JPH01117782A

JPH01117782A - アセテート・カイネースの製造法

Info

Publication number: JPH01117782A
Application number: JP27314687A
Authority: JP
Inventors: Akira Matsuyama; 松山　旭; Hideko Yamamoto; 秀子山本; Eiichi Nakano; 中野　衛一
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1987-10-30
Publication date: 1989-05-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、アセテート・カイネースの製造法に関する。

アセテート・カイネース（ａｃｅｔａｔｅ　ｋｉｎａｓ
ｅ）は、下記の反応式で示される反応を触媒する酵素で
ある。

そして、アセテート・カイネースは、ＡＴＰの製造等に
極めて有用なものである。

〔従来の技術〕

従来、アセテート・カイネースは、例えば、エッシェリ
シア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を
培養し、菌体よりアセテート・カイネースを分離、精製
することにより製造されている〔ジエイ、パイオル、ケ
ム、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、第２６１巻、第
２９号、第１３４８７〜１３４９７頁（１９８６）　）
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記のアセテート・カイネースの製造法
によるときには、該酵素の収率が著しく低い等の難点が
あった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記難点を解決すべく種々検討
した結果、アセテート・カイネースをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたアセテ
ート・カイネース生産能を有する菌株を培地に培養する
と高収率でアセテート・カイネースが生産されること等
の知見を得、本発明を完成した。

すなわち、本発明はアセテート・カイネースをコードす
る遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した
組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カイネース生産
能を有するエッシェリシア属に属する微生物を、培地に
培養し、培養物よりアセテート・カイネースを採取する
ことを特徴とするアセテート・カイネースの製造法であ
る。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡの調製について述べる。

例えば、大腸菌好ましくは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１
００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−１ｎｓｔｉｔｕｔ西独、ハ
イデルベルグより入手）を培養して培養物を得る。

上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養し
てもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。

また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィーブリカーあ
るいは大豆もしくは小麦艷の浸出液等の１種以上の窒素
源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩
化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩
類の１種以上を添加し、更に必要によりＩ！雪原料、ビ
タミン等を適宜添加したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７°Ｃ前
後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、通気撹拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。

このようにして得られる培養物を、例えば３０００ｒ、
ｐ、ｏｔ、以上、好ましくは８０００〜１００００ｒ、
ｐ、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分
離して大腸菌１１００の菌体を得る。　　　　　。

この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム、
バイオフィズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）］
、ケー・ニス・カービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ）の方法
［バイオケム。

ジェイ、（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　、第６４巻、第４
０５頁（１９５６年）］等の方法により染色体ＤＮＡを
得ることができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えば５ａｕ３Ａ　Ｔ　（東洋紡績社製）を、
温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度ｌ〜
ｌＯユニット／ｒｄで２０分以上、好ましくは３０分〜
２時間作用させて消化し、種々の染色ＤＮＡ断片混合物
を得る。

そして、アセテート・カイネース遺伝子は、リンケージ
・マツプ（Ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ）　（マイクロバイ
オロジカル・レビュウズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）、第４７巻、第２号、第１８０
〜２３０頁（１９８３年）ゴ上、ｐｕｒＦ（グルタミン
・フォスフォリボシルパイロフォスフエイト・アミドト
ランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａ−ｍｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａ
ｎ＋１ｄｏｔｒａｎｓ−ｆｅｒａｓｅ）遺伝子の近傍に
位置づけられているので、前記染色体ＤＮＡ断片混合物
からクロモゾーマル・ウオーキング（Ｃｈｒｏｎ＋ｏｓ
ｏｍａｌ　Ｗａｌｋｉｎｇ）法〔ネイチ−？　−（Ｎａ
　ｔｕｒｅ）、第３００巻、第４号、第３５〜４２頁（
１９８２年）〕によりｐｕｒＦ遺伝子の近傍に存在する
アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片を
検索することができる。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にアセ
テート・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片が含まれる）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＵＣ１
９　ＤＮＡ　（宝酒造社製）などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えばＥｃｏＲＩ及び勿旧（いずれも宝酒造社製）を
、温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１
０〜１０００ユニッ）／ｍｆで１時間以上、好ましくは
１〜３時間作用させて消化し、゛切断されたベクターＤ
ＮＡを得る。

