JP3085700B2 - 組換え宿主細胞を用いたタンパク質の調製法 - Google Patents
組換え宿主細胞を用いたタンパク質の調製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、増殖細胞濃度、誘導温度および添加される
含アミノ酸基質等のような相互に適した培養パラメター
によって、組換え宿主細胞、特に大腸菌における温度誘
導発現によるタンパク質および／または酵素の高生産速
度を比較的長時間にわたって持続させることのできる方
法に関する。
含アミノ酸基質等のような相互に適した培養パラメター
によって、組換え宿主細胞、特に大腸菌における温度誘
導発現によるタンパク質および／または酵素の高生産速
度を比較的長時間にわたって持続させることのできる方
法に関する。
（従来の技術） 遺伝子工学的工程の目的は、いずれも、特に、組換え
産生物の可能な最高収量を得ることである。今日まで、
この目的のために、二段階工程が成功していることが証
明されている。最初に、大きなバイオマスおよびプラス
ミド量を達成するために、細胞の最適増殖がこの目的の
ために目標とされる。同時に、増殖がよい一方で、蓄積
される酢酸塩の量があまり多くならないように、留意し
なければならない。この最初の段階において、ある場合
に過剰な基質消費により、また場合によっては毒性の効
果をも有する組換えタンパク質の過剰生産によって著し
く細胞増殖が阻害されるので、この段階での組換えタン
パク質の無視できない量の産生は望ましくない。この理
由のために、調節し得る発現系を利用できることが重要
である。そのような系では、プロモーターは細胞の増殖
期では抑制され、その結果、組換えタンパク質の産生は
ない。高細胞濃度または多量の増殖細胞が存在する第二
の段階では、プロモーターの抑制がはずされて、それに
よって発現が誘導される。調節が可能でかつタンパク質
発現の誘導が温度シフトまたは化学誘導によって行なわ
れる多くの発現系が微生物について知られている。最も
よく知られており、最も効果的な大腸菌のプロモーター
のひとつとして、例えば、ヨーロッパ特許出願公開（EP
−Ａ−）0,041,767号に記述されているλPLプロモータ
ーがあげられる。プロモーターをブロックするC1リプレ
ッサーは、約42℃への温度シフトによって不活化され、
構造遺伝子の転写をそれによって可能にする（第２段
階）。今日まで、多くの酵素および他のタンパク質、例
えば、EcoR I制限エンドヌクレアーゼ（Bottermannら:B
iotechnol.Bioeng.27（1985）,p.1320）、α−アミラー
ゼ（Reinikainenら:Biotechnol.Lett.10（３）（198
8）,p.149）、ムタロターゼ（EP−Ａ−0,307,730）また
はグルコースデヒドロゲナーゼ（EP−Ａ−0,290,768）
などが、大腸菌におけるそのような標準的な二段階工程
を用いることによって発現されてきた。増殖および発現
は、この工程では必ずしも一つの反応器中で連続的に行
われる必要はなく、二つの別々の反応器中で連続して行
なわれてもよい。
産生物の可能な最高収量を得ることである。今日まで、
この目的のために、二段階工程が成功していることが証
明されている。最初に、大きなバイオマスおよびプラス
ミド量を達成するために、細胞の最適増殖がこの目的の
ために目標とされる。同時に、増殖がよい一方で、蓄積
される酢酸塩の量があまり多くならないように、留意し
なければならない。この最初の段階において、ある場合
に過剰な基質消費により、また場合によっては毒性の効
果をも有する組換えタンパク質の過剰生産によって著し
く細胞増殖が阻害されるので、この段階での組換えタン
パク質の無視できない量の産生は望ましくない。この理
由のために、調節し得る発現系を利用できることが重要
である。そのような系では、プロモーターは細胞の増殖
期では抑制され、その結果、組換えタンパク質の産生は
ない。高細胞濃度または多量の増殖細胞が存在する第二
の段階では、プロモーターの抑制がはずされて、それに
よって発現が誘導される。調節が可能でかつタンパク質
発現の誘導が温度シフトまたは化学誘導によって行なわ
れる多くの発現系が微生物について知られている。最も
よく知られており、最も効果的な大腸菌のプロモーター
のひとつとして、例えば、ヨーロッパ特許出願公開（EP
−Ａ−）0,041,767号に記述されているλPLプロモータ
ーがあげられる。プロモーターをブロックするC1リプレ
ッサーは、約42℃への温度シフトによって不活化され、
構造遺伝子の転写をそれによって可能にする（第２段
階）。今日まで、多くの酵素および他のタンパク質、例
えば、EcoR I制限エンドヌクレアーゼ（Bottermannら:B
iotechnol.Bioeng.27（1985）,p.1320）、α−アミラー
ゼ（Reinikainenら:Biotechnol.Lett.10（３）（198
8）,p.149）、ムタロターゼ（EP−Ａ−0,307,730）また
はグルコースデヒドロゲナーゼ（EP−Ａ−0,290,768）
などが、大腸菌におけるそのような標準的な二段階工程
を用いることによって発現されてきた。増殖および発現
は、この工程では必ずしも一つの反応器中で連続的に行
われる必要はなく、二つの別々の反応器中で連続して行
なわれてもよい。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、上述の方法は今まで実際に用いられて
きており、またバチルスなどの他の細菌種のための調節
し得る他のプロモーター系を使った上述の方法を応用し
た方法も用いられているが、これらの方法は欠点を有す
