、上記と同様にして、１％ポリアクリル酸を含む１ＵのＬＤＨ溶液をスクリーン印刷カーボン電極に塗布、乾燥させ、１００μＬの２ｍＭ　ｍＰＭＳ／ＰＢＳ溶液を滴下し、乾燥させたＬＤＨを溶解させた。終濃度２～１０ｍＭとなるようにＬ－乳酸ナトリウム溶液を添加し、測定開始から５秒後の応答電流値を記録した。その結果、終濃度１０ｍＭ　Ｌ－乳酸ナトリウム添加時の電流値は２０μＡであった。ポリアクリル酸を添加しなかった際の電流値は、１４μＡであり、ポリアクリル酸を添加した方が高い電流値であった。また、終濃度２～１０ｍＭ　Ｌ－乳酸ナトリウム添加時の電流値を縦軸、乳酸濃度を横軸にしたグラフを作製した際の直線性はＲ２＝０．９７であり、Ｌ－乳酸を定量できることが示された。この結果から、液状試験での結果で効果があった化合物は、電極を作製する際の乾燥工程において酵素の失活を抑制でき、酵素の安定化効果を発揮することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
１５．ＬＤＨを塗布した印刷電極を用いた電流測定における安定化剤添加効果の検証２
　安定化剤として添加する化合物、および基質として用いるＬ－乳酸ナトリウムの濃度を変えて、前項で行ったクロノアンペロメトリ測定の実験を行った。前項と同様の手順で作成した電極に１００μＬの５ｍＭ　ｍＰＭＳ／ＰＢＳ溶液を滴下し、乾燥させたＬＤＨを溶解させた。印加電圧は＋２００ｍＶ（ｖｓ　Ａｇ／Ａｇ＋）とした。Ｌ－乳酸ナトリウム溶液を添加し、測定開始から５秒後の応答電流値を記録した。その結果、表９に示す通り、リンゴ酸ナトリウムやｍｙｏ－イノシトールを添加した場合にも、化合物を添加しなかった場合と比較して電流値が大きくなった。また、添加するポリマーの濃度を希釈しても化合物を添加しなかった場合と比較して電流値が大きくなった。さらに、これまでに安定性向上効果が見られた化合物は乳酸濃度が０～１０ｍＭのいずれの範囲において用いても同様に安定性向上効果を示した。この結果から、液状試験での結果で効果があった化合物は、電極を作製する際の乾燥工程において、その濃度によらず、酵素の失活を抑制でき、酵素の安定化効果を発揮することが示された。また、ＬＤＨが電極上で０～１０ｍＭの乳酸と反応する際に添加した化合物と共存していても、十分に活性を示すことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　なお、表中に示していないが、乳酸が１０ｍＭ存在するときにも、乳酸５ｍＭの場合と同様にＬＤＨ安定性向上効果が確認された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
配列の説明
配列番号１　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＳｃＬＤＨ）（ただし野生型の１～８５位は除去）
配列番号２　配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３　Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＰｋＬＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号４　配列番号３の２～７７位の配列を除去した配列
配列番号５　配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号６　Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＣａＬＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号７　配列番号６の２～６７位を除去した配列
配列番号８　配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号９　Ｏｇａｔａｅａ　ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来乳酸デヒドロゲナーゼ（ＯｇＬＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号１０　配列番号９の２～５６位を除去した配列
配列番号１１　配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列

Claims (16)

