JPS6359893A

JPS6359893A - 新規な組み換え体ｄｎａ

Info

Publication number: JPS6359893A
Application number: JP20128986A
Authority: JP
Inventors: Taiji Koyama; 泰二小山; Eiichi Nakano; 中野　衛一; Masaru Suzuki; 勝鈴木; Hideko Yamamoto; 秀子山本
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Priority date: 1986-08-29
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1988-03-15
Anticipated expiration: 2009-08-24
Also published as: JPH0665303B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮの製造に
有用な新規な組み換え体ＤＮＡに関する。

ザルコシン・オキシダーゼは、ザルコシン＋ｔｔｚｏ＋ｏ□→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋１（２０□の反応を触媒
する酵素であり、例えば、特開昭５４〜５２７８９号公
報、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第８９巻
、第５９９頁、１９８１年ジャパン（Ｊ。

１１ｉｏｃｈｅｍ、８９，５９９（１９８１）ＪＡＰＡ
Ｎ　）に記載され、公知である。

一方、クレアチニンあるいはクレアチンを酵素的に定量
する方法が報告され〔臨床化学シンポジウム、第１９集
、第１９６頁（１９７９）〕、該定量法にザ゛ルコシン
・オキシダーゼが使用されており、該酵素は、有用な酵
素である。該定量法は、下記の通りであり、下記の式中
、括弧内は使用酵素である。

タレ７チニン＋Ｈ２０＃クレアチニン（クレアチニン・アミドヒドロラーゼ）クレアチン＋Ｈ
２０→ザルコシン＋尿素（クレアチン・アミノヒドロラ
ーゼ）ザルコシン＋１１２０　＋　Ｏ□→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋１（２０□（ザルコシン
・オキシダーゼ）〔従来の技術〕先に、本発明者等の内の１人が、新たに土壌より分離し
たバチルス属に属する菌株を培養したものより、微酸性
でも充分酵素活性を示し、耐熱性で、ザルコシンに対す
るｋｍ値の低い新規なザルコシン・オキシダーゼが得ら
れることを知り、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ及
びその製造法の特許出願を行なった（特開昭６１４６２
１７４号公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記の耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎ製造法により、該酵素の収率を最大にするためには、
培地中に高価なりレアチニン、クレアチン及び／又はザ
ルコシンを添加することが必要であり、経済的に不利で
あり、また、製造操作も煩雑になる等の問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエツジ
エリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ）属に属する菌株
に含ませた耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ生産能を
有する菌株を培地に培養すると、培地中に、クレアチニ
ン、クレアチン及び／又はザルコシンを全く添加するこ
となしに、効率よく耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ
が生産されること等の知見を得、本発明を完成した。

即ち、本発明は耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコ
ー・ドする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡであ
る。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ（以下、ＳＯ
Ｎと略称する。）をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
の調製について述べる。

バチルス・エスピーＮＳ−１２９Ｃ微工研ｍｇ第２９２
２号（ＦεＲＭ　ＢＰ−６７１））株を、特開昭６１−
１６２１７４号公報記載の方法と全く同様にして培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば３０００ｒ、ｐ
、ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００ｒ、ｐｌ
ｍ、で５分以上、好ましりは１０〜１５分間遠心分離し
てバチルス・エスピーＮＳ−１２９株の菌体を得る。

この菌体より、例えば査藤、三浦の方法〔バイオケム、
ハイオフィズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

Ａｃｔａ）　、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕
等により染色体ＤＮＡを得ることができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えば５ａｕ３Ａｒ（東洋紡績社・製）を温度
３０°Ｃ以上、好ましくは３７℃、酵素濃度は１〜１０
ユニッｌ−／＋ｎ／で２０分以上、好ましくは０．５〜
２時間作用させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断片混合
物を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にＳＯ
Ｎをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれる
）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（ヘセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ−ｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生しさせる制限酵素
、例えばＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を、温度３０℃以上
、好ましくは３７℃、酵素濃度１０〜１０００ユニツト
／−で１時間以上、好ましくは２〜３時間作用させて消
化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーＮＳ
−１２９由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合
し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（二ニー・イン
グランド・バイオ・ラプス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ
４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７℃、好ましくは４〜
１６°Ｃ１酵素濃度１〜１００ユニット／ｒｎｌで１時
間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体
ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌ＨＢＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３６９４）
、大腸菌Ｄ　ＨＩ（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、大腸菌
Ｘ−１７７６（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１２４４）、などを形質
転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この
形質転換はディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇい、第６８
巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕により行なう
ことができる。また形質導入ハヒ・ホーン（Ｂ、Ｈｏｈ
ｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー第６８巻
、第２９９〜３０９頁（１９７９年）〕によって行なう
ことができる。

