JP2019000020A - 改変型グルコース脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

【課題】 血糖測定において用いる、より熱安定性の高い酵素等を提供すること。
【解決手段】 野生型のグルコース脱水素酵素等のタンパク質を構成する一部のアミノ酸を改変することにより得られる、熱安定性が高いという優れた特性を有する改変型グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサ、並びに、該測定試薬組成物及びバイオセンサの製造方法等。
【選択図】図１

Description

本発明は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサ等に関する。

血液中のグルコース（血糖）濃度の測定は、主に糖尿病患者の血糖コントロールにおいて重要である。血糖測定において、酵素を利用した血糖測定機器として、バイオセンサが広く使われている。

バイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素やグルコース脱水素酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。グルコース脱水素酵素のうち、真核細胞由来のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないこと、補酵素の添加を必要としないこと及び基質特異性に優れることから、バイオセンサ用の酵素として有用である（特許文献１〜５）。

国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット 国際公開２００６／１０１２３９号パンフレット 国際公開２００８／００１９０３号パンフレット 国際公開２００９／０８４６１６号パンフレット 特許第５８９６３７５号公報

血糖測定において、より熱安定性の高い酵素が求められていた。本発明は、熱安定性の高いグルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供する。更に、測定試薬組成物及びバイオセンサの製造方法を提供する。

本発明者は、野生型のグルコース脱水素酵素等のタンパク質を構成するアミノ酸の一部を改変することで、熱安定性が高いという優れた特性を有する改変型グルコース脱水素酵素を取得できることを見出した。更に、該酵素をコードするポリヌクレオチドを用いて該酵素を効率的に製造できるということ、及び該酵素を用いてグルコース測定が可能なことを見出し、本発明に至った。

即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。

［態様１］
以下のａ）〜ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、
ａ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８で示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２６に示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列、
配列番号２で示されるアミノ酸配列のＳ７１、Ｇ７２、Ｑ１６９、Ｇ１８３、Ｓ１８８、Ｇ２１０、Ａ２２１、Ｓ２６９、Ｎ３４６、Ｓ４２７、Ｓ４２９、Ｆ５２１又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列から成る、
改変型グルコース脱水素酵素。
［態様２］
態様１に記載のａ）〜ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、
Ｓ７１に対応する位置のアミノ酸がセリン、グリシンもしくはアスパラギンであり、Ｇ７２に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、Ｑ１６９に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、チロシンもしくはフェニルアラニンであり、Ｇ１８３に対応する位置のアミノ酸がグリシンもしくはアスパラギンであり、Ｓ１８８に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、Ｇ２１０に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、Ａ２２１に対応する位置のアミノ酸がアラニンもしくはセリンであり、Ｓ２６９に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、Ｎ３４６に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンもしくはアラニンであり、Ｓ４２７に対応する位置のアミノ酸がセリンもしくはアラニンであり、Ｓ４２９に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、Ｆ５２１に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸がバリンであるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、
態様１記載の改変型グルコース脱水素酵素。
［態様３］
配列番号２で示されるアミノ酸配列のＳ７１、Ｇ７２、Ｑ１６９、Ｇ１８３、Ｓ１８８、Ｇ２１０、Ａ２２１、Ｓ２６９、Ｎ３４６、Ｓ４２７、Ｓ４２９、Ｆ５２１又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸置換が、
Ｓ７１に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に、Ｇ７２に対応する位置のアミノ酸がアラニンに、Ｑ１６９に対応する位置のアミノ酸がシステインに、Ｇ１８３に対応する位置のアミノ酸がリジンに、Ｓ１８８に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｇ２１０に対応する位置のアミノ酸がシステインに、Ａ２２１に対応する位置のアミノ酸がチロシンに、Ｓ２６９に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｎ３４６に対応する位置のアミノ酸がリジンに、Ｓ４２７に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｓ４２９に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｆ５２１に対応する位置のアミノ酸がトリプトファンもしくはチロシンに、又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸がアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン、セリンもしくはスレオニンに置換されたものである、
態様１又は２記載の改変型グルコース脱水素酵素。
［態様４］
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で４５℃、３０分間処理後の残存活性について、野生型酵素より高い残存活性を有する、態様１〜３の何れか１項に記載の改変型グルコース脱水素酵素。
［態様５］
態様１〜４の何れか１項に記載の改変型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
［態様６］
態様５記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［態様７］
態様６記載のベクターを用いて形質転換された形質転換細胞。
［態様８］
態様７の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、改変型グルコース脱水素酵素の製造方法。
［態様９］
態様１〜４の何れか１項に記載の改変型グルコース脱水素酵素を使用するグルコース測定方法。
［態様１０］
態様１〜４の何れかに１項記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
［態様１１］
態様１〜４の何れかに１項記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。

