CN1347455A - 新甘露糖异构酶及其编码的dna - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具甘露糖异构酶活性的新蛋白质、编码蛋白质的DNA、包含DNA的重组载体、将重组载体导入宿主细胞而得到的转化子,以及用转化子产生上述蛋白质、甘露糖、果糖、木酮糖和来苏糖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及具甘露糖异构酶活性的蛋白质、编码蛋白质的DNA、包含该DNA的重组DNA、携带重组DNA的转化子、用转化子产生甘露糖异构酶的方法,以及产生果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖的方法。
背景技术
甘露糖异构酶公知存在于假单胞菌属(Pseudomonas)[生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.),218,535(1956);日本公开未审专利申请No.292578/94;美国专利No.5,124,262(1992)]、分支杆菌属(Mycobacterium)[细菌学杂志(J.Bacteriol.),101,777(1970)]、黄单胞菌属(Xanthomonas)[农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.),28,605(1964)]、链霉菌属(Streptomyces)[农业与生物化学,31,435(1967)]、不动杆菌属(Acinetobacter)(日本公开未审专利申请No.9986/96)和埃希氏菌属(Escherichia)[普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.),97,257(1976)]的微生物中。但至今为止,尚未从上述任一微生物中分离到编码该酶的DNA。
已纯化了来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的甘露糖异构酶,并对其特性进行了研究[普通微生物学杂志,124,219(1981)],但尚未分析其氨基酸序列。由于大肠杆菌染色体DNA的核苷酸序列已被确定[科学(Science),277,1453(1997)],根据耶鲁大学数据库,大肠杆菌基因原种中心(http://cgsc.biology.yale.edu),可以推断甘露糖异构酶基因大约存在于染色体的87.6分钟附近。但是,该基因尚未被确定或分离。
关于用甘露糖异构酶产生糖类,用来自假单胞菌属的细菌的甘露糖异构酶产生甘露糖(日本公开未审专利申请No.292587/94)及用来自不动杆菌属的细菌的甘露糖异构酶产生甘露糖(日本公布的未检验专利申请No.9986/96)均有公知的方法。但是,由于每个细胞的酶活性低,这些方法需要的反应时间长,不适于甘露糖的工业生产。
至今,用甘露糖异构酶有效地产生糖类的方法仍未知。
发明内容
本发明的目的是提供具甘露糖异构酶活性的蛋白质、编码蛋白质的DNA、用DNA产生具甘露糖异构酶活性的蛋白质的方法,以及用该蛋白质产生果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖的有效方法。
为达到这个目的本发明者进行了深入研究。最终,他们成功地从埃希氏菌属的微生物中分离到了编码甘露糖异构酶的DNA,并发现用分离到的DNA有效生产糖类如甘露糖是可能的。本发明是在这个结果的基础上完成的。
本发明涉及下述的(1)-(14)。
(1)一种由氨基酸序列组成的蛋白质,其中SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被删除、替换或添加,并且具有甘露糖异构酶活性。根据分子克隆,实验室手册,第二版,冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)(下文用分子克隆,第二版指代);分子生物学最新方法(Current Protocolsin Molecular Biology),John Wiley & Sons(1987-1997)(下文用分子生物学最新方法指代);核酸研究(Nucleic Acids Research),10,6487(1982);核酸研究,13,4431(1985);美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),79,6409(1982);美国国家科学院院报,82,488(1985);基因(Gene),34,315(1985)等描述的定点诱变方法产生这样的蛋白质,该蛋白质包含的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被删除、替换或添加,并且具有甘露糖异构酶活性。
根据上述方法产生的蛋白质的实例为那些通过将编码具SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列之蛋白质的DNA中导入一种定点诱变,从而获得的蛋白质。
对被删除、替换或添加的氨基酸残基数没有明确的限制,但是优选的范围为一至几十个氨基酸,更优选的为一至几个氨基酸。
(2)一种编码蛋白质的DNA,其中蛋白质由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
(3)一种编码蛋白质的DNA,蛋白质包括一种氨基酸序列,其中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被删除、替换或添加,并且具有甘露糖异构酶活性。