次いで、上記のようにして得た大腸菌１１００由来で、
アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合
し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（二ニー・イン
グランド・バイオ・ラプス社製）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
ベーリンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ４
ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜
１６°Ｃ１酵素濃度１−１００ユニットで１時間以上、
好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを
得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（ＡＴＣＣ３３８
７６）、大腸菌ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）
、大腸菌Ｄ　ＨＩ　（ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌χ
−１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）、などを形質転換あ
るいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。

この形質転換はデイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）　、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕
により行なうことができる。

また形質導入はビー・ホーン（Ｂ、　Ｈｏｈｎ）の方法
〔メソヅ・イン・エンザイモロジー第６８巻、第２９９
〜３０９頁（１９７９年）〕によって行なうことができ
る。

そして、上記菌株よりアセテート・カイネース生産能を
有する菌株をスクリーニングすることにより、アセテー
ト・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、ア
セテート・カイネース生産能を有するエッシェリシア属
に属する菌株を得ることができる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジエイ、バクテリオロジー（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６
４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレウ
ェル（Ｄ。

Ｂ、Ｃｌｅ％１ｅｌｌ）の方法〔ジェー、バタテリオロ
ジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕
などにより得ることができる。

上記のようにして得られたアセテート・カイネースをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カイネー
ス生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を用い
てアセテート・カイネースを生産するには、前記大腸菌
１１００の培養法と全く同様にして培養し、培養物を得
る。

培養終了後、該培養物よアセテート・カイネースを採取
するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができ
る。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

更に、アセテート・カイネースの精製品を得るには、例
えばＤＥＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチ
ル・セルロース、米国ブラウン社製）　、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス（ジ・エチル・アミン・エチル・セファデ
ックス、スウェーデン国ファルマシア社製）、ＱＡＥ−
セファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社製）
等のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか
、またセファデックスＧ−２００（スウェーデン国、フ
ァルマレア社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国
、ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハイトロ
キシルアパタイト　（米国バイオランド社製、バイオゲ
ル１１Ｔ）を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲ
ル等を用いる電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施
することにより、高度に精製されたアセテート・カイネ
ース標品を得ることができる。

上記精製手段により得られる精製アセテート・カイネー
スの理化学的性質は、〔ジエイ、パイオル、ケム、　（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、）、第２６１巻、第２９
号、第１３４８７〜１３４９７頁（１９８６年）〕記載
のアセテート・カイネースの理化学的性質と全く同様で
ある。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明の新規な組み換
え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属する菌株を培地
に培養することにより、アセテート・カイネースを高収
率で得ることができるので、本発明は産業上極めて有用
なものである。

〔実施例］以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例（１）大腸菌１１００株ＤＮＡの調製大腸菌１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｌｌｏｏ
（西独、ハイデルベルグより入手）株を、Ｔ−Ｙ培地［
１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎ）　　（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製Ｌ０．
５％（Ｗ／Ｖ）バクトーイーストエキストラクト（Ｂａ
ｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）　　（デイフコ
（Ｄｉｒｃｏ）社製〕及び０．５％（Ｗ／Ｖ）　ＮａＣ
１（ｐ　Ｈ７，２）　］１００　ｒｄに接種し、温度３
７°Ｃで８時間振盪培養し、培養物を得た。

この培養物を１０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１５分間、常
法により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得たのち
、該菌体から斎胚、三浦の方法〔バイオケム、バイオフ
ィズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕
により染色体ＤＮＡを得た。