本発明により、熱安定性に優れた改変型グルコース脱水素酵素を利用することが可能になった。更に、本発明の改変型グルコース脱水素酵素を効率的に製造できるようになり、加熱工程を含むバイオセンサ製造工程でも安定した製造が可能になった。

各配列のアライメントを示す図である。

本明細書の“改変型グルコース脱水素酵素”とは、グルコース脱水素酵素等の野生型のタンパク質を構成するアミノ酸の一部が別のアミノ酸に置換された、グルコース脱水素酵素活性を有する酵素（グルコース脱水素酵素）である。

本明細書ではアミノ酸残基を１文字表記で表現することがあり、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列の７１番目に対応するセリンをアスパラギン酸に置換するアミノ酸置換は、Ｓ７１Ｄと表す。

本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、上記の野生型のタンパク質を構成するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＳ７１、Ｇ７２、Ｑ１６９、Ｇ１８３、Ｓ１８８、Ｇ２１０、Ａ２２１、Ｓ２６９、Ｎ３４６、Ｓ４２７、Ｓ４２９、Ｆ５２１又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

改変前（野生型）のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列の例として、配列番号２もしくは３で示されるアミノ酸配列、又は該配列と相同性を有するアミノ酸配列であって、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列である。尚、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列を含まないアミノ酸配列である。更に、上記の野生型のタンパク質を構成するアミノ酸配列の例として、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔでの公開配列である、Ｌ２Ｇ９０６（配列番号２４）、Ｔ０ＬＢＵ８（配列番号２５）、Ａ０Ａ１Ｑ８ＲＹ４０（配列番号２６）、Ｎ４ＶＧＳ５（配列番号２７）及びＲ１ＥＺＦ７（配列番号２８）の配列、又は該配列と相同性を有するアミノ酸配列を例示できる。配列番号２４〜２８のアミノ酸配列と配列番号２との類似性はそれぞれ９９％、９９％、９８％、９６％及び９２％である。

本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、
（ａ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
又は
（ｃ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８で示されるアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列、
において、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＳ７１、Ｇ７２、Ｑ１６９、Ｇ１８３、Ｓ１８８、Ｇ２１０、Ａ２２１、Ｓ２６９、Ｎ３４６、Ｓ４２７、Ｓ４２９、Ｆ５２１又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するタンパク質である。

１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたとは、好ましくは多くとも６０個、より好ましくは多くとも５５個、５０個、４０個、３０個、２０個、１０個又は５個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加である。

アミノ酸配列が「相同性」を有するとは、類似性が好ましくは少なくとも９０％又は９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列であること、又は同一性が好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸配列であることを意味する。

類似性は、表１のスコア表（ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）の説明書 ｐ．２２０ Ａ．１８ ホモロジースコア表 Ａ．１８．２ アミノ酸、参考文献：Atlas of Protein Sequence and Structure Vol.5 (1978)）を用いて、アライメント時にスコアが０以上になる文字数÷アライメント長で算出された値である。配列解析ソフトである、ＧＥＮＥＴＹＸ（（登録商標）、株式会社ゼネティックス製）を用いて算出できる。詳細には、該ソフトを初期設定で使用し、アミノ酸配列同士のホモロジー解析を行い、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙとして算出される。
同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス製）のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。

グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列において「配列番号２で示されるアミノ酸配列のＳ７１、Ｇ７２、Ｑ１６９、Ｇ１８３、Ｓ１８８、Ｇ２１０、Ａ２２１、Ｓ２６９、Ｎ３４６、Ｓ４２７、Ｓ４２９、Ｆ５２１又はＶ５６７に対応する位置」という表現は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の開始アミノ酸であるメチオニン（Ｍ）を１番目とした場合の７１番目のセリン、７２番目のグリシン、１６９番目のグルタミン、１８３番目のグリシン、１８８番目のセリン、２１０番目のグリシン、２２１番目のアラニン、２６９番目のセリン、３４６番目のアスパラギン、４２７番目のセリン、４２９番目のセリン５２１番目のフェニルアラニン又は５６７番目のバリンに対応するアミノ酸を意味し、配列番号２との配列アライメントにより特定できる。例えば図１に示したように対応する位置を特定できる。