(4)一种DNA,其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
(5)一种DNA,其在严格条件下可与根据上述(2)-(4)中任意一项所述的DNA杂交,并且编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质。
此处所用的表述“可在严格条件下杂交的DNA”指的是以上述(2)-(4)中任意一项所述的DNA作为探针,通过集落杂交、空斑杂交、Southern杂交等而得到的DNA。这样的DNA可如下鉴定例如,在65℃、0.7-1.0M NaCl存在时,与固定有集落-或者空斑-来源之DNA的滤膜杂交,然后用0.1至2倍浓度的SSC溶液65℃洗膜(1倍浓度的SSC溶液:150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)。
通过实验室手册中描述的方法进行杂交,如分子克隆,第二版;分子生物学最新方法;以及DNA克隆1:核心技术,实用方法,第二版,牛津大学(DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University)(1995)。可杂交的DNA是例如,与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少有80%同源性的DNA,优选地95%或更高同源性的DNA。
(6)一种重组DNA,其通过将上述(2)-(5)中任意一项所述的DNA插入载体而获得。
(7)一种转化子,其通过将上述(6)的重组DNA导入宿主细胞而获得。
(8)根据上述(7)的转化子,其为大肠杆菌。
(9)一种产生具甘露糖异构酶活性之蛋白质的方法,其包括在培养基中培养根据上述(7)或(8)之转化子,在培养物中形成并累积具甘露糖异构酶活性的蛋白质,以及从培养物中回收蛋白质。
(10)一种产生果糖的方法,其包括使水性培养基中存在以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及甘露糖,从而在水性培养基中形成并累积果糖,以及从水性培养基中回收果糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
(11)一种产生甘露糖的方法,其包括使水性培养基中存在以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及果糖,从而在水性培养基中形成并累积甘露糖,以及从水性培养基中回收甘露糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
(12)一种产生木酮糖的方法,其包括使水性培养基中存在以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及来苏糖,从而在水性培养基中形成并累积木酮糖,以及从水性培养基中回收木酮糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
(13)一种产生来苏糖的方法,其包括使水性培养基中存在以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及木酮糖,从而在水性培养基中形成并累积来苏糖,以及从水性培养基中回收来苏糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
(14)根据上述(10)-(13)中任意一项所述的方法,其中转化子是根据上述(7)或(8)的转化子。
对本发明的详述如下。
[1]制备编码甘露糖异构酶的DNA
编码甘露糖异构酶的DNA可从埃希氏菌属的微生物中制备。合适的埃希氏菌属的微生物实例有大肠杆菌、蟑螂埃希氏菌(Escherichiablattae)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫曼氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、中间埃希氏菌(Escherichiaintermedia)、伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)等,尤其是大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、蟑螂埃希氏菌ATCC33430、弗格森埃希氏菌ATCC 35473、赫曼氏埃希氏菌ATCC 33652、中间埃希氏菌ATCC 20173、伤口埃希氏菌ATCC 39368等。
根据公知的方法(例如:分子生物学最新方法)培养埃希氏菌属的微生物,并且分离、纯化微生物的染色体DNA。
由于大肠杆菌染色体DNA的序列已被确定[科学,277,1453(1997)],根据耶鲁大学数据库,大肠杆菌基因原种中心(http://cgsc.biology.Yale.edu),可以推断甘露糖异构酶基因大约存在于染色体的87.6分钟处。
在上述信息的基础上,包含编码来自埃希氏菌属微生物的甘露糖异构酶之DNA片段可通过PCR获得[PCR方法(PCR Protocols),学术出版社(Academic Press)(1990)],所用引物根据大肠杆菌染色体上约87.6分钟处的核苷酸序列制备,模板为基因组DNA。
以根据基因组核苷酸序列设计的合成DNA作为探针,也可通过例如,杂交获得编码甘露糖异构酶的DNA。