次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Ｓａｕ
　３ＡＩ（東洋紡績社製）３ユニツトを、１０ｍＭ　）
リス−塩酸緩衝液（５０１１１Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏ＜及び１ｍＭジチオスレイトール含有）　（
ｐＨ７，４）に夫々混合し、温度３７°Ｃで３０分間反
応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処
理し、エタノール沈澱処理した後、この５ａｕ３Ａ　Ｉ
で消化されたＤＮＡ断片が再結合することを防止するた
めに、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１３３〜１３４頁の方法でバ
クチリアル・アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）
処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行ない、常法に
よりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理し
て、５ａｕ３ＡＩで消化された大腸菌１１００株の染色
体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。

（２）バクテリオファージベクターＤ　Ｎ　Ａ　（ＥＭ
ＢＬ４）を利用した大腸菌染色体ＤＮＡライブラリーの
作製バクテリオファージベクターＤＮＡ　（ＥＭＢＬ４）〔
プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ
）社製〕２０ｕｇ及び制限酵素１旧（宝酒造社製）２０
０ユニツトを５０１１ＩＭトリスー塩酸緩衝液（１００
ｍＭ　ＮａＣ１及び１０ｍＭＭｇＳＯ４含有）（ｐＨ７
，４）に混合し、温度３７°Ｃで２時間反応させて消化
液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノー
ル沈澱処理した後、バクテリオファージ・ベクター由来
の中間ＤＮＡフラグメントが再結合することによりバク
テリオファージができることを防止するために、エタノ
ール沈澱物２０μｇ及び制限酵素５ａｉｌ　１００ユニ
ツトを５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　Ｎ
ａＣ１及び１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，含有）（ｐＨ７，４）
に混合し、温度３７°Ｃで２時間反応させて消化液を得
、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱
処理して、１旧で消化されたバクテリオファージＥＭＢ
Ｌ４ＤＮＡを得た。

ついで、この」並旧で消化されたバクテリオファージＥ
ＭＢＬ４ＤＮＡ１ｕｇ、上記項目（１）で得られた５ａ
ｕ３ＡＩで消化された大腸菌１１００株の染色体ＤＮＡ
断片１μｇ及び２ユニツトの７４ＤＮＡリガーゼ〔ベー
リンガー・マンハイム（ＢｏｅｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅ
ｉｍ）社製〕を、６６ｍＭ　ＭｇＣｈ、１０ｍＭジチオ
スレイトール及び１０ｍＭＡ　Ｔ　Ｐを含有する６６ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加し、温度１
６°Ｃで１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。

ついで、ｍｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ混合物を、イン・ビトロ・パ
ッケージング（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ
）法〔メンズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第２８
１〜２９８頁（１９７９年）］により、バクテリオファ
ージの被膜蛋白質で包み、バクテリオファージ粒子を調
製した。

ついで、このようにして得たバクテリオファージ粒子を
大腸菌ＮＭ５３９　　（プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）社より入手〕を指示菌として
、トリプトン寒天培地［トリプトン（Ｄｉｆｃｏ（社）
製］１％、ＮａＣ１０，２５％、寒天１．２％で、加圧
滅菌したのち、３０ａ／ずつ直径９ｃｍのシャーレに分
注したものである。］上に撒き、温度３７°Ｃで１６時
間静置培養したのち、約ｓ、ｏｏｏ個の溶菌斑を得、こ
れをライブラリーとして使用した。

（３）　　ｐ　ｕ　ｒ　Ｆ遺伝子を含むＤＮＡの調製大
腸菌アセテート・カイネース発現に関与する遺伝子ａｃ
ｋＡは、前述した如く、遺伝子の近傍に位置づけられて
いる。ｐｕｒＦ遺伝子の塩基配列は、ジエイ・ヤン・ツ
オー（Ｊ、Ｙｕｎ、Ｔｓｏ）等の報告〔ジャーナル・オ
プ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　
、第２５７巻、第３５２５〜３５３１頁、１９８２年〕
に記載されている。このｐｕｒＦ遺伝子の塩基配列の一
部である５”ＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＧＴＧ　３’
の１６塩基のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔ベッ
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）社製〕を用いて、合成した
。この２０ｎｇのオリゴヌクレオチドの５′末端を（”
Ｐ　）　ＡＴＰ　　（アマジャム社製）を用いて、モレ
キュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ）、第１２２〜１２６頁、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）記
載の方法に従って標識した。

