JPH01117788A

JPH01117788A - 新規な組み換え体ｄｎａ

Info

Publication number: JPH01117788A
Application number: JP27314787A
Authority: JP
Inventors: Akira Matsuyama; 松山　旭; Hideko Yamamoto; 秀子山本; Eiichi Nakano; 中野　衛一
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1987-10-30
Publication date: 1989-05-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、アセテート・カイネースの製造に有用な新規
な組み換え体ＤＮＡに関する。。

アセテート・カイネース（ａｃｅｔａｔｅ　ｋｉｎａｓ
ｅ）は、下記の反応式で示される反応を触媒する酵素で
ある。

そして、アセテート・カイネースは、ＡＴＰの製造等に
極めて有用なものである。

〔従来の技術〕

従来、アセテート・カイネースは、例えば、エツジエリ
シア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を
培養し、菌体よりアセテート・カイネースを分離、精製
することにより製造されている〔ジェイ、パイオル、ケ
ム、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、）　、第２６１巻、第
２９号、第１３４８７〜１３４９７頁（１９８６）　）
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記のアセテート・カイネースの製造法
によるときには、該酵素の収率が著しく低い等の難点が
あった。

〔問題点を解決するための手段］そこで、本発明者等は、上記難点を解決すべく種々検討
した結果、アセテート・カイネースをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを得、この組み換え体をエツジエリシア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたアセテ
ート・カイネース生産能を有する菌株を培地に培養する
と高収率でアセテート・カイネースが生産されること等
の知見を得、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、アセテート・カイネース′をコー
ドする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入
したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡである。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡの調製について述べる。

例えば、大腸菌好ましくは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　
１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−１ｎｓｌ１００（西独
、ハイデルベルグより入手）を培養して培養物を得る。

上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養し
てもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。

また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスイープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦該の浸出液等の１種以上の窒素
源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩
化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩
類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタ
ミン等を適宜添加したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ２好ましくは３７°Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、通気撹
拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが
好ましい。

このようにして得られる培養物を、例えば３０００ｒ、
ｐ、ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００ｒ、ｐ
ｏｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分離
して大腸菌１１００の菌体を得る。

この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム、
バイオフィズ、アクタ、（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。

Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）］
、ケー・ニス・カービー（Ｋ、　Ｓ、　Ｋ　ｉ　ｒｂｙ
）の方法［バイオケム。

ジエイ、（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　、第６４巻、第４
０５頁（１９５６年）１等の方法により染色体ＤＮＡを
得ることができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えば」且３ＡＩ（東洋紡績社製）を、温度３
０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜１０ユ
ニット／−で２０分以上、好ましくは３０分〜２時間作
用させて消化し、種々の染色ＤＮＡ断片混合物を得る。

そして、アセテート・カイネース遺伝子は、リンケージ
・マツプ（Ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ）　（マイクロバイ
オロジカル・レビュウズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）、第４７巻、第２号、第１８０
〜２３０頁（１９８３年）〕上、ｐｕｒＦ　（グルタミ
ン・フォスフォリボシルパイロフォスフエイト・アミド
トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａ−ｍｉｎｅ　Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
ａｍｉｄｏｔｒａｎｓ−ｆｅｒａｓｅ）遺伝子の近傍に
位置づけられているので、前記染色体ＤＮＡ断片混合物
からクロモゾーマル・ウオーキング（Ｃｈｒｏｎ＋ｏｓ
ｏｍａｌ　Ｗａｌｋｉｎｇ）法〔ネイチャー　（Ｎａ　
ｔｕｒｅ）、第３００巻、第４号、第３５〜４２頁（１
９８２年）〕によりｐｕｒＦ遺伝子の近傍に存在するア
セテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片を検
索することができる。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法に−よりＤＮＡ断片混合物
を得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精
製し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段に
より濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にア
セテート・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片が含まれる）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＵＣ１
９　ＤＮＡ　（宝酒造社製）などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えば−ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ　（いずれも宝酒
造社製）を、温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１
酵素濃度１０〜１０００ユニット／−で１時間以上、好
ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断されたベク
ターＤＮＡを得る。

次いで、上記のようにして得た大腸菌１１００由来で、
アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合
し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・イング
ランド・バイオ・ラプス社Ｍ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好ましくは゛４〜
１６°Ｃ１酵素濃度１〜１００ユニットで１時間以上、
好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを
得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（ＡＴＣＣ３３８
７６）、大腸菌ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）
、大腸菌Ｄ　ＨＩ　（ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌χ
−１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）、などを形質転換あ
るいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。

この形質転換はデイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）　、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年））
により行なうことができる。