対応する位置のアミノ酸は、Ｓ７１に対応するのはセリン、グリシンもしくはアスパラギンであることが好ましく、Ｇ７２に対応するのはグリシンであることが好ましく、Ｑ１６９に対応するのはグルタミン、チロシンもしくはフェニルアラニンであることが好ましく、Ｇ１８３に対応するのはグリシンもしくはアスパラギンであることが好ましく、Ｓ１８８に対応するのはセリンであることが好ましく、Ｇ２１０に対応するのはグリシンであることが好ましく、Ａ２２１に対応するのはアラニンもしくはセリンであることが好ましく、Ｓ２６９に対応するのはセリンであることが好ましく、Ｎ３４６に対応するのはアスパラギンもしくはアラニンであることが好ましく、Ｓ４２７に対応するのはセリンもしくはアラニンであることが好ましく、Ｓ４２９に対応するのはセリンであることが好ましく、Ｆ５２１に対応するのはフェニルアラニンであることが好ましく、Ｖ５６７に対応するのはバリンであることが好ましい。

また、アミノ酸置換について、Ｓ７１Ｄ、Ｇ７２Ａ、Ｑ１６９Ｃ、Ｇ１８３Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｇ２１０Ｃ、Ａ２２１Ｙ、Ｓ２６９Ｖ、Ｎ３４６Ｋ、Ｓ４２７Ｖ、Ｓ４２９Ｖ、Ｆ５２１ＷもしくはＦ５２１Ｙ、又はＶ５６７Ａ、Ｖ５６７Ｃ、Ｖ５６７Ｇ、Ｖ５６７Ｍ、Ｖ５６７Ｑ、Ｖ５６７ＳもしくはＶ５６７Ｔアラニンであることが好ましい。つまり、Ｓ７１に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に、Ｇ７２に対応する位置のアミノ酸がアラニンに、Ｑ１６９に対応する位置のアミノ酸がシステインに、Ｇ１８３に対応する位置のアミノ酸がリジンに、Ｓ１８８に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｇ２１０に対応する位置のアミノ酸がシステインに、Ａ２２１に対応する位置のアミノ酸がチロシンに、Ｓ２６９に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｎ３４６に対応する位置のアミノ酸がリジンに、Ｓ４２７に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｓ４２９に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｆ５２１に対応する位置のアミノ酸がトリプトファンもしくはチロシンに、又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸がアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン、セリンもしくはスレオニンに、少なくとも１箇所置換されていることが好ましい。

本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、野生型酵素が有するグルコース脱水素酵素活性の残存活性に比べて、高い残存活性を有するのが好ましい。尚、各酵素の残存活性は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で４５℃、３０分間処理する前の活性に対する処理後の活性の比を意味する。野生型酵素の残存活性に対する本発明の改変型グルコース脱水素酵素の残存活性の割合は、１０２％以上がより好ましく、１１０％以上がさらに好ましく、１２０％以上が特に好ましく、１３０％以上が特に好ましい。

本発明のポリヌクレオチドは、態様１〜４の何れかに記載の改変型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドは、イントロンを含む配列であっても良く、ｃＤＮＡでも良い。例えば、配列番号２、３、２４、２５、２６、２７又は２８で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに変異を導入したポリヌクレオチドが例示できる。

本発明のポリヌクレオチドは、公知の方法で容易に調製することができる。例えば、配列番号２、３、２４、２５、２６、２７又は２８で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、適切なプライマーセットを用いた公知の各種ＰＣＲ法を利用して、変異を導入することにより調製することができる。又は、人工的に合成しても良い。形質転換細胞に応じてコドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドでも良い。