ることもまれではなく、特別の場合には工程が実施不可
能になる。このように、組換え宿主細胞の増殖速度の、
場合によっては著しい低下が、プラスミド複製数が増加
し、これと連関してタンパク質の過剰発現が増大する場
合（例えば、BentlyおよびKompala:Biotechn.Bioeng.33
（1989）p.49）のほとんどにおいて認められる。
きており、またバチルスなどの他の細菌種のための調節
し得る他のプロモーター系を使った上述の方法を応用し
た方法も用いられているが、これらの方法は欠点を有す
ることもまれではなく、特別の場合には工程が実施不可
能になる。このように、組換え宿主細胞の増殖速度の、
場合によっては著しい低下が、プラスミド複製数が増加
し、これと連関してタンパク質の過剰発現が増大する場
合（例えば、BentlyおよびKompala:Biotechn.Bioeng.33
（1989）p.49）のほとんどにおいて認められる。
さらに、プロモーターの抑制解除は、例えば温度シフ
トによって行われるが、これが増殖の厳しい抑制および
プラスミドの著しい損失を引き起こし得る（例えば、Si
egelおよびRyu,Biotechn.Bioeng.27（1985）,p.28）こ
とが知られている。なお、通常短時間しか持続せず、し
たがって急速に減速するものであるが、プロモーター誘
導の直後に著しく高速の組換えタンパク質生合成が起き
ることがしばしば観察されることは注目すべきである
（例えば、PerettiおよびBailey,Biotechn.Bioeng.32
（1988）,p.418）。これらの影響はすべて、プロモータ
ー誘導が起きた後の増殖速度の減少による真の合成速度
の制限を引き起こす。したがって、組換えタンパク質の
絶対収量が、しばしば不十分となるばかりではなく、古
い細胞が比較的短時間後に非生産性になり、ほとんどの
場合、もはや再増殖できなくなるために、新たな組換え
宿主細胞を絶えず培養しなくてはならない。これは経済
的な欠点である。
トによって行われるが、これが増殖の厳しい抑制および
プラスミドの著しい損失を引き起こし得る（例えば、Si
egelおよびRyu,Biotechn.Bioeng.27（1985）,p.28）こ
とが知られている。なお、通常短時間しか持続せず、し
たがって急速に減速するものであるが、プロモーター誘
導の直後に著しく高速の組換えタンパク質生合成が起き
ることがしばしば観察されることは注目すべきである
（例えば、PerettiおよびBailey,Biotechn.Bioeng.32
（1988）,p.418）。これらの影響はすべて、プロモータ
ー誘導が起きた後の増殖速度の減少による真の合成速度
の制限を引き起こす。したがって、組換えタンパク質の
絶対収量が、しばしば不十分となるばかりではなく、古
い細胞が比較的短時間後に非生産性になり、ほとんどの
場合、もはや再増殖できなくなるために、新たな組換え
宿主細胞を絶えず培養しなくてはならない。これは経済
的な欠点である。
したがって、本発明の目的は、タンパク質および酵素
の生産における上記の欠点を培養パラメターを最適にす
ることによって調節し得る組換えプロモーターを含む宿
主細胞を用いて除去すること、および長時間にわたる高
速の組換えタンパク質生合成を可能にすることにある。
の生産における上記の欠点を培養パラメターを最適にす
ることによって調節し得る組換えプロモーターを含む宿
主細胞を用いて除去すること、および長時間にわたる高
速の組換えタンパク質生合成を可能にすることにある。
（課題を解決するための手段） タンパク質や酵素の発現を開始させるプロモーターに
よる発現の誘導を（１）従来行っていたように組換え宿
主細胞の増殖細胞量が最高になるのを待たずに比較的早
期の増殖期における中程度の増殖細胞量で、（２）最適
発現温度よりも低い温度で、および（３）添加される含
アミノ酸基質の存在下で行えば、組換え技術によって調
製されたタンパク質や酵素の収量（活性）を５〜10倍に
上昇させることができ、生合成は従来よりもより長い時
間高レベルで維持され得ることがいま見い出された。例
えば、遺伝子工学によって調製された酵素グルコースデ
ヒドロゲナーゼで、200〜500、好ましくは250〜350U/ml
培養液の活性および100〜300、好ましくは150〜250U/mg
タンパク質の比活性を達成することができる。
よる発現の誘導を（１）従来行っていたように組換え宿
主細胞の増殖細胞量が最高になるのを待たずに比較的早
期の増殖期における中程度の増殖細胞量で、（２）最適
発現温度よりも低い温度で、および（３）添加される含
アミノ酸基質の存在下で行えば、組換え技術によって調
製されたタンパク質や酵素の収量（活性）を５〜10倍に
上昇させることができ、生合成は従来よりもより長い時
間高レベルで維持され得ることがいま見い出された。例
えば、遺伝子工学によって調製された酵素グルコースデ
ヒドロゲナーゼで、200〜500、好ましくは250〜350U/ml
培養液の活性および100〜300、好ましくは150〜250U/mg
タンパク質の比活性を達成することができる。
このように、本発明は、組換え宿主細胞を栄養溶液中
で培養して、温度誘導発現を行い、次いでタンパク質を
単離することによってタンパク質を調製する方法に関
し、タンパク質の発現を ａ）最高の達成可能な増殖細胞量の５〜40％に相当する
組換え宿主細胞の増殖細胞量において発現の誘導を開始
し、 ｂ）最適発現温度よりも低い温度で、 ｃ）添加アミノ酸および／または酵母エキスの存在下
で、行うことを特徴とする。
で培養して、温度誘導発現を行い、次いでタンパク質を
単離することによってタンパク質を調製する方法に関