  1. 　フラビン化合物を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物に、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩（硫酸アンモニウムを除く）からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、若しくはイオン性ポリマーを１種類以上共存させる工程を含む、乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
  2. 　乳酸デヒドロゲナーゼが、サッカロマイセス属、ピキア属、カンディダ属、オガタエア属、ブレタノマイセス属、シベルリンドネラ属、ハンセニアスポラ属、カザツタニア属、クルイウェロマイセス属、ラチャンセア属、ナウモヴォジマ属、テトラピシスポラ属、トルラスポラ属、ヴァンデルワルトジマ属、ジゴサッカロマイセス属、ジゴトルラスポラ属、ミセリオフトラ属、サーモセロマイセエス属、カエトミウム属、又はマドゥレラ属由来の乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
  3. 　乳酸デヒドロゲナーゼが以下の（ｉ）及び／または（ｉｉ）である、請求項１に記載の乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法、
    （ｉ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列との同一性が７０％以上又は８０％以上のアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｉｉ）配列番号４の第１３８～１４０位、１８６～１９４位、２１７～２２２位、２４３～２４５位、２７１～２７８位、２８０～２８３位、３５５～３６７位、３９８～４０１位、４０３～４０６位及び４２５～４３３位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該乳酸デヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが８０％以上又は９０％以上の配列同一性を有する乳酸デヒドロゲナーゼ。
  4. 　モノカルボン酸がグルコン酸、ロイシン酸、３－フェニル乳酸、グリシン、リジン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群より選択され、
    　ジカルボン酸がリンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、メチルマロン酸、オキサロ酢酸、酒石酸、シュウ酸、スクシン酸、グルタル酸、α－ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、タルトロン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３－３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、及び３－ヒドロキシアスパラギンからなる群より選択され、
    　トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３－プロパントリカルボン酸、及び２－ホスホノブタン－１，２，４－トリカルボン酸からなる群より選択され、
    　テトラカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸から選択され、
    　リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、
    　硫酸が硫酸塩から選択され、
    　単糖がmyo-イノシトールからなる群より選択され、
    　二糖がスクロース、トレハロース、及びマルトースからなる群より選択され、又は
    　ポリエチレングリコール、
    　イオン性ポリマーがアニオン性ポリマーであるか、若しくはカチオン性ポリマーであり、
    　アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ヒアルロン酸、及びカルボキシメチルセルロース若しくはこれらの塩からなる群より選択されるか、若しくは、
    　カチオン性ポリマーがポリリジン、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、及びポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)から選択される、請求項１～３のいずれかに記載の乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
  5. 　モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、アニオン性ポリマー若しくはカチオン性ポリマーが溶液中において、０．０１重量％から３０重量％の範囲で含む、請求項１～４のいずれかに記載の乳酸デヒドロゲナーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
  6. 　フラビン化合物を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼ及び、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩（硫酸アンモニウムを除く）からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、イオン性ポリマーのいずれか１種類以上の化合物を含む乳酸測定用組成物。
  7. 　乳酸デヒドロゲナーゼが、サッカロマイセス属、ピキア属、カンディダ属、オガタエア属、ブレタノマイセス属、シベルリンドネラ属、ハンセニアスポラ属、カザツタニア属、クルイウェロマイセス属、ラチャンセア属、ナウモヴォジマ属、テトラピシスポラ属、トルラスポラ属、ヴァンデルワルトジマ属、ジゴサッカロマイセス属、ジゴトルラスポラ属、ミセリオフトラ属、サーモセロマイセエス属、カエトミウム属、又はマドゥレラ属由来の乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項６に記載の乳酸測定用組成物。
  8. 　乳酸デヒドロゲナーゼが以下の（ｉ）及び／または（ｉｉ）である、請求項６に記載の組成物、