鋳型となるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の配列を合成しても良い。又は、配列番号２記載のアミノ酸配列を用いて、公開配列に対して例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ）等のホモロジー検索を行って、ヒットした類似性及び／又は同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列も鋳型として利用できる。上記の公開配列からプライマーをデザインし、該遺伝子配列の由来株のＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにより増幅して得ることができる。公開配列の由来株と同種又は同属の株からも得ることができる。又は、公開配列情報から人工的に合成できる。類似性は、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。同一性は、好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％又は９９％である。尚、配列番号１に記載の配列は野生型のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列である配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。

本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択し、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含む。インサートは、宿主が真核細胞の場合、イントロンを含んでいても良い。発現ベクターとしては、原核細胞発現用ベクター又は真核細胞発現用ベクターの何れでも良く、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システム等が例示できるが、タンパク質の大量発現が可能なベクターが好ましい。尚、必要に応じて、シャペロンやリゾチーム等の発現に寄与するポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一及び／又は別のベクターに導入することも可能である。

本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属等の子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができ、本発明のベクターで形質転換させて得ることができる。

本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物から改変型グルコース脱水素酵素を採取することによって、組換え改変型グルコース脱水素酵素を製造することができる。

本発明で使用される改変型グルコース脱水素酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸等のアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。ビタミン類としては、リボフラビン、ピリドキシン、ナイアシン（ニコチン酸）、チアミン等が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄等が使用できる。更に、タンパク質の発現の調整に必要な化合物を適宜添加しても良い。

本発明の改変型グルコース脱水素酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌等の方法により好気的条件下で行うのが良い。改変型グルコース脱水素酵素生産菌の特性を踏まえて、改変型グルコース脱水素酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は２０℃から５０℃、且つｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。培養期間は２日から１０日の範囲が好ましいが、流加培養や連続培養による生産量増大を行うのであれば、生産性が最適と判断される範囲で期間を延ばすことができる。この様な方法で培養することにより、培養物中に改変型グルコース脱水素酵素を生成蓄積することができる。

培養物中から改変型グルコース脱水素酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初に改変型グルコース脱水素酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれる改変型グルコース脱水素酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製できる。

本発明の改変型グルコース脱水素酵素は乾燥して使用することができる。酵素が失活しなければ乾燥方法は制限されないが、凍結乾燥により、凍結乾燥品を得るのが好ましい。乾燥工程で、緩衝液剤及び安定化剤を添加することができる。乾燥後に粉砕して、粉末化し、粉末品にしても良い。

本発明の改変型グルコース脱水素酵素を用いて、グルコースを測定することができる。本発明のグルコース測定方法は、グルコースを含む被検試料と本発明の改変型グルコース脱水素酵素とを接触させる工程を含むことにより、被検試料中のグルコースを定量できる。被検試料は特に限定されないが、例えば生体試料が例示でき、具体例として血液試料、涙、唾液、尿、間質液等が例示できる。本発明の酵素は、特に血糖測定に有用である。

本発明は、本発明の改変型グルコース脱水素酵素を用いてグルコース測定試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサを製造する製造方法を提供する。本発明の酵素は基質特異性が高く、酸素を実質的に電子受容体としないため、グルコース測定において、測定試料中の他の糖類及び溶存酸素の影響を受け難い。よって、他の糖類や溶存酸素の影響を受け難いグルコース測定試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサが提供でき、測定精度の高いグルコース測定が可能である。

本発明の改変型グルコース測定試薬組成物は、酵素として本発明の改変型グルコース脱水素酵素を含む試薬組成物であれば良い。該組成物中の酵素量は、試料中のグルコースを測定できれば特に限定されないが、１測定あたりの酵素量が０．０１から１００Ｕ程度が好ましく、０．０５から５０Ｕ程度がより好ましく、０．１から２０Ｕ程度が更に好ましい。該組成物は、緩衝剤を含むことが好ましく、安定化剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めるのがより好ましい。前記成分としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質等を例示できる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませても良い。本発明のグルコース測定用キットは、前記試薬組成物を含み、グルコース標準液を含ませても良い。

本発明のバイオセンサは、酵素として本発明の改変型グルコース脱水素酵素を含むセンサであれば良い。例えば、電気化学式バイオセンサは、基板、対極、作用極メディエータ及び前記酵素を備えることによって作製される。メディエータは、ヘム等の蛋白質性電子メディエータ、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等が例示できる。この他に、イオン変化、発色強度、ｐＨ変化等を検知する方式のバイオセンサも構築可能である。該バイオセンサを用いてグルコース測定が可能である。