し、タンパク質の発現を ａ）最高の達成可能な増殖細胞量の５〜40％に相当する
組換え宿主細胞の増殖細胞量において発現の誘導を開始
し、 ｂ）最適発現温度よりも低い温度で、 ｃ）添加アミノ酸および／または酵母エキスの存在下
で、行うことを特徴とする。
特に、本発明は、組換え宿主細胞が大腸菌細胞であ
り、タンパク質の発現がλPLプロモーターによって調節
され、かつ、添加するアミノ酸混合物が少なくともフェ
ニールアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む
ことを特徴とする、対応する方法に関する。
り、タンパク質の発現がλPLプロモーターによって調節
され、かつ、添加するアミノ酸混合物が少なくともフェ
ニールアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む
ことを特徴とする、対応する方法に関する。
また特に、本発明は、発現されるタンパク質がグルコ
ースデヒドロゲナーゼであることを特徴とする対応する
方法に関する。
ースデヒドロゲナーゼであることを特徴とする対応する
方法に関する。
本発明の方法を実施するために適する宿主細胞として
は、原則的に、調節可能であり、かつ温度で発現誘導で
きる少なくとも一つのプロモーターによってその中での
構造遺伝子の発現が調節される全ての微生物由来の組換
え形質転換宿主細胞が利用できる。大腸菌、バチルス属
の細菌は、特に適する微生物である。組換え大腸菌宿主
細胞は特に好ましい。調節し得る適当なプロモーターと
しては、温度的に調節することが可能であり、用いる個
々の微生物において機能する全てのプロモーターが利用
でき、特に、大腸菌λPLプロモーター、対応するlac、t
rpまたはtetプロモーターまたは他のハイブリドプロモ
ーターなどがあげられる。温度を42℃に上げることによ
って誘導することができるEP−Ａ−001,767に開示され
ているλPLプロモーターは、特に好ましい。
は、原則的に、調節可能であり、かつ温度で発現誘導で
きる少なくとも一つのプロモーターによってその中での
構造遺伝子の発現が調節される全ての微生物由来の組換
え形質転換宿主細胞が利用できる。大腸菌、バチルス属
の細菌は、特に適する微生物である。組換え大腸菌宿主
細胞は特に好ましい。調節し得る適当なプロモーターと
しては、温度的に調節することが可能であり、用いる個
々の微生物において機能する全てのプロモーターが利用
でき、特に、大腸菌λPLプロモーター、対応するlac、t
rpまたはtetプロモーターまたは他のハイブリドプロモ
ーターなどがあげられる。温度を42℃に上げることによ
って誘導することができるEP−Ａ−001,767に開示され
ているλPLプロモーターは、特に好ましい。
発現さるべき構造遺伝子のタイプおよびオリジンは、
本発明の方法を実施するにおいて重要な部分ではない。
したがって、用いる個々の微生物中で発現され得る構造
遺伝子はいずれも、原則的に、適している。
本発明の方法を実施するにおいて重要な部分ではない。
したがって、用いる個々の微生物中で発現され得る構造
遺伝子はいずれも、原則的に、適している。
本発明の方法の特長は、従来技術による同様の方法と
の直接的比較によって、すなわち、同一のプラスミド構
造による同一の構造遺伝子の同一の微生物における発現
との比較によって常に認められるはずである。適当な構
造遺伝子は、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝
子、ムタロターゼ遺伝子およびソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼおよびジヒドロフォレートレダクターゼの遺伝子で
ある。
の直接的比較によって、すなわち、同一のプラスミド構
造による同一の構造遺伝子の同一の微生物における発現
との比較によって常に認められるはずである。適当な構
造遺伝子は、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝
子、ムタロターゼ遺伝子およびソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼおよびジヒドロフォレートレダクターゼの遺伝子で
ある。
本発明による方法は好ましくは次のようにして実施さ
れる。
れる。
適当な発現ベクターで形質転換させた任意の所望の大
腸菌株（例えば、大腸菌K12または大腸菌N100）を、例
えば、組換え微生物として用いる。構造遺伝子は、好ま
しくは、温度誘導性のλPLプロモーターによって調節さ
れる。
腸菌株（例えば、大腸菌K12または大腸菌N100）を、例
えば、組換え微生物として用いる。構造遺伝子は、好ま
しくは、温度誘導性のλPLプロモーターによって調節さ
れる。
好ましい態様において、大腸菌株N100/pRK248/pJH115
（DSM4047）を用いる。この株は、EP−Ａ−0,290,768に
開示されており、ベクターpJH115によって形質転換され
たものである。プラスミドpJH115は、バチルス・メガテ
リウム（Bacillus megaterium）からのグルコースデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を含む。
（DSM4047）を用いる。この株は、EP−Ａ−0,290,768に
開示されており、ベクターpJH115によって形質転換され
たものである。プラスミドpJH115は、バチルス・メガテ
リウム（Bacillus megaterium）からのグルコースデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を含む。
