JP2014102144A - 糖化ヘモグロビン測定キットおよび糖化ヘモグロビン測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高感度で血中の糖化ヘモグロビン濃度を測定するキットおよび方法を提供する。
【解決手段】糖化ヘモグロビン測定キットは、バイオセンサ１１が装置本体に着脱可能に設けられた糖化ヘモグロビン測定装置と、プロテアーゼと、を具備する。バイオセンサ１１は、第１電極２４と、第２電極２６と、検体が導入される試料空間４０と、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼおよび電子メディエータを含む試薬と、を備える。装置本体は、バイオセンサの第１電極２４及び第２電極２６に電圧を印加する電圧印加手段と、第１電極２４と第２電極２６との間に生じた電流値を測定する電流測定手段と、を備える。プロテアーゼは、オリエンターゼ（エイチビィアイ株式会社商品名）である。
【選択図】図２

Description

本発明は、糖化ヘモグロビン測定キットおよび糖化ヘモグロビン測定方法に関する。

糖化ヘモグロビンは、血中グルコースと共に糖尿病の診断、糖尿病患者の管理の指標として重要とされている。

糖化ヘモグロビン濃度を測定する方法は、光学的に実施されているのが一般的である。この測定系を、簡便な電気化学測定系にする試みがなされている（特許文献１〜４）。

特開２００１−２６４３３６号公報 ＷＯ２００７/０９４３５４号パンフレット 特開２００９−１７１８７４号公報 特開２０１０−０５７４７４号公報

しかしながら、前述された各特許文献に開示されている測定方法は、未だ実用的ではない。まず、特許文献１における測定は人工的に調製され、かつヒト血液と比較して極めて高濃度な糖化リジンの溶液で検討しているにすぎない。次に、特許文献２および３における測定は、糖化ヘモグロビンではなく、人工的に調製された糖化ペプチドを含む試料液を用いているだけに過ぎないばかりか、その結果も数十ナノアンペアレベルの電流値しか得られていない。

本発明の課題は、高感度で血中の糖化ヘモグロビン濃度を測定するキットおよび方法を提供することである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、特定のタンパク分解酵素とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの組み合わせが、電気化学的な系であっても、極めて高感度（マイクロアンペアレベル）に測定できることを見いだし本発明に至った。

本発明に係る糖化ヘモグロビン測定キットは、バイオセンサが装置本体に着脱可能に設けられた糖化ヘモグロビン測定装置と、プロテアーゼと、を具備する。上記バイオセンサは、第１電極と、第２電極と、検体が該第１電極及び第２電極と接触可能に導入される試料空間と、少なくともクリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼおよび電子メディエータを含む試薬と、を備える。上記装置本体は、上記バイオセンサが装着された状態において、上記バイオセンサの第１電極及び第２電極に電圧を印加する電圧印加手段と、該第１電極と該第２電極との間に生じた電流値を測定する電流測定手段と、を備える。上記プロテアーゼが、オリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）である。

上記プロテアーゼは、上記バイオセンサの試料空間に設けられたものであってもよい。これにより、バイオセンサに導入される検体をプロテアーゼによって前処理する工程が省かれる。

本発明は、また、上記糖化ヘモグロビン測定キットを用いて、ヒトから採取した血液をオリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）で処理をする工程を含む糖化ヘモグロビン測定方法も提供する。

本発明によれば、高感度で血中の糖化ヘモグロビン濃度測定する方法を提供することができる。

図１は、本発明の一実施形態に係るヘモグロビン測定装置１０の外観を示す斜視図である。 図２は、バイオセンサ１１の分解斜視図である。

［糖化ヘモグロビン測定装置］
図１に示されるように、糖化ヘモグロビン測定装置１０は、バイオセンサ１１と装置本体１２とを有する。バイオセンサ１１が装置本体１２の接続部１３に差し込まれることによって、バイオセンサ１１と装置本体１２とが電気的に接続される。バイオセンサ１１は、１回の測定毎に取り替えられるものである。