更に本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース脱水素酵素を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金族金属等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。

本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５−０．６Ｕ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明の改変型グルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。

（グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性測定法）
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、３ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２０ｍＬ及び超純水０．６１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。

グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（−（ΔＡ６００−ΔＡ６００ｂｌａｎｋ）×３．０×酵素の希釈倍率）／（１０．８×１．０×０．０５）
尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。

以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。又、本明細書中に引用される文献に記載された内容は、本明細書の一部として本明細書の開示内容を構成するものである。

［実施例１］
（フラビン結合型野生型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）の取得）
ＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ ＮＢＲＣ５９５１の培養上清にＧＬＤ活性が確認できた。

（１）菌体培養
パインデックス（松谷化学工業社製）４％（ｗ／ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）１％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社製）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１０ｍＬを太試験管に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記ＧＬＤ生産菌を接種し、２５℃で７２時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。

（２）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。

（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
（２）で取得したＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。

（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子取得用プライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、ＧＬＤ遺伝子の内部配列と思われるＰＣＲ産物が確認された。前記ＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。

得られたプラスミドベクターを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（タカラバイオ社製）を用いてプラスミドベクターを抽出・精製し、インサートの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を基に、ＧＬＤ遺伝子の上流及び下流配列を解明するためのプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法によって、開始コドンから終止コドンまでの全長ＧＬＤ遺伝子１７５８塩基を解明した。該遺伝子配列を配列番号１に示した。

（５）野生型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）遺伝子を含むプラスミドベクターの調製
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最終的に、本プロモーターの下流に配列番号１に記載のＧＬＤ遺伝子を結合させて、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。

［実施例２］
（部位特異的変異を導入した改変型ＧＬＤ遺伝子を持つ形質転換体の取得）
ＧＬＤ遺伝子に変異を導入するために、下記のようなオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。これらの塩基配列は配列番号１に記載の塩基配列を元に決定した。

プライマーＳ７１Ｄ :5’-ACGTGACCAGCCCCGACGGCTACGGACTGGCCTTTGG-3’（配列番号４）
プライマーＧ７２Ａ :5’-CAGCCCCTCTGCCTACGGACTGGCCTTTGGTACCG-3’（配列番号５）
プライマーＱ１６９Ｃ :5’-ACCTACATCCCTGAGTGCCACGGTACCTCTGGTCCTCTC-3’（配列番号６）
プライマーＧ１８３Ｋ :5’-GTCGGCTGGAAGTCCAAGGGTGTCGAGAAGTCCTTCGTC-3’（配列番号７）
プライマーＳ１８８Ｖ :5’-GGCGGTGTCGAGAAGGTTTTCGTCGACGTCTTGAACCAG-3’（配列番号８）
プライマーＧ２１０Ｃ :5’-CTGAAGGACATTGCTTGCGGAGACATGGTCGGCTGGAAC-3’（配列番号９）
プライマーＡ２２１Ｙ :5’-CTGGAACATCTACCCCTACACCCTGGACACTGCTCTTC-3’（配列番号１０）
プライマーＳ２６９Ｖ :5’-GCTGAGGCCACCGCCGTTGGAGTTCTCGTCAAGGACAAG-3’（配列番号１１）
プライマーＮ３４６Ｋ :5’-CAGACCAGCTCCAAGAAATTCACCGGTGTCACCACCTTC-3’（配列番号１２）
プライマーＳ４２７Ｖ :5’-ACCCCTGCCGGTTCTGTTTTCTCCACCGAGTACTGGGCC-3’（配列番号１３）
プライマーＳ４２９Ｖ :5’-GCCGGTTCTTCCTTCGTTACCGAGTACTGGGCCCTCCTG-3’（配列番号１４）
プライマーＦ５２１Ｗ :5’-GAACTACCGCTCCAACTGGCACCCCGTCGGCACCAC-3’（配列番号１５）
プライマーＦ５２１Ｙ :5’-AACTACCGCTCCAACTATCACCCCGTCGGCACCACCGCC-3’（配列番号１６）
プライマーＶ５６７Ａ :5’-TTTGCGGCCACCTTGCCTCCACTCTCTACGCCATTGCC-3’（配列番号１７）
プライマーＶ５６７Ｇ :5’-GTTTGCGGCCACCTTGGGTCCACTCTCTACGCCATTGCC-3’（配列番号１８）
プライマーＶ５６７Ｍ :5’-GTTTGCGGCCACCTTATGTCCACTCTCTACGCCATTGCC-3’（配列番号１９）
プライマーＶ５６７Ｑ :5’-GTTTGCGGCCACCTTCAGTCCACTCTCTACGCCATTGCC-3’（配列番号２０）
プライマーＶ５６７Ｓ :5’-GTTTGCGGCCACCTTAGCTCCACTCTCTACGCCATTGCC-3’（配列番号２１）
プライマーＶ５６７Ｔ :5’-GTTTGCGGCCACCTTACGTCCACTCTCTACGCCATTGCC-3’（配列番号２２）
プライマーＶ５６７Ｃ :5’-GTTTGCGGCCACCTTTGTTCCACTCTCTACGCCATTGCC-3’（配列番号２３）