適当な大腸菌株を、この目的のための通常の既知の増
殖培地中で標準法によって培養する。細胞の増殖を、培
養培地の吸光度または濁度を分光光度計を用いて、好ま
しくは578nmで測定することによって既知の方法でモニ
ターする。本発明では、温度シフト前の増殖細胞量は中
程度（増殖期中期の初期）とする。これは用いる個々の
組換え宿主株が一定の培養条件で達成できる最高の増殖
細胞量の５〜40％、好ましくは10〜20％に相当する。一
般に、これは、578nmにおいて測定される濁度で2.0〜5.
5OD、好ましくは2.5〜4.5ODに対応する細胞量に相当す
る。通常、達成し得る最高の増殖細胞量は、８〜10OD
（578nm）の濁度に相当する。しかし、例外的には、最
高に達成され得る細胞密度において著しく低いOD値が測
定される場合もある。用いられる個々の測定装置（キュ
ベットの大きさ、分光光度計など）によってもOD値は変
動し得る。しかし、温度の上昇によるプロモーターの活
性化およびこれによって開始されるタンパク質発現を、
上述したように、達成可能な最高の細胞密度を著しく下
回る細胞量において始めることが、本発明においては常
に必須である。
殖培地中で標準法によって培養する。細胞の増殖を、培
養培地の吸光度または濁度を分光光度計を用いて、好ま
しくは578nmで測定することによって既知の方法でモニ
ターする。本発明では、温度シフト前の増殖細胞量は中
程度（増殖期中期の初期）とする。これは用いる個々の
組換え宿主株が一定の培養条件で達成できる最高の増殖
細胞量の５〜40％、好ましくは10〜20％に相当する。一
般に、これは、578nmにおいて測定される濁度で2.0〜5.
5OD、好ましくは2.5〜4.5ODに対応する細胞量に相当す
る。通常、達成し得る最高の増殖細胞量は、８〜10OD
（578nm）の濁度に相当する。しかし、例外的には、最
高に達成され得る細胞密度において著しく低いOD値が測
定される場合もある。用いられる個々の測定装置（キュ
ベットの大きさ、分光光度計など）によってもOD値は変
動し得る。しかし、温度の上昇によるプロモーターの活
性化およびこれによって開始されるタンパク質発現を、
上述したように、達成可能な最高の細胞密度を著しく下
回る細胞量において始めることが、本発明においては常
に必須である。
増殖期（タンパク質の発現を行わない）における温度
は、25〜35℃、好ましくは28〜32℃の間である。所望の
細胞密度で、温度を37〜40℃、好ましくは38〜39℃に上
げて、これによって発現を開始させる。この温度はλPL
プロモーターの最適誘導のために要求される温度（42
℃）よりも明かに低い。驚いたことに、本発明による全
ての工程パラメターが守られれば、これにより酵素活性
またはタンパク質の収量を低減することなく、その著し
い増加を可能にする。
は、25〜35℃、好ましくは28〜32℃の間である。所望の
細胞密度で、温度を37〜40℃、好ましくは38〜39℃に上
げて、これによって発現を開始させる。この温度はλPL
プロモーターの最適誘導のために要求される温度（42
℃）よりも明かに低い。驚いたことに、本発明による全
ての工程パラメターが守られれば、これにより酵素活性
またはタンパク質の収量を低減することなく、その著し
い増加を可能にする。
本発明による工程において、温度を上げる直前または
直後、好ましくは直前、に含アミノ酸基質を培養培地に
加える。単一アミノ酸、２種以上のアミノ酸の混合物、
酵母エキスまたはアミノ酸と酵母エキスの混合物をこれ
に関して基質として用いることができる。
直後、好ましくは直前、に含アミノ酸基質を培養培地に
加える。単一アミノ酸、２種以上のアミノ酸の混合物、
酵母エキスまたはアミノ酸と酵母エキスの混合物をこれ
に関して基質として用いることができる。
したがって、適するアミノ酸例としては、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸、セリン、グルタミン、グリシン、
スレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、トリプ
トファン、バリン、フェニルアラニン、リジン、ロイシ
ン、イソロイシンおよびプロリンがあげられるが、自然
に見られる他のアミノ酸もまた用いることができる。少
なくともフェニールアラニン、チロシンおよびトリプト
ファンを含む混合物がこれに関して好ましい。
ン酸、グルタミン酸、セリン、グルタミン、グリシン、
スレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、トリプ
トファン、バリン、フェニルアラニン、リジン、ロイシ
ン、イソロイシンおよびプロリンがあげられるが、自然
に見られる他のアミノ酸もまた用いることができる。少
なくともフェニールアラニン、チロシンおよびトリプト
ファンを含む混合物がこれに関して好ましい。
添加アミノ酸の濃度は、本発明によると、１種のアミ
ノ酸当り0.05g/リットル〜1.0g/リットル、好ましくは
0.1g/リットル〜0.5g/リットル、の間と多様である。代
わりの酵母エキスは、1g/リットル〜10g/リットル、好
ましくは４〜6g/リットルの濃度で加える。各種のアミ
ノ酸を揃えたアミノ酸スペクトルを加えれば、特に高い
酵素活性やタンパク質収量を得ることができる。代わり
に、酵母エキス、あるいはアミノ酸混合物、とくに三つ
の芳香族アミノ酸、フェニールアラニン、チロシンおよ
びトリプトファンの混合物を用いることもできる。
ノ酸当り0.05g/リットル〜1.0g/リットル、好ましくは
0.1g/リットル〜0.5g/リットル、の間と多様である。代
