JPH02177888A

JPH02177888A - 新規な組み換え体ｄｎａ及びフォスフォトランスアセチラーゼの製造法

Info

Publication number: JPH02177888A
Application number: JP63329314A
Authority: JP
Inventors: Akira Matsuyama; 松山　旭; Hideko Yamamoto; 秀子山本; Eiichi Nakano; 中野　衛一
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1988-12-28
Filing date: 1988-12-28
Publication date: 1990-07-10
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: US5175104A; JPH0763373B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、フォスフォトランスアセチラーゼの製造に有
用な新規な組み換え体ＤＮＡ及びフォスフォトランスア
セチラーゼの製造法に関する。

フォスフォトランスアセチラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒ
ａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ、　ＥＣ２，３，１，８、以
下ＰＴＡと略称する。）は、アセチルリン酸（ａｃｅｔ
ｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びコエンザイムＡ（Ｃｏ
Ａ）からアセチル−ＣｏΔ及びリン酸を形成する反応を
触媒する酵素であり、その反応式は下記のとおりである
。

ＰＴ八アセデルリン酸＋ＣｏＡ　−＝−□ アセチルＣ〇へ−トリン酸ＰＴＡは、アセチル−ＣｏＡの製造及び再生に用いるこ
とができ、また、アセチル−Ｃｏ八、　Ｃｏ八及びアセ
チルリン酸の定量用酵素として極めて有用なものである
。

〔従来の技術〕

従来、ＰＴＡは、例えば、大腸菌（［Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｂ
を培地に培養し、菌体よりＰＴＡを分離、精製すること
により製造されている［ハイオキム、ハイオフィズ、ア
クタ、　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ
、）、　１．９１ρ、５５０〜５５８（１９６９年）］
。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、上記のＰＴＡの製造法によるときには、
該酵素の収率が著しく低い等の難点があった。

〔課題を解決するための手段］そこで、本発明者等は、上記難点を解決すべく種々検討
した結果、ＰＴＡをコードする遺伝子を含有するＤ　Ｎ
　ＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得
、この組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ）属に属する菌株に含ませたＰＴＡ生産能を有す
る菌株を培地に培養すると、高収率でＰＴＡが生産され
ること等の知見を得、本発明を完成した。

すなわち本発明は、フォスフォトランスアセチラーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡであ
り、また本発明は、フォスフォＩ・ランスアセチラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡ
に挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、フォスフォトラン
スアセチラーセ生産能を有するエッシェリシア属に属す
る菌株を培地に培養し、培養物よりフォスフォトランス
アセチラーゼを採取することを特徴とするフォスフォト
ランスアセチラーゼの製造法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、ＰＴＡをコードする遺伝子を含有するＤＮＡの調
製について述べる。

ＰＴＡをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを有する微
生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）　１１００　［マソクスープランクーインスチチュ
ート　（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−１ｎｓｔｉｔｕｔ）西独
、ハイデルベルグより入手１株を通常の固体培養法で培
養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養し
、培養物を得る。

また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵素
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー
あるいは大豆もしくは小麦共の浸出液等の１種以上の窒
素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マグネジうム、塩化第２鉄、硫酸
第２銖あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７“Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。

この培養物を、例えば３０００ｒ、ｐ、ｍ、以上、好ま
しくは８０００〜１００００ｒ、ｐ；ｍ、で５分以上、
好ましくは１０〜１５分間遠心分離して大腸菌１１００
株の菌体を得る。

この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム、
バイオフィズ、アクク、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）］
、ケエス・カービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ）の方法［バ
イオケム。

ジェイ、（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　、第６４巻、第４
０５頁（１９５６年）１等の方法により染色体ＤＮＡを
得ることができる。

次いで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばＳａｕ　３　Ａｌ（東洋紡績社製）を、
温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜
１０ユニット／ｍｌで２０分以上、好ましくは０．５〜
２時間作用させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断片混合
物を得る。