また形質導入はビー・ホーン（Ｂ、Ｈｏｈｎ）の方法〔
メソヅ・イン・エンザイモロジー第６８巻、第２９９〜
３０９頁（１９７９年）〕によって行なうことができる
。

そして、上記菌株よりアセテート・カイネース生産能を
有する菌株をスクリーニングすることにより、アセテー
ト・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、ア
セテート・カイネース生産能を有するエツジエリシア属
に属する菌株を得ることができる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジェイ、バタテリオロジー（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１Ｏ６
４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレウ
ェル（Ｄ。

Ｂ、Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェー、バクテリオロジ
ー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕な
どにより得ることができる。

上記のようにして得られたアセテート・カイネースをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カイネー
ス生産能を有するエツジエリシア属に属する菌株を用い
てアセテート・カイネースを生産するには、前記大腸菌
１１００の培養法と全く同様にして培養し、培養物を得
る。

培養終了後、該培養物よアセテート・カイネースを採取
するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができ
る。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

更に、アセテート・カイネースの精製品を得るには、例
えばＤＥＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチ
ル・セルロース、米国ブラウン社製）　、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス（ジ・エチル・アミン・エチル・セファデ
ックス、スウェーデン国ファルマシア社製）　、ＱＡＥ
−セファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社製
）等のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて着装する
か、またセファデックスＧ−２００（スウェーデン国、
ファルマシア社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン
国、ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハイト
ロキシルアパタイト　（米国バイオランド社製、バイオ
ゲルＨＴ）を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲ
ル等を用いる電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施
することにより、高度に精製されたアセテート・カイネ
ース標品を得ることができる。

上記精製手段により得られる精製アセテート・カイネー
スの理化学的性質は、〔ジエイ、パイオル、ケム、（Ｊ
ｊ３ｉ０１．Ｃｈｅｍ、）、第２６１巻、第２９号、第
１３４８７〜１３４９７頁（１９８６年）〕記載のアセ
テート・カイネースの理化学的性質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明の新規な組み換
え体ＤＮＡを含むエツジエリシア属に属する菌株を培地
に培養することにより、アセテート・カイネースを高収
率で得ることができるので、本発明は産業上極めて有用
なものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例（１）大腸菌１１００株ＤＮＡの調製、大腸菌１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−１ｎｓｌ１０
０（西独、ハイデルベルグより入手）株を、Ｔ−Ｙ培地
［１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔ
ｒｙｐｔｏｎ）　　（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製）、
０．５％（Ｗ／Ｖ）バクトーイーストエキストラクト（
Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）　　（デイ
フコ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕及び０．５％（Ｗ／Ｖ）Ｎａ
Ｃ１（ｐＨ７，２）コ１００−に接種し、温度３７°Ｃ
で８時間振盪培養し、培養物を得た。

この培養物を１０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１５分間、常
法により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得たのち
、該菌体から斎藤、三浦の方法〔バイオケム、バイオフ
ィズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）
〕により染色体ＤＮＡを得た。

次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Ｓａｕ
　３ＡＩ（東洋紡績社製）３ユニツトを、１０ｍＭ　）
リス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＳＯ４及び１ｍＭジチオスレイトール含有）　（ｐＨ
７，４）に夫々混合し、温度３７°Ｃで３０分間反応さ
せた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し
、エタノール沈澱処理した後、この５ａｕ３ＡＩで消化
されたＤＮＡ断片が再結合することを防止するために、
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、第１３３〜１３４頁の方法でバクチリ
アル・アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理に
より、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行ない、常法によりフ
ェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理して、５
ａｕ３ＡＩで消化された大腸菌１１００株の染色体ＤＮ
Ａ断片５０ｕｇを得た。

（２）バクテリオファージベクターＤ　Ｎ　Ａ　（ＥＭ
ＢＬ４）を利用した大腸菌染色体ＤＮＡライブラリーの
作製バクテリオファージベクターＤＮＡ　（ｔ！ＭＢＬ４）
〔プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅ
ｃ）社製〕２０μｇ及び制限酵素」憇旧（宝酒造社製）
２００ユニツトを５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（１０
０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１及び１０ｍＭＭｇ５Ｏａ含有）　（
ｐＨ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで２時間反応させ
て消化液を得、液液を常法によりフェノール抽出及びエ
タノール沈澱処理した後、バクテリオファージ・ベクタ
ー由来の中間ＤＮＡフラグメントが再結合することによ
りバクテリオファージができることを防止するために、
エタノール沈澱物２０μｇ及び制限酵素５ａｉｌ　１０
０ユニツトを５０ＩＩＩＭトリスー塩酸緩衝液（１００
ｍＭ　ＮａＣ１及び１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，含有）　（ｐ
Ｈ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで２時間反応させて
消化液を得、液液を常法によりフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱処理して、１旧で消化されたバクテリオファ
ージＥＭＢ　Ｌ　４　ＤＮＡを得た。

ついで、この」」旧で消化されたバクテリオファージＥ
ＭＢＬ４ＤＮＡ１μｇ、上記項目（１）で得られた５ａ
ｕ３Ａ　Ｉで消化された大腸菌１１００株の染色体ＤＮ
Ａ断片ｌＩＩｇ及び２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ〔
ベーリンガー・マンハイム（ＢｏｅｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｈｅｉｍ）社製〕を、６６ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、１０ｍＭ
ジチオスレイトール及び１０ｍＭＡ　Ｔ　Ｐを含有する
６６ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加し
、温度１６°Ｃで１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた
。

ついで、該ＤＮＡ混合物を、イン・ビトロ・パッケージ
ング（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法〔メ
ソズ拳イン・エンデイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第２８１〜２９
８頁（１９７９年）〕により、ババクリオファージの被
膜蛋白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。

ついで、このようにして得たバクテリオファージ粒子を
大腸菌ＮＭ５３９　　（プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）社より入手〕を指示菌として
、トリプトン寒天培地［トリプトン（Ｄｉｒｃｏ（社）
製〕１％、ＮａＣ１０，２５％、寒天１．２％で、加圧
滅菌したのち、３０ｍＩずつ直径９ｃｍのシャーレに分
注したものである。］上に撒き、温度３７℃で１６時間
静置培養したのち、約５．０００個の溶菌斑を得、これ
をライプ′ラリ−として使用した。

（３）　　ｐ　ｕ　ｒ　Ｆ遺伝子を含むＤＮＡの調製大
腸菌アセテート・カイネース発現に関与する遺伝子ａｃ
ｋＡは、前述したー如く、遺伝子の近傍に位置づけられ
ている。ｐｕｒＦ遺伝子の塩基、配列は、ジエイ・ヤン
・ツオー（Ｊ、Ｙｕｎ、Ｔｓｏ）等の報告〔ジャーナル
・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　、第２５７巻、第３５２５〜３５３１頁、１９８２
年〕に記載されている。このρｕｒＦ遺伝子の塩基配列
の一部である５°ＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＧＴＧ　
３’の１６塩基のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔
ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）社製〕を用いて、合成
した。この２０μｇのオリゴヌクレオチドの５°末端を
（”Ｐ　）　ＡＴＰ　　（アマジャム社製）を用いて、
モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ）、第１２２〜１２６頁、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリＩ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９Ｂ
２）記載の方法に従って標識した。

上記の方法で調製した３！Ｐで標識したｐｕｒＰ遺伝子
の一部であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
、項目（２）で作製した組み換え体バクテリオファージ
ＥＭＢＬ４ＤＮＡをベクターとする大腸菌１１００株染
色体ＤＮＡライブラリーを、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法〔（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第３１２〜３２８　
Ｌコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）　（１９８２）〕で検索し、ｐｕｒＦ遺伝子を
有するプラークを得た。該プラークをモレキュラー・ク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、
第３７１〜３７２頁、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリイ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）記載の方法に
い、バクテリオファージＤＮＡを精製し、この組み換え
体バクテリオファージＤＮＡをｈｙ１０２　＆命名した
。

該組み換え体バクテリオファージｈｙ１０２　ＤＮＡを
制限酵素紅組ＩＩ１．　Ｅ並ＲＩ＋　　Ｂａｍ旧、」れ
ＩＩ及び５ａｉｌ（いずれも宝酒造社製）を用い、単一
消化及び二重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロース
電気泳動法により、移動度パターンを分析し、得られた
移動度パターンとバクテリオファージＤＮＡ（宝酒造社
製）をＨｉｎｄＩＩＩにより消化して得られたＤＮＡ断
片の標準移動度パターンとを対比することにより得られ
た制限酵素地図は、第１図に示すとおりであった。

（４）アセテート・カイネース遺伝子の検索−一一プロ
ープＤＮＡの作製組み換え体バクテリオファージｈｙ１０２　Ｄ　Ｎ　Ａ
　５μｇを、１５μ」のＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡを
含む１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５））に
溶解し、これに１艷の旧ｇｈ緩衝液〔５抛ｉトリス−塩
酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０００ｄ　ＮａＣ１
／　１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ／　１０ｍＭジチオスレイ
トール〕及び３０ユニツトのＢｃｏＲＩを添加し、温度
３７℃で２時間切断処理した。

このＤＮＡ全量を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
、ティ・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方
法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８
２）　）に従って行なった。バクテリオファージｈｙ１
０２　ＤＮＡ中の３．４５Ｋｂｐ　　Ｅ匹Ｒ１／Ｅｃｏ
ＲＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を含むゲル部分をゲルより切りだ
して透析チューブに入れ、２−のＴＥ緩衝液を加えた後
、透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲル中か
ら緩衝液中にＤＮＡを溶出した。

この溶液に等量の水飽和フェノールを加え、撹拌したの
ち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。

得られた３、４５Ｋｂｐ　ＤＮＡ断片を、（”Ｐ　）　
　ｄＣＴＰ（アマジャム社製）を用いてニックトランス
レーション法により標識した。ニックトランスレーショ
ンは、宝酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示する
ジェイ・モル・パイオル・　Ｕ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９
７７）及び、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｍ　１０９〜１１２頁、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ４　（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）（１９８２）記載の方法に従って行なった。

（５）アセテート・カイネース遺伝子の検索−ｍ−りロ
モゾーマル・ウオーキング法によるアセテート・カイネ
ース遺伝子の検索前述の方法で調製した３ｔｐで標識した３、４５Ｋｂｐ
ＤＮＡ断片をプローブとして用い、項目（２）で作製し
た組み換え体バクテリオファージＥＭＢ　Ｌ　４　ＤＮ
Ａをベクターとする大腸菌１１００株染色体ＤＮＡライ
ブラリィを、項目（３）と同様にプラーク・ハイブリダ
イゼーション法で検索し、３．４５Ｋｂｐ　ＤＮＡ断片
を有するプラークを得た。該プラークを夫々、−１−Ｌ
／キュラクークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）、１３７１〜３７２　Ｌコールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ４　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２
）記載の方法に従い、バクテリオファージＤＮＡを精製
した。３．４５Ｋｂｐ　’Ｄ　Ｎ　Ａ断片を含む組み換
え体バクテリオファージＤＮＡをｈｙ１２２と命名した
。

該組み換え体バクテリオファージｈｙ１２２　ＤＮＡを
、項目（３）に記載の方法に従って、前記各種制限酵素
を用い、消化し、第２図に示す通り制限酵素地図を得た
。

該組み換え体バクテリオファージ１ｔｙ１２２　ＤＮＡ
１０μｇを、１５ｕｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、
２μｌのｌｌｉｇｈ緩衝液、３０ユニツトの制限酵素」
匹ＲＩ及び３０ユニツトの制限酵素ｔｆａｍＨＩを夫々
添加し、温度３７°Ｃで２時間反応を行ない、ＤＮＡを
切断した。切断した組み換え体バクテリオファージｈｙ
１２２ＤＮＡより、４．５ＫｂｐのＥｃｏＲＩ／　Ｂ互
ｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を、前述のアガロースゲル電気
泳動法を用いる方法に従って単離し、６μｇのＥｃｏＲ
Ｉ／　Ｂａｎ＋旧ＤＮＡ断片を得た。

一方、プラスミドｐＵＣ１９　ＤＮＡ　（宝酒造社製）
１μｇ　、１８ｕｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、３
μｍの旧ｇｈ緩衝液、５ユニツトのＢａｍ１（Ｔ及び５
ユニツトのＥｃｏＲＩを添加し、温度３７°Ｃで１時間
消化したのち、常法によりフェノール抽出及びエタノー
ル沈澱処理を行ない、沈澱物を得た。

０．５μｇのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラ
スミドｐＵＰ１９　ＤＮＡ及び、０．５μｇのｈｙ１２
２　Ｄ　Ｎ　Ａ由来の４．５Ｋｂｐ　Ｅ並ＲＩ／勿旧Ｄ
ＮＡ断片を、夫々７μＩの水に溶解し、１３μｌの混液
（７７ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）／１５
ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ／１５ｍＭジチオスレイトール１０．
１５ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ）及び、１ユニツトのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを添加し、温度８℃で１８時間連結反応を行なっ
た。この反応液を用い、ジャーナル・オン・バクテリオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ−ｔｅ　ｒｉｏ
ｌｏｇｙ）、第１１９巻、第１０７２〜１０７４頁（１
９７４年）記載の形質転換法により、大腸菌ＪＭＩＯＩ
株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、薬剤耐性（ア
ンピシリン耐性）及び、β−ガラクトシダーゼ活性を検
討し、形質転換株を得、その株の含有する組み換え体プ
ラスミドＤＮＡをｐＡＫ１２２と命名した。このように
して得られた大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２）は、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１５３
４号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５３４）として寄託されてい
る。

（６）大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（ｐＡＫ１２２）の培養
及び粗酵素液の調整大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２）　（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−１５３４）を、ＬＢ−ａｍｐ培地〔バクトトリプト
ン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（稠ハ）　、
ＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）及びアンピシリン５０　（
ａｇｅｄ））３−にて温度３７℃で１８時間振盪培養を
行なった。この培養液０．３　ｒｄを、１０ｒｎｌの上
記Ｌ　Ｂ−ａｍｐ培地に接種し、温度３７°Ｃで６時間
振盪培養したのち、３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠
心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｈ及びＩｎ＋ＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，５）　２　ｄに懸濁し、常法により超音
波破壊処理し、粗酵素液を得た。このようにして得られ
た粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の測定は、
下記の方法により行い、その結果を下表に示した。

得られた粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の測
定は、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）等の方法〔ジャーナル
・オン・バクテリオロジーＵｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　、第１４４巻、第６７２〜６Ｂ
２頁（１９８０）年）〕を改良して、生成するＮＡＤＰ
Ｈのモル数を算出することにより行なった。

すなわち、５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭグルコース
、０．５ｍＭＮＡＤＰ、５ｍＭＡＤＰ及び５ｍＭアセチ
ルリン酸を含有する０、１ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ　
Ｈ７，０）中に、５ユニット／ｍＺのグルコース６リン
酸デバイドロゲナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製
）及び２１ユニツトのへキソキナーゼ（ベーリンガー・
マンハイム社製）を添加し、この溶液２．４　ｍｌに５
０倍希釈した粗酵素液０．１−を混合したのち、３４０
ｎｍの吸収の変化より、生成したＮＡＤＰＨの量を算出
した値を下表に示した。

また、比較のため、プラスミドｐＵＣ１９　ＤＮＡを有
する大腸菌ＪＭＩＯＩ株（大腸菌１０１　（ｐＵＣ１９
）　）についても同様にアセテート・カイネース活性を
測定した結果を下表に示した。

上表より明らかな如く、本発明は、対照に比しＮＡＤＰ
Ｈ生成量が著しく増加しており、アセテート・カイネー
スが発現されていることが判る。

（７）アセテート・カイネース遺伝子を含むプラスミド
ｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａの調製上記で得られたプラスミドｐＡＫ１２２を含有する大腸
菌１０１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５３４）を、トリプト
ン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）及
びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１１に、該
培地を用い、温度３７℃で２４時間前培養して得られた
大腸菌ＪＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２）の培養液２０ｍ１を
接種し、温度３７°Ｃで３時間振盪培養したのち、０．
２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同一温度で
２０時時間項養を行ない、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により６０００ｒ、ｐ、ｍ
。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体２ｇを得、これを
２０−の２５％（Ｗ／Ｖ）　シー！糖を含有する３５０
ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した
後、更に、これにリゾチーム（シグマ社製）ｌＯ■、０
．２５ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）８−および２０
％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８−を夫
々添加し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶
菌液を得た。この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液１３−を
添加し、温度４°Ｃで１６時間処理したものを常法によ
り、１５０００ｒ、ｐ、ａｇ、　　ｒで３０分間遠心分
離して抽出液を、常法によりフェノール抽出処理及びエ
タノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。

次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）　６　ｍｌに溶解し、さらに、これに
塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９■／
ｒｄ）０．２ｍｒを添加したものを、常法により３９０
００ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用いて平衡
密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体プラスミド
ｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａを単離し、また更に、ｎ−ブ
タノールを使用してエチジウムブロマイドを除去したの
ち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ＩＩＭトリスー塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化された
組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａ　５０
０ｕｇを得た。

該組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａを項
目（３）に記載の方法に従って、各種制限酵素を用い消
化し、第３図に示す通りの制限酵素地図を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体バクテリオファージｂｙｔ。２　ＤＮＡの制限酵素地図であり、第２図は、組み換え
体バクテリオファージｈｙ１２２　ＤＮＡの制限酵素地
図であり、また、第３図は、組み換え体プラスミドｐＡ
Ｋ１２２Ｄ　Ｎ　Ａの制限酵素地図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入したことを特徴と
する新規な組み換え体ＤＮＡ。
（２）アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡが大腸菌由来のＤＮＡである特許請求の範
囲第１項記載の新規な組み換え体ＤＮＡ。
（３）アセテート・カイネースをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡが、大腸菌１１００由来のＤＮＡである特
許請求の範囲第１項記載の新規な組み換え体ＤＮＡ。
（４）ベクターＤＮＡがプラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡで
ある特許請求の範囲第１項記載の新規な組み換え体ＤＮ
Ａ。