上記の方法で調製した３！Ｐで標識したｐｕｒＦ遺伝子
の一部であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
、項目（２）で作製した組み換え体バクテリオファージ
ＥＭＢＬ４ＤＮＡをベクターとする大腸菌１１００株染
色体ＤＮＡライブラリーを、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第３１２〜３２８頁、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）　（１９８２））で検索し、ｐｕｒＦ遺伝子を有
するプラークを得た。

該プラークをモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ−
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第３７１〜３７２頁、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ　（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉ−ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）（１９８２）記載の方法に従い、バクテリオ
ファージＤＮＡを精製し、この組み換え体バクテリオフ
ァージＤＮＡをｂｙ１０２と命名した。

該組み換え体バクテリオファージｈｙ１０２　Ｄ　Ｎ　
Ａを制限酵素地図ＩＩＩ、　」並Ｒ１，Ｂ憇旧、」■Ｉ
Ｉ及び５ａｉｌ（いずれも宝酒造社製）を用い、単一消
化及び二重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロース電
気泳動法により、移動度パターンを分析し、得られた移
動度パターンとバクテリオファージＤＮＡ（宝酒造社製
）をＨｉｎｄｌｌｌにより消化して得られたＤＮＡ断片
の標準移動度パターンとを対比することにより得られた
制限酵素地図は、第１図に示すとおりであった。

（４）アセテート・カイネース遺伝子の検索−一一プロ
ープＤＮＡの作製組み換え体バクテリオファージｈｙ１０２　Ｄ　Ｎ　Ａ
　５μｇを、１５μｌのＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡを
含む１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５））に
溶解し、これに１ｍｌの旧ｇｈ緩衝液（５０ｍＭ　）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／１０００ｍＭ　ＮａＣ
１／１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１０ｍＭジチオスレイト
ール〕及び３０ユニツトのＥｃｏＲＩヲ添加し、温度３
７°Ｃで２時間切断処理した。

このＤＮＡ全量を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
、ティ・マニアナイス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方
法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９
８２）　）に従って行なった。バクテリオファージｈｙ
１０２　ＤＮＡ中の３．４５Ｋｂｐ−彫遼ＲＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を含むゲル部分をゲルより切りだ
して透析チューブに入れ、２−のＴＥ緩衝液を加えた後
、透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲル中か
ら緩衝液中にＤＮＡを溶出した。

この溶液に等量の水飽和フェノールを加え、撹拌したの
ち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。

得られた３、４５Ｋｈｐ　ＤＮＡ断片を、（”Ｐ　）　
　ｄＣＴＰ（アマジャム社製）を用いてニックトランス
レーション法により標識した。ニックトランスレーショ
ンは、宝酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示する
ジェイ・モル・パイオル・　（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９
７７）及び、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１０９〜１１２　Ｌコ
ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）（１９８２）記載の方法に従って行なった。

（５）アセテート・カイネース遺伝子の検索−ｍ−りロ
モゾーマル・ウオーキング法によるアセテート・カイネ
ース遺伝子の検索前述の方法で調製した！！ｐで標識した３、４５Ｋｂｐ
ＤＮＡ断片をプローブとして用い、項目（２）で作製し
た組み換え体バクテリオファージＥＭＢＬ４ＤＮＡをベ
クターとする大腸菌１１００株染色体ＤＮＡライブラリ
ィを、項目（３）と同様にプラーク・ハイブリダイゼー
ション法で検索し、３．４５Ｋｂｐ　ＤＮＡ断片を有す
るプラークを得た。該プラークを夫々、モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）
、第３７１〜３７２頁、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）記載の方法に
従い、バタテリオファージＤＮＡを精製した。３．４５
にｂρＤＮＡ断片を含む組み換え体バクテリオファージ
ＤＮＡをｂｙ１２２と命名した。