そして、上記菌株よりＳＯＮ生産能を有する菌株をスク
リーニングすることにより、ＳＯＮをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエツジエリシア
属に属する菌株を得ることができる。

このようにして得られた菌株より純化された組み換え体
ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリ−（Ｐ、Ｇｕｅ
ｒｒｙ）等の方法〔ジエイ、バクテリオロジー（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６４〜１
０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレウェル（
Ｄ、Ｂ。

Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェー・バタテリオロジー第
１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕などに
より得ることができる。

そして、以上の如くして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡ中のＳＯＳをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡには、ＳＯＮをコードする遺伝子以外に不用なりＮ
Ａが存在するため、以下の操作により該不用なりＮＡを
除去するのである。

次いで、このようにして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡに、制限酵素、例えばＨｐａＴ及び地（ＩＩ
Ｉ（夫々、宝酒造社製）を、温度３０℃以上、好ましく
は３７℃、酵素濃度１０〜１０００ユニツト／ｍｌで２
０分以上、好ましくは１〜６時間作用させて消化し、Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１２、ｐｕｃ　８　Ｄ　ＮＡ〔ファルマシア
社製］などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、制限酵素、例えば勿ＩＩ　１及
びｕ匹■（夫々、宝酒造社製）を、温度３０℃以上、好
ましくは３７°Ｃ１酵素濃度夫々１０〜１０００ユニソ
ｌ−／ｍｌで１時間以上、好ましくは１〜３時間作用さ
せて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーＮ５
−１２９由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合
し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・イング
ランド・バイオ・ラプス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
ベーリンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ４
ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７℃、好ましくは４〜１
６°Ｃ１酵素濃度１〜１００ユニットで１時間以上、好
ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得
る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌Ｊ　ＭＩＯｌ（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８
７６）、大腸菌ＨＢ　１０１　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６９
４）、大腸菌ＤＨＩ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、大
腸菌Ｘ−１７７６（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１２４４）、などを
形質転換あるいは形質４人してそれぞれの菌株を得る。

この形質転換はディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロ
ジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）］によ
り行なうことができる。また形質導入はビ・ホーン（Ｂ
。

Ｈｏｈｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー第
６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）〕によって
行なうことができる。

そして、上記苗株よりＳＯＮ生産能を有する菌株をスク
リーニングすることにより、ＳＯＮをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエンシェリシア
属に属する菌株を得ることができる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー（Ｐ、
　Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジエイ、バクテリオロジ−
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０
６４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレ
ウェル（Ｄ、Ｂ、Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェー・バ
クテリオロジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９
７２年）〕などにより得ることができる。

上記のようにして得られたＳＯＮをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエツジエリシア属
に属する菌株を用いてＳＯＮを生産するには、この菌株
を通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体
培養法を採用して培養するのが好ましい。

また、上記菌株を培養する培地としては、例え１ｆｆｌ
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー
あるいは大豆もしくは小麦数の浸出液等の１種以上の窒
素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２銖あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７°Ｃ前
後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌深
部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ま
しい。

培養終了後、該培養物よりＳＯＮを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

そして本酵素は、必要により酵素の単離精製の常法に従
って、例えば、（１１Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロースのカ
ラムクロマトグラフィー、（２）硫安分画、（３）ＱＡ
Ｅ−セファデックスのカラムクロマトグラフィー、（４
）　Ｔ　Ｓ　Ｋ　−Ｇ　Ｅ　Ｌブチルート−ヨーバール
６５０Ｃ〔東洋ソーダ＠製〕の疎水クロマトグラフィー
、（５）セスアデフクスによるゲル濾過等の方法、又は
その他の方法を必要に応じて組み合わせて用いることに
より高度に精製されたＳ　ＯＮ標品を得ることができる
。

上記精製手段により得られる精製ＳＯＮの理化学的性質
は、特開昭６１−１６２１７４号公報記載のＳＯＮの理
化学的性質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明の新規な組み換
え体ＤＮＡを含むエツジユリシア属に屈する菌株を培地
に培養すると、クレアチン、クレアチニン、ザルコシン
等を添加使用することなく、ＳＯＮを効率よく得ること
ができるので、本発明は産業上究めて有用なものである
。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例（１）　　バチルス・エスピーＮ５−１２９株の’ｈ　
包体Ｄ　ＮＡの調整バチルス・エスピーＮＮ５−１２９（ＦＥＲＢＰ−６７
１）株を、Ｔ−Ｙ培地〔１％　（Ｗ／Ｖ）バタトートリ
ブトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ　（ディフコ（Ｄ
ｉｒｃｏ）社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）バクトーイース
ト・エキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔ
ｒａｃｔ）　Ｃディフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕・０．５
％（Ｗ　／　Ｖ　）ＮａＣ１（ｐｔ＋７．２）　）　２
００　ｍｌに接種し、温度３０°Ｃで１６時間振盪培養
し、培養物を得た。

この培養物を１００００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間常法に
より遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得たのち、該
菌体からＴｒ藤、三浦の方法〔ハイオケム、ハイオフィ
ズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕に
より染色体ＤＮＡを得た。

ついで、この染色体ＤＮＡ０．１ｍｇ及び制限酵素５ａ
ｕ３ＡＩ（東洋紡績社製）２ユニツトを、１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ］、１０ｍＭ　ＭｇＳ
Ｏ４及び１ｍＭジチオスレイトール含有）　（ｐＨ７，
４）にそれぞれ混合し、温度３７°Ｃで４５分間反応さ
せた。反応終了液を常法により０．７％（Ｗ／Ｖ）アガ
ロースゲル（宝酒造社製）電気泳動処理したものより、
４〜８Ｋｂ（キロヘースベアー）の大きさのＤＮＡ断片
をアール・シー・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，Ａ、Ｙａｎｇ
）等の方法〔メンズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第
１７６〜１８２頁（１９７９年）〕により溶出して溶出
物を得、これから常法によりフェノール抽出処理し、更
にエタノール沈ｓ処理して５ａｕ３ＡＩで消化されたバ
チルス・エスピーＮＳ−１２９株の染色体ＤＮＡ断片１
０μｇを得た。

（２）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　ＤＮＡの
作製プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）社製）１０μｇ
と制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）１００ユニツトを
５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣ１、及
びｌｏｍＭ　Ｍｇ５ＯＪ含有）　（ｐＨ７，４）に混合
し、温度３７゛Ｃで２時間反応させて消化液を得、該液
を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理し
て、Ｂａｍ　ＩＩ　Ｉで消化されたプラスミドｐＢＲ３
２２ＤＮＡを得た。

ついで、このＲａｍ　ＨＩで消化されたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　１０μｇ、上記（１）で得られた
鎧ｕ３ＡＩで消化されたバチルス・エスピーＮＳ−１２
９株の染色体ＤＮＡ断片１０μｇ及び５ユニツトのＴ４
ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉ−ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製〕を６．６　ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１ｇ、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０
ｍＭＡＴＰを含有する６６ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、Ｄ
ＮＡを連結させた。

ついで、ディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏ−ｒ
ｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジ（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、第
６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕で、塩化
カルシウム処理した大腸菌ＤＨＩ株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３
８４９）を、上記のように連結させたＤＮＡで形質転換
し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン惑受性の形
質転換株１０００株を得た。

このようにして得られた形質転換株がＳＯＮ活性を有す
るか否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、０．５％（Ｗ／Ｖ）ザルコシン（東京化成工
業社製）及び５０μｇ／ｍ／アンピシリンを含有するＴ
−Ｙ培地５ｍｌに接種し、温度３０゛Ｃで２４時間培養
して培養液を得た。これを３５０Ｏｒ、　ｐ、ｍ、で１
０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１％（
Ｗ／Ｖ）ザルコシンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐｉ−１７，０）　　１　ｍｌに懸濁し、これに、２０
μβトルエンを添加し、温度３７°Ｃで１時間反応させ
た液を常法により３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心
分離処理して反応液を得、この反応液に１％（Ｗ／Ｖ）
４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２
゜４−トリアゾール、２３％（Ｗ／Ｖ）水酸化カリウム
及び０．０８％（Ｗ／Ｖ）メタ過ヨウ素ナトリウムを夫
々０゜１５艷ずつ添加し、反応液が紫色に変化したもの
がＳＯＮ活性を有する形質転換株であり、ＳＯＮ活性を
有する形質転換株である大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　　Ｄ　ＨＩ　（ｐＫＬＳ　６０１）株を得
た。

（３）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　Ｄ　Ｎ　
Ａの単離トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ
／Ｖ）　、及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培
地１βに、該培地を用い温度３７℃で１６〜２４時間前
培養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　ＨＩ　（ｐ
ＫＬＳ　６０１）の培養液２０ｍＺを接種し、温度３７
℃で３時間振盪培養シタのち、培養液にクロラムフェニ
コール０．２ｇを添加し、更に同一温度で２０時間培養
し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により１００００ｒ、　ｐ
ｏｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
ｍ１の２５％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖を含有する５０ｍＭ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更
に、これに、リゾチーム１０ｎｗ、０．２５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ溶液（ｐＨ８，０）　８　ｍＺ及び２０％（Ｗ／Ｖ）
　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌをそれぞれ添加
し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を
得た。

この溶菌液に、５　Ｍ　ＮａＣ１溶液１３＋ｎｌを添加
し、温度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１
５０００ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を
得、常法によりフェノール抽出処理したのち、常法によ
りエタノール沈澱処理し、沈澱物を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液６
　ｍＺ　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に、これに塩化
セシウム６ｇ及び１０■／ｍｌエチジウムブロマイド０
、２　ｍｌを添加したものを、常法により３９０００ｒ
、ｐ、ｍ。

で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理
を行ない組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　ＤＮＡ
を単離し、また、更に、ノルマルブタノールを使用して
エチジウムブロマイドを除去したのち、１ｍＭＥＤＴＡ
を含有する１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミド
ｐＫＬｓ６０１　ＤＮＡ　（、大きさは、９．ＩＫｂで
ある’）　２７００μｇを得た。

（４）新規な組み換え体ｐＫＬｓ６１２　Ｄ　Ｎ　Ａの
作製プラスミドｐＵＣ１８　ＤＮＡ　　（ファルマシア
社製）０．２μｇ並びに制限酵素肛匹■　（宝酒造社製
）及びＢａｍ１ｌＴ（宝酒造社製）を夫々１０ユニツト
ずつを１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ
１，１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ及び１ｍＭジチオスレイトー
ル含有）　（ｐＨ７，４）に混合し、温度３７℃で１時
間反応させて消化液を得、接液を常法によりフェノール
抽出及びエタノールプラスミドｐＵＣ１８　ＤＮＡを得
た。

次いで、上記（３）で得られた組み換え体ｐＫＬｓ６０
１ＤＮＡ１２μｇ並びに、Ｈｐａｒ（宝酒造社製）１２
ユニツト及びＢｇｌｌｌ（宝酒造社製）３０ユニツトを
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０
ｍＭ　ＭｇＳＯ４及び１ｍ−ジチオスレイトール含有）
　（ｐＨ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで５時間反応
させて消化液を得た。

該消化液を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動
したものより１．７　ＫｂのＤＮＡ断片を、アール・シ
ー・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，Ａ、　Ｙａｎｇ）等の方法
〔メンズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第０８巻、第１７６〜１
８２頁（１９７９年）〕により）容出して？容出物を得
、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理し
てＤＮＡ断片１．３μｇを得た。

なお、該断片は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片である。

そして、上記ＤＮＡ断片を、シＨＩ　ＩＩ　、Ｄｒａ　
Ｉ　、Ｐｖｕｌｌ、旦皿■、ＩＩｐａＩ（いずれも宝酒
造社製、制限酵素〕、　・ＡｓｕＵ（プロメガ　バイオ
チク社製、制限酵素）及びＢｓｔＥＩＩにッポンジーン
社製、制限酵素）を夫々用い単一消化及び２重消化して
得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により
移動度パターンを分析し、得られた移動度パターンと、
λＤＮＡを、前記Ｈｉｎｄｌｌｌにより消化して得られ
たＤＮＡ断片の標準移動度パターンと対比することによ
り得られた分子量は、１，７００　ｂｐ　（ヘースペア
ー）であり〔ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
　Ｂｉｏｌｏｇｙ）第９８巻、５５１〜５６４頁、１９
７５年参照〕、上記ＤＮＡ断片の制限酵素による切断地
図は、第１図に示すとおりであった。

このようにして得たＤＮＡ断片０．１５Ｍｇ、ｌ１ｉｎ
ｃ■及びＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＵＣ１８
　ＤＮ　Ａ　０．２μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガーマンハイム社製）■ユニットを、６６ｍＭ　ト
’Ｊス塩酸緩衝液（６，６ｍＭ　ＭｇＣ１，，１０ｍＭ
ジチオスレイトール及び１０ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ含有）　（
ｐＨ７，５）に混和し、温度４℃で１６時間反応させて
ＤＮＡを連結させた。

次イで、前述のディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法により塩化カルシウム処理し
た大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８７６）
を、上記のように連結させたＤＮＡで形質転換し、得ら
れた形質転換株ｔ−５０μｇ７ｍｌアンピシリン、０．
５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド及び０
．００４％（Ｗ／Ｖ）５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを、夫々含有するＴ−
Ｙ寒天平板培地を用いて温度３７°Ｃで２４時間培養し
、白色のコロニーを形成するものがＳＯＮを生産する株
であるので、白色のコロニーを形成する大腸菌Ｊ　Ｍ　
１０１　（ｐＫＬｓ６１２）を得た。

このようにして得られたＳＯＮ生産能を有する形質転換
株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＫ
Ｌｓ６１２）は、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第１１４６（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４６）とし
て寄託されている。

（５）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡの
単離トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％
（Ｗ／■）、及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる
培地１１に、該培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４時
間前培養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯ
Ｉ　（ｐＫＬｓ６１２）の培養液２０ｍ１を接種し、温
度３７℃で３時間振の培養したのち、培養液にクロラム
フェニコール０．２ｇを添加し、更に同一温度で２０時
間培養し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により１００００ｒ、　ｐ
、ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
−の２５％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖を含有する５０ｍＭ　
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更に
、これに、リゾチーム１０■、０．２５Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ溶液（ｐＨ８，０）　８　ｍｆ及び２０％（Ｗ／Ｖ
）　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８−をそれぞれ添加
し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を
得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液１３ｍ／を添加し、温
度４℃で１６時間処理したものを常法により１５０００
ｒ。

ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、常法によ
りフェノール抽出処理したのち、常法によりエタノール
沈澱処理し、沈澱物を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　ｈリス塩酸緩衝液
６　ｍ　（ｐＨ７，５）に溶解し、更に、これに塩化セ
シウム６ｇ及び１０■／−エチジウムブロマイド０．２
−を添加したものを、常法により３９０００ｒ、ｐ、ｍ
。

で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理
を行ない組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡ
を単離し、また、更に、ノルマルブタノールを使用して
エチジウムブロマイドを除去したのち、１ｍＭＥＤＴＡ
を含有する１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミド
ｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡ　（大きさは、４．４Ｋｂであ
る。）２３００μｇを得た。

（６）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＫＬ
ｓ６１２）によるＳＯＮの生産及び該酵素の分離、精製トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ
／Ｖ）　、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド／
ｍＭ、及び食塩０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２ｐを
攪拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注し
、常法により高圧滅菌処理したものに、上記と同一組成
の培地で予め温度３７℃で２４時間振盪培養した大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＫＬＳ６１２）の
培養液２０ｍ／を接種し、温度３７℃で８時間通気攪拌
培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体３５ｇを得た。

この菌体を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０
０　ｍｆに懸濁し、常法により超音波破壊処理したのち
、１５０００ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間通常の遠心分離処
理し、ＳＯＮの粗酵素液１２０　ｍｆ（２９０ユニット
／−）を得た。

このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシン
を用いて除核酸処理を施したものを、温度５０℃で１時
間加温処理を行なったのち、不溶性物質を１００００ｒ
、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離処理して除去した。

０．０１Ｍリン酸緩衝液で平衡化済みのＱＡＥ−セファ
デックスＡ−５０カラム（１，４Ｘ４０ｃｍ）に吸若さ
せたのち、０．２７塩化カリウムを含有する０、ＯＩＭ
　リン酸緩衝液で洗浄したち、０．３７１’ｌ塩化カリ
ウムを含有する０、ＯＩＭリンＭ１１衝液を用いて溶出
し、ＳＯＮ含有溶出液を得た。

このＳＯＮ含有溶出液を、常法により？農縮したのち、
凍結乾燥することにより純化されたＳＯＮ粉末２０．８
００単位を得た。なお、収率は、６０％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＯＳをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片の制限酵素による切断地図を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入したこと
を特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。２、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡが、バチルス・エスピーＮ５−１
２９株由来のＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の
新規な組み換え体ＤＮＡ。３、ベクターＤＮＡが、プラスミドｐＵＣ１８ＤＮＡで
ある特許請求の範囲第１項記載の新規な組み換え体ＤＮ
Ａ。