ごのようにして得たＤＮＡＵｒ片混合物から、例えば通
常のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物
を得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精
製し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段に
より濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にＰ
ＴＡをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれ
る）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、ハクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａ　［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）社製］、プラスミドｐＵＣ１１８ＤＮＡ
（全酒造・社・製）などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えば」堕旧　（全酒造社製）を、温度３０°Ｃ以上
、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１０〜１０００ユニッ
ト／ｍｌで１時間以上、好ましくは２〜３時間作用させ
て消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得た大腸菌１１００由来で、
ＰＴＡをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物
と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、これに例えば
大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・イングランド・バイオ・
ラプス社製）、Ｔ４ＤＮ　Ａ　ＩＪガーゼ（ヘーリンガ
ー・マイハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ１
酵素濃度１〜１００ユニットで１時間以上、好ましくは
６〜２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、エッシェリヒア属に属
する菌株例えば大腸菌に−１２、好ましくは大腸菌ＨＢ
　１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）　、大腸菌Ｄ　ＨＩ
　（ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌χ−１７７６（ＡＴ
ＣＣ３１２４４）、大腸菌１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎ
ｋ−Ｉｎｓｌｌｏｏ（西独、ハイデルベルグより入手）
、大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（ＡＴＣＣ３３８７６）など
を形質転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る
。この形質転換はデイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法［メソヅ・イン・エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）］に
より行なうことができる。また形質導入はビー・ホーン
（Ｂ、Ｈｏｈｎ）の方法［メソヅ・イン・エンザイモロ
ジー第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）］に
よって行なうことができる。

そして、上記菌株よりＰＴＡ生産能を有する菌株をスク
リーニングすることにより、ＰＴＡをコドする遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、ＰＴＡ生産能を有するエッシェリシア属
に属する菌株を得ることができる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法［ジェイ・ハクテリオロジー（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６
４〜１０６６頁（１９７３年）］、デ・フレウェル（Ｄ
、Ｂ、ＣＩｅｗｅｅｌ）の方法［ジェー・ハクテリオロ
ジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）］
などにより得ることができる。

上記のようにして得られたＰＴＡをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、ＰＴＡ生産能を有するエッシェリシア属
に属する菌株を用いてＰＴＡを生産するには、該菌株を
前述と同様にして培養し、培養物を得る。

培養終了後、該培養物よりＰＴＡを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
ノチ、これに硫安、アルコール、アセトン等ヲ添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

更に、ＰＴＡの精製品を得るには、例えばＤＥＡＥ−セ
ルロース（ジ・エチル・アミノ　エチル・セルロース、
米国ブラウン社製）　　、ＤＥＡＥセファデンクス（ジ
・エチル・アミノ・エチル・セファデックス・スウェー
デン国、ファルマソア社り　、ＱＡＥ−セファデックス
（スウエーテン国、ファルマシア社製）等のイオン交換
物質を用いる吸着溶出法にて精製するか、またセファデ
ックスＣ−２００（スウェーデン国、ファルマシア社製
）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国、ファルマシー
１社製）等を用いるゲル濾過法、ハイドロギシルアバタ
イト　（米国ハイオラソド社製、バイオゲル１（Ｔ）を
用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド′ゲル等を用い
る電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施することに
より、高度に精製されたＰＴＡ標品を得ることができる
。

上記手段により得られるＰＴＡの理化学的性質は、ハイ
オキム、ハイオフィス、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）、１９１、ｐ、５５０〜
５５８　（１９６９）記載のＰＴＡの理化学的性質と全
く同様である。

〔発明の効果〕

上ｊホしたことから明らかな如く、本発明の新規な組み
換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属する菌株を培
地に培養すると、ＰＴＡを効率よく得ることができるの
で、本発明は産業上極めて有用なものである。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

〔実施例〕

（］）大腸菌１１００株の染色体ＤＮＡの調整大腸菌（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）１１００　（Ｍａ
ｘ−ＰｌａｎｋＩｎｓｔｉｔｕｔ西独、ハイデルベルク
より入手）株を、Ｔ−Ｙ培地［１χ（ＩＬＩ／ｖ）ハク
トートリプトン（Ｂａｃｔ。

