CN109161514A - 一种重组d-甘露糖异构酶及其在d-甘露糖生产中的应用 - Google Patents

一种重组d-甘露糖异构酶及其在d-甘露糖生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组甘露糖异构酶及其在甘露糖生产中的应用，属于基因工程技术领域。先将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的D‑甘露糖异构酶基因(mi)转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)得到一种重组大肠杆菌(pET‑24a‑mi‑BL21)，利用重组大肠杆菌高产D‑甘露糖异构酶，从而提高D‑甘露糖的转化率。利用本发明提供的重组大肠杆菌和应用方法，可以使D‑甘露糖异构酶的产量达到5.3mg/mL，酶活达到284790U/mL，产D‑甘露糖的转化率达到39.3％。这一发现对于工业化制备D‑甘露糖具有重要的意义。

Description

一种重组D-甘露糖异构酶及其在D-甘露糖生产中的应用
技术领域
本发明涉及一种重组D-甘露糖异构酶及其在D-甘露糖生产中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
D-甘露糖是D-葡萄糖的一个C-2位置的差向异构体，以游离状态存在于柑橘、桃、苹果等水果的果皮中。由于其在体内不能被很好的代谢，因此在服用甘露糖的过程中血糖浓度基本不会升高。此外D-甘露糖还参与某些特定的免疫反应，能预防和减少细菌和病毒的感染。临床上还使用D-甘露糖治疗尿路感染。它已广泛应用于食品、医药、化工和饲料中。
鉴于D-甘露糖的应用价值较高，很多研究者对D-甘露糖的生产方法进行了大量研究。第一种方法是从植物和微生物中提取得到D-甘露糖。D-甘露糖可由半纤维素和纤维素经胞外木聚糖酶分解而来，同时还可以从苹果果肉、蔓越橘、荔枝皮、桔皮、红枣中提取得到。但提取得到的D-甘露糖的量还是极少的。也有报道以棕树籽为原料经酸水解、碱中和等一系列步骤提取D-甘露糖。但由于其工艺复杂，且在生产过程中用到很多酸碱，容易污染环境。
第二种是用化学合成的方法获得D-甘露糖。赵光辉等人通过化学反应在酸性条件下使得D-葡萄糖在1％钼酸盐的催化作用下，差向异构部分D-葡萄糖转化生成D-甘露糖，最终生成D-甘露糖的转化率约为32％。
第三种是利用酶合成D-甘露糖的方法，即以D-果糖或D-葡萄糖为底物，利用生物酶催化得到D-甘露糖。此法在D-甘露糖的制备中越来越占有重要地位，它具有反应条件温和、副产物少、易分离纯化、不污染环境和成本低等优点。目前用于D-甘露糖生产的酶有D-甘露糖异构酶(EC 5.3.1.7)、D-来苏糖异构酶(EC 5.3.1.15)和纤维二糖差向异构酶(EC5.1.3.11)，可以催化D-果糖或D-葡萄糖生成D-甘露糖。常用的产D-甘露糖异构酶的基因的菌株主要有：假单胞菌、大肠杆菌、放射形土壤杆菌、嗜热放线细菌、黄单胞菌、链霉菌等。D-来苏糖异构酶和纤维二糖差向异构酶使用较少。
现有报道中，菌株产D-甘露糖异构酶的最高产量是0.7mg/mL，酶活为79.23U/mL，转化率为15-33％，产量较低，活性较弱，转化率较差。因此，提供一种高产D-甘露糖异构酶的菌株以及利用该菌株提高D-甘露糖产量的方法，对于工业制备D-甘露糖具有重大的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是将来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)的D-甘露糖异构酶基因(mi)转入大肠杆菌(Escherichia coli)得到的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，编码D-甘露糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，该重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主，以pET-24a为表达载体，表达SEQ ID NO.1所编码的D-甘露糖异构酶。
本发明第二个目的在于提供一种高效表达D-MI的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法如下：
1)以恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)的基因组为模板，设计引物，经PCR扩增得到目的基因D-甘露糖异构酶基因(mi)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2)将目的基因连接到表达载体pET-24a，得到重组质粒pET-24a-mi；
3)将重组质粒pET-24a-mi通过转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，获得大肠杆菌D-MI基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，步骤1)扩增得到目的基因后，将PCR产物纯化后与克隆载体pMD18T于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布在含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒，得到pMD18T-mi-JM109；酶切回收目的基因，将其与表达载体pET-24a进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布含有kana(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒，得到pET-24a-mi；将重组质粒pET-24a-mi转化到提前制备好的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态中，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-24a-mi-BL21)。
本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在D-甘露糖生产中的应用，所述应用包括以下步骤：
(1)重组大肠杆菌发酵产D-甘露糖异构酶；
(2)D-甘露糖异构酶催化D-果糖生成D-甘露糖。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)包括将重组大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在36-38℃下培养8-10h后，以4-6％接种量转接至TB发酵培养基中，先放至36-38℃、190-210rpm恒温培养1-2h，当菌体OD600达到0.5-1.0时加入诱导剂IPTG 12.5-25μL，此后转至24-26℃、190-210rpm进行诱导发酵22-26h，发酵结束后，收集菌体、破碎、离心后，所得上清即为重组大肠杆菌所产的D-甘露糖异构酶酶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)包括在初始反应温度50-55℃，起始pH 7.5-8.0，D-果糖为200-250g/L的情况下，加D-甘露糖异构酶，加酶量控制为0.04-0.06mL/mL；设置水浴摇床温度为50-55℃、转速160-170r/min，从0.5h开始每隔1h取样煮沸终止反应。
本发明先将来源于恶臭假单胞菌的D-甘露糖异构酶基因(mi)转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)得到一种重组大肠杆菌，利用重组大肠杆菌高产D-甘露糖异构酶，从而提高D-甘露糖的转化率。利用本发明提供的重组大肠杆菌和应用方法，可以使D-甘露糖异构酶的产量达到5.3mg/mL，酶活达到284790U/mL，反应2h产D-甘露糖的转化率达到39.3％。这一发现对于工业化制备D-甘露糖具有重要的意义。
附图说明
图1：pMD18T-mi-JM109重组质粒双酶切验证图，M：Takara DL10000DNA marker；1：双酶切后的pMD18T-mi-JM109重组质粒；
图2：pET-24a-mi重组质粒的双酶切验证图，M：Takara DL10000DNA marker；1：双酶切后的pET-24a-mi重组质粒；
图3：pET-24a-mi-BL21重组菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图，M：GENEray SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分子量标准蛋白；1：摇瓶发酵后表达的重组D-甘露糖异构酶(D-MI)；
图4：D-果糖的标准曲线；
图5：D-甘露糖异构酶转化率达39.3％时的酶转化HPLC色谱图。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。
TB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，K2HPO4·3H2O 16.43g/L，KH2PO42.31g/L。
实施例1：恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)来源的D-甘露糖异构酶基因(mi)的克隆及表达载体的构建
以恶臭假单胞菌基因组为模板，设计引物，经PCR后得到目的基因D-甘露糖异构酶基因(mi)，构建重组质粒pET24a-mi。具体步骤如下：
PCR引物：D-F：序列如SEQ ID NO.2所示；D-R：序列如SEQ ID NO.3所示。序列的第4-9位为限制性酶切位点。
PCR体系为：20μM引物D-F和D-R各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer 10μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5μL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL。
PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min50s，30个循环。
将PCR产物进行胶回收、加A纯化后与克隆载体pMD18T于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布在含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pMD18T-mi-JM109(见图1)。酶切回收目的基因，将其与表达载体pET-24a进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布含有kana(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pET-24a-mi(见图2)。
实施例2：重组质粒pET-24a-mi的转化
将重组质粒pET-24a-mi转化到提前制备好的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态中，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-24a-mi-BL21)，涂布含卡那霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，经37℃培养10-12h。挑选单菌落至含卡那霉素(100μg/mL)抗性的10mL液体LB培养基中，37℃培养8h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。测序验证正确后进行摇瓶发酵产酶。
实施例3：摇瓶发酵产酶
将实施例2中得到的重组大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后，以5％接种量转接至50mL TB发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养1-2h，在菌体OD600在0.5-1.0时加入诱导剂IPTG 12.5μL。此后转至25℃、200rpm进行摇瓶诱导发酵24h。发酵结束后，将发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组大肠杆菌所产的D-MI酶液。蛋白电泳(SDS-PAGE)结果显示在43kDa处有一条与理论分子量一致的条带(见图3)。
实施例4：D-MI酶活测定
1.标准曲线绘制：
取15mL的具塞试管分别加入50mg/mL的果糖标准液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL，再用去离子水分别补充至1.0mL。然后每管中加入6mL 75％的硫酸，1.5％的半胱氨酸盐酸盐0.2mL，振荡均匀后立即加入0.12％的乙醇咔唑溶液0.2mL，再次振荡均匀，立即置于60℃水浴保温10min，取出用冰水冷却后，用10mm光径的比色皿，在560nm波长下测吸光值。以D-果糖浓度(mg/mL)为横坐标，560nm处的吸光值为纵坐标作图，即得到标准曲线(见图4)。(Y＝0.0251X-0.0017，X:D-果糖浓度mg/L，Y:560nm处的吸光值)
2.所用试剂:
a.0.12％(w/v)酒精咔唑溶液：
称取咔唑30.0mg，用无水乙醇溶解并定容至25mL，放置在棕色瓶中，4℃冰箱放置24h后可以使用。保存于4℃冰箱，长期可用。使用时提前取出，放至室温再使用。
b.1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐溶液：
称取生化试剂L-半胱氨酸盐酸盐0.375g，用去离子水溶解，并定容至25mL。(尽量现配现用，8h内使用比较稳定)
c.75％浓硫酸：
量取分析纯浓硫酸300mL，再量取100mL去离子水，在不断搅拌下慢慢向水中加入浓硫酸。
d.0.1mol/L的D-甘露糖：
称取分析纯无水D-甘露糖0.45g，用pH 7.5，0.05mol/L的磷酸钠缓冲液溶解，定容至25mL。
e.0.5mol/L的高氯酸溶液：
取分析纯70％的高氯酸19.68mL，补加去离子水定容至500mL。
3.酶活测定
用D-甘露糖作为底物生成D-果糖来检测D-MI酶的活性，反应体系为：
(1)取0.1mol/L的D-甘露糖溶液900μL(用pH 7.5，0.05mol的磷酸钠缓冲液配制)于试管中，预热5min。
(2)向预热后的D-甘露糖溶液中加入0.1mL D-MI的酶液，60℃反应1min。对照为向1中加入0.1mL pH 7.5，0.05mol/L的磷酸钠缓冲液。
(3)取(2)中的反应液0.1mL。
(4)向(3)中加入0.4mL的0.5mol/L的高氯酸终止反应，用漩涡振荡器混匀。
(5)取(4)中0.1mL梯度稀释150倍。
(6)取(5)中1mL加入干净的具塞试管中，向试管中加入6mL 75％的硫酸溶液，0.2mL 1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐溶液，振荡混匀，立即加入0.2mL 0.12％(w/v)酒精咔唑溶液，剧烈振荡15s，于60℃保温10min，取出冰水浴冷却5min。
(7)取(6)中冷却后的液体适量，用10mm光径的比色皿，于560nm处测吸光值。
D-MI酶活定义：以D-甘露糖为底物1mL发酵液每分钟转化生成1μg D-果糖所需的酶量为一个酶活力单位，U/mL。
酶活计算公式：(U/mL)＝稀释倍数×转化生成的D-果糖的量(μg/mL)/转化时间(min)
在上述条件下，测得D-MI酶活力可达284790U/mL。摇瓶发酵至OD值为15时的蛋白含量为5.3g/L。
实施例5：酶转化
在初始反应温度50℃，起始pH 7.5，D-果糖为200g/L的情况下，加酶量控制为0.05mL/mL反应体系。设置水浴摇床温度为50℃、转速150r/min，从0.5h开始每隔1h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。产物用HPLC进行检测。
HPLC检测条件为：最终反应体系中的D-果糖、D-甘露糖的量采用HPLC来确定。色谱条件为：Agilent1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱NH2P-50 4E(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相采用75％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8mL/min，柱温设定为30℃。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应糖的浓度。
按上述条件进行酶转化反应，当反应进行到2h后，产D-甘露糖的转化率可达到39.3％，D-甘露糖异构酶的产量达到5.3mg/mL，酶活达到284790U/mL，HPLC色谱峰图如图5所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种重组D-甘露糖异构酶及其在D-甘露糖生产中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1227
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgagcacct cgcccgattt ccgttcagcc gcgttcctgc gtgcgcacat cgccgacaca 60
atggcgttct accacccgcg ctgcatcgat ccgaacggcg gcttcttcca ctacttccgt 120
gacgacggca gcatctacga tgccagccac cgccacctgg tgagcagcac ccgtttcgtc 180
ttcaactacg cgatggccta ccgcgagttc ggcaacgccg aataccgcga cgcggtcgag 240
cacggcgtgc gctacctgcg cgaggtgcac cgcaacccgg ccaccggcgg ctacgcctgg 300
accctgcgcg acggcaaggt cgaggacgac atgaaccact gctatggcgt ggcgttcgtg 360
ctgctggcct acagctgtgc gctgaaggcc ggcatcgagc aggcgcgcgc ctggatcgac 420
gagacctggc aactgctgga agcgcgcttc tgggagccgc agcacggcct gtacaaggac 480
gaggccgacg gccagtggaa cttcaccggc tatcgcggcc agaacgccaa catgcacatg 540
tgcgaggcga tgctggcggc gttcgaggcc agtggcgaac cgcgttacgt cgagcgtgcg 600
ctgcagctgg ccgacaacat gacccgccgc caggccgcca aggctggcgg cctggtctgg 660
gagcactacg attccaactg ggagattgac tgggactaca acctggacga tcccaagcac 720
ctgttccgcc cgtggggctt ccagccgggg catcagaccg agtgggccaa gctgctgctg 780
atcctcgatc gccacgtgca ggccgactgg ctggtgccga ccgcgcagca tctgttcgac 840
gtggccgtgg cgcgcagctg ggacgacgcg cgaggcggcc tgtactacgg cttcgcaccg 900
gaatcgcgcc ggcagccggg catggagggc gcgccgatcg gtggcgacag cttcgtctgc 960
gacgacgaca agtacttctg ggtgcaggcc gaaacgctgg ccaccgccgc actgatggcc 1020
aagcgcaccg gtgatgaccg ctactggcag tggtacgagc gcatctgggc gtacgcgtgg 1080
gagcacttcg tcgaccatca gtacggcgcc tggttccgca tcctcgatgc cgacaaccgc 1140
aagtacagcg acgagaagag cccggccggc aaggtggatt accacaccat gggtgcgtgc 1200
tacgaagtgt tgaacgtggt gcgttga 1227
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgccatatga gcacctcgcc cgattt 26
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cccaagcttt tatcaacgca ccacgttca 29

Claims (10)

1.一种表达D-甘露糖异构酶(D-MI)的重组大肠杆菌，其特征在于，是将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的D-甘露糖异构酶基因(mi)转入大肠杆菌(Escherichiacoli)得到的基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码D-甘露糖异构酶的基因(mi)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET-24a为表达载体。
5.一种构建权利要求1-4任一所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)以恶臭假单胞菌的基因组为模板，设计引物，经PCR扩增得到目的基因D-甘露糖异构酶基因(mi)；
2)将目的基因连接到表达载体pET-24a，得到重组质粒pET-24a-mi；
3)将重组质粒pET-24a-mi通过转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，获得大肠杆菌D-MI基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中得到的D-甘露糖异构酶基因(mi)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌在D-甘露糖生产中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
(1)重组大肠杆菌发酵产D-甘露糖异构酶；
(2)D-甘露糖异构酶催化D-果糖生成D-甘露糖。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(1)包括将重组大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在36-38℃下培养8-10h后，以4-6％接种量转接至TB发酵培养基中，先放至36-38℃、190-210rpm恒温培养1-2h，当菌体OD600达到0.5-1.0时加入诱导剂IPTG12.5-25μL，此后转至24-26℃、190-210rpm进行诱导发酵22-26h，发酵结束后，收集菌体、破碎、离心后，所得上清即为重组大肠杆菌所产的D-甘露糖异构酶酶液。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，步骤(2)包括在初始反应温度50-55℃，起始pH 7.5-8.0，D-果糖为200-250g/L的情况下，加步骤(1)制备得到的D-甘露糖异构酶酶液，加酶量控制为0.04-0.06mL/mL；设置水浴摇床温度为50-55℃、转速160-170r/min，煮沸终止反应。
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