将所获得的DNA(如原样或用合适的限制性酶切割后)用传统方法插入载体,然后用通常的核苷酸序列分析方法测定DNA的核苷酸序列,例如,用373A DNA测序仪(Perkin-Elmer公司)或类似仪器双脱氧法测序[美国国家科学院院报,74,5463(1977)]。
可插入上述DNA的合适载体包括pBluescript KS+(Strategene)、pDIRECT[核酸研究,18,6069(1990)]、pCR-Script Amp SK+(Strategene)、pT7Blue(Novagen)、pCR II(Invitrogen)、pCR-TRAP(GenHunter)、pNotAT7(5Prime→3Prime)等。
通过上述方法获得的具核苷酸序列的DNA的实例为具SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA。
携带包含SEQ ID NO:2所示序列之DNA的质粒的大肠杆菌菌株的一个实例为大肠杆菌NM522/pYP27。
根据已测定的DNA核苷酸序列,也可使用DNA合成仪(例如,DNASynthesizer Model 8905,PerSeptive Biosystems),用化学合成法制备靶DNA。
可按照任一将DNA导入上述宿主细胞的方法进行重组DNA的导入,例如,钙离子法[美国国家科学院院报,69,2110(1972)]、原生质体法(日本公开未审专利申请No.248394/88)以及电穿孔法[核酸研究,16,6127(1988)]。
[2]制备本发明的蛋白质
例如,按照以下方法,通过在宿主细胞中表达编码具甘露糖异构酶活性的DNA而产生具甘露糖异构酶活性的蛋白质,其中DNA如上述[1]描述的方法获得。
基于编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA,并且如上述[1]描述的方法,获得的DNA,根据需要来制备合适长度的DNA片段,其包含编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质的区域。
进一步地,用于提高具甘露糖异构酶活性的蛋白质生产效率的DNA可如下制备:通过对编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质区域的核苷酸序列中进行核苷酸置换,以获得最适于在宿主细胞中表达的密码子。
将上述DNA片段或者全长的DNA插入合适的表达载体之启动子的下游,构建重组DNA。
然后,将重组DNA导入适合于表达载体的宿主细胞,由此可获得转化子,它可产生具甘露糖异构酶活性的蛋白质。
至于宿主细胞,任何表达目标基因的原核细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等均可使用。动物和植物也可用作宿主。
可使用的表达载体是那些能在上述宿主细胞中自主复制或能整合于上述宿主细胞的染色体中的载体,并且包含一种启动子,其所在位置适于转录编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA。
当原核细胞如细菌细胞用作宿主时,表达上述DNA的表达载体优选是能在原核细胞中自主复制的表达载体,其中还包含启动子、核糖体结合序列、上述DNA和转录终止序列。进一步地,载体还包含调节启动子的基因。
合适的表达载体的实例为pBTrp2、pBTac1和pBTac2(均可从Boehringer Mannheim购得)、pKK233-2(Pharmacia)、pSE280(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(QIAGEN)、PQE-30(QIAGEN)、pKYP10(日本公布的未检验专利申请No.110600/83)、pKYP200[农业与生物化学,48,669(1984)]、pLSA1[农业与生物化学,53,277(1989)]、pGEL1[美国国家科学院院报,82,4306(1985)]、pBluescript II SK+(Stratagene)、pBluescript IISK-(Stratagene)、pTrs30(FERM BP-5407)、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM BP-400)、pGKA2(FERM BP-6798)、pTerm2(日本公开未审专利申请No.22979/91,US4686191,US4939094,US5160735),pEG400[细菌学杂志(J.Bacteriol.),172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia)、pET系统(Novagen)、pSupex、pUBl10、pTP5、pC194、pTrxFus(Invitrogen)、pMAL-c2(New England Biolabs)、pUC18[基因(Gene),33,103(1985)]、pUC19[基因,33,103(1985)]、pSTV29(Takara Shuzo Co.,Ltd.)、pSTV28(Takara Shuzo Co.,Ltd.)、pUC118(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和pPA1(日本公开未审专利申请No.233798/88)。
作为启动子,可用任一能在宿主细胞中发挥作用的启动子。例如,来自大肠杆菌或者噬菌体的启动子,如trp启动子(Ptrp)、1ac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子和PSE启动子、SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子。也可用经人工修饰的启动子,如将两个Ptrps串联后得到的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、1acT7启动子和1etI启动子等。