Ｌｒｙｐｔｏｎ）　（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）−社・製
）、０．５％（Ｗ／Ｖ）ハク１−一イーストエクストラ
クト　（Ｂａｃｔｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）　（デ
イフコ（Ｄｉｆｃｏ）−社・製〕及び０．５％（Ｗ／Ｖ
）　ＮａＣｌ　（ｐ　Ｈ７，２）　］　］、　００ｍ１
に接種し、温度３７°Ｃで８時間振の培養し、培養物を
得た。

この培養物を、１０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１５分間、
常法に」　１より遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得たのち、該
菌体から斎藤、三浦の方法［ハイオケム、ハイオフィズ
、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、八Ｃ
Ｌａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）］によ
り染色体ＤＮＡを得た。

次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Ｓａｕ
　３　ＡＩ　（東洋紡績・社・製）３ユニ・ントを、１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０
ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，及び１、ｍＭジチオスレイトール含有
、ｐＨ７，／ｌ）に夫々混合し、温度３７“Ｃで３０分
間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽
出処理したのち、エタノール沈澱処理し、このＳａｕ　
３　Ａｌで消化されたＤＮＡ断片が再結合することを防
１１−するために、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉＢ）、第１３３〜１３４頁
の方法でバクチリアル・アルカリフメスファターゼ（Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔａｓｅ）処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行な
い、常法によりフェノール抽出処理し、更に、エタノー
ル沈澱処理して、Ｓａｕ　３八１で消化された大腸菌１
１００株の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。

（２）組み換え体プラスミドｐＰＴ１．００Ｄ　Ｎ　Ａ
の作製プラスミド’　ｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（ヘセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）・社・製〕１０μｇ及び制限酵素−Ｈ（宝酒
造社製）１００ユニットを５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝
液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ　、及び１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ
ａ含有、ｐＨ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで２時間
反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽
出及びエタノール沈澱処理して、ＢａｍＨＩで消化され
たプラスミｔ”　ｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａを得た。

次いで、このＢａｍ旧で消化されたプラスミ）”ｐＢＲ
３２２ＤＮＡ１０μｇ、項目（１）で得られた跡哄３Ａ
Ｉで消化された大腸菌１１００株の染色体ＤＮＡ断片１
０μｇ及び５ユニツトＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ヘーリンガ
ー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉ
ｍ）−社・製〕を、６．６　ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール及び１０ｍ門ＡＴＰを含有する６
６ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加し、温
度１６°Ｃで１６時間反応させ、ＤＮＡを連結させ、種
々の組み換え体プラスミドＤＮＡを得た。

そして、デイ−エム・モーリソン（［１，）４．Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ）の方法［メンズ・イン・エンデイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｌｙい、第
６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）］により、
塩化カルシウム処理した大腸菌１１００株を、」二記の
ように連結させた種々の組み換え体プラスミドＤＮＡで
形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感
受性の形質転換株３０００株を得た。

このよ・うにして得られた形質転換株のＰＴＡ活性が」
−昇しているか否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、５０μｇ／ｒｒ＝Ｒアンピシリンを含有する
ＴＹ培地１．５１ＴＩＩ！に接種し、温度３０°Ｃで２
４時間振盪培養して培養液を得た。これを３．５００ｒ
、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、
該菌体を１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び１ｍＭＥＤＴＡを含
有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　１．　ｍ
ｌに懸濁し、これに２０μｆｆ１ｌ□ルエンを添加し、
温度３７゛Ｃで２０分間振盪した。この反応液１００μ
ｆを、５ｍＭ　ＭｇＣｌ□、０．５ｍＭ　ＮＡＤ、０．
５　ｍＭ　ＣｏＡ（コエンザイムへ）、５ｍＭＬ−リン
ゴ酸、１２．５ｇｇ／ｍｌマレート・デヒドロゲナーゼ
、２５μｇ／ｍｌクエン酸シンターセ及び１０．ｍＭア
セチルリン酸を含有する１００ｍＭ　　ｌ−リス−塩酸
緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）　２．９ｍｌに添加し、温度２
５°Ｃにおける３４０ｎｍの吸収の変化を測定すること
により、ＰＴＡの酵素活性を測定した。３４０ｎｍの時
間当りの吸収量の変化が大きいものが、ＰＴＡ活性が上
昇している形質転換株であり、宿主大腸菌１１００株よ
りＰＴＡ活性が上昇している形質転換株である大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ＩＩＰＴｌｏｏ）株を得た。