わりの酵母エキスは、1g/リットル〜10g/リットル、好
ましくは４〜6g/リットルの濃度で加える。各種のアミ
ノ酸を揃えたアミノ酸スペクトルを加えれば、特に高い
酵素活性やタンパク質収量を得ることができる。代わり
に、酵母エキス、あるいはアミノ酸混合物、とくに三つ
の芳香族アミノ酸、フェニールアラニン、チロシンおよ
びトリプトファンの混合物を用いることもできる。
本発明の方法の各要件はそれぞれ独立して発現速度の
加速に関して多少の認識し得る効果を有する。これは、
後述の諸例および図面によって認められる。しかし、従
来技術における工程パラメターを用いた場合に対して、
５〜10倍と実際に有意性のある発現レベルの増加を比較
的長時間持続できるという効果は本発明の三つのパラメ
ター、すなわち、中程度の増殖細胞量、低い誘導温度お
よび含アミノ酸基質の添加の組合せによってのみ観察す
ることができる。発現は比較例においてはほんの２〜３
時間後には停止するのに対して、本発明による方法にお
いては高発現を４〜８時間持続することができる。
加速に関して多少の認識し得る効果を有する。これは、
後述の諸例および図面によって認められる。しかし、従
来技術における工程パラメターを用いた場合に対して、
５〜10倍と実際に有意性のある発現レベルの増加を比較
的長時間持続できるという効果は本発明の三つのパラメ
ター、すなわち、中程度の増殖細胞量、低い誘導温度お
よび含アミノ酸基質の添加の組合せによってのみ観察す
ることができる。発現は比較例においてはほんの２〜３
時間後には停止するのに対して、本発明による方法にお
いては高発現を４〜８時間持続することができる。
実質的に発現が完了した後、例えばEP−Ａ−0,290,76
8またはEP−Ａ−0,307,730に記載の標準法によって細胞
を処理して、発現タンパク質を単離してから通常の方法
で精製して、発現速度または酵素活性を既知の方法で決
定する。これに関して用いる方法は、それぞれの場合に
発現されるタンパク質のタイプによって変わる。
8またはEP−Ａ−0,307,730に記載の標準法によって細胞
を処理して、発現タンパク質を単離してから通常の方法
で精製して、発現速度または酵素活性を既知の方法で決
定する。これに関して用いる方法は、それぞれの場合に
発現されるタンパク質のタイプによって変わる。
（実施例） 本発明を実施例および図面によって以下に説明する。
なお、第１図〜第８図の各図においてａは工程パラメ
ターを変えた場合の578nmにおけるOD単位で表した培養
液の吸光度、ｂは単位/mlで表した酵素活性およびｃは
キロ単位/OD/時間で表した単位細胞量当りの発現速度
を、接種後の時間を横軸にとって図示したものである。
全ての場合、グルコースデヒドロゲナーゼ（Gluc−DH）
を温度誘導によって発現させることができる同一の組換
え大腸菌宿主株（比較例１を参照されたい）を培養して
処理した。
ターを変えた場合の578nmにおけるOD単位で表した培養
液の吸光度、ｂは単位/mlで表した酵素活性およびｃは
キロ単位/OD/時間で表した単位細胞量当りの発現速度
を、接種後の時間を横軸にとって図示したものである。
全ての場合、グルコースデヒドロゲナーゼ（Gluc−DH）
を温度誘導によって発現させることができる同一の組換
え大腸菌宿主株（比較例１を参照されたい）を培養して
処理した。
比較例１ 大腸菌N100/pRK248/pJH115（DSM4047）を以下の組成
を必須成分として含む栄養溶液で100リットルのファー
メンタ中で32℃で培養した。
を必須成分として含む栄養溶液で100リットルのファー
メンタ中で32℃で培養した。
％（w/v） Na2HPO4・2H2O 0.19 KH2PO4 0.075 NH4Cl 0.4 MgSO4・7H2O 0.1 クエン酸 0.2 グルコース 0.1 CaCl2・2H2O 0.01 増殖期の間、細胞増殖を578nmにおける吸光度を一定
間隔で測定してモニターした。吸光度が2.5になったと
き（接種後７〜10時間で達する）に、温度を42℃にあげ
て、細胞をさらに５時間増殖させた。Gluc−DH活性を一
定間隔で例えばEP−Ａ−0,290,768に記載の活性測定法
によって測定した。次いで、細胞を20℃（5000rpm）で
遠心分離して、pH6.5の燐酸ナトリウム緩衝液（0.1mol/
リットル）中に加え、高圧ホモジナイザーで1000barで
冷却しながらホモジェネートした。35％のPEG1500（ポ
リエチレングリコール）を得られたホモジェネートに20
〜25分間かけて攪拌混合した。PEGの溶解の後、67％（w
/vホモジェネート）の燐酸緩衝液（w/w:26.2％NaN2PO4
・2H2O、1.3％K2HPO4、pH4.7）をpH5.2（±0.1）で攪拌
しながら測り入れた。６％（w/vホモジェネート）のNaC
lを次いで加えて、混合物をさらに２時間攪拌した。相
を遠心分離によって分離した。Gluc−DHを含む上相を必
要であれば濾過または透析濾過（dia−filtration）す
ることができる。40U/mlの活性を有するGluc−DHを得た
（第1a〜1c図）。
間隔で測定してモニターした。吸光度が2.5になったと
き（接種後７〜10時間で達する）に、温度を42℃にあげ
て、細胞をさらに５時間増殖させた。Gluc−DH活性を一
定間隔で例えばEP−Ａ−0,290,768に記載の活性測定法
によって測定した。次いで、細胞を20℃（5000rpm）で
遠心分離して、pH6.5の燐酸ナトリウム緩衝液（0.1mol/
リットル）中に加え、高圧ホモジナイザーで1000barで
冷却しながらホモジェネートした。35％のPEG1500（ポ
リエチレングリコール）を得られたホモジェネートに20