［装置本体１２］
図１に示されるように、装置本体１２は、筐体５０に電子部品が収容された電子装置である。筐体５０の表側には、液晶ディスプレイ５１及び操作キー５２，５３，５４が配置されている。操作キー５２，５３，５４は、ユーザの操作に基づいて対応するコマンドを発生させるためのものである。液晶ディスプレイ５１は、装置本体１２の状態や測定結果、エラー表示などを行う。各図には現れていないが、筐体５０の内部には、電圧印加手段及び電流測定手段としての制御基板が内蔵されている。制御基板は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭなどを有する演算装置として構成されており、液晶ディスプレイ５１及び操作キー５２，５３，５４と電気的に接続されている。操作キー５２，５３，５４からの入力に応じて、制御基板は、予めＲＯＭに格納されたプログラムを動作させる。また、筐体５０の内部には、バイオセンサ１１に電位を印加するための電源が内蔵されている。制御基板は、電源から所定の電位をバイオセンサ１１に印加する。この電源及び制御基板によって、電圧印加手段が構成されている。また、制御基板は、所定の電位に応答してバイオセンサ１１に流れた電流値から糖化ヘモグロビン濃度を演算する。演算された糖化ヘモグロビン濃度は、液晶ディスプレイ５１に表示される。

［バイオセンサ１１］
図１に示されるように、バイオセンサ１１は、細長なシート形状である。バイオセンサ１１の長手方向１０１の一端が、装置本体１２の接続部１３に差し込まれることによって、バイオセンサ１１が装置本体１２に装着される。また、バイオセンサ１１が長手方向１０１に引き抜かれることによって、バイオセンサ１１が装置本体１０から取り外される。

バイオセンサ１１の表裏は相対的な関係なので、いずれが表であっても裏であってもよい。本実施形態においては、図１に現れる側が表と称され、図１に現れない側が裏と称される。

図２に示されるように、バイオセンサ１１は、主として、第１基板２３、第１電極２４、スペーサ２５、第２電極２６、第３電極２７及び第２基板２８を有する。図２における上側、つまり表側から順に、第１基板２３、スペーサ２５、第１電極２４、第２電極２６及び第３電極２７、第２基板２８の順に積層されて、シート形状のバイオセンサ１１が構成されている。

［第１基板２３］
図２に示されるように、第１基板２３は、平面視がバイオセンサ１１と概ね同じ形状であって、長手方向１０１において第２基板２４より若干短いシートである。第１基板２３は、電気絶縁性の材料からなる。この電気絶縁性の材料として、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等のポリエステルや、フッ素樹脂及びポリカーボネイト、ガラスなどが挙げられる。

第１基板２３の一方の面は、表面２１を構成する。第１基板２３の表面２１には、方向１０２の両端に一対の着色部３０，３１が形成されている。着色部３０，３１は、表面２１と色分けされたものである。着色部３０，３１は、後述される試料導入口４１の位置の視認を容易にするためのものである。したがって、着色部３０，３１は、試料導入口４１の直上に配置されている。第１基板２３において、空間４０に対応する領域４２には、試薬の各成分が固定されている。試薬の各成分の詳細については、後述される。

［第２基板２８］
図２に示されるように、第２基板２８は、平面視がバイオセンサ１１と概ね同じ形状のシートである。第２基板２８は、電気絶縁性の材料からなる。この電気絶縁性の材料として、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等のポリエステルや、フッ素樹脂及びポリカーボネイト、ガラスなどが挙げられる。

第２基板２８の一方の面は、裏面２２を構成する。裏面２２と反対側の面３４には第１電極２４，第２電極２６及び第３電極２７が設けられている。第２基板２８において、装置本体１２の接続部１３に差し込まれる長手方向１０１の一端側は、第１基板２３とは対向されていない。なお、各図には現れていないが、第２基板２８の裏面２２には、着色部３０，３１と同様の着色部が形成されている。