該組み換え体バタテリオファージｈｙ１２２　ＤＮＡを
、項目（３）に記載の方法に従って、前記各種制限酵素
を用い、消化し、第２図に示す通り制限酵素地図を得た
。

該組み換え体バタテリオファージｈｙ１２２　ＤＮＡ１
０μｇを、１５ｕｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、２
μｌの旧ｇｈ緩衝液、３０ユニツトの制限酵素」並Ｒ１
及び３０ユニツトの制限酵素」憇旧を夫々添加し、温度
３７°Ｃで２時間反応を行ない、ＤＮＡを切断した。切
断した組み換え体バタテリオファージｈｙ１２２ＤＮＡ
より、４．５Ｋｂｐの」並Ｒ１／　ＢａｍＨＩ　Ｄ　Ｎ
　Ａ断片を、前述のアガロースゲル電気泳動法を用いる
方法に従って単離し、６μｇの」並ＲＩ／　Ｂ憇旧ＤＮ
Ａ断片を得た。

一方、プラスミドｐＵＣ１９　ＤＮＡ　（宝酒造社製）
１１１ｇ　、１８ｕｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、
３μｌの旧ｇｈ緩衝液、５ユニツトの１旧及び５ユニツ
トのＥｃｏＲＩを添加し、温度３７℃で１時間消化した
のち、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処
理を行ない、沈澱物を得た。

０．５μｇのＥｃｏＲＩ及びｌ旧で消化したプラスミド
ｐＵＰ１９　ＤＮＡ及び、０．５μｇのｈｙ１２２　Ｄ
ＮＡ由来の４．５Ｋｂｐ　Ｅ並Ｒ１／勿旧ＤＮＡ断片を
、夫々７μｌの水に溶解し、１３μｌの混液〔７７ＩＩ
ＩＭトリスー塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）　／　１５ｎ
＋Ｍ　ＭｇＣｈ／　１５ｍＭジチオスレイトール１０．
１５ｍＭ　ＡＴＰ）及び、１ユニツトのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを添加し、温度８°Ｃで１８時間連結反応を行なっ
た。この反応液を用い、ジャーナル・オブ・バタテリオ
ロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ−ｔｅ　ｒｉｏ
ｌｏｇｙ）、第１１９巻、第１０７２〜１０７４頁（１
９７４年）記載の形質転換法により、大腸菌ＪＭＩＯＩ
株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、薬剤耐性（ア
ンピシリン耐性）及び、β−ガラクトシダーゼ活性を検
討し、形質転換株を得、その株の含有する組み換え体プ
ラスミドＤＮＡをｐＡＫ１２２と命名した。このように
して得られた大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（ｐＡＫ１２２）
は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１
５３４号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５３４）として寄託され
ている。

（６）大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（ｐＡＫ１２２）の培養
及び粗酵素液の調整大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２）　（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−１５３４）を、ＬＢ−ａｍｐ培地〔バタトトリプト
ン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）　
、ＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）及びアンピシリン５０　
（μｇ／ｍｆ）　）　３−にて温度３７°Ｃで１８時間
振盪培養を行なった。この培養液０．５　ｍｌを、１０
ｍ１の上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種し、温度３７°Ｃで
６時間振盪培養したのち、３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１０
分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１０ｍＭ
　ＭｇＣｌ□及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　２　ｍｆに懸濁し、常法に
より超音波破壊処理し、粗酵素液を得た。このようにし
て得られた粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の
測定は、下記の方法により行い、その結果を下表に示し
た。

得られた粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の測
定は、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）等の方法〔ジャーナル
・オブ・バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　、第１４４巻、第６７２〜６
８２頁（１９８０）年）〕を改良して、生成するＮＡＤ
ＰＨのモル数を算出することにより行なった。