〜25分間かけて攪拌混合した。PEGの溶解の後、67％（w
/vホモジェネート）の燐酸緩衝液（w/w:26.2％NaN2PO4
・2H2O、1.3％K2HPO4、pH4.7）をpH5.2（±0.1）で攪拌
しながら測り入れた。６％（w/vホモジェネート）のNaC
lを次いで加えて、混合物をさらに２時間攪拌した。相
を遠心分離によって分離した。Gluc−DHを含む上相を必
要であれば濾過または透析濾過（dia−filtration）す
ることができる。40U/mlの活性を有するGluc−DHを得た
（第1a〜1c図）。
比較例２ 組換え宿主細胞の増殖、Gluc−DHの発現および単離を
比較例１と同様にして行った。ただし、発現を開始させ
る前に細胞を吸光度10になるまで（最高増殖菌体量）増
殖させた。結果として50U/mlのGluc−DH活性が得られ、
これは酵素活性または単位増殖菌体量あたりの発現速度
の僅かな増加を示した（第2a〜2c図）。
比較例１と同様にして行った。ただし、発現を開始させ
る前に細胞を吸光度10になるまで（最高増殖菌体量）増
殖させた。結果として50U/mlのGluc−DH活性が得られ、
これは酵素活性または単位増殖菌体量あたりの発現速度
の僅かな増加を示した（第2a〜2c図）。
比較例３ 組換え宿主細胞の増殖、Gluc−DHの発現および単離を
比較例２と同様にして行うが、発現誘導の温度を39℃ま
でしかあげなかった。活性および収量は、比較例２と同
様であった（第3a〜3c図）。
比較例２と同様にして行うが、発現誘導の温度を39℃ま
でしかあげなかった。活性および収量は、比較例２と同
様であった（第3a〜3c図）。
実施例１ 組換え宿主細胞の増殖およびGluc−DHの発現および単
離を比較例１と同様にして行った。ただし、吸光度ODが
2.5になったとき、各々0.3g/リットルのトリプトファ
ン、チロシンおよびフェニールアラニンを加え、培養液
の温度をその後すぐに39℃にあげた。170U/mlの酵素活
性が達成された（第4a〜4c図）。
離を比較例１と同様にして行った。ただし、吸光度ODが
2.5になったとき、各々0.3g/リットルのトリプトファ
ン、チロシンおよびフェニールアラニンを加え、培養液
の温度をその後すぐに39℃にあげた。170U/mlの酵素活
性が達成された（第4a〜4c図）。
実施例２ 組換え宿主細胞の増殖およびGluc−DHの発現および単
離を実施例１と同様にして行った。ただし、アミノ酸混
合物の代わりに、OD＝5.0において酵母エキス（5g/リッ
トル）を加えた。270U/mlの酵素活性および最高で増殖
菌体量あたりの発現速度9kU/OD/時が達成された（第5a
〜5c図）。
離を実施例１と同様にして行った。ただし、アミノ酸混
合物の代わりに、OD＝5.0において酵母エキス（5g/リッ
トル）を加えた。270U/mlの酵素活性および最高で増殖
菌体量あたりの発現速度9kU/OD/時が達成された（第5a
〜5c図）。
実施例３ 組換え宿主細胞の増殖、Gluc−DHの発現および単離を
実施例１と同様にして行った。ただし、吸光度ODが2.0
に達したときに、酵母エキス（5g/リットル）およびア
ミノ酸としてのフェニールアラニン、チロシンおよびト
リプトファンをさらに各々0.2g/リットルの濃度で温度
を39℃に上げる前に加えた。Gluc−DHの生合成は７時間
継続した。240U/mlの活性が達成された（第6a〜6c
図）。
実施例１と同様にして行った。ただし、吸光度ODが2.0
に達したときに、酵母エキス（5g/リットル）およびア
ミノ酸としてのフェニールアラニン、チロシンおよびト
リプトファンをさらに各々0.2g/リットルの濃度で温度
を39℃に上げる前に加えた。Gluc−DHの生合成は７時間
継続した。240U/mlの活性が達成された（第6a〜6c
図）。
実施例４ 組換え宿主細胞の増殖、Gluc−DHの発現および単離を
実施例１と同様にして行った。ただし、吸光度ODが3.5
に達したときに、天然に生成されるアミノ酸のスペクト
ル（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アスパ
ラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
リジン、アルギニンおよびヒスチジン）を各々0.1g/リ
ットルの濃度で含む混合物を培養温度を39℃に上げる前
に加えた。460U/mlの活性および最高で約14KU/OD/時の
単位増殖菌体量あたりの発現速度が達成された。生合成
活性はこの場合にも約７時間持続した（第7a〜7c図）。
実施例１と同様にして行った。ただし、吸光度ODが3.5
に達したときに、天然に生成されるアミノ酸のスペクト
ル（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アスパ
ラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
リジン、アルギニンおよびヒスチジン）を各々0.1g/リ
ットルの濃度で含む混合物を培養温度を39℃に上げる前
に加えた。460U/mlの活性および最高で約14KU/OD/時の
単位増殖菌体量あたりの発現速度が達成された。生合成
活性はこの場合にも約７時間持続した（第7a〜7c図）。
比較例４ 組換え宿主細胞の増殖、Gluc−DHの発現および単離を
実施例３と同様にして行った。ただし、OD＝2.5で適当
な基質を添加した後に温度を42℃に上げた。比較例１の
場合のように、短時間持続する、速いが次いで大いに減
速する生合成速度が認められ、これは95U/mlの酵素活性
をもたらした。
実施例３と同様にして行った。ただし、OD＝2.5で適当