［第１電極２４］
図２に示されるように、第１電極２４は、第２基板２８における裏面２２と反対側の面３４に設けられている。第１電極２４は、第２基板２８の面３４において、長手方向１０１へ延出されており、方向１０２において第２基板２８の１／３程度の幅を有する。面３４において、第１電極２４は、後述される第２電極２６及び第３電極２７と電気的に非接続に配置されている。第１電極２４の素材としては、例えば、カーボンが挙げられる。第１電極２４にカーボンが用いられることによって、銀／塩化銀、金、パラジウム、白金などが用いられた電極の抵抗値より、カーボン製の第１電極２４の抵抗値が低くなるので、比較的弱い電位による小さな応答電流によっても、糖化ヘモグロビン濃度の測定感度が維持され易くなる。第１電極２４は、第１基板２３に対して、スクリーン印刷法、インクジェット法、スパッタリング、真空蒸着、ゾルゲル法、クラスタビーム蒸着又はＰＬＤなどの手法によって面３４に積層されている。第１電極２４において、装置本体１２の接続部１３側に対応する端部は、第１基板２３と対向せずに露出されている。この端部が装置本体１２と電気的に接続される接続端子３３である。

［第２電極２６］
図２に示されるように、第２電極２６は、第２基板２８における裏面２２と反対側の面３４に設けられている。第２電極２６は、第２基板２８の面３４において、長手方向１０１へ延出されており、方向１０２において第２基板２８の１／３程度の幅を有する。面３４において、第２電極２６は、第１電極２４及び後述される第３電極２７と電気的に非接続に配置されている。第２電極２６の素材としては、例えば、カーボン、銀／塩化銀、金、パラジウム、白金などが挙げられる。第２電極２６において、装置本体１２の接続部１３側に対応する端部は、第１基板２３と対向せずに露出されている。この端部が装置本体１２と電気的に接続される接続端子３７である。

［第３電極２７］
図２に示されるように、第３電極２７は、第２基板２８における裏面２２と反対側の面３４に設けられている。第３電極２７は、第２基板２８の面３４において、長手方向１０１へ延出されており、方向１０２において第２基板２８の１／３程度の幅を有する。面３４において、第３電極２７は、第１電極２４及び第２電極２６と電気的に非接続に配置されている。第３電極２７の素材としては、例えば、カーボン、銀／塩化銀、金、パラジウム、白金などが挙げられる。第３電極２７は、空間４０へ血液が導入されたか否かを検出するための電極である。第３電極２７において、装置本体１２の接続部１３側に対応する端部は、第１基板２３と対向せずに露出されている。この端部が装置本体１２と電気的に接続される接続端子３９である。

［スペーサ２５］
図２に示されるように、スペーサ２５は、平面視がバイオセンサ１１と概ね同じ形状のシートである。スペーサ２５としては、電気絶縁性を有する両面テープが好適に用いられる。スペーサ２５は、着色部３０，３１に対応する位置に、方向１０２へ延びる空間４０を有する。つまり、スペーサ２５は、長手方向１０１に対して空間４０によって分断された２枚のシートから構成されている。空間４０によって、領域３８と領域４２との間に、スペーサ２５の厚み分の試料空間が形成される。つまり、空間４０が試料空間となる。空間４０には、第１電極２４の一部、第２電極２６の一部及び第３電極２７の一部がそれぞれ露出されている。第１電極２４において、空間４０に対応する領域３８には、試薬の各成分が固定されている。試薬の各成分の詳細については、後述される。

図１に示されるように、空間４０は、バイオセンサ１１の端に開口されており、この開口が試料導入口４１となる。なお、図１には現れていないが、試料導入口４１と対向する位置においても空間４０が開口されている。試料導入口４１が血液に曝されると、毛細管作用によって血液が空間４０に流れ込む。

［領域３８，４２へ固定される試薬の成分］
領域３８，４２に固定される試薬は、少なくともクリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、電子メディエータ及びプロテアーゼを含む。

クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの１種であり、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンに対して基質特異性を有する酵素をいう（特許文献４参照）。なお、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼは、遺伝子組換え体であってもよい。特許文献４は、熱安定性が向上したクリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの遺伝子組換え体も開示している。