已将SD序列(核糖体结合序列)与起始密码子之间的距离调节至合适长度(例如,6-18个碱基)的质粒为优选使用的质粒。
转录终止序列对表达目的DNA并不关键,但是优选转录终止序列紧紧位于结构基因的下游。
合适的宿主细胞的实例为属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、芽胞杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、着色菌属(Chromatium)、欧文氏菌属(Erwinia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、Scenedesmun、链霉菌属(Streptomyces)、Synnecoccus和发酵单胞菌属(Zymomonas)的微生物细胞。优选属于埃希氏菌属、芽胞杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、脂环酸杆菌属、鱼腥蓝细菌属、组囊蓝细菌属、节杆菌属、固氮菌属、着色菌属、欧文氏菌属、甲基杆菌属、席蓝细菌属、红细菌属、红假单胞菌属、红螺菌属、Scenedesmun、链霉菌属、Synnecoccus和发酵单胞菌属的微生物细胞。
上述微生物的特定实例为大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC 6872、Brevibacterium immariophilumATCC 14068、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)ATCC 13825、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC 19240、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)ATCC 15991、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium lilium)ATCC 15990、Corynebacterium melassecola ATCC 17965、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354、假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaenacylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaena doliolum)、水华鱼腥蓝细菌(Anabaena flos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globformis)、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)、原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)、巴氏着色菌(Chromatium buderi)、微温着色菌(Chromatium tepidum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、沃氏着色菌(Chromatium warmingii)、(Chromatium fluviatile)、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、Erwinia punctata、Erwinia terreus、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脱甲基杆菌(Meylobacterium extorquens)、席蓝细菌(Phormidium sp.)ATCC29409、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonasblastica)、海红红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)、血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、需盐红螺菌(Rhodospirillumsalexigens)、盐厂红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomycesolivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashienesis)、葡萄色链霉菌(Streptomycesvinaceus)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
采用任一将DNA导入上述宿主细胞的方法进行重组DNA的导入,例如,电穿孔法[核酸研究,16,6127(1988)]、钙离子法[美国国家科学院院报,69,2110(1972)]、原生质体法(日本公布的未检验专利申请No.248394/88)以及在基因,17,107(1982)和分子与普通遗传学(Molecular&General Genetics.),168,111(1979)中描述的方法。
当酵母细胞用作宿主细胞时,可用YEp13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)、pHS19、pHS15等作为表达载体。
作为启动子,可用任一能在酵母细胞中发挥作用的启动子。合适的启动子包括PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等。
合适的宿主细胞的实例为属于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)等的酵母菌株细胞。尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和产朊假丝酵母(Candida utilis)。
采用任一将DNA导入酵母细胞的方法进行重组DNA的导入,例如电穿孔法[酶学方法(Methods in Enzymol.),194,182(1990)]、原生质体法[美国国家科学院院报,75,1929(1978)]、醋酸锂法[细菌学杂志,153,163(1983)]以及在美国国家科学院院报,75,1929(1978)]中描述的方法。
当动物细胞用作宿主细胞时,可用pcDNA I/Amp、pcDNA I和pDM8(均可从Funakoshi获得)、pAGE107[日本公开未审专利申请No.22979/91;细胞技术(Cytotechnology),3,133(1990)]、pREP4(Invitrogen)、pAGE103[生物化学杂志(J.Biochem.),101,1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA[生物学和化学杂志,268,22782-227879(1993),另一名称:pAMoPRSA(日本公开未审专利申请No.336963/93)]、pAS3-3(日本公开未审专利申请No.227075/90)等作为表达载体。
作为启动子,可用任一能在动物细胞中发挥作用的启动子。合适的启动子包括巨细胞病毒(人CMV)IE(即时早期)基因的启动子、SV40早期启动子、莫洛尼鼠类白血病病毒的长末端重复启动子、反转录病毒启动子、热休克启动子、SRα启动子、金属硫蛋白启动子等。人CMV IE基因的增强子可与启动子联合使用。
合适的宿主细胞的实例为小鼠骨髓瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠杂交瘤细胞、中国仓鼠来源的CHO细胞、BHK细胞、非洲绿猴肾细胞、人源Namalwa细胞和Namalwa KJM-1细胞、人胚胎肾细胞、人白血病细胞、HBT5637(日本公开未审专利申请No.299/88)和人大肠肿瘤细胞株。
小鼠骨髓瘤细胞包括SP2/0、NSO等;大鼠骨髓瘤细胞包括YB2/0等;人胚胎肾细胞包括HEK293(ATCC:CRL-1573)等;人白血病细胞包括BALL-1等;非洲绿猴肾细胞包括COS-1、COS-7等;人大肠肿瘤细胞株包括HCT-15等。
可根据任一将DNA导入动物细胞的方法将重组DNA导入动物细胞,例如,电穿孔法[细胞技术,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本公布的未检验专利申请No.227075/90)、脂质体法[美国国家科学院院报,84,7413(1987)]以及在病毒学(Virology),52,456(1973)中描述的方法。
当昆虫细胞被用作宿主细胞时,可使用在杆状病毒表达载体,实验室手册(Baculavirus Expression Vectors,A LaboratoryManual),W.H.Freeman和Company,纽约(1992);分子生物学,实验室手册;分子生物学最新方法,增刊1-38;生物/技术(Bio/Technology),6,47(1988)等中描述的方法表达蛋白质。
就是说,将重组基因转移载体和杆状病毒共转染入昆虫细胞后,在昆虫细胞的培养上清液中,可获得重组病毒,然后用重组病毒感染昆虫细胞,由此蛋白质可被表达。
适用于这种方法的基因转移载体的实例有pVL1392、pVL1393和pBlueBacIII(Invitrogen产品)。
杆状病毒的实例为苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus),它属于Barathra科的一种可感染昆虫的病毒。
昆虫细胞的实例为秋粘虫(Spodoptera frugiperdade)卵巢细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢细胞以及蚕卵巢来源的细胞系。
秋粘虫卵巢细胞包括sf9、sf21(杆状病毒表达载体,实验室手册)等;粉纹夜蛾卵巢细胞包括High 5、BTI-TN-5B1-4(Invitrogen)等;以及蚕卵巢来源的细胞系包括Bombyx mori N4等。
采用磷酸钙法(日本公开未审专利申请No.227075/90)、脂质体法[美国国家科学院院报,84,7413(1987)]等将上述重组基因转移载体和上述杆状病毒共转染入昆虫细胞,制备重组病毒。
采用将DNA导入动物细胞同样的方法也可将DNA导入昆虫细胞。例如,电穿孔法[细胞技术,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本公布的未检验专利申请No.227075/90)和脂质体法[美国国家科学院院报,84,7413(1987)]。
当植物细胞或植物用作宿主时,可根据公知的方法产生蛋白质[组织培养(Soshiki Baiyo),20(1994);组织培养,21(1995);生物技术趋势(Trends in Biotechnology),15,45(1997)].
有用的表达载体包括Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。
作为基因表达的启动子,可用任一能在植物细胞中发挥作用的启动子。合适的启动子包括花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaicvirus;CaMV)35S启动子、稻肌动蛋白1启动子等。可通过在启动子和欲表达基因之间插入玉米乙醇脱氢酶基因的内含子I或类似物增加基因的表达效率。
合适的宿主细胞的实例为土豆、烟草、玉米、水稻、油菜、黄豆作物、番茄、胡萝卜、小麦、大麦、燕麦、苜蓿和亚麻等植物的细胞。
采用任一将DNA导入植物细胞的方法进行重组DNA的导入。例如,土壤杆菌属法(Agrobacterium)(日本公开未审专利申请No.251887/85)以及使用粒子枪(基因枪)的方法(日本专利Nos.2606856和2517813)。
可用罐式(jar)发酵器大量培养携带有导入基因的植物细胞或器官。
用于培养的合适的培养基包括常用的培养基,如Murashige-Skoog(MS)培养基和White培养基,以及向这些培养基中加入植物激素(如生长素和细胞分裂素)而制备的培养基。
通常在pH5-9、20-40℃下,培养3-60天。
如果有必要的话,在培养过程中,可将抗生素(如卡那霉素和潮霉素)加至培养基中。
进一步地,可以使携带有导入基因的植物细胞再分化从而产生具有导入基因的植物(转基因植物)。
用动物产生目标蛋白质也是可能的。例如,根据公知的方法[美国临床营养学杂志(American Journal of ClinicalNutrition),63,639S(1996);美国临床营养学杂志,63,627S(1996);生物/技术,9,830(1991)],携带有导入基因的动物可产生目标蛋白质。
作为启动子,可用任一能在动物中发挥作用的启动子。优选的启动子包括乳腺细胞特异的启动子,例如α酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子和乳清酸性蛋白启动子。
可根据传统的培养方法,通过培养携带有包含编码蛋白质之DNA的重组载体的转化子而产生目标蛋白质,使蛋白质可形成并累积,从培养物中回收蛋白质,其中转化子源自微生物、动物细胞或植物细胞。
当转化子是动物或植物时,可通过常用方式培育或培养动物或植物,产生蛋白质,使蛋白质在体内形成并累积,然后从动物或植物中回收蛋白质。
在是动物的情况下,可产生具甘露糖异构酶活性的蛋白质,方法是例如,通过培育携带编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA的非人转基因动物,使得在动物中形成并累积重组DNA编码的蛋白质,从动物中回收蛋白质。形成并累积蛋白质的地方包括动物的乳、卵等。
在是植物的情况下,可产生具甘露糖异构酶活性的蛋白质,方法是例如,通过培养携带编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA的转基因植物,使得在植物中形成并累积重组DNA编码的蛋白质,从植物中回收蛋白质。
当用于产生本发明之具甘露糖异构酶活性的蛋白质的转化子为原核生物,如大肠杆菌;或为真核生物,如酵母时,可通过在培养基中培养转化子,并使具甘露糖异构酶活性的蛋白质在培养物中形成并累积,从培养物中回收蛋白质,从而产生具甘露糖异构酶活性的蛋白质。
可用培养转化子宿主的传统方法培养本发明的转化子。
当培养以原核生物(如大肠杆菌)或真核生物(如酵母)作为宿主而制备的转化子时,可用至今所用的任一天然培养基和合成培养基,只要培养基适于转化子的有效培养,含有可被所用宿主同化的碳源、氮源、无机盐等即可。
作为碳源,可用任一可被宿主同化的碳源。合适的碳源的实例包括糖,如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖浆、淀粉和淀粉水解物;有机酸,如乙酸和丙酸;以及醇类,如乙醇和丙醇。
作为氮源,可用氨、多种有机酸或无机酸的铵盐,如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵、以及其它含氮化合物,还可用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆饼、大豆饼水解物和各种发酵过的微生物细胞和其消化产物。
无机盐的实例包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
例如,于15-40℃在有氧条件下振荡培养或者在通气情况下浸没旋转培养,通常培养5小时至7天。培养过程中,pH维持在3.0-9.0。通过使用有机酸或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等对pH进行调节。
如果有必要的话,在培养过程中,可将抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素加至培养基中。
当培养用包含可诱导的启动子的表达载体转化的微生物时,如果有必要的话,可向培养基中加入诱导物。例如,当微生物是用包含1ac启动子的表达载体转化时,可向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或其类似物;当微生物是用包含trp启动子的表达载体转化时,可向培养基中加入吲哚乙酸(IAA)或其类似物。
当培养以动物细胞作为宿主细胞而制备的转化子时,常用的培养基如RPMI 1640培养基[美国医学协会杂志(The Journal of theAmerican Medical Association),199,519(1967)、Eagle’s MEM[科学,122,501(1952)]、DMEM[病毒学,8,396(1959)]和199培养基[生物医学学会报告(Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine),73,1(1950)]、向这些培养基中加入胎牛血清或类似物制备的培养基等均可用作培养基。
通常在5%CO2存在下,于pH6-8,25-40℃培养1-7天。
如果有必要的话,在培养过程中,可将抗生素如卡那霉素、青霉素和链霉素加至培养基中。
当培养以昆虫细胞作为宿主细胞而制备的转化子时,常用的培养基如TNM-FH培养基(Pharmingen)、Sf-900II SFM培养基(Gibco BRL)、ExCell 400和ExCell 405(JRH Biosciences)以及Grace’s InsevtMedium[Grace,T.C.C.,自然(Nature),195,788(1962)]均可用作培养基。
通常在pH6-7,25-30℃培养1-5天。
如果有必要的话,在培养过程中,可将抗生素如庆大霉素加至培养基中。
上述的具甘露糖异构酶活性的全长蛋白质或者包含具甘露糖异构酶活性区(催化域)的部分多肽可根据分子克隆,第二版等描述的方法直接表达为分泌蛋白质或者融合蛋白质。被融合的蛋白质的实例包括β-半乳糖苷酶、蛋白质A、蛋白质A的IgG结合区、氯霉素乙酰转移酶、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、蛋白质G、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、多聚组氨酸链(His-标签)、S-肽、DNA结合蛋白域、Tac抗原、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白以及任一抗体表位[AkioYamakawa,实验医学(Jikken Igaku),13,469-474(1995)]。
具甘露糖异构酶活性的蛋白质可以在宿主细胞的细胞内产生、也可分泌至细胞外或产生在宿主细胞的外膜上。可根据所用宿主细胞的种类或者通过对具甘露糖异构酶活性的蛋白质的结构进行改变来选择这些产生方式。
当具甘露糖异构酶活性的蛋白质产生在宿主细胞内或产生在宿主细胞的外膜上时,根据Paulson等人的方法[生物与化学杂志,264,17619(1989)]、Lowe等人的方法[美国国家科学院院报,86,8227(1989);基因进展(Genes Develop.),4,1288(1990)]或者日本公开未审专利申请No.336963/93,WO94/23021等描述的方法,可能会使具甘露糖异构酶活性的蛋白质分泌至胞外。
就是说,通过重组DNA技术,将信号肽加至包含具甘露糖异构酶活性之蛋白质活性位点的多肽的上游,能引起宿主细胞对具甘露糖异构酶活性的蛋白质的胞外分泌。进一步地,也可将用于纯化和检测的标签添加在信号肽和包含催化域的多肽之间,或者添加在包含催化域的多肽的C端。
适用于纯化和检测的标签包括β-半乳糖苷酶、蛋白质A、蛋白质A的IgG结合区、氯霉素乙酰转移酶、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、蛋白质G、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、多聚组氨酸链(His-标签)、S-肽、DNA结合蛋白域、Tac抗原、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白以及任一抗体表位[Akio Yamakawa,实验医学,13,469-474(1995)]。
根据日本公开未审专利申请No.227075/90中描述的方法,使用二氢叶酸还原酶基因或类似的基因扩增系统可能提高蛋白质的产量。
用传统的分离和纯化酶的方法,可从产生具甘露糖异构酶活性之蛋白质的转化子培养物中分离和纯化本发明的多肽。
例如,当具甘露糖异构酶活性的蛋白质以可溶形式累积在转化子细胞中时,通过离心并且洗涤,从培养物收获细胞,然后用超声波仪、弗氏压碎仪、Manton Gaulin匀浆器、Dynomill或类似装置获得无细胞提取液。
离心无细胞提取液,取上清,然后将上清用溶剂提取,硫酸铵盐析等,脱盐,用有机溶剂沉淀,用树脂如二乙氨乙基-琼脂糖(DEAE-Sepharose)和DIAION HPA-75(Mitsubishi Kasei Corporation)阴离子交换层析、用树脂如S-琼脂糖FF(S-Sepharose FF)(Pharmacia)阳离子交换层析、用树脂如丁基琼脂糖和苯基琼脂糖疏水层析、用分子筛进行凝胶过滤、亲和层析、层析聚焦、电泳如等电聚焦等等,可获得纯化的蛋白质制品。
当具甘露糖异构酶活性的蛋白质在细胞内以包涵体形式表达,对细胞进行相似的收获和破碎,然后离心,获得沉淀部分。用常规方法从沉淀部分回收具甘露糖异构酶活性的蛋白质后,将具甘露糖异构酶活性的蛋白质的包涵体用蛋白质变性剂溶解。将已溶解蛋白质的溶液用不包含蛋白质变性剂的溶液稀释,或透析,或用含低浓度、不至于引起蛋白质变性的蛋白质变性剂溶液稀释或透析,由此使具甘露糖异构酶活性的蛋白质恢复正常的三级结构。然后,用上述同样的分离和纯化步骤可得到纯化的蛋白质制品。
当具甘露糖异构酶活性的蛋白质分泌至胞外时,通过如离心处理培养物,得到可溶性部分。用上述的从无细胞提取液上清中分离和纯化同样的方式,从可溶性部分可得到具甘露糖异构酶活性的纯化的蛋白质制品。