（３）組み換え体プラスミドｐＰＴ１００　ＤＮＡの単
離トリ１ｌ−：／　１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキ、Ｚ、　
０．５％（Ｗ／Ｖ）、及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）
からなる培地１１に、該培地を用い温度３７°Ｃで２４
時間前培養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（
ｐＰＴｌｏｏ）株の培養液２０ｍ１を接種し、温度３７
°Ｃで３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェ
ニコール０．２ｇを添加し、更に同一温度で２０時間培
養し、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により１０．００Ｏｒ、ｐ
、ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
ｍ１の２５％（Ｗ／Ｖ）ショ糖を含有する５０ｍＭｔ・
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）にｐ：濁したのち、更
に、これに、リゾチーム１０ｍｇ、０．２５門ＥＤＴＡ
？容Ｙ夜（ｐ　Ｈ８，０）　８　＋ｎｌ及び２０％（１
１／Ｖ）　　ドデシル硫酸すＩ・リウム溶液８ｍｌ！を
夫々添加し、温度６０’Ｃで３０分間保温して溶菌し、
溶菌液を得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣ］溶液１３ｍ／を添加し、温
度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５，０
００乙凱「、で３０分間遠心分離して抽出液を得、常法
によりフェノール抽出処理したのち、常法によりエタノ
ール沈澱処理し、沈澱物を得た。

そして、この沈澱物を、常法により減圧乾燥処理したも
のを、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　トリス−塩
酸緩衝液６　＋ｎ／　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に
、これに塩化セシウム６ｇ及び１０■／ｍｌエチジウム
ブロマイド０．２−を添加したものを、常法により３９
．０００ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用いて
平衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドｐ
ＰＴ　１００ＤＮＡを単離し、また、更に、ｎ−ブタノ
ールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、
１ｍＭＥＤＴＡを含有するｌ０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化された組み
換え体プラスミドｐＰＴ１００　Ｄ　Ｎ　Ａ　（大きさ
は、１０、ＯＫｂである。）１５００μｇを得た。

（４）新規な組み換え体プラスミドｐＰＴ２００　Ｄ　
Ｎ　Ａの作製プラスミドｐｌＪｃ］−１８Ｄ　Ｎ　Ａ　（全酒造・社
・製）０．２μｇ並びに制限酵素Ｋｐｎｌ　（全酒造・
社・製）１０ユニツトをｌＱｍＭｌ□リス−塩酸緩衝液
（］ＯｍＭ　ＭｇＣｌ□、及び１ｍＭジチオスレイトー
ル含有、ｐ　Ｈ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで１時
間反応させたのち、更に、５０ｍＭ　ＮａＣｌ　となる
ようにＮａＣ１を添加し、制限酵素ＨｉｎｄｌｌＴ　（
全酒造・社・製）１０ユニツトを加え、３７°Ｃで１時
間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール
抽出及びエタノール沈澱処理して、Ｋｐｎ　Ｉ及び旧ｎ
ｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＵＣ１１８　ＤＮＡ
を得た。

次いで、項目（３）で得られた組み換え体プラスミドｐ
ＰＴ１００Ｄ　Ｎ　Ａ　１　ｕｇ並びにＫｐｎｒ　１０
コー’−ｙトを１０ｍＭＩ・リス−塩酸緩衝液（１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ□、及び１１ジチオスレイトール含有、ｐ
　Ｈ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで１時間反応させ
たのち、更に最終濃度５０ｍＭとなるようにＮａＣｌを
添加したものに、制限酵素Ｈｔｎｄ１１１１０ユニット
を加え、温度３７°Ｃで１時間反応させて消化液を得た
。

該消化液を、０７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動
したものより３．．３ＫｂのＤＮＡ断片をアール・シー
・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，Ａ、Ｙａｎｇ）等の方法［メ
ンズ・イン・エンデイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｕｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、第６８巻、第１７６−１
８２頁（１９７９年）］により溶出して溶出物を得、常
法によりフェノル抽出及びエタノール沈澱処理してＤＮ
Ａ断片０．３μｇ得た。