ヘモグロビンにより還元され得る電子メディエータとしては、例えば、ヘキサシアノルテニウム、フェリシアン化カリウムおよび塩化ヘキサアミンルテニウムなどが挙げられる。

領域３８，４２に固定される試薬は、プロテアーゼを含む。プロテアーゼは、オリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）である。オリエンターゼ９０は、Bacillus subtilis起源の中性プロテアーゼの１つであり、また、金属プロテアーゼの１つでもある。

これら試薬の各成分は、領域３８，４２に任意に選択的に固定されてよい。また、試薬の各成分が、領域３８，４２にそれぞれ塗布される手法は、公知の手法が採用される。このような公知の手法として、例えば、ディッピング法やスクリーン印刷法、オフセット印刷法、インクジェット印刷法などが挙げられる。

なお、プロテアーゼは、領域３８，４２に固定される試薬に含まれずに、バイオセンサ１１や装置本体１２とは別に溶液の状態で容器に収容されていてもよい。本実施形態では、バイオセンサ１１にプロテアーゼが固定されているので、バイオセンサ１１と装置本体１２とのみによって構成されることとなるが、このような実施態様も広義のキットとして定義されるものとする。

［糖化ヘモグロビンの測定方法］
以下、糖化ヘモグロビン測定キットを用いた糖化ヘモグロビンの測定方法が説明される。

ユーザは、糖化ヘモグロビンの測定に際して、装置本体１２の接続部１３にバイオセンサ１１を差し込む。ユーザは、指などから採取して血液を、そのまま空間４０に導入する。空間４０において、領域３８，４２に固定されたプロテアーゼによって、空間４０に導入された血液中の糖化ヘモグロビンが分解される。プロテアーゼにより糖化ヘモグロビンが分解された血液を、以下において「プロテアーゼ処理血液」と称する。

なお、オリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）が、バイオセンサ１１および装置本体１２とは別に溶液の状態で容器に収容している場合は、ユーザが、指などから採取した血液を予めオリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）で処理することにより、血液中の糖化ヘモグロビンが分解される。この処理した血液、すなわちプロテアーゼ処理血液が空間４０に導入される。

空間４０において、血液が第１電極２４及び第３電極２７に接触すると、第１電極２４と第３電極２７との間の導電状態が変化する。制御基板により構成される演算装置は、この導電状態の変化によって、空間４０に血液が導入されたと判断する。

空間４０に血液が導入されたと判断した後に、制御基板及び電源により構成される電圧印加手段は、第１電極２４の接続端子３３及び第２電極２６の接続端子３７に所定の電位を１０秒間印加する。この電圧の印加は、領域３８，４２に固定されたオリエンターゼ９０が糖化ヘモグロビンを分解するに十分な時間が経過した後に実施される。これにより、第１電極２４が作用極となり、第２電極２６が対極となる。空間４０においては、血液中の糖化ヘモグロビンのオリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）による分解産物とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（フルクトシルペプチド酸オキシダーゼ）が反応することより、電子メディエータが還元される。この還元されたメディエータが第１電極２４において酸化されることにより、第１電極２４と第２電極２６との間に酸化応答電流が流れる。このようにして第１電極２４及び第２電極２６間に流れた酸化応答電流に基づいて、制御基板により構成される電流測定手段は糖化ヘモグロビン濃度を演算し、その結果を液晶ディスプレイ５１に表示する。

［ヘモグロビンの全体量の測定］
前述された糖化ヘモグロビンの測定方法と並行してヘモグロビンの全体量（糖化ヘモグロビンも含む）が測定されることが望ましい。ヘモグロビンの全体量（糖化ヘモグロビンも含む）を測定する方法は、シアンメトヘモグロビン法などの従来公知の方法で測定しても問題ないが、電気化学的に測定する方法が好ましく、１回の血液の採取で済むよう、バイオセンサ１１にヘモグロビンの全体量を測定するための電極系を設けることが最も好ましい。ヘモグロビンの全体量（糖化ヘモグロビンも含む）を電気化学的に測定する方法は、例えば、全血をコール酸系界面活性剤で処理することにより、全血を溶血させた後、フェリアシアン化カリウム等のヘモグロビンによって直接還元されるメディエータを用いることができる。この発明について、出願人は本願と同日付けにて特許出願をしている。

［本実施形態の作用効果］
本実施形態によれば、高感度で血中の糖化ヘモグロビン濃度を測定することができる。とりわけ、電気化学糖化ヘモグロビンを分解するプロテアーゼとして、オリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）を選択し、糖化ヘモグロビンの分解産物におけるフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンを基質とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（フルクトシルペプチド酸オキシダーゼ）として、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを選択したことにより、驚くべきことに従来のナノアンペアオーダーであった測定感度が、マイクロアンペアオーダーまで向上した。

以下、本発明の実施例が説明される。

［実施例１］
バイオセンサとしては、前述された実施形態と同様の構成のバイオセンサ１１を製造した。第１電極２４、第２電極２６及び第３電極２７の素材としてはカーボンを用いた。バイオセンサ１１の領域３８には、５０Ｕ／ｍＬクリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼおよび３００ｍＭヘキサシアノルテニウムを含むＭＥＳ緩衝液の試薬を２μＬ塗布して乾燥させた。

［実験例１］
ヒトから採取された全血２０μＬと、オリエンターゼ９０水溶液８０μＬを混合（オリエンターゼ９０終濃度５０００Ｕ／ｍＬ）し、４２℃に加温してプロテアーゼ処理血液を調製した。なお、ヒトから採取された全血には、少なからず糖化ヘモグロビンは存在する。このプロテアーゼ処理血液３μＬを、バイオセンサの試料空間に導入した。検体が検知された後に、第１電極２４と第２電極２６との間の電位を３０秒間、０ｍＶに保持し、その後、第１電極２４と第２電極２６との間の電位を６０秒間、５００ｍＶに保持して、６０秒後の応答電流を測定した。測定結果を表１に示す。

［参考例１］
実験例１において、全血２０μＬに代わって生理食塩水２０μＬを用いたこと以外は、実験例１と同様に行った。その結果を表１に示す。

表１の結果によれば、実施例１では、マイクロアンペアレベルの電流が確認された。これは、特許文献２および３のナノアンペアレベルと比較すると１オーダー高い値であった。なお、参考例１の結果では電流がほとんど測定されないため、実施例１において測定された電流は、全血における糖化ヘモグロビンとオリエンターゼ９０の反応によりフルクトシルバリルヒスチジンが生成し、さらにバイオセンサ１１におけるクリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼによる反応により生じたものであるといえる。

１０・・・糖化ヘモグロビン測定装置
１１・・・バイオセンサ
１２・・・装置本体
２４・・・第１電極
２６・・・第２電極
４０・・・空間（試料空間）

Claims (3)

1. バイオセンサが装置本体に着脱可能に設けられた糖化ヘモグロビン測定装置と、プロテアーゼと、を具備する糖化ヘモグロビン測定キットであって、
   上記バイオセンサは、第１電極と、第２電極と、検体が該第１電極及び第２電極と接触可能に導入される試料空間と、少なくともクリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼおよび電子メディエータを含む試薬と、を備えており、
   上記装置本体は、上記バイオセンサが装着された状態において、上記バイオセンサの第１電極及び第２電極に電圧を印加する電圧印加手段と、該第１電極と該第２電極との間に生じた電流値を測定する電流測定手段と、を備えてなり、
   上記プロテアーゼが、オリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）である糖化ヘモグロビン測定キット。
2. 上記プロテアーゼは、上記バイオセンサの試料空間に設けられたものである請求項１に記載の糖化ヘモグロビン測定キット。
3. 請求項１に記載の糖化ヘモグロビン測定キットを用いて血液中の糖化ヘモグロビン濃度を測定する方法であって、
   ヒトから採取した血液をオリエンターゼ９０（エイチビィアイ株式会社商品名）で処理をする工程を含む糖化ヘモグロビン測定方法。

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