実施例１で取得した野生型ＧＬＤ遺伝子（配列番号１）を含むプラスミドと、実施例２で合成したプライマー、及びプライマーと相補的なオリゴヌレオチドを用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて、キットに添付されている実験手順に従って変異導入したプラスミドを取得した。作製したプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した後、得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体からｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてプラスミドを抽出した。

抽出したプラスミドを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、各改変ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製した。得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。

最終的に、野生型ＧＬＤを産生する形質転換体（カビ）と、Ｓ７１Ｄ、Ｎ３４６Ｋ、Ｓ４２９Ｖ、Ｆ５２１Ｗ、Ｖ５６７Ａ、Ｖ５６７Ｃ、Ｖ５６７Ｇ、Ｖ５６７Ｍ、Ｖ５６７Ｑ、Ｖ５６７Ｓ、Ｖ５６７Ｔ、Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ、Ｇ１８３Ｋ+Ｖ５６７Ａ、Ｓ７１Ｄ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｖ５６７Ｃ、Ａ２２１Ｙ+Ｖ５６７Ｃ、Ｓ２６９Ｖ+Ｖ５６７Ｃ、Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｓ１８８Ｖ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ａ２２１Ｙ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｓ４２７Ｖ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｆ５２１Ｙ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ、Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ+Ｖ５６７Ｃ、Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ+Ｆ５２１Ｗ、Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ+Ｆ５２１Ｙ、Ｓ１８８Ｖ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃ、Ａ２２１Ｙ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃ又はＳ７１Ｄ+Ｇ７２Ａ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃのアミノ酸置換を有する各改変型ＧＬＤを産生する形質転換体（カビ）が得られた。

［実施例３］
（各改変型ＧＬＤの熱安定性評価）
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（和光純薬工業社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、実施例２で取得した各形質転換体を植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法に準じ、プレートリーダーを用いてＧＬＤ活性を測定したところ、ＧＬＤ活性が確認できた。

得られた各培養上清を約６．６Ｕ／ｍＬになるように希釈した後、終濃度０．１Ｍになるように１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加した。該各試料を４５℃、３０分処理し、処理前と処理後のサンプルについて各々前述のＧＬＤ活性測定法で酵素活性を測定した。処理前の活性値に対する処理後の活性値の比を各々残存活性（％）として算出し、さらに野生型ＧＬＤの残存活性に対する各改変型ＧＬＤの残存活性の割合（％）を算出し、表２〜６に示した。

上記より、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で４５℃、３０分間処理した前後の残存活性について、上記改変型ＧＬＤは何れも、野生型ＧＬＤより高い残存活性を有することが分かった。つまり、野生型ＧＬＤと比較して、上記の改変型ＧＬＤは何れも熱安定性が向上していた。詳細には、野生型の残存活性（％）を１００とした場合に、改変型Ｖ５６７Ｑ及びＶ５６７Ｍは１００より大きく、改変型Ｓ７１Ｄ、Ｎ３４６Ｋ、Ｓ４２９Ｖ、Ｆ５２１Ｗ及びＧ１８３Ｋ+Ｖ５６７Ａは１１０以上、改変型Ｖ５６７Ｔは１２０以上、改変型Ｓ７１Ｄ+Ｖ５６７Ｃ、Ａ２２１Ｙ+Ｖ５６７Ｃ、Ｓ２６９Ｖ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｓ４２７Ｖ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｆ５２１Ｙ+Ｖ５６７Ｃ、Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ+Ｆ５２１Ｗ及びＳ７１Ｄ+Ｇ７２Ａ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃは１４０以上、改変型Ｖ５６７Ｃ、Ｖ５６７Ｇ、Ｖ５６７Ｓ、Ｇ７２Ａ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｓ１８８Ｖ+Ｖ５６７Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃ及びＳ１８８Ｖ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃは１５０以上、改変型Ｖ５６７Ａ、Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃ、Ａ２２１Ｙ+Ｆ５２１Ｗ+Ｖ５６７Ｃ及びＱ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ+Ｆ５２１Ｙは１６０以上、改変型Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ、Ｇ７２Ａ+Ａ２２１Ｙ+Ｖ５６７Ｃ、Ｑ１６９Ｃ+Ｇ２１０Ｃ+Ｖ５６７Ｃは１７０以上だった。