な基質を添加した後に温度を42℃に上げた。比較例１の
場合のように、短時間持続する、速いが次いで大いに減
速する生合成速度が認められ、これは95U/mlの酵素活性
をもたらした。
（発明の効果） 本発明の方法によれば、培養開始後、達成し得る最高
増殖細胞量の５〜40％の増殖細胞量に達した時点で温度
シフトによる発現誘導を行い、かつ発現を40℃未満の温
度で行い、さらに発現に際してアミノ酸を培養液中に加
えることにより、高レベルでのタンパク質の発現をより
長時間にわたって維持することができる。
増殖細胞量の５〜40％の増殖細胞量に達した時点で温度
シフトによる発現誘導を行い、かつ発現を40℃未満の温
度で行い、さらに発現に際してアミノ酸を培養液中に加
えることにより、高レベルでのタンパク質の発現をより
長時間にわたって維持することができる。
第１図〜第８図はそれぞれ比較例１〜４および実施例１
〜４で得た結果を示す図であり、各図におけるａは培養
液の吸光度（OD578nm）の変化を、ｂは単位/mlで表した
酵素活性の変化を、ｃはキロ単位/OD/時間で表した発現
速度をそれぞれ示す。
〜４で得た結果を示す図であり、各図におけるａは培養
液の吸光度（OD578nm）の変化を、ｂは単位/mlで表した
酵素活性の変化を、ｃはキロ単位/OD/時間で表した発現
速度をそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヴォルフガング エーベリング ドイツ連邦共和国 デー‐6100 ダルム シュタット フランクフルター シュト ラーセ 250 (72)発明者 ヴォルフガング ブリュマー ドイツ連邦共和国 デー‐6100 ダルム シュタット フランクフルター シュト ラーセ 250 (56)参考文献 特開 昭63−12283（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−20098（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，1987，Ｖｏ ｌ．５，ｐ．237−253 Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ他編，”Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｎ ｏ．３，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏ ｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ ｓ，1989，17．11−12 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12P 21/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】組換え宿主原核細胞を栄養溶液中で培養し
て、温度誘導プロモーターシステムによって生物学的に
活性なタンパク質を発現させ、次いで該タンパク質を単
離する生物学的に活性なタンパク質の調製法であって、 該タンパク質の発現が、 ａ）発現誘導時における前記組換え宿主原核細胞の増殖
細胞量が、最高の達成可能な増殖細胞量の５〜40％に相
当する量であり、 ｂ）最適発現温度よりも低い温度で、かつ ｃ）アミノ酸及び酵母エキスから選択された１種以上の
追加された成分の存在下で 行なわれることを特徴とするタンパク質の調製法。 - 【請求項２】前記組換え宿主原核細胞が大腸菌である請
求項１に記載の調製法。 - 【請求項３】前記タンパク質の発現が、λPLプロモータ
ー及びCI857リプレッサーにより制御される請求項２に
記載の調製法。 - 【請求項４】前記タンパク質の発現が、37〜40℃の温度
で行なわれる請求項３に記載の調製法。 - 【請求項５】前記タンパク質の発現が、38〜39℃の温度
で行なわれる請求項３に記載の調製法。 - 【請求項６】前記アミノ酸が、フェニールアラニン、チ
ロシン及びトリプトファンを含む請求項１〜５のいずれ
かに記載の調製法。 - 【請求項７】前記発現されるタンパク質がグルコースデ
ヒドロゲナーゼである請求項１〜７のいずれかに記載の
調製法。 - 【請求項８】比活性として150〜250U/mgタンパク質の収
量が達成される請求項７に記載の調製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3936408A DE3936408A1 (de) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | Ueberexpression von proteinen in rekombinanten wirtszellen |
| DE3936408.9 | 1989-11-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03183478A JPH03183478A (ja) | 1991-08-09 |
| JP3085700B2 true JP3085700B2 (ja) | 2000-09-11 |
Family
ID=6392683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02295560A Expired - Fee Related JP3085700B2 (ja) | 1989-11-02 | 1990-11-02 | 組換え宿主細胞を用いたタンパク質の調製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5196317A (ja) |