上記のよう番こして得た０、３μｇのＫｐｎＩ及び旧ｎ
ｄ■で消化したプラスミドｐＵＣ１１８ＤＮＡ及び０．
３μｇのｐＰＴ１００プラスミドＤＮＡ由来の３．３　
ＫｂｐのＫｐｎＴ／Ｈｉｎｄｌｌｌで消化したＤＮＡ断
片を、夫々７μ！の水に溶解し、これに、混液［７７ｍ
Ｍ　）　リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）／１５ｍＭ　
ＭｇＣｈ／１５ｍＭジヂオスレイトル１０．１５ｍＭＡ
Ｔ　Ｐ　）　１３μＲ及び１ユニントのＴ４　ＤＮＡリ
ガーゼを添加し、温度８°Ｃで１８時間連結反応を行な
った。この反応液を用い、ジャーナル　オブ・ハタテリ
オロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇい、第１１９巻、第１０７２〜１０７４頁（１９７
４年）記載の形質転換法により、大腸菌ＪＭＩ１００株
（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、薬剤耐性（アン
ピシリン耐性）及び、β−ガラクトシダーゼ活性を検討
し、形質転換株を得、その株の含有する組み換え体プラ
スミドＤＮＡをｐＰＴ２００と命名した。このようにし
て形質転換して得られた大腸菌Ｊ　Ｍｌｌｏｏ（ｐＰＴ
２００）は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
条寄第２１９５号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２１９５）として
寄託されている。

（５）大腸菌Ｊ　Ｍ　１１００　（ｐＰＴ２００）の培
養及び粗酵素液の８周製項目（４）で得た大腸菌Ｊ　ＭＩｌｏｏ（ｐＰＴ２００
）　（ＦＥＲＭ　ＢＰ２１．９５）を、ＬＢ−ａｍｐ培
地〔ハタトドリブトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．
５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣｌ　Ｏ，５％（町い及びアンピ
シリン５０　（μｇ／ｍり　）　３ｍｌにて温度３７°
Ｃで１８時間振盪培養を行なって得た培養液０．５　ｍ
１を、１０ｍ１のイソプロピル−β−Ｄ＝チオガラクト
シド１ｍＭを含む上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種し、温度
３７’Ｃで６時間振盪培養したのち、３．５０Ｏｒ、ｐ
、ｍ、で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌
体を、１０ｍＭ　ＭｇＣｌｚ及び１ｍＭＥＤＴＡを含有
する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　Ｉ　ｍｌに
懸濁し、常法により超音波破壊処理し、粗酵素液を得た
。このようにして得られた粗酵素液中のＰＴＡ活性の測
定は、下記の方法により行なった。

上記粗酵素液１００μｆｆｉを、５ｍＭ　Ｍｇｃ＋□、
０．５ｍＭＮＡ　Ｄ、　０．５　ｍＭ　ＣｏＡ、５ｍＭ
　Ｌ−リンゴ酸、１２，５μｇ７ｍｌマレート・デヒド
ロゲナーゼ、２５μｇ／ｍｌクエン酸シンクーゼ及び１
０ｍＭアセチルリン酸を含有する１００ｍＭ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）　２．９　ｍｌに添加し、
温度２５°Ｃにおける３４０ｎｍの吸収の変化より、生
成したＮＡＤＨの量を算出した値を下表に示した。

また、比較のため、プラスミドｐＵＣ１１８　Ｄ　Ｎ　
Ａを有する大腸菌ＪＭＩ１００株Ｃ大腸菌Ｊ　ＭＩｌｏ
ｏ　（ｐＵＣ１１８）　）についても同様にＰＴＡ活性
を測定した結果を下表に示した。

表上表より明らかな如く、本発明により得られる粗酵素値
は、対照の粗酵素液に比して、ＮＡＤＰＨ生成量が著し
く増加しており、ＰＴＡが発現されていることが判る。

（６）　　ＰＴＡ遺伝子を含む組み換え体プラスミドｐ
ＰＴ２００ＤＮＡの調製上記項目（５）で得られた大腸菌１．１００　（ｐＰＴ
２００）株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２１９５）を、トリプト
ン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）及
びＮａＣｌ　Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地ＩＩ！、
に、該培地を用い、温度３７°Ｃで２４時間前培養して
得られた大腸菌１１００　（ｐＰＴ２００）株の培養液
２０ｍ１を接種し、温度３７°Ｃで３時間振盪培養した
のち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に
同一温度で２０時間同培養を行ない、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により６．０ＯＯｒ、ｐ、
ｍで１０分間遠心分離処理して湿潤菌体２ｇを得、これ
を２０ｍｆの２５％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖を含有する３
５０ｍＭ　　Ｉ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸
濁したのち、更に、これにリゾチーム（シグマ・社・製
）ｌＯｍｇ、０．２５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　溶？夜（
ｐＨ８，０）　８　ｍｌ！及び２０％ＧＷ／Ｖ）　　ド
デシル硫酸ナトリウム溶液８ｍＲを夫々添加し、温度６
０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。この
溶菌液に、５ＭＮａＣｌ水溶液１３ｍ１を添加し、温度
４°Ｃで１６時間処理したものを常法により、１５．０
０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して得た抽出液を
、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処
理を行ない沈澱物を得た。

次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有する］ＯｍＭ　トリス
−塩酸ｆｆｔ衝？ｖ、（ｐ　Ｈ７，５＞　６　ｍｌに熔
解し、更に、コレニ塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブ
ロマイド（１９ｍｇ／ｍ１）０．２ｍｌを添加したもの
を、常法により３９．００Ｏｒ、旧印、で４２時間超遠
心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、
組み換え体プラスミドｐＰＴ２００　Ｄ　Ｎ　Ａを単離
し、また更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブ
ロマイドを除去したのち、１　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含
有する１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＩ−１７，５
）に対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミ
ドｐＰＴ２００　Ｄ　Ｎ　Ａ　６００μｇを得た。

該組み換え体プラスミドｐＰＴ２００　Ｄ　Ｎ　Ａを制
限酵素は遼Ｒ１，，拘狙１１影馴旧、は冴ＲＶ及び肛荊
■　（いずれも全酒造・社・製）を用い、単一消化及び
二重消化して得られたＤＮＡ断片を、アガロース電気泳
動法により、移動度パターンを分析し、得られた移動度
パターンとハタテリオファージλＤＮＡ（全酒造・社・
製）を肛皿■により消化して得られたＤＮＡ断片の標準
移動度パターンとを対比することにより得られた制限酵
素開裂地図は、第１図に示すとおりであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例でえられた新規な組み換え体ｐＰＴ２
００プラスミドＤＮＡの制限酵素開裂地図である。出願人　キ・ノコ−マン株式会社代理人　弁理士　平　木　祐　輔同　　弁理士　石　井　頁　次

Claims

【特許請求の範囲】

（１）フォスフォトランスアセチラーゼをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入したこと
を特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
（２）フォスフォトランスアセチラーゼをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡが、エッシェリシア・コリ１１０
０株由来のＤＮＡである請求項１記載の新規な組み換え
体ＤＮＡ。
（３）ベクターＤＮＡが、プラスミドｐＢＲ３２２又は
ｐＵＣ１１８ＤＮＡである請求項１記載の新規な組み換
え体ＤＮＡ。
（４）フォスフォトランスアセチラーゼをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを含み、フォスフォトランスアセチラーゼ
生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を、培地
に培養し、培養物よりフォスフォトランスアセチラーゼ
を採取することを特徴とするフォスフォトランスアセチ
ラーゼの製造法。
（５）フォスフォトランスアセチラーゼをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡが、エッシェリシア・コリ１１０
０株由来のＤＮＡである請求項４記載のフォスフォトラ
ンスアセチラーゼの製造法。
（６）ベクターＤＮＡが、プラスミドｐＢＲ３２２又は
ｐＵＣ１１８ＤＮＡである請求項４記載のフォスフォト
ランスアセチラーゼの製造法。