すなわち、５ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、１０ｍＭグルコース、
０．５ｍＭＮＡＤＰ、５ｍＭＡＤＰ及び５ｍＭアセチル
リン酸を含有する０、１ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７
，０）中に、５ユニット／−のグルコース６リン酸デバ
イドロゲナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）及び
２１ユニツトのへキソキナーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム社製）を添加し、この溶液２．４−に５０倍希釈し
た粗酵素液０．１　ｍＺを混合したのち、３４０ｎＩ１
１の吸収の変化より、生成したＮＡＤＰＨの量を算出し
た値を下表に示した。

また、比較のため、プラスミドｐＵＣ１９　ＤＮＡを有
する大腸菌ＪＭＩＯＩ株〔大腸菌１０１　（ｐＵＣ１９
）　）についても同様にアセテート・カイネース活性を
測定した結果を下表に示した。

表上表より明らかな如（、本発明は、対照に比しＮＡＤＰ
Ｈ生成量が著しく増加しており、アセテート・カイネー
スが発現されていることが判る。

（７）アセテート・カイネース遺伝子を含むプラスミド
ｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａの調製上記で得られたプラスミドｐＡＫ１２２を含有する大腸
菌１０１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５３４）を、トリプト
ン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）及
びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１２に、該
培地を用い、温度３７°Ｃで２４時間前培養して得られ
た大腸菌ＪＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２）の培養液２０−を
接種し、温度３７°Ｃで３時間振盪培養したのち、０．
２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同一温度で
２０時時間項養を行ない、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により６０００ｒ、ｐ、ｍ
。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体２ｇを得、これを
２０ｄの２５％（Ｗ／Ｖ）　：＞　ａ　糖を含有する３
５０ＩＩＩＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁
した後、更に、これにリゾチーム（シグマ社製）１０■
、０．２５＋ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）　８　ｍ
ｌおよび２０％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム
溶液８−を夫々添加し、温度６０°Ｃで３０分間保温し
て溶菌し、溶菌液を得た。この溶菌液に、５ＭＮａＣ１
溶液１３ｍＺを添加し、温度４°Ｃで１６時間処理した
ものを常法により、１５０００ｒ、ｐ、ｍ。

で３０分間遠心分離して抽出液を、常法によりフェノー
ル抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得
た。

次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）６−に溶解し、さらに、これに塩化セ
シウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９■、／ｄ）
０．２ｍｌを添加したものを、常法により３９０００ｒ
、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾
配遠心分離処理を行ない、組み換え体プラスミドｐＡＫ
１２２　Ｄ　Ｎ　Ａを単離し、また更に、ｎ−ブタノー
ルを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、１
ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化された組み換え
体プラスミドｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａ　５００ｕｇを
得た。

工亥組み換え体プラ不ミドｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａを
項目（３）に記載の方法に従って、各種制限酵素を用い
消化し、第３図に示す通りの制限酵素地図を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体バタテリオファージｂｙｔ。２　ＤＮＡの制限酵素地図であり、第２図は、組み換え
体バタテリオファージｈｙ１２２　ＤＮＡの制限酵素地
図であり、また、第３図は、組み換え体プラスミドｐＡ
Ｋ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａの制限酵素地図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを含み、アセテート・カイネース生産能を有するエ
ッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培養
物よりアセテート・カイネースを採取することを特徴と
するアセテート・カイネースの製造法。
（２）アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡが大腸菌由来のＤＮＡである特許請求の範
囲第１項記載のアセテート・カイネースの製造法。
（３）アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡが、大腸菌１１００由来のＤＮＡである特
許請求の範囲第１項記載のアセテート・カイネースの製
造法。
（４）ベクターＤＮＡが、プラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡ
である特許請求の範囲第１項記載のアセテート・カイネ
ースの製造法。