| EP (1) | EP0427035B1 (ja) |
| JP (1) | JP3085700B2 (ja) |
| DE (2) | DE3936408A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018216978A1 (en) * | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Cj Healthcare Corporation | Cell culture method at low temperature applicable to mass production of protein |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2722138B1 (fr) | 1994-07-07 | 1996-09-20 | Bourrieres Francis | Pochoir de serigraphie et procede pour le realiser |
| EP0832255B1 (en) * | 1995-06-07 | 2005-12-14 | Washington University | Recombinant bacterial system with environmentally limited viability |
| WO2007000994A1 (ja) * | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗ｈｃｖ作用を有する化合物の製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985003522A1 (en) * | 1984-02-08 | 1985-08-15 | Cetus Corporation | Monitoring and control systems for recombinant manipulations |
| US4894334A (en) * | 1984-03-28 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
| DE3711881A1 (de) * | 1987-04-08 | 1988-10-27 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur herstellung von glucosedehydrogenase aus bacillus megaterium |
| DE3711883A1 (de) * | 1987-04-08 | 1988-10-27 | Merck Patent Gmbh | Genetische kontrolleinheit und klonierungs- und expressionssystem |
-
1989
- 1989-11-02 DE DE3936408A patent/DE3936408A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-10-20 EP EP90120176A patent/EP0427035B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-20 DE DE59009060T patent/DE59009060D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-02 JP JP02295560A patent/JP3085700B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-02 US US07/608,443 patent/US5196317A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９８７，Ｖｏｌ．５，ｐ．２３７−２５３ |
| Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ他編，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｎｏ．３，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，１７．１１−１２ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018216978A1 (en) * | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Cj Healthcare Corporation | Cell culture method at low temperature applicable to mass production of protein |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3936408A1 (de) | 1991-05-08 |
| DE59009060D1 (de) | 1995-06-14 |
| EP0427035B1 (de) | 1995-05-10 |
| US5196317A (en) | 1993-03-23 |
| JPH03183478A (ja) | 1991-08-09 |
| EP0427035A1 (de) | 1991-05-15 |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |