KR930006708B1 - 유전자 재조합 바실러스(Bacillus) 균주를 이용한 세파로스포린 반합성 효소의 제조방법 - Google Patents

유전자 재조합 바실러스(Bacillus) 균주를 이용한 세파로스포린 반합성 효소의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

유전자 재조합 바실러스(Bacillus) 균주를 이용한 세파로스포린 반합성 효소의 제조방법
제1도는 본 발명의 재조합 플라스미드를 제조하는 공정도이다.
본 발명은 페니실린 G를 6-아미노페니실란산(6-APA)으로 분해하거나 또는 세파로틴, 세파만돌, 세파로글리신 및 세팔렉신을 분해하고, 혹은 7-아마노데스아세톡시 세파로스포란산과 페닐글리신 메틸에스테르로부터 세팔렉신(Cephalexin)를 합성하거나 또는 세파로리딘, 세파세트릴 및 세파만돌을 합성하는 세파로스포린 반합성 효소(이하 "반합성 효소"라 칭함)를 반합성 효소활성이 있는 미생물에서 유래된 유전자를 조작하여 숙주 바실러스균주에 도입하고, 이를 배양하여 반합성 효소를 대량제조하고 분리하는 방법에 관한 것이다.
6-아미노페니실란산은 암피실린(Ampicillin), 아목시실린(Amoxicillin) 등의 페니실린 유도체를 합성하는데 사용되는 전구체로서 생물학적 방법에 의해 생산되고 있다.
최근 국내에 발표된 대한민국 특허공보 제83-1800호에는 야생균주 바실러스 메가테리움 ATCC 14945(Bacillus megaterium ATCC 14945)를 돌연변이 조작 및 배지조건 최적화를 통해 개발한 균주의 반합성 효소 역가가 야생균주 보다 700% 증가되었다고 기재하고 있고, 대한민국 특허공보 제89-3716호에는 바실러스 메가테리움 ATCC 14945로부터 유전자 조작을 이용하여 재조합 에스케리키아 콜리(E.coli)를 개발하고, 이를 배양하여 반합성 효소를 제조하였다.
그러나, 상기 특허중 제83-1800호의 방법으로 제조한 반합성 효소는 역가가 만족스럽지 못하였고, 제89-3716호의 방법은 E.coli를 배양하여 생산하는 방법이므로 분리 및 정제가 용이하지 못한 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 역가가 높은 반합성 효소를 생성할 수 있고, 생성된 반합성 효소의 분리정제를 용이하게 행할 수 있도록 하는 유전자 재조합 바실러스 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 유전자 재조합 바실러스 균주에 도입되는 신규한 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)를 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드 제조방법 및 상기의 바실러스 균주를 이용한 반합성 효소의 제조방법을 제공하는데 있다.
상술한 목적들을 달성하기 위하여 본 발명에서는 바실러스 메가테리움 ATCC 14945로부터 분리된 반합성 효소의 유전자를 플라스미드 pUB110에 접합시켜 반합성 효소 단백질의 유전정보를 지정하는 유전자조각을 포함하는 재조합플라스미드를 만들고, 이를 바실러스 서티리스 DB104에 형질전환시켜 얻은 유전자 조작된 재조합 바실러스균주 KCTC 8501P를 배양하여 역가가 향상된 반합성 효소를 제조하였으며, 반합성 효소의 분리 및 정제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명에서 제조된 재조합 바실러스균주는 1991년 2월 11일자로 한국유전공학쎈타 유전자 은행에 수탁번호 KCTC 8501P로 기탁하였다.
본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저, 국내 공고특허 제89-3716호에 기재된 방법으로 KFCC-10381호 균주를 제조하였다. 즉, 박토트립톤 1% 박토이스트엑기스 0.5% 및 염화나트륨 1%, pH 7.5인 멸균된 액체배지 100㎖에 바실러스 메가테리움 ATCC 14945를 접종하여 30℃에서 진탕배양하여 원심분리 수확하고, 1% 도데실 설폰산나트륨, 프로네이즈, 페놀 및 RNA 분해효소를 처리하여 DNA를 얻은 후 에탄올로 침전시켜 농축한다. 농축된 DNA를 1mM EDTA가 함유된 10mM 트리스 완충액(pH 8.0) 1㎖에 현탁시키고 제한 효소 PstⅠ을 처리하였다. 에스케리키아 콜리 HB 101/pBR322를 위와 동일한 방법으로 배양하고 리소자임과 도데실 설폰산나트륨을 처리한 후, 에티디움 브로마이드를 이용한 염화세슘 초고속 원심분리 방법에 의해 플라스미드를 순수분리한다. 위와 동일한 제한효소 PstⅠ를 사용하여 플라스미드를 잘라낸 뒤 연결효소 T4리가제로 접합시켜 재조합 플라스미드를 만들고 이를 형질전환시켰다. 형질전환된 에스케리키아 콜리 HB101을 고체배지에 도포하여 37℃에서 하룻밤 배양하고 이중반합성 효소 활성이 있는 형질전환체를 분리하였다. 이 분리된 형질전환체에서 플라스미드(pCSE94)를 분리한 후 제한효소 Sau 3AⅠ 및 EcoRⅠ를 이용하여 산탁식 방법으로 pUC 19벡터에 재조합시켜 크기를 줄이고 이 크기가 줄여진 재조합 플라스미드의 제한효소 EcoRⅠ 및 PstⅠ부위를 절단하여 다시 pBR322벡터의 EcoRⅠ 및 PstⅠ부위에 재조합하여 에스케리키아 콜리 HB 101에 형질전환시켜 반합성 효소를 생성하는 재조합 균주를 제조하였다.
암피실린 10㎎을 함유한 상기의 액체배지 100㎖에 KFCC 10381를 접종하여 37℃에서 진탕배양하여 원심분리 수확하고, 1% 도데실 설폰산나트륨, 페놀 및 RNA분해효소를 처리하여 플라스미드 DNA(pUCSE70)를 얻은 후 에탄올로 침전시켜 농축한다. 농축된 플라스미드 DNA를 1미리몰 EDTA가 함유된 10mM 트리스 완충액(pH 8.0) 1㎖에 현탁시키고 제한효소 Sau 3AⅠ, ClaⅠ 및 Ba131을 처리한 플라스미드 DNA(pUCSE59)에 제한효소 EcoRⅠ을 처리하였다. 바실러스 서티리스 UB104/pUB110을 가나마이신을 10㎍/㎖ 함유한 상기 배지에 배양하고 리소자임과 도데실설폰산 나트륨을 처리한후, 에티디움 브로마이드를 이용한 염화세슘(CsCl) 초고속 원심분리 방법에 의해 플라스미드 pUB110을 순수분리하였다. 위와 동일한 제한효소 EcoRⅠ 을 사용하여 플라스미드를 잘라낸 뒤 연결효소 T4-DNA 리가제로 접합시켜 재조합 플라스미드(pUBC103)를 만들고 이를 에스케리키아 콜리 HB101에 형질전환시켰다. 형질전환된 에스케리키아 콜리 HB101에 형질전환시켰다. 형질전환된 에스케리키아 콜리 HB101을 고체배지에 도포하여 37℃에서 하룻밤 배양하고 이중 반합성 효소 활성이 있는 형질전환체를 분리하였다.
이 분리된 형질전환체에서 플라스미드(pUBC103)를 분리한 후 제한효소 XbaⅠ을 이용하여 크기를 줄이고 이 크기가 줄여진 재조합 플라스미드(pUBC103)를 에스케리키아 콜리 HB101에 형질전환시켜 반합성 효소를 생성하는 재조합 에스케리키아 콜리균주를 제조하였다. 이 재조합 에스케리키아 균주에서 플라스미드(pUBC103)를 분리하여 리소자임이 처리된 바실러스 서티리스 DB104균주와 혼합하고 가나마이신 최종농도 10㎍/㎖인 멸균된 고체배지에 도포하고 배양하여 가나마이신 내성을 가지며 반합성 효소를 생성하는 재조합 바실러스균주 KCTC 8501P를 제조하였다.
상술한 방법으로 제조한 재조합 바실러스균주 KCTC 8501P를 0.1% 페닐아세트산이 함유된 상기의 액체배지에 36시간 배양한 후 상층액을 셀라이트(Celite)에 흡착하여 황산암모늄으로 각각 처리하여 정제된 반합성 효소를 제조하였다.
본 발명에서 제조한 재조합균주 KCTC 8501P는 바실러스 메가테리움의 넓은 기질특이성을 가지고 있어 세파로스포린 반합성 및 6-APA생성이 가능하며 세파렉신 반합성 및 페니실린 G가수분해 역가가 야생균주에 비해 2,300% 및 4,000%, 대한민국 특허공보 제83-1800호에시의 변이주보다 페니실린 G 가수분해 역가가 230%, 대한민국 특허공보 제89-3716호에서의 재조합 에스케리키아 콜리보다 세팔렉신 반합성 및 페니실린 G가수분해 역가가 13% 및 30% 증가한 활성을 갖는 재조합 바실러스균주로서, 그 산업적 가치가 매우크다. 또한 본 발명에서 개발한 바실러스 재조합균주 KCTC 8501P는 바실러스균주가 가지고 있는 단백 유출현상을 이용하므로 반합성 효소의 분리정제를 농축만으로 수행할 수 있어 그 용융성이 크다.
다음의 실시예 및 비교예는 본 발명의 재조합균주 KCTC 8501P를 이용한 반합성 효소의 생산방법 및 이의 효과를 좀 더 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
박토트립톤 10g/ℓ, 이스트엑기스 5g/ℓ, 염화나트륨 10g/ℓ 및 0.1% 페닐아세트산을 함유한 배지 50㎖을 500㎖ 진탕플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 가압 살균한 다음, 일야간 배양한 대수기의 본 발명 재조합 바실러스균주 KCTC 8501P를 1%로 접종하고, 30℃에서 36시간 배양한 후, 균주를 원심분리하여 상층액을 셀라이트에 흡착시키고 황산암모늄을 처리하여 반합성 효소를 제조하고, 후지등의 방법(Fujii etal, Process Biochemistry 10 (1976)으로 세팔렉신 반합성 효소의 역가를 측정한 결과,총 700유니트였다.
[실시예 2]
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 반합성 효소를 제조하여, 발라싱함등의 방법(Balasingham etal, Biochim. Biophys, Acta 216. 250(1972))으로 6-아미노페니실란산 생성역가를 측정한 결과, 9,700유니트였다.
[비교예 1]
실시예 1에 기재된 배지와 동일한 배지에서 바실러스 메가테리움 ATCC 14945를 배양한 후, 균체와 배양액 전체의 세팔렉신 반합성 효소의 역가를 측정한 결과, 30유니트였다.
[비교예 2]
실시예 1에 기재된 배지와 동일한 배지에서 재조합 에스케리키아 콜리 균주(KFCC-10381)를 배양한 후, 균체와 배양액 전체의 세팔렉신 반합성 효소의 역가를 측정한 결과, 620유니트였다.
[비교예 3]
바실러스 메가테리움 ATCC 14945를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 반합성 효소를 제조하고, 실시예 2의 방법으로 6-아미노페니실란산 생성역가를 측정한 결과, 250유니트였다.
[비교예 4]
에스케리키아 콜리 KFCC 10381을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 반합성 효소를 제조하고, 실시예 2의 방법으로 6-아미노페니실란산 생성역가를 측정한 결과, 7520유니트였다.
상술한 바와 같이, 바실러스 메가테리움 ATCC 14945로 부터 분리된 반합성 효소의 유전자를 플라스미드 pUB110에 접합시켜 반합성 효소 단백질의 유전정보를 지정하는 유전자조각을 포함하는 재조합플라스미드를 만들고, 이를 바실러스 서티리스 DB104에 형질전환시켜 얻은 유전자 조작된 재조합 바실러스균주 KCTC 8501P를 배양함으로써 역가가 향상된 반합성 효소를 제조하였으며, 반합성 효소의 분리 및 정제를 용이하게 할 수 있었다.

Claims (3)

  1. 바실러스 메가테리움 ATCC 14945로부터 분리된 세파로스포린 반합성 유전자를 플라스미드 pUB110에 접합시킨 것을 특징으로 하는 제조합 플라스미드 pUBC73.
  2. 제1항의 재조합 플라스미드 pUBC73을 바실러스 서티리스 DB104에 형질전환시켜 얻은 유전자 조작된 바실러스균주 KCTC 8501P.
  3. 제2항의 유전자 조작된 바실러스균주 KCTC 8501P를 배양하여 원심분리하고 상층액을 셀라이트에 흡착시킨 후 황산암모늄을 처리함을 특징으로 하는 세파로스포린 반합성 효소의 제조방법.
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