    （ｉ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列との同一性が７０％以上又は８０％以上のアミノ酸配列を有する乳酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｉｉ）配列番号４の第１３８～１４０位、１８６～１９４位、２１７～２２２位、２４３～２４５位、２７１～２７８位、２８０～２８３位、３５５～３６７位、３９８～４０１位、４０３～４０６位及び４２５～４３３位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該乳酸デヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが８０％以上又は９０％以上の配列同一性を有する乳酸デヒドロゲナーゼ。
  9. 　モノカルボン酸がグルコン酸、ロイシン酸、３－フェニル乳酸、グリシン、リジン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群より選択され、
    　ジカルボン酸がリンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、メチルマロン酸、オキサロ酢酸、酒石酸、シュウ酸、スクシン酸、グルタル酸、α－ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、タルトロン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３－３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、及び３－ヒドロキシアスパラギンからなる群より選択され、
    　トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３－プロパントリカルボン酸、及び２－ホスホノブタン－１，２，４－トリカルボン酸からなる群より選択され、
    　テトラカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸から選択され、
    　リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、
    　硫酸が硫酸塩から選択され、
    　単糖がmyo-イノシトールからなる群より選択され、
    　二糖がスクロース、トレハロース、及びマルトースからなる群より選択され、又は
    　ポリエチレングリコール、
    　イオン性ポリマーがアニオン性ポリマーであるか、若しくはカチオン性ポリマーであり、
    　アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ヒアルロン酸、及びカルボキシメチルセルロース若しくはこれらの塩からなる群より選択され、
    　カチオン性ポリマーがポリリジン、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、及びポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)から選択される、請求項６～８のいずれかに記載の乳酸測定用組成物。
  10. 　モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩（硫酸アンモニウムを除く）からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール若しくはアニオン性ポリマー又はカチオン性ポリマーが溶液中において、０．０１重量％から３０重量％の範囲で含む、請求項６～９のいずれかに記載の乳酸測定用組成物。
  11. 　請求項６～１０のいずれかに記載の組成物を含む乳酸測定用キット。
  12. 　フラビン化合物を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼ及び、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、イオン性ポリマーのいずれか１種類以上の化合物を含む組成物を含む電極。
  13. 　請求項１２に記載の電極を含む乳酸センサー。
  14. 　請求項１２に記載の電極を含む燃料電池。
  15. 　乳酸デヒドロゲナーゼを電極に塗布する工程を含む電極の製造方法において、乳酸デヒドロゲナーゼの活性低下又は失活を抑制する方法であって、
    i) 乳酸デヒドロゲナーゼを含む溶液を用意する工程、
    ii)前記溶液に、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、テトラカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸、硫酸またはこれらの塩からなる群より選択されるアニオン、単糖、二糖、ポリエチレングリコール、イオン性ポリマーからなる群より選択される１以上の安定化剤を添加する工程、
    iii) 前記乳酸デヒドロゲナーゼ及び前記安定化剤を含む溶液を電極に塗布する工程、
    iv)塗布した前記の溶液を乾燥させる工程、
    を含む、前記方法。
  16. 　乳酸デヒドロゲナーゼを塗布した電極が乳酸センサーに含まれる、請求項１５に記載の製造方法。
PCT/JP2021/035929 2020-09-29 2021-09-29 フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法 WO2022071417A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21875715.1A EP4223884A1 (en) 2020-09-29 2021-09-29 Method for improving stability of composition containing flavin-dependent lactate dehydrogenase
KR1020237011749A KR20230078697A (ko) 2020-09-29 2021-09-29 플라빈 의존성 락트산 데히드로게나제를 포함하는 조성물의 안정성을 향상시키는 방법
JP2022554051A JPWO2022071417A1 (ja) 2020-09-29 2021-09-29
US18/246,060 US20230365959A1 (en) 2020-09-29 2021-09-29 Method for improving the stability of a composition comprising a flavin-dependent lactate dehydrogenase

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-163631 2020-09-29
JP2020163631 2020-09-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022071417A1 true WO2022071417A1 (ja) 2022-04-07

Family

ID=80950645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/035929 WO2022071417A1 (ja) 2020-09-29 2021-09-29 フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230365959A1 (ja)
EP (1) EP4223884A1 (ja)
JP (1) JPWO2022071417A1 (ja)
KR (1) KR20230078697A (ja)
WO (1) WO2022071417A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4108678A4 (en) * 2020-02-21 2024-03-27 Kikkoman Corporation DEVICE FOR EVALUATION OF THE CONDITION OF A SAMPLE, SYSTEM COMPRISING SAME, METHOD FOR EVALUATION OF THE CONDITION OF A SAMPLE AND LACTATE DEHYDROGENASE USED FOR THIS PURPOSE

Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58175498A (ja) * 1982-03-26 1983-10-14 メルク・パテント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング 液体中の物質の測定用試験系および試験方法
JPS61159164A (ja) * 1984-09-21 1986-07-18 ジヨナサン・エル・キ−ル ミクロ化学発光アツセイシステム
JPH01104172A (ja) * 1987-10-16 1989-04-21 Agency Of Ind Science & Technol 酵素の安定化法
JPH034791A (ja) * 1989-05-30 1991-01-10 Kanebo Ltd 酵素の安定化方法
JPH04271785A (ja) * 1991-02-28 1992-09-28 Kao Corp 酵素固形製剤及びその製造方法
JPH1169973A (ja) * 1997-08-29 1999-03-16 Kao Corp 酵素の安定化方法
JP2000513940A (ja) * 1996-07-03 2000-10-24 モレキュラー バイオロジー リソーシス，インコーポレイテッド 酵素の安定化のための方法および処方物
JP2007129965A (ja) * 2005-11-11 2007-05-31 Toyobo Co Ltd 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
JP2007163268A (ja) * 2005-12-13 2007-06-28 Canon Inc 酵素電極
JP2008154573A (ja) * 2006-03-31 2008-07-10 Toyobo Co Ltd 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法
JP2009034095A (ja) * 2007-07-06 2009-02-19 Sanyo Chem Ind Ltd タンパク質含有水溶液安定化剤、タンパク質含有水溶液の安定化方法及びタンパク質含有水溶液
JP2012099242A (ja) * 2010-10-29 2012-05-24 Toyota Motor Corp 酵素燃料電池
JP2014018096A (ja) * 2012-07-13 2014-02-03 Kikkoman Corp フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
JP2015008707A (ja) * 2013-07-02 2015-01-19 東洋紡株式会社 酵素の安定化方法
JP2015177790A (ja) * 2014-02-27 2015-10-08 キッコーマン株式会社 アマドリアーゼ含有組成物の安定化方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物
JP2017527669A (ja) 2014-09-09 2017-09-21 ユニバーシティ・オブ・ワシントン 官能性双性イオン性ポリマーおよび混合電荷ポリマー、関連するヒドロゲルならびにこれらの使用方法
JP6484742B1 (ja) 2018-04-13 2019-03-13 キッコーマン株式会社 新規メディエータ
JP6484741B1 (ja) 2018-04-13 2019-03-13 キッコーマン株式会社 新規メディエータ
JP2020163631A (ja) 2019-03-28 2020-10-08 大日本印刷株式会社 樹脂フィルム、積層体及び包装製品
WO2021167011A1 (ja) * 2020-02-21 2021-08-26 キッコーマン株式会社 検体の状態を評価するためのデバイス、それを含むシステム、検体の状態を評価する方法及びそれに用いる乳酸デヒドロゲナーゼ

Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58175498A (ja) * 1982-03-26 1983-10-14 メルク・パテント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング 液体中の物質の測定用試験系および試験方法
JPS61159164A (ja) * 1984-09-21 1986-07-18 ジヨナサン・エル・キ−ル ミクロ化学発光アツセイシステム
JPH01104172A (ja) * 1987-10-16 1989-04-21 Agency Of Ind Science & Technol 酵素の安定化法
JPH034791A (ja) * 1989-05-30 1991-01-10 Kanebo Ltd 酵素の安定化方法
JPH04271785A (ja) * 1991-02-28 1992-09-28 Kao Corp 酵素固形製剤及びその製造方法
JP2000513940A (ja) * 1996-07-03 2000-10-24 モレキュラー バイオロジー リソーシス，インコーポレイテッド 酵素の安定化のための方法および処方物
JPH1169973A (ja) * 1997-08-29 1999-03-16 Kao Corp 酵素の安定化方法
JP2007129965A (ja) * 2005-11-11 2007-05-31 Toyobo Co Ltd 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
JP2007163268A (ja) * 2005-12-13 2007-06-28 Canon Inc 酵素電極
JP2008154573A (ja) * 2006-03-31 2008-07-10 Toyobo Co Ltd 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法
JP2009034095A (ja) * 2007-07-06 2009-02-19 Sanyo Chem Ind Ltd タンパク質含有水溶液安定化剤、タンパク質含有水溶液の安定化方法及びタンパク質含有水溶液
JP2012099242A (ja) * 2010-10-29 2012-05-24 Toyota Motor Corp 酵素燃料電池
JP2014018096A (ja) * 2012-07-13 2014-02-03 Kikkoman Corp フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
JP2015008707A (ja) * 2013-07-02 2015-01-19 東洋紡株式会社 酵素の安定化方法
JP2015177790A (ja) * 2014-02-27 2015-10-08 キッコーマン株式会社 アマドリアーゼ含有組成物の安定化方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物
JP2017527669A (ja) 2014-09-09 2017-09-21 ユニバーシティ・オブ・ワシントン 官能性双性イオン性ポリマーおよび混合電荷ポリマー、関連するヒドロゲルならびにこれらの使用方法
JP6484742B1 (ja) 2018-04-13 2019-03-13 キッコーマン株式会社 新規メディエータ
JP6484741B1 (ja) 2018-04-13 2019-03-13 キッコーマン株式会社 新規メディエータ
JP2020163631A (ja) 2019-03-28 2020-10-08 大日本印刷株式会社 樹脂フィルム、積層体及び包装製品
WO2021167011A1 (ja) * 2020-02-21 2021-08-26 キッコーマン株式会社 検体の状態を評価するためのデバイス、それを含むシステム、検体の状態を評価する方法及びそれに用いる乳酸デヒドロゲナーゼ

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"12", NUCLEIC ACIDS RES., 1984, pages 9441
"Japanese Sepsis Clinical Practice Guidelines 2016", PNAS, vol. 112, no. 37, 15 September 2015 (2015-09-15), pages 11642 - 11647
AGRESTI ET AL.: "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 107, no. 9, March 2010 (2010-03-01), pages 4004 - 4009, XP055206226, DOI: 10.1073/pnas.0910781107
BIOCHEM. J., vol. 258, 1989, pages 255 - 259
BIOCHEM., vol. 39, 2000, pages 3266 - 3275
CHEM. REV., vol. 105, no. 11, 2005, pages 4056 - 72
COMB CHEM HIGH THROUGHPUT SCREEN., vol. 11, no. 2, 2008, pages 127 - 34
CURR OPIN STRUCT BIOL, vol. 17, 2007, pages 474 - 80
DATABASE Uniprot 31 July 2019 (2019-07-31), ANONYMOUS: "Uncharacterized protein", XP009535714, retrieved from NCBI Database accession no. A0A4T0X365 *
GENE, vol. 37, 1985, pages 73
METHODS ENZYMOL., vol. 154, no. 350, 1987, pages 1987
METHODS ENZYMOL., vol. 53, 1978, pages 238 - 56
NUCLEIC ACIDS RES, vol. 14, 1986, pages 9679
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 13, 1985, pages 8765
PROC. NATL. ACID. SCI. U.S.A, vol. 82, 1985, pages 488
SPORTS PERFORMANCE RESEARCH, vol. 3, 2011, pages 31 - 48

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4108678A4 (en) * 2020-02-21 2024-03-27 Kikkoman Corporation DEVICE FOR EVALUATION OF THE CONDITION OF A SAMPLE, SYSTEM COMPRISING SAME, METHOD FOR EVALUATION OF THE CONDITION OF A SAMPLE AND LACTATE DEHYDROGENASE USED FOR THIS PURPOSE

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022071417A1 (ja) 2022-04-07
US20230365959A1 (en) 2023-11-16
KR20230078697A (ko) 2023-06-02
EP4223884A1 (en) 2023-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5169991B2 (ja) 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP5176045B2 (ja) 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法
WO2022071417A1 (ja) フラビン依存性乳酸デヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
JP4381369B2 (ja) 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
JP2022153244A (ja) 熱安定性が向上した変異型グルコースデヒドロゲナーゼ及びその利用
JP2010054503A (ja) グルコース脱水素酵素を用いたグルコースの電気化学測定法
JP6101011B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
JP6652757B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質
JP4381463B2 (ja) 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
JP6127496B2 (ja) ジアホラーゼ
JP6440369B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
WO2014119516A1 (ja) ジアホラーゼ組成物
JP5793841B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上する方法
WO2019172400A1 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素とシトクロム分子との融合タンパク質
WO2020116330A1 (ja) グルコースデヒドロゲナーゼ
JP4770911B2 (ja) 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
JP2014143943A (ja) Ｎａｄ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ組成物
JP4591074B2 (ja) 加熱処理を施した脱水素酵素
JP2006034165A (ja) Ｐｑｑｇｄｈ製造法
JP6036826B2 (ja) Ｎａｄ依存型グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造方法
JP2009189375A (ja) 可溶性補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の熱安定性を向上する方法
JP2014097050A (ja) ジアホラーゼ
JP2007129966A (ja) グルコースデヒドロゲナーゼの熱安定性を向上する方法
JP2006081407A (ja) Ｐｑｑ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
WO2006068170A1 (ja) グルコースデヒドロゲナーゼの熱安定性を向上させる方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21875715

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022554051

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20237011749

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021875715

Country of ref document: EP

Effective date: 20230502