本発明により、熱安定性に優れた改変型グルコース脱水素酵素を利用することが可能になった。更に、本発明の改変型グルコース脱水素酵素は効率的に製造することが出来、加熱工程を含むバイオセンサを安定して製造することが可能になった。

Claims (11)

1. 以下のａ）〜ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、
   ａ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８で示されるアミノ酸配列、
   ｂ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８に示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、又は
   ｃ）配列番号２、３、２４、２５、２６、２７もしくは２８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列、
   配列番号２で示されるアミノ酸配列のＳ７１、Ｇ７２、Ｑ１６９、Ｇ１８３、Ｓ１８８、Ｇ２１０、Ａ２２１、Ｓ２６９、Ｎ３４６、Ｓ４２７、Ｓ４２９、Ｆ５２１又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列から成る、
   改変型グルコース脱水素酵素。
2. 請求項１に記載のａ）〜ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、
   Ｓ７１に対応する位置のアミノ酸がセリン、グリシンもしくはアスパラギンであり、Ｇ７２に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、Ｑ１６９に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、チロシンもしくはフェニルアラニンであり、Ｇ１８３に対応する位置のアミノ酸がグリシンもしくはアスパラギンであり、Ｓ１８８に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、Ｇ２１０に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、Ａ２２１に対応する位置のアミノ酸がアラニンもしくはセリンであり、Ｓ２６９に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、Ｎ３４６に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンもしくはアラニンであり、Ｓ４２７に対応する位置のアミノ酸がセリンもしくはアラニンであり、Ｓ４２９に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、Ｆ５２１に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンであり、又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸がバリンであるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、
   請求項１記載の改変型グルコース脱水素酵素。
3. 配列番号２で示されるアミノ酸配列のＳ７１、Ｇ７２、Ｑ１６９、Ｇ１８３、Ｓ１８８、Ｇ２１０、Ａ２２１、Ｓ２６９、Ｎ３４６、Ｓ４２７、Ｓ４２９、Ｆ５２１又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸置換が、
   Ｓ７１に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に、Ｇ７２に対応する位置のアミノ酸がアラニンに、Ｑ１６９に対応する位置のアミノ酸がシステインに、Ｇ１８３に対応する位置のアミノ酸がリジンに、Ｓ１８８に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｇ２１０に対応する位置のアミノ酸がシステインに、Ａ２２１に対応する位置のアミノ酸がチロシンに、Ｓ２６９に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｎ３４６に対応する位置のアミノ酸がリジンに、Ｓ４２７に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｓ４２９に対応する位置のアミノ酸がバリンに、Ｆ５２１に対応する位置のアミノ酸がトリプトファンもしくはチロシンに、又はＶ５６７に対応する位置のアミノ酸がアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン、セリンもしくはスレオニンに置換されたものである、
   請求項１又は２記載の改変型グルコース脱水素酵素。
4. ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で４５℃、３０分間処理後の残存活性について、野生型酵素より高い残存活性を有する、請求項１〜３の何れか１項に記載の改変型グルコース脱水素酵素。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載の改変型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
6. 請求項５記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
7. 請求項６記載のベクターを用いて形質転換された形質転換細胞。
8. 請求項７の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、改変型グルコース脱水素酵素の製造方法。
9. 請求項１〜４の何れか１項に記載の改変型グルコース脱水素酵素を使用するグルコース測定方法。
10. 請求項１〜４の何れかに１項記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
11. 請求項１〜４の何れかに１項記載の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。

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