JPH06153995A - 細菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法 - Google Patents
細菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法Info
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- JPH06153995A JPH06153995A JP4317068A JP31706892A JPH06153995A JP H06153995 A JPH06153995 A JP H06153995A JP 4317068 A JP4317068 A JP 4317068A JP 31706892 A JP31706892 A JP 31706892A JP H06153995 A JPH06153995 A JP H06153995A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 被試験サンプル、発光細菌由来のホロルシフ
ェラーゼおよびアルデヒドを混合し、発生する光を測定
する被試験サンプル中のＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの
測定法である。また被試験サンプル、ＮＡＤ+ あるいは
ＮＡＤＰ+ 、測定目的物質に特異的なデヒドロゲナー
ゼ、発光細菌由来のホロルシフェラーゼおよびアルデヒ
ドを混合し、発生する光を測定する、被試験サンプル中
の、デヒドロゲナーゼの基質の測定法である。 【効果】 本測定法は非常に高感度であり、測定範囲も
広い。また本発明の測定法では高価なＮＨＲを使用しな
いで本ホロルシフェラーゼのみで測定ができるので、測
定にかかるコストを低くすることができる。また、ＮＡ
ＤＨやＮＡＤＰＨを生成する酵素系、例えばある生体内
微量物質に特異的なデヒドロゲナーゼを組合わせること
により、該生体内微量物質を高感度に測定することがで
きる。
ェラーゼおよびアルデヒドを混合し、発生する光を測定
する被試験サンプル中のＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの
測定法である。また被試験サンプル、ＮＡＤ+ あるいは
ＮＡＤＰ+ 、測定目的物質に特異的なデヒドロゲナー
ゼ、発光細菌由来のホロルシフェラーゼおよびアルデヒ
ドを混合し、発生する光を測定する、被試験サンプル中
の、デヒドロゲナーゼの基質の測定法である。 【効果】 本測定法は非常に高感度であり、測定範囲も
広い。また本発明の測定法では高価なＮＨＲを使用しな
いで本ホロルシフェラーゼのみで測定ができるので、測
定にかかるコストを低くすることができる。また、ＮＡ
ＤＨやＮＡＤＰＨを生成する酵素系、例えばある生体内
微量物質に特異的なデヒドロゲナーゼを組合わせること
により、該生体内微量物質を高感度に測定することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発光細菌に由来する新
規ホロ酵素を用い、被試験サンプル中のＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨ、または、被試験サンプル中の、デヒドロ
ゲナーゼの基質を測定する方法に関する。
規ホロ酵素を用い、被試験サンプル中のＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨ、または、被試験サンプル中の、デヒドロ
ゲナーゼの基質を測定する方法に関する。
【０００２】
(1) ＮＡＤＨの測定 ３４０ｎｍにおける吸収極大を測定する（モル吸光
係数６２７０）。例えば、特開昭５８−８９２００号公
報には、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）
依存性コレステロール脱水素酵素を被検体に作用させ、
生成するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの増加を吸光度３４
０ｎｍで測定して、被検体中のコレステロールを測定す
る方法が記載されている。
係数６２７０）。例えば、特開昭５８−８９２００号公
報には、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）
依存性コレステロール脱水素酵素を被検体に作用させ、
生成するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの増加を吸光度３４
０ｎｍで測定して、被検体中のコレステロールを測定す
る方法が記載されている。
【０００３】 励起波長３４０ｎｍで発生する蛍光を
４６０ｎｍで測定する。例えば、特開平２−２６５５０
０号公報には、液中のアルデヒドとＮＡＤとをアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼの存在下反応させ、生成するＮＡＤ
Ｈの蛍光量を測定して試料溶液中のアルデヒドを測定す
る方法が記載されている。
４６０ｎｍで測定する。例えば、特開平２−２６５５０
０号公報には、液中のアルデヒドとＮＡＤとをアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼの存在下反応させ、生成するＮＡＤ
Ｈの蛍光量を測定して試料溶液中のアルデヒドを測定す
る方法が記載されている。
【０００４】 発光細菌由来のＮＡＤＨ：ＦＭＮオキ
シドレダクターゼ（ＮＨＲ）とルシフェラーゼの共役反
応により生じる光を測定する。
シドレダクターゼ（ＮＨＲ）とルシフェラーゼの共役反
応により生じる光を測定する。
【０００５】発光細菌の発光系を利用する補酵素ＮＡＤ
およびＮＡＤＰＨの測定は、発光細菌の持つ２つの酵素
が触媒する下記反応に基づいて行われる。
およびＮＡＤＰＨの測定は、発光細菌の持つ２つの酵素
が触媒する下記反応に基づいて行われる。
【０００６】
【化１】 反応(a) は、ＮＡＤＨ：ＦＭＮオキシドレダクターゼ
（ＥＣ．１．６．９９．３）あるいはＮＡＤＰＨ：ＦＭ
Ｎオキシドレダクターゼ（ＥＣ．１．６．９９．１）に
より還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ2 ）を
生成するものである。
（ＥＣ．１．６．９９．３）あるいはＮＡＤＰＨ：ＦＭ
Ｎオキシドレダクターゼ（ＥＣ．１．６．９９．１）に
より還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ2 ）を
生成するものである。
【０００７】他方、反応(b) は、ルシフェラーゼ（Ｅ
Ｃ．１．１４．１４．３）によりＦＭＮＨ2 と長鎖脂肪
族アルデヒド（ＲＣＨＯ）と酵素（Ｏ2 ）から、ＦＭＮ
と該アルデヒドに対応する脂肪族（ＲＣＯＯＨ）と水
（Ｈ2 Ｏ）と光が生成する反応である。ここで、ＲＣＨ
Ｏとしては、炭素数８以上の直鎖飽和脂肪族アルデヒド
が望ましく、たとえば、ｎ−デカナール、ｎ−テトラデ
カナール等が好適に用いられる。従って、上記反応によ
り発生した光を測定することにより、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
定量を行うことができる。
Ｃ．１．１４．１４．３）によりＦＭＮＨ2 と長鎖脂肪
族アルデヒド（ＲＣＨＯ）と酵素（Ｏ2 ）から、ＦＭＮ
と該アルデヒドに対応する脂肪族（ＲＣＯＯＨ）と水
（Ｈ2 Ｏ）と光が生成する反応である。ここで、ＲＣＨ
Ｏとしては、炭素数８以上の直鎖飽和脂肪族アルデヒド
が望ましく、たとえば、ｎ−デカナール、ｎ−テトラデ
カナール等が好適に用いられる。従って、上記反応によ
り発生した光を測定することにより、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
定量を行うことができる。
【０００８】 ＮＡＤの存在下、被検体中の胆汁酸
に、３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを
作用させ、生成するＮＡＤＨとニトロブルーテトラゾリ
ウムをジアホラーゼの存在下反応させ、生成するジホル
マザンの吸光度変化率から、被検体中の総胆汁酸濃度を
測定する（特開昭６０−２１４９００号公報参照）。
に、３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを
作用させ、生成するＮＡＤＨとニトロブルーテトラゾリ
ウムをジアホラーゼの存在下反応させ、生成するジホル
マザンの吸光度変化率から、被検体中の総胆汁酸濃度を
測定する（特開昭６０−２１４９００号公報参照）。
【０００９】(2) 生体成分の測定法 特異的なオキシダーゼを作用させて、Ｈ2 Ｏ2 を発
生させ、これにペルオキシダーゼと発色基質（例えば、
４−アミノアンチピリンおよびフェノール）を加え、生
じたキノン色素を比色定量する。例えば、特開昭５７−
２０６３９９号公報には、グルコースにムタロターゼ存
在下グルコースオキシダーゼを作用させ、生じる過酸化
水素によりペルオキシダーゼの存在下４−アミノアンチ
ピリンとアニリン化合物を縮合させ、生成する色素体を
比色定量してグルコース量を測定する方法が記載されて
いる。
生させ、これにペルオキシダーゼと発色基質（例えば、
４−アミノアンチピリンおよびフェノール）を加え、生
じたキノン色素を比色定量する。例えば、特開昭５７−
２０６３９９号公報には、グルコースにムタロターゼ存
在下グルコースオキシダーゼを作用させ、生じる過酸化
水素によりペルオキシダーゼの存在下４−アミノアンチ
ピリンとアニリン化合物を縮合させ、生成する色素体を
比色定量してグルコース量を測定する方法が記載されて
いる。
【００１０】この方法の例として、下記のものがある。
【００１１】例１） ピルビン酸にピルビン酸オキシダ
ーゼを作用させると以下の反応が起こる。
ーゼを作用させると以下の反応が起こる。
【００１２】
【化２】 この反応で生じたＨ2 Ｏ2 にペルオキシダーゼを作用さ
せると、
せると、
【化３】 の反応が起きる。この反応で生じたキノイド色素を比色
定量する。
定量する。
【００１３】例２） 乳酸に乳酸オキシダーゼを加える
と、
と、
【化４】 の反応が起きる。この反応で生じたＨ2 Ｏ2 にペルオキ
シダーゼを作用させると、
シダーゼを作用させると、
【化５】 の反応が起きる。この反応で生じたキノイド色素を比色
定量する。
定量する。
【００１４】他にこの反応に用いることのできるオキシ
ダーゼとして、例えば以下のものがある。
ダーゼとして、例えば以下のものがある。
【００１５】グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ コリンオキシダーゼ キサンチンオキシダーゼ Ｎ−アセチルグルコサミンオキシダーゼ ザルコシンオキシダーゼ グルコースオキシダーゼ アシルＣｏＡオキシダーゼ コレステロールオキシダーゼ ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ の存在下で、特異的な
デヒドロゲナーゼを作用させて測定目的物質を酸化さ
せ、その結果生じるＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを上記
(1) のＮＡＤＨの測定法により測定する。
デヒドロゲナーゼを作用させて測定目的物質を酸化さ
せ、その結果生じるＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを上記
(1) のＮＡＤＨの測定法により測定する。
【００１６】例１） α−ヒドロキシ酪酸にＮＡＤ+ と
α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを加え、生じたＮ
ＡＤＨにジアホラーゼとＮＴＢを加え、生じたジホルマ
ザンを比色定量する。
α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを加え、生じたＮ
ＡＤＨにジアホラーゼとＮＴＢを加え、生じたジホルマ
ザンを比色定量する。
【００１７】例２） 例１）とは逆に、α−ケト酪酸に
ＮＡＤＨとα−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを加
え、ＮＡＤＨの吸光度の減少を測定する。
ＮＡＤＨとα−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを加
え、ＮＡＤＨの吸光度の減少を測定する。
【００１８】他にこの反応に用いることのできるデヒド
ロゲナーゼとして例を挙げると、 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ リンゴ酸デヒドロゲナーゼ 乳酸デヒドロゲナーゼ グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ イソクエン酸デヒドロゲナーゼ アルデヒドデヒドロゲナーゼ アルコールデヒドロゲナーゼ グルコースデヒドロゲナーゼ ガラクトースデヒドロゲナーゼ ３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ 例３） J.Ford et al, ; Anal.Biochem.,110,43-48(19
81) G.Wienhausen et al, ; Anal.Biochem.,127,380-388(19
82) デヒドロゲナーゼと発光細菌由来のＮＨＲとルシフェラ
ーゼを作用させて発生する光を測定する。
ロゲナーゼとして例を挙げると、 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ リンゴ酸デヒドロゲナーゼ 乳酸デヒドロゲナーゼ グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ イソクエン酸デヒドロゲナーゼ アルデヒドデヒドロゲナーゼ アルコールデヒドロゲナーゼ グルコースデヒドロゲナーゼ ガラクトースデヒドロゲナーゼ ３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ 例３） J.Ford et al, ; Anal.Biochem.,110,43-48(19
81) G.Wienhausen et al, ; Anal.Biochem.,127,380-388(19
82) デヒドロゲナーゼと発光細菌由来のＮＨＲとルシフェラ
ーゼを作用させて発生する光を測定する。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】上述の従来技術にはそ
れぞれつぎのような欠点がある。
れぞれつぎのような欠点がある。
【００２０】(1) ＮＡＤＨの定量 のＮＡＤＨの吸収極大（３４０ｎｍ）の測定および
のジホルマザンの比色定量は、吸光測定であるので、い
ずれも測定感度が低い。
のジホルマザンの比色定量は、吸光測定であるので、い
ずれも測定感度が低い。
【００２１】例えばの測定法では、ＮＡＤＨの測定下
限は、１０-5〜１０-6位である。
限は、１０-5〜１０-6位である。
【００２２】のＮＡＤＨの蛍光測定では、検出下限は
約１０-7Ｍであり吸光分析に比べ高いが、不純物や機械
的条件の影響を受けやすいという欠点がある。蛍光性の
不純物やあるいは逆に蛍光を吸収する物質や消光を起こ
す物質が存在すると誤差を生じる。
約１０-7Ｍであり吸光分析に比べ高いが、不純物や機械
的条件の影響を受けやすいという欠点がある。蛍光性の
不純物やあるいは逆に蛍光を吸収する物質や消光を起こ
す物質が存在すると誤差を生じる。
【００２３】の測定法では、発光細菌のＮＡＤＨ：Ｆ
ＭＮオキシドレダクターゼ（ＮＨＲ）とルシフェラーゼ
による発光測定であるので、感度は良い（測定範囲：約
１０ -9〜１０-6Ｍ）。しかし、発光細菌を培養しそこか
ら精製して得られたＮＨＲは、収量が少ないため高価で
あり、従って測定にかかるコストが高くつく。
ＭＮオキシドレダクターゼ（ＮＨＲ）とルシフェラーゼ
による発光測定であるので、感度は良い（測定範囲：約
１０ -9〜１０-6Ｍ）。しかし、発光細菌を培養しそこか
ら精製して得られたＮＨＲは、収量が少ないため高価で
あり、従って測定にかかるコストが高くつく。
【００２４】(2) 生成成分の測定 の特異的オキシダーゼを利用する測定法では、特異的
オキシダーゼが見つかっていない等の理由でオキシダー
ゼ−ペルオキシダーゼ系による測定方法が利用できない
場合、この方法による測定は実施できない。例えば、グ
ルコース−６−リン酸、イソクエン酸、３−ヒドロキシ
酪酸、３−α−ヒドロキシステロイド（胆汁酸）の測定
はできない。
オキシダーゼが見つかっていない等の理由でオキシダー
ゼ−ペルオキシダーゼ系による測定方法が利用できない
場合、この方法による測定は実施できない。例えば、グ
ルコース−６−リン酸、イソクエン酸、３−ヒドロキシ
酪酸、３−α−ヒドロキシステロイド（胆汁酸）の測定
はできない。
【００２５】また、この定量法はキノイド色素の比色定
量であるので、感度がよくない。
量であるので、感度がよくない。
【００２６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、発光細菌
が生産するルシフェラーゼ、あるいは、発光細菌の遺伝
子を含有する発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し
て得られる形質転換体が生産するルシフェラーゼは、菌
体内あるいは細胞内ではフラビンモノヌクレオチドおよ
び特定の物質を補因子としてホロ酵素となっていること
を見出し、該ホロ酵素を、これから補因子がはずれるこ
となく、生体内から分離・精製して取得した。
が生産するルシフェラーゼ、あるいは、発光細菌の遺伝
子を含有する発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し
て得られる形質転換体が生産するルシフェラーゼは、菌
体内あるいは細胞内ではフラビンモノヌクレオチドおよ
び特定の物質を補因子としてホロ酵素となっていること
を見出し、該ホロ酵素を、これから補因子がはずれるこ
となく、生体内から分離・精製して取得した。
【００２７】本発明者らは、また、該ホロ酵素が、ＮＡ
ＤＨあるいはＮＡＤＰＨを酸化することにより自らの補
因子部分であるＦＭＮを還元してＦＭＮＨ2 とする反応
を司ることを見出した（反応(c) ）。ここで、該ホロ酵
素をＬｕｃ〜ＦＭＮ・Ｘと表わす。Ｘは、約３５０ｎ
ｍ、４０５ｎｍ、５４０ｎｍおよび５７０ｎｍに特徴的
吸収スペクトルを示すと特定物質である。
ＤＨあるいはＮＡＤＰＨを酸化することにより自らの補
因子部分であるＦＭＮを還元してＦＭＮＨ2 とする反応
を司ることを見出した（反応(c) ）。ここで、該ホロ酵
素をＬｕｃ〜ＦＭＮ・Ｘと表わす。Ｘは、約３５０ｎ
ｍ、４０５ｎｍ、５４０ｎｍおよび５７０ｎｍに特徴的
吸収スペクトルを示すと特定物質である。
【００２８】反応(c) で得られた、ルシフェラーゼとＦ
ＭＮＨ2 と特定物質より成るホロ酵素（ＬＵＣ〜ＦＭＮ
Ｈ2 ・Ｘ）は、下記式(d) に示す反応を司る。
ＭＮＨ2 と特定物質より成るホロ酵素（ＬＵＣ〜ＦＭＮ
Ｈ2 ・Ｘ）は、下記式(d) に示す反応を司る。
【００２９】
【化６】 反応(d) では、ホロ酵素ＬＵＣ〜ＦＭＮＨ2 ・Ｘがアル
デヒド（ＲＣＨＯ）および酸素（Ｏ2 ）と反応してＬＵ
Ｃ〜ＦＭＮとなり、それと同時に該アルデヒドに対応す
る脂肪酸（ＲＣＯＯＨ）と水（Ｈ2 Ｏ）と光（ｈν）が
生成する。そこで、この光を測定することによりＮＡＤ
ＨおよびＮＡＤＰＨを定量することができる。
デヒド（ＲＣＨＯ）および酸素（Ｏ2 ）と反応してＬＵ
Ｃ〜ＦＭＮとなり、それと同時に該アルデヒドに対応す
る脂肪酸（ＲＣＯＯＨ）と水（Ｈ2 Ｏ）と光（ｈν）が
生成する。そこで、この光を測定することによりＮＡＤ
ＨおよびＮＡＤＰＨを定量することができる。
【００３０】すなわち、本発明による第１の測定法によ
れば、被試験サンプル中のＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
の測定法であって、 被試験サンプル 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ アルデヒド を混合し、発生する光を測定することを特徴とする、細
菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法が提供される。
れば、被試験サンプル中のＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
の測定法であって、 被試験サンプル 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ アルデヒド を混合し、発生する光を測定することを特徴とする、細
菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法が提供される。
【００３１】発光細菌由来のホロルシフェラーゼを用い
て、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを定量する第１の測定
法は、次の利点を有する。
て、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを定量する第１の測定
法は、次の利点を有する。
【００３２】(1) 検出系が発光分析であるので、反応が
迅速である上に、検出感度が従来の吸光分析、比色定量
および蛍光分析より向上する。また、測定領域が、吸光
・蛍光分析では２桁程度であるのに対し、３〜６桁と広
い。
迅速である上に、検出感度が従来の吸光分析、比色定量
および蛍光分析より向上する。また、測定領域が、吸光
・蛍光分析では２桁程度であるのに対し、３〜６桁と広
い。
【００３３】(2) 従来のＮＡＤＨ：ＦＭＮオキシドレダ
クターゼ（ＮＨＲ）とルシフェラーゼの共役反応による
発光分析では、高価なＮＨＲが必要であるのに対し、該
ホロルシフェラーゼを使用すれば、ＮＨＲが不要であ
り、従って測定コストが低くなる。
クターゼ（ＮＨＲ）とルシフェラーゼの共役反応による
発光分析では、高価なＮＨＲが必要であるのに対し、該
ホロルシフェラーゼを使用すれば、ＮＨＲが不要であ
り、従って測定コストが低くなる。
【００３４】また、該ホロルシフェラーゼは、ＮＡＤＨ
やＮＡＤＰＨの分析に用いられるだけでなく、ＮＡＤＨ
やＮＡＤＰＨを生成する酵素系と該ホロルシフェラーゼ
系とを共役反応により組合せれば、これらの酵素の基質
濃度や酵素活性を高感度に測定することができる。ここ
で、上記ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを生成する酵素系は、こ
れが１つの酵素反応よりなる場合も、複数の酵素反応よ
りなる場合も、該ホロルシフェラーゼ系と共役させるこ
とができる。
やＮＡＤＰＨの分析に用いられるだけでなく、ＮＡＤＨ
やＮＡＤＰＨを生成する酵素系と該ホロルシフェラーゼ
系とを共役反応により組合せれば、これらの酵素の基質
濃度や酵素活性を高感度に測定することができる。ここ
で、上記ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを生成する酵素系は、こ
れが１つの酵素反応よりなる場合も、複数の酵素反応よ
りなる場合も、該ホロルシフェラーゼ系と共役させるこ
とができる。
【００３５】例えば、ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ の存
在下、測定目的物質に特異的なデヒドロゲナーゼを作用
させ、生じたＮＡＤＨにアルデヒドと該ホロルシフェラ
ーゼを加え、発生する光を測定することにより、測定目
的物質を定量することができる。また、このデヒドロゲ
ナーゼ活性を測定することもできる。
在下、測定目的物質に特異的なデヒドロゲナーゼを作用
させ、生じたＮＡＤＨにアルデヒドと該ホロルシフェラ
ーゼを加え、発生する光を測定することにより、測定目
的物質を定量することができる。また、このデヒドロゲ
ナーゼ活性を測定することもできる。
【００３６】すなわち、本発明による第２の測定法によ
れば、被試験サンプル中の、デヒドロゲナーゼの基質の
測定法であって、 被試験サンプル ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ 測定目的物質に特異的なデヒドロゲナーゼ 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ アルデヒド を混合し、発生する光を測定することを特徴とする、細
菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法が提供される。
れば、被試験サンプル中の、デヒドロゲナーゼの基質の
測定法であって、 被試験サンプル ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ 測定目的物質に特異的なデヒドロゲナーゼ 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ アルデヒド を混合し、発生する光を測定することを特徴とする、細
菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法が提供される。
【００３７】例えば、臨床検査用等の生体試料中の脱水
素酵素およびその基質の分析は、上記測定法の好適な例
である。脱水素酵素としては例えば以下のものが挙げら
れるが、脱水素酵素はこれらに限定されるものではな
い。
素酵素およびその基質の分析は、上記測定法の好適な例
である。脱水素酵素としては例えば以下のものが挙げら
れるが、脱水素酵素はこれらに限定されるものではな
い。
【００３８】イソクエン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵
素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水
素酵素、グリセロリン酸脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸脱水素酵素、アルコ
ール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、ｌ−グルタミ
ン酸脱水素酵素、ｌ−アラニン脱水素酵素、３−α−ヒ
ドロキシステロイド脱水素酵素。
素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水
素酵素、グリセロリン酸脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸脱水素酵素、アルコ
ール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、ｌ−グルタミ
ン酸脱水素酵素、ｌ−アラニン脱水素酵素、３−α−ヒ
ドロキシステロイド脱水素酵素。
【００３９】被試験サンプル中の、デヒドロゲナーゼの
基質を測定する第２の測定法は、次の利点を有する。
基質を測定する第２の測定法は、次の利点を有する。
【００４０】(1) オキシダーゼ−ペルオキシダーゼの系
は、生成したキノイド色素の比色定量によるものである
のに対し、該ホロルシフェナーゼ系は発光測定によるも
のであるので、測定感度を格段に向上し、また測定領域
も広くすることができる。
は、生成したキノイド色素の比色定量によるものである
のに対し、該ホロルシフェナーゼ系は発光測定によるも
のであるので、測定感度を格段に向上し、また測定領域
も広くすることができる。
【００４１】(2) さらに、測定目的物質に特異的なオキ
シダーゼが見つかっていない等の理由により、上記オキ
シダーゼ−ペルオキシダーゼ系による測定方法が利用で
きない場合でも、測定目的物質に特異的なデヒドロゲナ
ーゼが存在すれば、本発明の方法により測定が可能であ
る。このように測定可能な基質（酵素）の例としては、
グルコース−６−リン酸、イソクエン酸、３−ヒドロキ
シ酪酸、３−α−ヒドロキシステロイド（胆汁酸）が挙
げられる。
シダーゼが見つかっていない等の理由により、上記オキ
シダーゼ−ペルオキシダーゼ系による測定方法が利用で
きない場合でも、測定目的物質に特異的なデヒドロゲナ
ーゼが存在すれば、本発明の方法により測定が可能であ
る。このように測定可能な基質（酵素）の例としては、
グルコース−６−リン酸、イソクエン酸、３−ヒドロキ
シ酪酸、３−α−ヒドロキシステロイド（胆汁酸）が挙
げられる。
【００４２】本発明の測定法で用いられるホロルシフェ
ラーゼは、発光細菌に由来するホロ酵素である。該ホロ
ルシフェラーゼを生産する発光細菌としては、例えばビ
ブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi) 、ビブリオ・フ
イッシェリ（Vibrio fisheri) 、ビブリオ・スプレン
ディダス（Vibrio splendidus)、ビブリオ・コレラエ
（Vibrio cholerae)、フォトバクテリウム・フォスフ
ォレウム（Photobacterium phosphoreum) 、フォトバ
クテリウム・レイオグナシ（Photobacterium leiognath
i)等が挙げられる。上記細菌以外にも、発光反応を触媒
する酵素を生産する細菌は上記ホロ酵素の生産に使用で
きる。
ラーゼは、発光細菌に由来するホロ酵素である。該ホロ
ルシフェラーゼを生産する発光細菌としては、例えばビ
ブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi) 、ビブリオ・フ
イッシェリ（Vibrio fisheri) 、ビブリオ・スプレン
ディダス（Vibrio splendidus)、ビブリオ・コレラエ
（Vibrio cholerae)、フォトバクテリウム・フォスフ
ォレウム（Photobacterium phosphoreum) 、フォトバ
クテリウム・レイオグナシ（Photobacterium leiognath
i)等が挙げられる。上記細菌以外にも、発光反応を触媒
する酵素を生産する細菌は上記ホロ酵素の生産に使用で
きる。
【００４３】また、本発明の方法で用いられる細菌ホロ
ルシフェラーゼには、上記発光細菌を培養して得られる
ホロルシフェラーゼのみに限らず、上記発光細菌由来の
ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する発現ベク
ターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体
が生産するホロルシフェラーゼも含まれる。該形質転換
体を用いてホロルシフェラーゼを生産する場合は、遺伝
子工学の技術により、該ホロ酵素の発現効率を大きく向
上できる可能性があるので、この手法は好適に用いられ
る。
ルシフェラーゼには、上記発光細菌を培養して得られる
ホロルシフェラーゼのみに限らず、上記発光細菌由来の
ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する発現ベク
ターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体
が生産するホロルシフェラーゼも含まれる。該形質転換
体を用いてホロルシフェラーゼを生産する場合は、遺伝
子工学の技術により、該ホロ酵素の発現効率を大きく向
上できる可能性があるので、この手法は好適に用いられ
る。
【００４４】該形質転換体として、例えば、特開平２−
２３６３号に示されるＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８０２）
は、該ホロルシフェラーゼを大量に発現するので、好適
に用いることができる。該ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８０
２）は、発光細菌ビブリオ・ハーベイのルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより大腸
菌ＪＭ１０９を形質転換して得られたものである。
２３６３号に示されるＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８０２）
は、該ホロルシフェラーゼを大量に発現するので、好適
に用いることができる。該ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８０
２）は、発光細菌ビブリオ・ハーベイのルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより大腸
菌ＪＭ１０９を形質転換して得られたものである。
【００４５】次に、形質転換体ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１
８０２）の調製法について説明する。
８０２）の調製法について説明する。
【００４６】ビブリオ・ハーベイを、例えばハスティン
グ（J.W.Hastings) らの方法（Methods in Enzymology,
vol. LVII,153(1978)）により培養し、そこから例えば
ミヤモト（C.Miyamoto) らの方法（Methods in Enzymol
ogy, vol.133,70(1986) ）によりクロモソーム遺伝子を
抽出する。抽出したクロモソームＤＮＡは、次に、遺伝
子ライブラリーを作成するために既知のプラスミドベク
ターに組み込まれる。上記プラスミドベクターとして
は、例えば、ｌａｃプロモーターを持つｐＵＣ１８（宝
酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、pBluescrip
t ＳＫ II （＋）（Stratagene社製）、ｐＵＲ２７８
（Ruther et el.;EMBO J.,2,1791(1983)）等；あるいは
ｔａｃプロモーター（ｔｒｐ−ｌａｃプロモター）を持
つｐＫＫ１７７−３（Amann E.and J.Brosius ;Gene ，
４０，１８３（1985) ）等；あるいは、λファージのＰ
L プロモーターを持つｐＫＣ３０（Shimatake H and M.
Rosenberg ；Nature.292.128(1981)）等が挙げられる。
グ（J.W.Hastings) らの方法（Methods in Enzymology,
vol. LVII,153(1978)）により培養し、そこから例えば
ミヤモト（C.Miyamoto) らの方法（Methods in Enzymol
ogy, vol.133,70(1986) ）によりクロモソーム遺伝子を
抽出する。抽出したクロモソームＤＮＡは、次に、遺伝
子ライブラリーを作成するために既知のプラスミドベク
ターに組み込まれる。上記プラスミドベクターとして
は、例えば、ｌａｃプロモーターを持つｐＵＣ１８（宝
酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、pBluescrip
t ＳＫ II （＋）（Stratagene社製）、ｐＵＲ２７８
（Ruther et el.;EMBO J.,2,1791(1983)）等；あるいは
ｔａｃプロモーター（ｔｒｐ−ｌａｃプロモター）を持
つｐＫＫ１７７−３（Amann E.and J.Brosius ;Gene ，
４０，１８３（1985) ）等；あるいは、λファージのＰ
L プロモーターを持つｐＫＣ３０（Shimatake H and M.
Rosenberg ；Nature.292.128(1981)）等が挙げられる。
【００４７】これらのプラスミドベクターは適当な制限
酵素により切断される。上記抽出されたクロモソームＤ
ＮＡも適当な制限酵素により切断され、上記制限酵素に
より切断されたプラスミドベクターに連結される。
酵素により切断される。上記抽出されたクロモソームＤ
ＮＡも適当な制限酵素により切断され、上記制限酵素に
より切断されたプラスミドベクターに連結される。
【００４８】例えば、図１に示すように、ビブリオ・ハ
ーベイから単離したクロモソームＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化する一方、ｐＵＣ１
８を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化し、これ
らを、例えばＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社製）を用いて連結させる。
ーベイから単離したクロモソームＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化する一方、ｐＵＣ１
８を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化し、これ
らを、例えばＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社製）を用いて連結させる。
【００４９】このようにして得られた組換えプラスミド
は、例えば、ハナハン（Hanahan D）の方法（J.Mol.Bio
l.,166.557(1983) ）、あるいはMolecular Cloning
（１．７４〜１．８４頁、Cold Spring Harbor Laborat
ory(1989) ）記載の方法により適当な宿主細胞に導入さ
れる。宿主細胞の例としては、エセリシア属やバチルス
属、シュードモナス属の菌株、酵母、真菌類、ヒトおよ
びその他の動物の培養細胞、植物の培養細胞等が挙げら
れるが、例えば大腸菌E. Coli ＪＭ１０９株（東洋紡
績社製）が好適に用いられる。
は、例えば、ハナハン（Hanahan D）の方法（J.Mol.Bio
l.,166.557(1983) ）、あるいはMolecular Cloning
（１．７４〜１．８４頁、Cold Spring Harbor Laborat
ory(1989) ）記載の方法により適当な宿主細胞に導入さ
れる。宿主細胞の例としては、エセリシア属やバチルス
属、シュードモナス属の菌株、酵母、真菌類、ヒトおよ
びその他の動物の培養細胞、植物の培養細胞等が挙げら
れるが、例えば大腸菌E. Coli ＪＭ１０９株（東洋紡
績社製）が好適に用いられる。
【００５０】このようにして得られた形質転換微生物か
ら、ルシフェラーゼを生産する菌株がスクリーニングさ
れる。このスクリーニングは、例えば使用したプラスミ
ドベクターに由来する薬剤耐性の発現、菌株が生産する
ルシフェラーゼによる発光反応あるいは、ビブリオ・ハ
ーベイ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子の塩基
配列の一部分より構成されるＤＮＡプローブを用いたハ
イブリダイゼーション等を利用して行われる。
ら、ルシフェラーゼを生産する菌株がスクリーニングさ
れる。このスクリーニングは、例えば使用したプラスミ
ドベクターに由来する薬剤耐性の発現、菌株が生産する
ルシフェラーゼによる発光反応あるいは、ビブリオ・ハ
ーベイ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子の塩基
配列の一部分より構成されるＤＮＡプローブを用いたハ
イブリダイゼーション等を利用して行われる。
【００５１】例えば、プラスミドベクターとして上記ｐ
ＵＣ１８を使用する例においては、該ｐＵＣ１８がアン
ピシリン耐性遺伝子を持つことを利用して、得られた大
腸菌群をアンピシリンおよびイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）含有培地で培養し、
該培地で生育する菌を選択する。さらに、これらの菌体
に対して、長鎖アルデヒド（例えば、ｎ−デカナール）
を作用させて発光を示す菌体を選択する。このようにし
て得られた形質転換微生物は、ビブリオ・ハーベイ由来
のルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれた組み換え体プラ
スミドを有する。本発明者らは、上記形質転換大腸菌群
の中からルシフェラーゼ活性の最も高い大腸菌群を選び
出し、これをＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８０１）と命名
し、また該大腸菌が有するルシフェラーゼ活性を発現し
得るプラスミドをｐＬＵＸ１８０１と命名した。
ＵＣ１８を使用する例においては、該ｐＵＣ１８がアン
ピシリン耐性遺伝子を持つことを利用して、得られた大
腸菌群をアンピシリンおよびイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）含有培地で培養し、
該培地で生育する菌を選択する。さらに、これらの菌体
に対して、長鎖アルデヒド（例えば、ｎ−デカナール）
を作用させて発光を示す菌体を選択する。このようにし
て得られた形質転換微生物は、ビブリオ・ハーベイ由来
のルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれた組み換え体プラ
スミドを有する。本発明者らは、上記形質転換大腸菌群
の中からルシフェラーゼ活性の最も高い大腸菌群を選び
出し、これをＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８０１）と命名
し、また該大腸菌が有するルシフェラーゼ活性を発現し
得るプラスミドをｐＬＵＸ１８０１と命名した。
【００５２】形質転換微生物ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８
０１）から再び組換えプラスミドｐＬＵＸ１８０１を単
離し、該プラスミドに挿入されているルシフェラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片をサブクローン化することによ
り、さらにルシフェラーゼ活性の高い形質転換微生物、
および該ルシフェラーゼ活性を発現し得る組換えプラス
ミドが得られる。
０１）から再び組換えプラスミドｐＬＵＸ１８０１を単
離し、該プラスミドに挿入されているルシフェラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片をサブクローン化することによ
り、さらにルシフェラーゼ活性の高い形質転換微生物、
および該ルシフェラーゼ活性を発現し得る組換えプラス
ミドが得られる。
【００５３】例えば上記ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８０
１）を大量培養し、菌体をアルカリ処理してプラスミド
を単離し、種々の制限酵素を単独でもしくは２以上を組
み合わせて用いて、上記プラスミドを切断することによ
り、次のＤＮＡ断片が得られた。
１）を大量培養し、菌体をアルカリ処理してプラスミド
を単離し、種々の制限酵素を単独でもしくは２以上を組
み合わせて用いて、上記プラスミドを切断することによ
り、次のＤＮＡ断片が得られた。
【００５４】(1) ４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III Ｄ
ＮＡ断片 (2) ３．７ｋｂｐのＳａｌ Ｉ−Ｈｉｎｄ III Ｄ
ＮＡ断片 (3) ３．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III −Ｐｓｔ Ｉ Ｄ
ＮＡ断片、および (4) １．５ｋｂｐのＨｉｎｄ III −ＥｃｏＲＩ Ｄ
ＮＡ断片。
ＮＡ断片 (2) ３．７ｋｂｐのＳａｌ Ｉ−Ｈｉｎｄ III Ｄ
ＮＡ断片 (3) ３．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III −Ｐｓｔ Ｉ Ｄ
ＮＡ断片、および (4) １．５ｋｂｐのＨｉｎｄ III −ＥｃｏＲＩ Ｄ
ＮＡ断片。
【００５５】これらのＤＮＡ断片を再び上記方法に準じ
てｐＵＣ１８プラスミドベクターに組み込み、それぞれ
のＤＮＡ断片に対応する組み換えプラスミド(1) ｐＬＵ
Ｘ１８０２、(2) ｐＬＵＸ１８０３、(3) ｐＬＵＸ１８
０４および(4) ｐＬＵＸ１８０５を得た。これらの組換
えプラスミドにより、それぞれ、大腸菌ＪＭ１０９株を
形質転換し、そのルシフェラーゼ活性を調べたところ、
ｐＬＵＸ１８０２を有する形質転換大腸菌（ＪＭ１０９
（ｐＬＵＸ１８０２）と命名）、およびｐＬＵＸ１８０
３を有する形質転換大腸菌（ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８
０３）と命名）にルシフェラーゼ活性が認められた。
てｐＵＣ１８プラスミドベクターに組み込み、それぞれ
のＤＮＡ断片に対応する組み換えプラスミド(1) ｐＬＵ
Ｘ１８０２、(2) ｐＬＵＸ１８０３、(3) ｐＬＵＸ１８
０４および(4) ｐＬＵＸ１８０５を得た。これらの組換
えプラスミドにより、それぞれ、大腸菌ＪＭ１０９株を
形質転換し、そのルシフェラーゼ活性を調べたところ、
ｐＬＵＸ１８０２を有する形質転換大腸菌（ＪＭ１０９
（ｐＬＵＸ１８０２）と命名）、およびｐＬＵＸ１８０
３を有する形質転換大腸菌（ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ１８
０３）と命名）にルシフェラーゼ活性が認められた。
【００５６】図２に組換えプラスミドｐＬＵＸ１８０
１、ｐＬＵＸ１８０２、ｐＬＵＸ１８０３、ｐＬＵＸ１
８０４およびｐＬＵＸ１８０５の制限酵素切断地図を示
し、図３にｐＬＵＸ１８０２の模式図を示す。図２から
ルシフェラーゼ遺伝子は３．７ｋｂｐのＳａｌＩ−Ｈｉ
ｎｄ III ＤＮＡ断片および４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ
III ＤＮＡ断片内に存在すことが確認された。
１、ｐＬＵＸ１８０２、ｐＬＵＸ１８０３、ｐＬＵＸ１
８０４およびｐＬＵＸ１８０５の制限酵素切断地図を示
し、図３にｐＬＵＸ１８０２の模式図を示す。図２から
ルシフェラーゼ遺伝子は３．７ｋｂｐのＳａｌＩ−Ｈｉ
ｎｄ III ＤＮＡ断片および４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ
III ＤＮＡ断片内に存在すことが確認された。
【００５７】次に、本発明者らによるホロルシフェラー
ゼの分離・精製法について説明する。
ゼの分離・精製法について説明する。
【００５８】菌体内ではルシフェラーゼはフラビンモノ
ヌクレオチドと特定物質とを補因子としてホロ酵素の状
態となっているので、これを上記発光細菌から分離・精
製する場合も、上記形質転換体から分離・精製する場合
も、該ホロ酵素中の上記２つの補因子がルシフェラーゼ
からはずれない方法を用いて、該ホロルシフェラーゼの
分離・精製を行う必要がある。
ヌクレオチドと特定物質とを補因子としてホロ酵素の状
態となっているので、これを上記発光細菌から分離・精
製する場合も、上記形質転換体から分離・精製する場合
も、該ホロ酵素中の上記２つの補因子がルシフェラーゼ
からはずれない方法を用いて、該ホロルシフェラーゼの
分離・精製を行う必要がある。
【００５９】菌体の培養 発光細菌を、例えばハスティングらの前記方法（Method
s in Enzymology vol.LVII ，153(1978) により培養
し、菌体内にホロルシフェラーゼを蓄積させる。
s in Enzymology vol.LVII ，153(1978) により培養
し、菌体内にホロルシフェラーゼを蓄積させる。
【００６０】あるいは、上記形式転換体ＪＭ１０９（ｐ
ＬＵＸ１８０２）を、例えば特開平２−２３６３号に示
す方法により培養する。培地としては、例えば、E. Co
liＪＭ１０９株の培養に用いられるＬＢ培地（１％トリ
プトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）等が
挙げられる。また、該培地に、リボフラビンを添加する
のも好ましい。培養温度は、例えば３０〜４０℃、好ま
しくは３７℃程度で、培養時間は、例えば２〜１６時
間、好ましくは８時間程度である。該培地にイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナ
カライテスク社製）を添加することにより、ベクターｐ
ＵＣ１８のｌａｃプロモーターが誘導され、ホロルシフ
ェラーゼの生産が行われる。
ＬＵＸ１８０２）を、例えば特開平２−２３６３号に示
す方法により培養する。培地としては、例えば、E. Co
liＪＭ１０９株の培養に用いられるＬＢ培地（１％トリ
プトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）等が
挙げられる。また、該培地に、リボフラビンを添加する
のも好ましい。培養温度は、例えば３０〜４０℃、好ま
しくは３７℃程度で、培養時間は、例えば２〜１６時
間、好ましくは８時間程度である。該培地にイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナ
カライテスク社製）を添加することにより、ベクターｐ
ＵＣ１８のｌａｃプロモーターが誘導され、ホロルシフ
ェラーゼの生産が行われる。
【００６１】ホロ酵素の抽出および精製 培養した菌体を、遠心分離等により集菌し、集菌した菌
体を破砕する。破砕方法としては、菌体に例えば細胞磨
砕用酸化アルミニウムを加えて、菌体を乳鉢で磨砕する
方法、あるいは緩衝液中、浸透圧ショックによる方法、
あるいは、酵素リゾチームや界面活性剤等を用いた菌体
破砕法が挙げられる。
体を破砕する。破砕方法としては、菌体に例えば細胞磨
砕用酸化アルミニウムを加えて、菌体を乳鉢で磨砕する
方法、あるいは緩衝液中、浸透圧ショックによる方法、
あるいは、酵素リゾチームや界面活性剤等を用いた菌体
破砕法が挙げられる。
【００６２】得られた抽出液から、該ホロルシフェラー
ゼの２つの補因子がホロルシフェラーゼからはずれない
ように、以下の(i)(ii) の方法によりホロ酵素を精製し
た。すなわち、(i) まず、クエン酸鉄アンモニウムで処
理したイオン交換カラムによるクロマトグラフィーを行
う。
ゼの２つの補因子がホロルシフェラーゼからはずれない
ように、以下の(i)(ii) の方法によりホロ酵素を精製し
た。すなわち、(i) まず、クエン酸鉄アンモニウムで処
理したイオン交換カラムによるクロマトグラフィーを行
う。
【００６３】「クエン酸鉄アンモニウムで処理する」方
法として、例えば、カラムゲルをカラムに充填する前
に、クエン酸鉄アンモニウムを含有する緩衝液中で攪拌
する。イオン交換クロマトグラフィーとして、例えば、
ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロファイン等
の弱陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。
法として、例えば、カラムゲルをカラムに充填する前
に、クエン酸鉄アンモニウムを含有する緩衝液中で攪拌
する。イオン交換クロマトグラフィーとして、例えば、
ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロファイン等
の弱陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。
【００６４】(ii)次に、上記(i) により精製したホロル
シフェラーゼをさらに、ゲル濾過法により精製する。ゲ
ル濾過法として、例えば、セルファデックス−Ｇ７５カ
ラムが用いられる。
シフェラーゼをさらに、ゲル濾過法により精製する。ゲ
ル濾過法として、例えば、セルファデックス−Ｇ７５カ
ラムが用いられる。
【００６５】(iii) 該ホロルシフェラーゼの精製法の他
の例としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下クロマト
グラフィーを行う方法が挙げられる。
の例としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下クロマト
グラフィーを行う方法が挙げられる。
【００６６】ここで、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下」と
は、例えば、 クロマトグラフィーのカラムをＮＡＤＨあるいはＮ
ＡＤＰＨを含有した緩衝液で平衡化する、 カラムにアプライする前の粗酵素液にＮＡＤＨある
いはＮＡＤＰＨを混合しておき、ついで該混合液をカラ
ムにアプライする、 カラムの展開液（溶離液）中にＮＡＤＨあるいはＮ
ＡＤＰＨを加えて、その展開液を用いて該ホロルシフェ
ラーゼを溶離する、 の上記のいずれか１つあるいは複数の操作を含む
処理を言う。
は、例えば、 クロマトグラフィーのカラムをＮＡＤＨあるいはＮ
ＡＤＰＨを含有した緩衝液で平衡化する、 カラムにアプライする前の粗酵素液にＮＡＤＨある
いはＮＡＤＰＨを混合しておき、ついで該混合液をカラ
ムにアプライする、 カラムの展開液（溶離液）中にＮＡＤＨあるいはＮ
ＡＤＰＨを加えて、その展開液を用いて該ホロルシフェ
ラーゼを溶離する、 の上記のいずれか１つあるいは複数の操作を含む
処理を言う。
【００６７】ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨが存在する
と、該ホロルシフェラーゼは、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤ
ＰＨを酸化型に変えることにより、自らの補因子である
ＦＭＮをＦＭＮＨ2 に還元する。ＦＭＮは、還元されて
ＦＭＮＨ2 になると、ルシフェラーゼとの結合がより強
固になるので、フラビンモノヌクレオチドおよび該特異
吸収物質がルシフェラーゼからはずれないで、該ホロル
シフェラーゼが精製せられる。
と、該ホロルシフェラーゼは、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤ
ＰＨを酸化型に変えることにより、自らの補因子である
ＦＭＮをＦＭＮＨ2 に還元する。ＦＭＮは、還元されて
ＦＭＮＨ2 になると、ルシフェラーゼとの結合がより強
固になるので、フラビンモノヌクレオチドおよび該特異
吸収物質がルシフェラーゼからはずれないで、該ホロル
シフェラーゼが精製せられる。
【００６８】上記クロマトグラフィーとして、例えば、
上記ＤＥＡＥ・セルロファイン等の弱陰イオン交換クロ
マトグラフィーが好適に用いられる。
上記ＤＥＡＥ・セルロファイン等の弱陰イオン交換クロ
マトグラフィーが好適に用いられる。
【００６９】以上、(i) クエン酸鉄アンモニウムで処理
したイオン交換クロマトグラフィー、および(ii)ゲル濾
過の２つの方法の組合わせにより精製されたホロルシフ
ェラーゼは、下記(1)(2)の確認により、該ルシフェラー
ゼが、確かに２つの補因子が結合してホロ酵素の状態に
なっていることが明らかになった。
したイオン交換クロマトグラフィー、および(ii)ゲル濾
過の２つの方法の組合わせにより精製されたホロルシフ
ェラーゼは、下記(1)(2)の確認により、該ルシフェラー
ゼが、確かに２つの補因子が結合してホロ酵素の状態に
なっていることが明らかになった。
【００７０】(1) ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ルシフェ
ラーゼのαおよびβサブユニットに対応する２本のバン
ドが確認された。
ラーゼのαおよびβサブユニットに対応する２本のバン
ドが確認された。
【００７１】(2) 可視部の吸収スペクトルにおいて、一
方の補因子であるＦＭＮに由来する約３７０ｎｍ、４３
５ｎｍ、４６０ｎｍの吸収、および、もう１つの補因子
である上記特定物質に由来する約３５０ｎｍ、４０５ｎ
ｍ、５４０ｎｍ、５７０ｎｍの吸収が確認された。
方の補因子であるＦＭＮに由来する約３７０ｎｍ、４３
５ｎｍ、４６０ｎｍの吸収、および、もう１つの補因子
である上記特定物質に由来する約３５０ｎｍ、４０５ｎ
ｍ、５４０ｎｍ、５７０ｎｍの吸収が確認された。
【００７２】該ホロルシフェラーゼにＮＡＤＨおよびア
ルデヒドを加えたところ、前記反応(c)(d)による発光反
応が確認された。また、ＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨ
を加えた場合にも発光反応は確認されたが、この場合、
光量はＮＡＤＨの場合より弱かった。このことにより、
該ホロルシフェラーゼは、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
を酸化することによるＦＭＮの還元反応（上記反応
（ｃ））を触媒することが明らかとなった。従って、該
ホロルシフェラーゼのみを用いて、上記反応(c)(d)によ
るＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの定量が行えることが判明
した。
ルデヒドを加えたところ、前記反応(c)(d)による発光反
応が確認された。また、ＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨ
を加えた場合にも発光反応は確認されたが、この場合、
光量はＮＡＤＨの場合より弱かった。このことにより、
該ホロルシフェラーゼは、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
を酸化することによるＦＭＮの還元反応（上記反応
（ｃ））を触媒することが明らかとなった。従って、該
ホロルシフェラーゼのみを用いて、上記反応(c)(d)によ
るＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの定量が行えることが判明
した。
【００７３】ホロルシフェラーゼによるＮＡＤＨおよび
ＮＡＤＰＨの定量 該ホロルシフェラーゼは、例えば、上記の如く、(i) ク
エン酸鉄アンモニウムで処理したイオン交換カラムによ
るクロマトグラフィーおよび(iii) ゲル濾過の２つの方
法の組合せにより純品として得られ、これを用いること
により、下記の方法によりＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを
簡便に感度良く測定することができる。
ＮＡＤＰＨの定量 該ホロルシフェラーゼは、例えば、上記の如く、(i) ク
エン酸鉄アンモニウムで処理したイオン交換カラムによ
るクロマトグラフィーおよび(iii) ゲル濾過の２つの方
法の組合せにより純品として得られ、これを用いること
により、下記の方法によりＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを
簡便に感度良く測定することができる。
【００７４】被試験サンプル中のＮＡＤＨおよびＮＡＤ
ＰＨの定量は、 (1) 被試験サンプル (2) 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ (3) アルデヒド を混合し、発生する光を測定することにより行われる。
ＰＨの定量は、 (1) 被試験サンプル (2) 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ (3) アルデヒド を混合し、発生する光を測定することにより行われる。
【００７５】ここで、アルデヒドとしては、好ましくは
炭素数８以上の直鎖飽和脂肪族アルデヒドであり、その
好適な例としてｎ−デカナール、ｎ−テトラデカナール
が挙げられる。
炭素数８以上の直鎖飽和脂肪族アルデヒドであり、その
好適な例としてｎ−デカナール、ｎ−テトラデカナール
が挙げられる。
【００７６】また、「光を測定する」とは、例えば、酵
素反応開始直後の発光強度のピーク値を測定すること、
あるいは、発光量を単位時間積算した値を測定すること
等が挙げられるが、その他、通常の発光測定に用いる方
法も用いることができる。
素反応開始直後の発光強度のピーク値を測定すること、
あるいは、発光量を単位時間積算した値を測定すること
等が挙げられるが、その他、通常の発光測定に用いる方
法も用いることができる。
【００７７】また、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの定量
は、該ホロ酵素の上記完全精製品を用いなくても、精製
途中の中間精製品を用いることによって感度良く行うこ
とができる。
は、該ホロ酵素の上記完全精製品を用いなくても、精製
途中の中間精製品を用いることによって感度良く行うこ
とができる。
【００７８】上記中間精製品として、例えば、下記のも
のが用いられる。
のが用いられる。
【００７９】(1) 上記ホロルシフェラーゼを生産する細
胞を破砕して得られる菌体抽出液、(2) 上記菌体抽出液
に透析、硫安沈殿および限外濾過のうち少なくとも１つ
の処理を行ったもの、(3) 上記菌体抽出液に上記(i)
(ii)(iii)の精製法のうち少なくとも１つの処理を行っ
たもの。
胞を破砕して得られる菌体抽出液、(2) 上記菌体抽出液
に透析、硫安沈殿および限外濾過のうち少なくとも１つ
の処理を行ったもの、(3) 上記菌体抽出液に上記(i)
(ii)(iii)の精製法のうち少なくとも１つの処理を行っ
たもの。
【００８０】次に、デヒドロゲナーゼとホロルシフェラ
ーゼの共役反応による生体内微量物質の測定の例につい
て説明する。
ーゼの共役反応による生体内微量物質の測定の例につい
て説明する。
【００８１】本発明で用いられるホロルシフェラーゼ
は、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの測定に利用できるだけでな
く、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを生成する酵素反応と該ホロ
ルシフェラーゼの行う反応（上記(c)(d)）を共役させる
ことにより、この酵素の基質濃度や、酵素活性を簡便に
感度よく測定することができる。ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ
を生成する酵素として、例えばデヒドロゲナーゼが挙げ
られる。
は、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの測定に利用できるだけでな
く、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを生成する酵素反応と該ホロ
ルシフェラーゼの行う反応（上記(c)(d)）を共役させる
ことにより、この酵素の基質濃度や、酵素活性を簡便に
感度よく測定することができる。ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ
を生成する酵素として、例えばデヒドロゲナーゼが挙げ
られる。
【００８２】例えば、デヒドロゲナーゼとホロルシフェ
ラーゼの共役反応による、被試験試料中の生体内微量物
質の測定は、 (1) 被試験サンプル (2) ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ (3) 測定目的物質に特異的なデヒドロゲナーゼ (4) 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ (5) アルデヒド を混合し、発生する光を測定することにより行われる。
ラーゼの共役反応による、被試験試料中の生体内微量物
質の測定は、 (1) 被試験サンプル (2) ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ (3) 測定目的物質に特異的なデヒドロゲナーゼ (4) 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ (5) アルデヒド を混合し、発生する光を測定することにより行われる。
【００８３】
【実施例】参考例１ 組換え体プラスミドおよび形質転換微生物の調製 ビブリオ ハーベイＡＴＣＣ１４１２６株を、２％Ｎａ
Ｃｌを含有するＬＢ培地（バクトトリプトン１ｇ、酵母
エキス０．５ｇ、ＮａＣｌ ２ｇ／１００ｍｌ）１００
ｍｌで２８℃にて８時間培養した後、８，０００rpm で
１０分間遠心分離を行った。得られた菌体沈殿物をＥＤ
ＴＡを含有する生理食塩水（ＮａＣｌ０．８８ｇ、ＥＤ
ＴＡ・Ｎａ2 １．８６ｇ／１００ｍｌ、ｐＨ８．０）
１０ｍｌに懸濁して洗浄し、８，０００rpm で１０分間
遠心分離を行った。次いで、沈殿物を上記のＥＤＴＡを
含有する生理食塩水５ｍｌに懸濁し、リゾチームを最終
濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で２０
分間振盪しながらインキュベーションを行った。さら
に、この溶液に１０％ＳＤＳを０．６ｍｌ添加し、６０
℃で１０分間インキュベーションした。その後、等量の
フェノール溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミ
ルアルコール＝２５：２４：１）を添加して穏やかに攪
拌し、次いで遠心分離を行ってその上清（ＤＮＡを含有
する水層）を得た。この上清について、上記のフェノー
ル溶液による抽出操作をさらに２回繰り返した。
Ｃｌを含有するＬＢ培地（バクトトリプトン１ｇ、酵母
エキス０．５ｇ、ＮａＣｌ ２ｇ／１００ｍｌ）１００
ｍｌで２８℃にて８時間培養した後、８，０００rpm で
１０分間遠心分離を行った。得られた菌体沈殿物をＥＤ
ＴＡを含有する生理食塩水（ＮａＣｌ０．８８ｇ、ＥＤ
ＴＡ・Ｎａ2 １．８６ｇ／１００ｍｌ、ｐＨ８．０）
１０ｍｌに懸濁して洗浄し、８，０００rpm で１０分間
遠心分離を行った。次いで、沈殿物を上記のＥＤＴＡを
含有する生理食塩水５ｍｌに懸濁し、リゾチームを最終
濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で２０
分間振盪しながらインキュベーションを行った。さら
に、この溶液に１０％ＳＤＳを０．６ｍｌ添加し、６０
℃で１０分間インキュベーションした。その後、等量の
フェノール溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミ
ルアルコール＝２５：２４：１）を添加して穏やかに攪
拌し、次いで遠心分離を行ってその上清（ＤＮＡを含有
する水層）を得た。この上清について、上記のフェノー
ル溶液による抽出操作をさらに２回繰り返した。
【００８４】得られた上清に２倍量のエタノールを添加
し、浮遊している染色体ＤＮＡをガラス棒を用いて巻き
とり、回収した。この染色体ＤＮＡが巻き付いているガ
ラス棒を７０％エタノール、８０％エタノール、９０％
エタノール、１００％エタノールに順次浸漬し、ＤＮＡ
の脱水を行った。これをさらに室温で乾燥させた後、１
ｍｌのＴＥ１０−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ・Ｎａ2 ）に溶解させた。
し、浮遊している染色体ＤＮＡをガラス棒を用いて巻き
とり、回収した。この染色体ＤＮＡが巻き付いているガ
ラス棒を７０％エタノール、８０％エタノール、９０％
エタノール、１００％エタノールに順次浸漬し、ＤＮＡ
の脱水を行った。これをさらに室温で乾燥させた後、１
ｍｌのＴＥ１０−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ・Ｎａ2 ）に溶解させた。
【００８５】このようにして得られたビブリオ ハーベ
イの染色体ＤＮＡを２μｇ含有する溶液（ＤＮＡ量はＯ
Ｄ ２６０ｎｍにおける吸光度より求めた）に、１／１
０量の１０×Ｓａｕ３ＡＩ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、ｌ
Ｍ ＮａＣｌ）および制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを２単位添
加し、３７℃で１５分間部分消化した。この溶液のうち
ＤＮＡ２００ｎｇに相当する量（上記ＤＮＡ消化物の１
／１０量に相当する量）と、制限酵素で完全消化した大
腸菌プラスミドＤＮＡとを混合した。
イの染色体ＤＮＡを２μｇ含有する溶液（ＤＮＡ量はＯ
Ｄ ２６０ｎｍにおける吸光度より求めた）に、１／１
０量の１０×Ｓａｕ３ＡＩ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、ｌ
Ｍ ＮａＣｌ）および制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを２単位添
加し、３７℃で１５分間部分消化した。この溶液のうち
ＤＮＡ２００ｎｇに相当する量（上記ＤＮＡ消化物の１
／１０量に相当する量）と、制限酵素で完全消化した大
腸菌プラスミドＤＮＡとを混合した。
【００８６】この「制限酵素で完全消化した大腸菌プラ
スミドＤＮＡ」とは、大腸菌の多コピープラスミドｐＵ
Ｃ１８のＤＮＡ１００ｎｇに、１／１０量の１０×Ｂａ
ｍＨｌ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、７０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、１Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、および０．１％ウ
シ血清アルブミン）、２単位の制限酵素ＢａｍＨｌを添
加して、３７℃で２時間インキュベーションして完全に
消化したものである。この混合液に、１／１０量の１０
×Ｔ4 リガーゼ緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭジ
チオスレイトール、および１ｍＭ ＡＴＰ）、および１
０単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼを添加し、１０℃で一晩反
応を行って連結させた（図１参照）。
スミドＤＮＡ」とは、大腸菌の多コピープラスミドｐＵ
Ｃ１８のＤＮＡ１００ｎｇに、１／１０量の１０×Ｂａ
ｍＨｌ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、７０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、１Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、および０．１％ウ
シ血清アルブミン）、２単位の制限酵素ＢａｍＨｌを添
加して、３７℃で２時間インキュベーションして完全に
消化したものである。この混合液に、１／１０量の１０
×Ｔ4 リガーゼ緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭジ
チオスレイトール、および１ｍＭ ＡＴＰ）、および１
０単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼを添加し、１０℃で一晩反
応を行って連結させた（図１参照）。
【００８７】大腸菌ＪＭ１０９株のコンビテントセル
（宝酒造社製）に上記連結混合物を接触させて、該大腸
菌の形質転換を行った。この菌体を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天培
地（１００ｍｌあたりバクトトリプトン１ｇ、酵母エキ
ス０．５ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、および寒天１．５ｇ
を含む）１０枚に塗り、３７℃で一晩平板培養してスク
リーニングを行った。この培養で得られた１０，０００
個のアンピシリン耐性の形質転換コロニーに、ｎ−デカ
ナール（半井化学）を噴霧器を用いて霧状に添加し、発
光を示した（ルシフェラーゼ活性を有する）コロニーを
１株得た。このコロニーを形成する菌株に含有されるル
シフェラーゼ活性を有する組換え体プラスミドをｐＬＵ
Ｘ１８０１と命名し、該大腸菌コロニーを大量培養した
後にアルカリ処理を行うことにより、該プラスミドｐＬ
ＵＸ１８０１を単離・精製した。この精製されたプラス
ミドｐＬＵＸ１８０１に制限酵素Ｈｉｎｄ III、Ｓａｌ
Ｉ、ＰｓｔＩ、およびＥｃｏＲＩを種々の組合わせで作
用させて消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動す
ることにより、以下のＤＮＡ破片を得た：(1) ４．０ｋ
ｂｐのＨｉｎｄ IIIＤＮＡ断片、(2) ３．７ｋｂｐのＳ
ａｌＩ−Ｈｉｎｄ III ＤＮＡ断片、(3) ３．０ｋｂｐ
のＨｉｎｄ III−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片、および(4)
１．５ｋｂｐのＨｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断
片。
（宝酒造社製）に上記連結混合物を接触させて、該大腸
菌の形質転換を行った。この菌体を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天培
地（１００ｍｌあたりバクトトリプトン１ｇ、酵母エキ
ス０．５ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、および寒天１．５ｇ
を含む）１０枚に塗り、３７℃で一晩平板培養してスク
リーニングを行った。この培養で得られた１０，０００
個のアンピシリン耐性の形質転換コロニーに、ｎ−デカ
ナール（半井化学）を噴霧器を用いて霧状に添加し、発
光を示した（ルシフェラーゼ活性を有する）コロニーを
１株得た。このコロニーを形成する菌株に含有されるル
シフェラーゼ活性を有する組換え体プラスミドをｐＬＵ
Ｘ１８０１と命名し、該大腸菌コロニーを大量培養した
後にアルカリ処理を行うことにより、該プラスミドｐＬ
ＵＸ１８０１を単離・精製した。この精製されたプラス
ミドｐＬＵＸ１８０１に制限酵素Ｈｉｎｄ III、Ｓａｌ
Ｉ、ＰｓｔＩ、およびＥｃｏＲＩを種々の組合わせで作
用させて消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動す
ることにより、以下のＤＮＡ破片を得た：(1) ４．０ｋ
ｂｐのＨｉｎｄ IIIＤＮＡ断片、(2) ３．７ｋｂｐのＳ
ａｌＩ−Ｈｉｎｄ III ＤＮＡ断片、(3) ３．０ｋｂｐ
のＨｉｎｄ III−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片、および(4)
１．５ｋｂｐのＨｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断
片。
【００８８】(1) 〜(4) それぞれのＤＮＡ断片２０ｎｇ
と、１０ｎｇのｐＵＣ１８ＤＮＡを(1) 〜(4) と同じ制
限酵素の組合わせで消化したＤＮＡとを、１０単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０１よりサブクローニングし、プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０２、ｐＬＵＸ１８０３、ｐＬＵＸ１８０４、お
よびｐＬＵＸ１８０５を調製した（図２）。つまり、上
記４種の組換え体プラスミドは、それぞれ、以下のよう
なビブリオ ハーベイ由来のＤＮＡ断片を有する：ｐＬ
ＵＸ１８０２：４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III ＤＮＡ断
片、ｐＬＵＸ１８０３：３．７ＫｂｐのＳａｌＩ−Ｈｉ
ｎｄ IIIＤＮＡ断片、ｐＬＵＸ１８０４：３．０ｋｂｐ
のＨｉｎｄ III−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片、およびｐＬＵ
Ｘ１８０５：１．５ｋｂｐのＨｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片。これらそれぞれの組換え体プラスミドで
大腸菌ＪＭ１０９株を上記と同様の方法により形質転換
した。この形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、上記ｎ
−デカナールを用いる方法によりルシフェラーゼ活性を
調べた。その結果、組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０
２およびｐＬＵＸ１８０３を含有する菌体にルシフェラ
ーゼ活性が検出された。
と、１０ｎｇのｐＵＣ１８ＤＮＡを(1) 〜(4) と同じ制
限酵素の組合わせで消化したＤＮＡとを、１０単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０１よりサブクローニングし、プラスミドｐＬＵ
Ｘ１８０２、ｐＬＵＸ１８０３、ｐＬＵＸ１８０４、お
よびｐＬＵＸ１８０５を調製した（図２）。つまり、上
記４種の組換え体プラスミドは、それぞれ、以下のよう
なビブリオ ハーベイ由来のＤＮＡ断片を有する：ｐＬ
ＵＸ１８０２：４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III ＤＮＡ断
片、ｐＬＵＸ１８０３：３．７ＫｂｐのＳａｌＩ−Ｈｉ
ｎｄ IIIＤＮＡ断片、ｐＬＵＸ１８０４：３．０ｋｂｐ
のＨｉｎｄ III−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片、およびｐＬＵ
Ｘ１８０５：１．５ｋｂｐのＨｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片。これらそれぞれの組換え体プラスミドで
大腸菌ＪＭ１０９株を上記と同様の方法により形質転換
した。この形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、上記ｎ
−デカナールを用いる方法によりルシフェラーゼ活性を
調べた。その結果、組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０
２およびｐＬＵＸ１８０３を含有する菌体にルシフェラ
ーゼ活性が検出された。
【００８９】ルシフェラーゼ活性を発現し得る上記プラ
スミドｐＬＵＸ１８０２の、上記ｐＬＵＸ１８０１から
の調製の詳細は次のとおりである。まず、ｐＬＵＸ１８
０１のＤＮＡ１０μｇに、１／１０量の１０×Ｈｉｎｄ
III緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、７０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、６００ｍＭ ＮａＣｌ）
および制限酵素Ｈｉｎｄ III を２０単位添加して３７
℃で２時間完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電
気泳動することによって４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III
ＤＮＡ断片を得る。
スミドｐＬＵＸ１８０２の、上記ｐＬＵＸ１８０１から
の調製の詳細は次のとおりである。まず、ｐＬＵＸ１８
０１のＤＮＡ１０μｇに、１／１０量の１０×Ｈｉｎｄ
III緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、７０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、６００ｍＭ ＮａＣｌ）
および制限酵素Ｈｉｎｄ III を２０単位添加して３７
℃で２時間完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電
気泳動することによって４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III
ＤＮＡ断片を得る。
【００９０】この４．０ｋｂｐのＨｉｎｄ III ＤＮＡ
断片２０ｎｇと、ｐＵＣ１８ ＤＮＡ１０ｎｇを制限酵
素Ｈｉｎｄ III２単位で消化したＤＮＡとをＴ4 ＤＮＡ
リガーゼ１０単位を用いて結合し、組換え体プラスミド
ｐＬＵＸ１８０２を得る。
断片２０ｎｇと、ｐＵＣ１８ ＤＮＡ１０ｎｇを制限酵
素Ｈｉｎｄ III２単位で消化したＤＮＡとをＴ4 ＤＮＡ
リガーゼ１０単位を用いて結合し、組換え体プラスミド
ｐＬＵＸ１８０２を得る。
【００９１】このようにしてプラスミドｐＬＵＸ１８０
１から得られた組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０２で
大腸菌ＪＭ１０９株を上記と同様の方法により形質転換
した。この形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを
含有する１．５ｍｌのＬＢ培地で培養し、細胞数が５×
１０8 個／ｍｌに達したときにＩＰＴＧを１ｍＭになる
ように添加した。ｐＬＵＸ１８０２は、ｐＵＣ１８由来
のラクトースオペロンのプロモーター（Ｐｌａｃ）を有
するので、ＩＰＴＧの添加によりホロルシフェラーゼの
誘導が可能であり、かつホロルシフェラーゼが効率よく
生産され得る。さらに２時間培養を継続することにより
この形質転換体にホロルシフェラーゼを生産させた。こ
の培養物を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られ
た沈殿物を５００μｌの上記ＴＥ１０−１緩衝液（ｐＨ
８．０）に懸濁させた。この懸濁液から２０μｌを採取
し、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた沈
殿物を５μｌの滅菌水に懸濁し、５μｌの２×試料緩衝
液（０．１３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４
％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタ
ノール、および０．００２％ブロムフェノールブルー）
を添加し、９０℃で３分間熱処理して大腸菌を熱変性さ
せ、菌体内タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動後のゲ
ルを染色し、デンシトメーターにて分析すると、分子量
４２，０００および３７，０００にバンドが認められ
た。この２つのバンドは、それぞれビブリオ ハーベイ
由来のルシフェラーゼのサブユニットαおよびβに相当
する。この２つのバンドの吸光度を合計し、他のバンド
の吸光度の合計と比較すると、ルシフェラーゼ（α＋β
サブユニット）の発現は菌体内タンパク質の１０％以上
であった。この電気泳動図を図４に示す。図４におい
て、１は分子量マーカー；２はプラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８を有する大腸菌ＪＭ１０９株を上記と同様に熱処
理して得た菌体内のタンパク質：そして３は上記組換え
体プラスミドｐＬＵＸ１８０２を有する大腸菌ＪＭ１０
９株の熱処理菌体内タンパク質を示す。
１から得られた組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０２で
大腸菌ＪＭ１０９株を上記と同様の方法により形質転換
した。この形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを
含有する１．５ｍｌのＬＢ培地で培養し、細胞数が５×
１０8 個／ｍｌに達したときにＩＰＴＧを１ｍＭになる
ように添加した。ｐＬＵＸ１８０２は、ｐＵＣ１８由来
のラクトースオペロンのプロモーター（Ｐｌａｃ）を有
するので、ＩＰＴＧの添加によりホロルシフェラーゼの
誘導が可能であり、かつホロルシフェラーゼが効率よく
生産され得る。さらに２時間培養を継続することにより
この形質転換体にホロルシフェラーゼを生産させた。こ
の培養物を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られ
た沈殿物を５００μｌの上記ＴＥ１０−１緩衝液（ｐＨ
８．０）に懸濁させた。この懸濁液から２０μｌを採取
し、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた沈
殿物を５μｌの滅菌水に懸濁し、５μｌの２×試料緩衝
液（０．１３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４
％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタ
ノール、および０．００２％ブロムフェノールブルー）
を添加し、９０℃で３分間熱処理して大腸菌を熱変性さ
せ、菌体内タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動後のゲ
ルを染色し、デンシトメーターにて分析すると、分子量
４２，０００および３７，０００にバンドが認められ
た。この２つのバンドは、それぞれビブリオ ハーベイ
由来のルシフェラーゼのサブユニットαおよびβに相当
する。この２つのバンドの吸光度を合計し、他のバンド
の吸光度の合計と比較すると、ルシフェラーゼ（α＋β
サブユニット）の発現は菌体内タンパク質の１０％以上
であった。この電気泳動図を図４に示す。図４におい
て、１は分子量マーカー；２はプラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８を有する大腸菌ＪＭ１０９株を上記と同様に熱処
理して得た菌体内のタンパク質：そして３は上記組換え
体プラスミドｐＬＵＸ１８０２を有する大腸菌ＪＭ１０
９株の熱処理菌体内タンパク質を示す。
【００９２】参考例２ 形質転換微生物を用いたホロルシフェラーゼの生産およ
び精製 （イ） 形質転換大腸菌の培養 以下に示す方法により、培地Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ調製
した。
び精製 （イ） 形質転換大腸菌の培養 以下に示す方法により、培地Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ調製
した。
【００９３】培地Ａ（平板用培地） ポリペプトン １６ｇ 酵母エキス １０ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ 寒天末 １５ｇ 以上を純水に溶解し、１Ｌとした。１２０℃、２０分間
滅菌を行ったのち、７０℃付近で、 アンピシリン ２．５ｇ ＩＰＴＧ ０．２３８ｇ を加えて平板を作成した。
滅菌を行ったのち、７０℃付近で、 アンピシリン ２．５ｇ ＩＰＴＧ ０．２３８ｇ を加えて平板を作成した。
【００９４】培地Ｂ（種菌用液体培地） ポリペプトン １６ｇ 酵母エキス １０ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ 乳糖 ２．５ｇ リボフラビン ３０ｍｇ クエン酸鉄アンモニウム １００ｍｇ 以上を純水に溶解し、全量を１Ｌとした。１２０℃、２
０分間滅菌を行ったのち、液温が室温に戻った時点で、 アンピシリン ０．５ｇ ＩＰＴＧ ０．２３８ｍｇ を加えた。
０分間滅菌を行ったのち、液温が室温に戻った時点で、 アンピシリン ０．５ｇ ＩＰＴＧ ０．２３８ｍｇ を加えた。
【００９５】培地Ｃ（大量培養培地） ポリペプトン １６ｇ 酵母エキス １０ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ 乳糖 ４ｇ リボフラビン ３０ｍｇ クエン酸鉄アンモニウム １００ｍｇ 以上を純水に溶解し、全量を１Ｌとした。１２０℃、２
０分間滅菌を行ったのち、液温が室温に戻った時点で、 アンピシリン ０．２ｇ を加えた。
０分間滅菌を行ったのち、液温が室温に戻った時点で、 アンピシリン ０．２ｇ を加えた。
【００９６】種菌の培養 平板上に保存した形質転換大腸菌ＪＭ１０９（ｐＬＵＸ
１８０２）を１白金耳取り１Ｌの培地Ｂ２本にそれぞれ
接種し、３７℃で１４時間振盪培養した。
１８０２）を１白金耳取り１Ｌの培地Ｂ２本にそれぞれ
接種し、３７℃で１４時間振盪培養した。
【００９７】大量培養 培地Ｃ１．５Ｌを１０本調製し、先に培養した種菌を１
本に付き２００ｍＬずつ接種した。これらを３７℃で８
時間通気培養し、培養液を１６，０００Ｇで５分間遠心
し、集菌した。得られた菌体の湿重量は８０〜１００ｇ
であった。菌体をただちに冷凍保存した。
本に付き２００ｍＬずつ接種した。これらを３７℃で８
時間通気培養し、培養液を１６，０００Ｇで５分間遠心
し、集菌した。得られた菌体の湿重量は８０〜１００ｇ
であった。菌体をただちに冷凍保存した。
【００９８】（ロ）ホロルシフェラーゼの抽出 冷凍保存菌体５０ｇと細胞磨砕用酸化アルミニウム５０
ｇに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６０ｍＬを加
え、乳鉢を用いて菌体をよく磨砕した。得られた懸濁液
を４５，２００Ｇで１０分間遠心し、上清を得た。沈殿
に再び５０ｍＭリン酸緩衝液６０ｍＬを加え、これを乳
鉢で磨砕し、遠心により上清を得た。こうして合計５回
抽出操作を行い、計３００ｍＬの抽出液を得た。
ｇに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６０ｍＬを加
え、乳鉢を用いて菌体をよく磨砕した。得られた懸濁液
を４５，２００Ｇで１０分間遠心し、上清を得た。沈殿
に再び５０ｍＭリン酸緩衝液６０ｍＬを加え、これを乳
鉢で磨砕し、遠心により上清を得た。こうして合計５回
抽出操作を行い、計３００ｍＬの抽出液を得た。
【００９９】（ハ）ホロルシフェラーゼの精製 イオン交換クロマトグラフィー ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００の１Ｌを洗浄し、
ついで５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し
た後、クエン酸鉄アンモニウム５ｇを加え、よく攪拌し
た後、３５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３Ｌで洗
浄した。さらにこれを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）２Ｌで洗浄、平衡化し、カラム（径５ｃｍ×長さ５
０ｃｍ）を作成した。
ついで５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し
た後、クエン酸鉄アンモニウム５ｇを加え、よく攪拌し
た後、３５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３Ｌで洗
浄した。さらにこれを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）２Ｌで洗浄、平衡化し、カラム（径５ｃｍ×長さ５
０ｃｍ）を作成した。
【０１００】本カラムに先に調製した菌体抽出液３００
ｍｌをアプライした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１Ｌおよび３５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
１Ｌからなる非線形グラジエント溶出液で展開、溶出し
た。グラジエント溶出終了後はさらに３５０ｍＭリン酸
緩衝液による溶出を行った。カラム溶出液各分画（１
７．５ｍＬ）の蛋白量を求めるために各分画から１０μ
Ｌを取り、ＣＢＢ色素液２ｍＬを加えて発色後、５９５
ｎｍの吸光度を測定した。図５に溶出曲線を示す。分画
番号１１４〜１２５をホロルシフェラーゼ分画とし、蛋
白純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検定したところ、夾
雑蛋白がほとんどないことが確認された。ホロルシフェ
ラーゼ分画を集め、結晶硫酸アンモニウムを加えて、７
５％飽和とし蛋白を沈澱させた。沈澱を遠心で集め、５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析の後、
次の精製過程に供した。
ｍｌをアプライした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１Ｌおよび３５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
１Ｌからなる非線形グラジエント溶出液で展開、溶出し
た。グラジエント溶出終了後はさらに３５０ｍＭリン酸
緩衝液による溶出を行った。カラム溶出液各分画（１
７．５ｍＬ）の蛋白量を求めるために各分画から１０μ
Ｌを取り、ＣＢＢ色素液２ｍＬを加えて発色後、５９５
ｎｍの吸光度を測定した。図５に溶出曲線を示す。分画
番号１１４〜１２５をホロルシフェラーゼ分画とし、蛋
白純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検定したところ、夾
雑蛋白がほとんどないことが確認された。ホロルシフェ
ラーゼ分画を集め、結晶硫酸アンモニウムを加えて、７
５％飽和とし蛋白を沈澱させた。沈澱を遠心で集め、５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析の後、
次の精製過程に供した。
【０１０１】ゲル濾過 ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−７５カラム（径５ｃｍ×長さ９０ｃｍ）
に、上記精製ホロルシフェラーゼ溶液（４５ｍＬ）をア
プライした。５０ｍＭリン酸緩衝液で溶出を行い、各分
画（１７．５ｍＬ）の蛋白量を求めるために各分画から
１０μＬを取り、ＣＢＢ色素液２ｍＬを加えて発色後、
５９５ｎｍの吸光度を測定した。図６に溶出曲線を示
す。分画番号３１〜３９のものを精製ホロルシフェラー
ゼ分画として集め、結晶硫酸アンモニウムを加えて７５
％飽和とし、沈殿を遠心により集めた。沈殿は５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析後、不溶物は
遠心で除き、以下の測定に用いた（１８ｍＬ）。図７に
各分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果および図８に精製ホロ
ルシフェラーゼの可視部吸収スペクトルを示す。図８か
ら明らかなように、精製ホロルシフェラーゼは、３５０
ｎｍ、４０５ｎｍ、５４０ｎｍおよび５７０ｎｍに特徴
的吸収スペクトルを示す物質を含むことが認められる。
ァデックスＧ−７５カラム（径５ｃｍ×長さ９０ｃｍ）
に、上記精製ホロルシフェラーゼ溶液（４５ｍＬ）をア
プライした。５０ｍＭリン酸緩衝液で溶出を行い、各分
画（１７．５ｍＬ）の蛋白量を求めるために各分画から
１０μＬを取り、ＣＢＢ色素液２ｍＬを加えて発色後、
５９５ｎｍの吸光度を測定した。図６に溶出曲線を示
す。分画番号３１〜３９のものを精製ホロルシフェラー
ゼ分画として集め、結晶硫酸アンモニウムを加えて７５
％飽和とし、沈殿を遠心により集めた。沈殿は５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析後、不溶物は
遠心で除き、以下の測定に用いた（１８ｍＬ）。図７に
各分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果および図８に精製ホロ
ルシフェラーゼの可視部吸収スペクトルを示す。図８か
ら明らかなように、精製ホロルシフェラーゼは、３５０
ｎｍ、４０５ｎｍ、５４０ｎｍおよび５７０ｎｍに特徴
的吸収スペクトルを示す物質を含むことが認められる。
【０１０２】（ニ） ホロルシフェラーゼの酵素活性の
測定 ４８８μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）、
１０μｌの（ハ）で得られたホロルシフェラーゼ溶液、
２μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ｎ−テトラデカナールのエタ
ノール溶液、および、３．０×１０-7Ｍ ＮＡＤＨを含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）５００μｌを
混合し、酵素反応開始直後の発光ピークの高さ（ｃｐ
ｍ）をルミノメーター（アロカ社製：バイオルミネッセ
ンスリーダーＢＬＲ−１０２Ｂ型）により測定した。
測定 ４８８μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）、
１０μｌの（ハ）で得られたホロルシフェラーゼ溶液、
２μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ｎ−テトラデカナールのエタ
ノール溶液、および、３．０×１０-7Ｍ ＮＡＤＨを含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）５００μｌを
混合し、酵素反応開始直後の発光ピークの高さ（ｃｐ
ｍ）をルミノメーター（アロカ社製：バイオルミネッセ
ンスリーダーＢＬＲ−１０２Ｂ型）により測定した。
【０１０３】また、上記ＮＡＤＨ溶液の代わりに、２．
７×１０-6Ｍ ＮＡＤＰＨ、３．０×１０-6Ｍ ＮＡＤ
＋、および２．７×１０-6Ｍ ＮＡＤＰ＋をそれぞれ含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を添加した場
合、およびブランクとして５０ｍＭリン酸緩衝液のみを
添加した場合についても、添加直後に生じる発光ピーク
値を、ＮＡＤＨの場合と同様に、それぞれ測定した。
７×１０-6Ｍ ＮＡＤＰＨ、３．０×１０-6Ｍ ＮＡＤ
＋、および２．７×１０-6Ｍ ＮＡＤＰ＋をそれぞれ含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を添加した場
合、およびブランクとして５０ｍＭリン酸緩衝液のみを
添加した場合についても、添加直後に生じる発光ピーク
値を、ＮＡＤＨの場合と同様に、それぞれ測定した。
【０１０４】これらの測定結果を表１に示す。
【０１０５】
【表１】 表１より、該ホロルシフェラーゼは、ＮＡＤＨを補酵素
として、高い酵素活性を示すことがわかる。一方、ＮＡ
ＤＰＨを補酵素とする反応の場合、ＮＡＤＰＨをＮＡＤ
Ｈの約１０倍量添加してほぼ同じ発光量が得られたこと
より、ＮＡＤＨほどの特異性はないが、ＮＡＤＰＨに対
しても高い酵素活性を示すことがわかる。
として、高い酵素活性を示すことがわかる。一方、ＮＡ
ＤＰＨを補酵素とする反応の場合、ＮＡＤＰＨをＮＡＤ
Ｈの約１０倍量添加してほぼ同じ発光量が得られたこと
より、ＮＡＤＨほどの特異性はないが、ＮＡＤＰＨに対
しても高い酵素活性を示すことがわかる。
【０１０６】また、ＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋を添加した場
合、添加直後の発光量は、ブランク（リン酸緩衝液のみ
の添加）の場合とほとんど変わらなかった。
合、添加直後の発光量は、ブランク（リン酸緩衝液のみ
の添加）の場合とほとんど変わらなかった。
【０１０７】ところが、ＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋の添加の
場合、添加後２〜３分後から発光が始まり、８〜１０分
後に発光ピークが観察された（ピーク値は４〜６×１０
4 ｃｐｍであった）。
場合、添加後２〜３分後から発光が始まり、８〜１０分
後に発光ピークが観察された（ピーク値は４〜６×１０
4 ｃｐｍであった）。
【０１０８】これは、該ホロルシフェラーゼの働きによ
り、アルデヒドの脱水素反応が起こってＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨが生成し、それから反応（ｃ）（ｄ）が起
こり、この時、最初のアルデヒドの脱水素反応が非常に
時間のかかる緩慢な反応であるため、発光もすぐには起
こらないで、数分後に始まるものと思われる。
り、アルデヒドの脱水素反応が起こってＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨが生成し、それから反応（ｃ）（ｄ）が起
こり、この時、最初のアルデヒドの脱水素反応が非常に
時間のかかる緩慢な反応であるため、発光もすぐには起
こらないで、数分後に始まるものと思われる。
【０１０９】従って、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの測定の場
合、ＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋が共存してもその影響を受け
ることなく、これを測定できる。
合、ＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋が共存してもその影響を受け
ることなく、これを測定できる。
【０１１０】実施例１ 該ホロルシフェラーゼを用いたＮＡＤＨの定量 ４８８μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）
に、参考例２で調製したホロルシフェラーゼを１０μ
ｌ、および１０ｍｇ／ｍｌのｎ−テトラデカナールのエ
タノール溶液を２μｌ添加し混合した。
に、参考例２で調製したホロルシフェラーゼを１０μ
ｌ、および１０ｍｇ／ｍｌのｎ−テトラデカナールのエ
タノール溶液を２μｌ添加し混合した。
【０１１１】この溶液をルミノメーター（バイオルミネ
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のＮＡＤＨを含む５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌをマイクロシリンジ
で添加、混合し、添加直後に生じる発光ピークの高さ
（ｃｐｍ）を測定した。
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のＮＡＤＨを含む５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌをマイクロシリンジ
で添加、混合し、添加直後に生じる発光ピークの高さ
（ｃｐｍ）を測定した。
【０１１２】サンプル中のＮＡＤＨ濃度を横軸に、発光
ピーク値を縦軸にとり、両対数グラフに表して図９に示
すような検量線を描いた。この検量線から、少なくとも
サンプル中のＮＡＤＨ濃度が３．０×１０-9〜３．０×
１０-6Ｍの範囲で直線が得られ、相関も良好であった
（相関係数γ＝０．９９８）。
ピーク値を縦軸にとり、両対数グラフに表して図９に示
すような検量線を描いた。この検量線から、少なくとも
サンプル中のＮＡＤＨ濃度が３．０×１０-9〜３．０×
１０-6Ｍの範囲で直線が得られ、相関も良好であった
（相関係数γ＝０．９９８）。
【０１１３】また、従来のＮＡＤＨ：ＦＭＮオキシドレ
ダクターゼとルシフェラーゼとの共役反応（上記反応
(a)(b)）によるＮＡＤＨの定量（例えば渡辺治夫；蛋白
質核酸酵素，３３，２，１９２〜１９９（１９８８））
と比較しても、ほぼ同等の測定感度および測定領域（濃
度範囲）が得られた。
ダクターゼとルシフェラーゼとの共役反応（上記反応
(a)(b)）によるＮＡＤＨの定量（例えば渡辺治夫；蛋白
質核酸酵素，３３，２，１９２〜１９９（１９８８））
と比較しても、ほぼ同等の測定感度および測定領域（濃
度範囲）が得られた。
【０１１４】実施例２ 該ホロルシフェラーゼを用いたＮＡＤＰＨの定量 ４８８μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に参
考例２で調製したホロルシフェラーゼを１０μｌ、およ
び１０ｍｇ／ｍｌのｎ−テトラデカナールのエタノール
溶液を２μｌ添加して混合した。
考例２で調製したホロルシフェラーゼを１０μｌ、およ
び１０ｍｇ／ｍｌのｎ−テトラデカナールのエタノール
溶液を２μｌ添加して混合した。
【０１１５】この溶液をルミノメーター（バイオルミネ
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のＮＡＤＰＨを含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌをマイクロシリン
ジで添加、混合し、添加直後に生じる発光ピークの高さ
（ｃｐｍ）を測定した。
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のＮＡＤＰＨを含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌをマイクロシリン
ジで添加、混合し、添加直後に生じる発光ピークの高さ
（ｃｐｍ）を測定した。
【０１１６】サンプル中のＮＡＤＰＨ濃度を横軸に、発
光ピーク値を縦軸にとり、両対数グラフに表して図１０
に示すような検量線を描いた。この検量線から、少なく
ともサンプル中のＮＡＤＰＨ濃度が６．０×１０-9〜
６．０×１０-6Ｍの範囲で直線が得られ、相関も良好で
あった（相関係数ｒ＝０．９９７）。
光ピーク値を縦軸にとり、両対数グラフに表して図１０
に示すような検量線を描いた。この検量線から、少なく
ともサンプル中のＮＡＤＰＨ濃度が６．０×１０-9〜
６．０×１０-6Ｍの範囲で直線が得られ、相関も良好で
あった（相関係数ｒ＝０．９９７）。
【０１１７】実施例３ グルコキナーゼ、グリコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、および該ホロルシフェラーゼを用いたグルコース
の定量 グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−
Ｐ）デヒドロゲナーゼおよび該ホロルシフェラーゼを使
用して、次の反応によりグルコースを定量した。
ーゼ、および該ホロルシフェラーゼを用いたグルコース
の定量 グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−
Ｐ）デヒドロゲナーゼおよび該ホロルシフェラーゼを使
用して、次の反応によりグルコースを定量した。
【化７】 ３８４μｌの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．
５）に、５００μＭのＡＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、５
００μＭのＮＡＤ+ を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ＝７．５）を１００μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのｎ−
テトラデカナールのエタノール溶液を２μｌ、参考例２
で調製したホロルシフェラーゼを１０μｌ、１０ｕ／ｍ
ｌのグルコキナーゼと０．０２％のウシ血清アルブミン
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を２
μｌ、１０ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼと０．０２％のウシ血清アルブミンを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を２μｌ、およ
び１０ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼと０．０２％のウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を２μｌを添加、混
合した。
５）に、５００μＭのＡＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、５
００μＭのＮＡＤ+ を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ＝７．５）を１００μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのｎ−
テトラデカナールのエタノール溶液を２μｌ、参考例２
で調製したホロルシフェラーゼを１０μｌ、１０ｕ／ｍ
ｌのグルコキナーゼと０．０２％のウシ血清アルブミン
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を２
μｌ、１０ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼと０．０２％のウシ血清アルブミンを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を２μｌ、およ
び１０ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼと０．０２％のウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を２μｌを添加、混
合した。
【０１１８】この溶液をルミノメーター（バイオルミネ
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のグルコースを含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）５００μｌをマイクロ
シリンジで添加、混合し、添加直後に生じる発光ピーク
の高さ（ｃｐｍ）を測定した。
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のグルコースを含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）５００μｌをマイクロ
シリンジで添加、混合し、添加直後に生じる発光ピーク
の高さ（ｃｐｍ）を測定した。
【０１１９】サンプル中のグルコース濃度を横軸に、発
光ピーク値を縦軸にとり、両対数グラスに表して図１１
に示すような検量線を描いた。この検量線から、少なく
ともサンプル中のグルコース濃度が３．０×１０-9〜
９．０×１０-6Ｍの範囲で直線が得られ、相関も良好で
あった（相関係数ｒ＝０．９９９）。
光ピーク値を縦軸にとり、両対数グラスに表して図１１
に示すような検量線を描いた。この検量線から、少なく
ともサンプル中のグルコース濃度が３．０×１０-9〜
９．０×１０-6Ｍの範囲で直線が得られ、相関も良好で
あった（相関係数ｒ＝０．９９９）。
【０１２０】実施例４ イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、および該ホロルシフェ
ラーゼを用いたイソクエン酸の定量 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）と該ホロル
シフェラーゼを使用して次の反応により、イソクエン酸
を定量した。
ラーゼを用いたイソクエン酸の定量 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）と該ホロル
シフェラーゼを使用して次の反応により、イソクエン酸
を定量した。
【０１２１】
【化８】 １８６μｌの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．
５）に、１ｍＭのＭｎＣｌ2 を含む５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液を１００μｌ、０．２％のウシ血清アルブミンを
１００μｌ、参考例２で調製したホロルシフェラーゼを
１０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのｎ−テトラデカナールのエ
タノール溶液を２μｌ、５００μＭのＮＡＤＰ+ を含む
５００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を１００
μｌ、および１０ｕ／ｍｌのイソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼと０．０２％のウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液を２μｌ添加、混合した。
５）に、１ｍＭのＭｎＣｌ2 を含む５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液を１００μｌ、０．２％のウシ血清アルブミンを
１００μｌ、参考例２で調製したホロルシフェラーゼを
１０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのｎ−テトラデカナールのエ
タノール溶液を２μｌ、５００μＭのＮＡＤＰ+ を含む
５００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を１００
μｌ、および１０ｕ／ｍｌのイソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼと０．０２％のウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液を２μｌ添加、混合した。
【０１２２】この溶液をルミノメーター（バイオルミネ
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のイソクエン酸を含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）５００μｌをマイク
ロシリンジで添加、混合し、添加直後に生じる発光ピー
クの高さ（ｃｐｍ）を測定した。
ッセンスリーダーＢＬＲ−１０２型；アロカ社製）に着
装し、これに、既知濃度のイソクエン酸を含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）５００μｌをマイク
ロシリンジで添加、混合し、添加直後に生じる発光ピー
クの高さ（ｃｐｍ）を測定した。
【０１２３】サンプル中のイソクエン酸濃度を横軸に、
発光ピーク値を縦軸にとり、両対数グラフに表して図１
２に示すような検量線を描いた。この検量線から、少な
くともサンプル中のイソクエン酸濃度が８×１０-9〜６
×１０-6Ｍの間で直線が得られ、相関も良好であった
（相関係数ｒ＝０．９９９）。
発光ピーク値を縦軸にとり、両対数グラフに表して図１
２に示すような検量線を描いた。この検量線から、少な
くともサンプル中のイソクエン酸濃度が８×１０-9〜６
×１０-6Ｍの間で直線が得られ、相関も良好であった
（相関係数ｒ＝０．９９９）。
【０１２４】
【発明の効果】上述したように、本発明によれば、発光
細菌由来のホロルシフェラーゼを用いてＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨを測定する方法が提供される、本発明によ
る測定法は発光測定であるので、非常に高感度であり、
測定範囲も広い。また、同じく発光測定であるＮＨＲと
ルシフェラーゼとの共役反応による測定と比べると、本
発明の測定法では、高価なＮＨＲを使用しないで本ホロ
ルシフェラーゼのみでＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの測定がで
きるので、測定にかかるコストを低くすることができ
る。
細菌由来のホロルシフェラーゼを用いてＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨを測定する方法が提供される、本発明によ
る測定法は発光測定であるので、非常に高感度であり、
測定範囲も広い。また、同じく発光測定であるＮＨＲと
ルシフェラーゼとの共役反応による測定と比べると、本
発明の測定法では、高価なＮＨＲを使用しないで本ホロ
ルシフェラーゼのみでＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの測定がで
きるので、測定にかかるコストを低くすることができ
る。
【０１２５】また、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを生成する酵
素系、例えばある生体内微量物質に特異的なデヒドロゲ
ナーゼを、該ホロルシフェラーゼ系との共役反応により
組合わせることにより、該生体内微量物質を高感度に測
定することができる。
素系、例えばある生体内微量物質に特異的なデヒドロゲ
ナーゼを、該ホロルシフェラーゼ系との共役反応により
組合わせることにより、該生体内微量物質を高感度に測
定することができる。
【図１】組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０１の調製工
程を示す説明図である。
程を示す説明図である。
【図２】組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０１が有する
細菌ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片を種々の制
限酵素で切断した、欠失ＤＮＡが挿入されている組換え
体プラスミドｐＬＵＸ１８０２、ｐＬＵＸ１８０３、ｐ
ＬＵＸ１８０４およびｐＬＵＸ１８０５の制限酵素切断
地図である。
細菌ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片を種々の制
限酵素で切断した、欠失ＤＮＡが挿入されている組換え
体プラスミドｐＬＵＸ１８０２、ｐＬＵＸ１８０３、ｐ
ＬＵＸ１８０４およびｐＬＵＸ１８０５の制限酵素切断
地図である。
【図３】細菌ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片が
挿入されている組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０２を
示す模式図である。
挿入されている組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０２を
示す模式図である。
【図４】組換え体プラスミドｐＬＵＸ１８０２により形
質転換された大腸菌により生産されたルシフェラーゼの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す電気泳動図である。
質転換された大腸菌により生産されたルシフェラーゼの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す電気泳動図である。
【図５】本発明のホロルシフェラーゼのＤＥＡＥ−セル
ロファインＡ−５００による精製における溶出曲線図を
示すグラフである。
ロファインＡ−５００による精製における溶出曲線図を
示すグラフである。
【図６】本発明のホロルシフェラーゼのセファデックス
Ｇ−７５による精製における溶出曲線を示すグラフであ
る。
Ｇ−７５による精製における溶出曲線を示すグラフであ
る。
【図７】セファデックスＧ−７５における各分画のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥである。
Ｓ−ＰＡＧＥである。
【図８】精製された該ホロルシフェラーゼの可視部吸収
スペクトルである。
スペクトルである。
【図９】精製された該ホロルシフェラーゼを用いてＮＡ
ＤＨ濃度を測定した検量線である。
ＤＨ濃度を測定した検量線である。
【図１０】精製された該ホロルシフェラーゼを用いてＮ
ＡＤＰＨ濃度を測定した検量線である。
ＡＤＰＨ濃度を測定した検量線である。
【図１１】精製された該ホロルシフェラーゼ、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグルコキナーゼ
を用いてグルコース濃度を測定した検量線である。
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグルコキナーゼ
を用いてグルコース濃度を測定した検量線である。
【図１２】精製された該ホロルシフェラーゼとイソクエ
ン酸デヒドロゲナーゼを用いてイソクエン酸濃度を測定
した検量線である。
ン酸デヒドロゲナーゼを用いてイソクエン酸濃度を測定
した検量線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】 被試験サンプル中のＮＡＤＨあるいはＮ
ＡＤＰＨの測定法であって、 被試験サンプル 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ アルデヒド を混合し、発生する光を測定することを特徴とする、細
菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法。 - 【請求項２】 被試験サンプル中の、デヒドロゲナーゼ
の基質の測定法であって、 被試験サンプル ＮＡＤ+ あるいはＮＡＤＰ+ 測定目的物質に特異的なデヒドロゲナーゼ 発光細菌由来のホロルシフェラーゼ アルデヒド を混合し、発生する光を測定することを特徴とする、細
菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4317068A JPH06153995A (ja) | 1992-11-26 | 1992-11-26 | 細菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4317068A JPH06153995A (ja) | 1992-11-26 | 1992-11-26 | 細菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153995A true JPH06153995A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=18084072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4317068A Pending JPH06153995A (ja) | 1992-11-26 | 1992-11-26 | 細菌ホロルシフェラーゼを用いた測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06153995A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021167011A1 (ja) * | 2020-02-21 | 2021-08-26 | キッコーマン株式会社 | 検体の状態を評価するためのデバイス、それを含むシステム、検体の状態を評価する方法及びそれに用いる乳酸デヒドロゲナーゼ |
-
1992
- 1992-11-26 JP JP4317068A patent/JPH06153995A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021167011A1 (ja) * | 2020-02-21 | 2021-08-26 | キッコーマン株式会社 | 検体の状態を評価するためのデバイス、それを含むシステム、検体の状態を評価する方法及びそれに用いる乳酸デヒドロゲナーゼ |
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