本发明也可产生多肽,如与另一个蛋白质的融合蛋白质,且利用与融合蛋白质有亲和性的底物进行亲和层析,纯化此蛋白质[AkioYamakawa,实验医学,13,469-474(1995)]。
例如,根据Lowe等人的方法[美国国家科学院院报,86,8227(1989);基因进展(Genes Develop.),4,1288(1990)]以及日本公开未审专利申请No.336963/93,WO94/23021等描述的方法,具甘露糖异构酶活性的蛋白质可与蛋白质A以融合蛋白质的形式产生,并可用免疫球蛋白G进行亲和层析而纯化。
进一步地,具甘露糖异构酶活性的蛋白质可与FLAG肽以融合蛋白质的形式产生,并可用抗FLAG抗体进行亲和层析纯化[美国国家科学院院报,86,8227(1989);基因进展,4,1288(1990)]。
具甘露糖异构酶活性的蛋白质也可用抗该蛋白质自身的抗体亲和层析纯化。
根据公知的方法[J.Biomolecular NMR,6,129(1995);科学,242,1162(1988);生物化学杂志,110,166(1991)],用体外转录-翻译系统也可产生本发明的多肽。
基于上述获得的具甘露糖异构酶活性的蛋白质的氨基酸信息,可用化学合成方法产生具甘露糖异构酶活性的蛋白质,如Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)。
进一步地,可用Advanced ChemTech、Perkin-Elmer、PharmaciaBiotech、Protein Technology Instrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、Shimadzu Corporation等生产的肽合成仪化学合成蛋白质。
[3]果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖的生产
根据上述[2]描述的培养而获得的转化子培养物或其处理物可作为酶源,分别在水性培养基中生产果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖(此后有时称为本发明的生产)。
培养物的处理物包括浓缩的培养物、干燥的培养物、培养物离心收获的细胞、用各种方法处理细胞得到的产物,如干燥、冷冻干燥、表面活性剂处理、超声处理、机械摩擦处理、溶剂处理、酶处理、蛋白质分级分离和固定、提取细胞获得酶制品等。
在本发明的生产时,使用的酶源浓度为1mU/l-1000U/l,优选地10mU/l-100U/l,1单位(U)定义为37℃下1分钟内形成1毫摩尔的果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖的活性。
本发明的生产使用的水性培养基包括水;缓冲液,如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸酸盐缓冲液和Tris缓冲液;醇类,如甲醇、乙醇;酯类,如乙酸乙酯;酮类,如丙酮;酰胺类,如乙酰胺等。用作酶源的微生物培养物也可用作水性培养基。
如果有必要的话,在本发明的生产时,可加入表面活性剂或者有机溶剂。任一促进果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖形成的表面活性剂均可用。合适的表面活性剂包括非离子型表面活性剂,如聚氧乙烯十八烷基胺(例如,Nymeen S-215,NOF Corporation)、阳离子型表面活性剂如鲸蜡三甲基溴化铵和烷基二甲基苄基氯化铵(例如,CationF2-40E,NOF Corporation)、阴离子型表面活性剂如月桂酰肌氨酸酯和叔胺如烷基二甲基胺(例如,Tertiary Amine FB,NOF Corporation),它们可以单独使用或联合使用。表面活性剂的常用浓度为0.1-50g/l。至于有机溶剂,可使用如二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、乙酸乙酯等,常用浓度为0.1-50ml/l。
在pH5-10的水性培养基中进行本发明的生产反应,优选地,在pH6-8,20-60℃下反应1-96小时。如果有必要的话,可向反应中加入无机盐(例如MgCl2)等。
用糖分析系统(Dionex)或类似系统[生物化学年鉴(Anal.Biochem),189,151(1990)]测定水性培养基中形成的果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖。
用活性炭、离子交换层析等常规方法从反应混合物中回收所形成的果糖、甘露糖、木酮糖和来苏糖。
附图简述
图1给出了构建表达具甘露糖异构酶活性的质粒的过程。图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Ptrp表示色氨酸启动子,yihS表示甘露糖异构酶基因。
进行本发明的最佳模式
本发明的实施例如下所示。本发明的范围不限于用于解释的这些
实施例。
实施例1构建表达编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA的菌株,该菌株来源于大肠杆菌。
根据公知的方法[例如,分子生物学最新方法,John Wiley &Sons(1987-1997)]培养大肠杆菌W3110(ATCC 27325),分离并纯化其染色体DNA。
基于已知的大肠杆菌染色体DNA的核苷酸序列信息[科学,277,1453(1997)],耶鲁大学推断的甘露糖异构酶基因在染色体上的定位信息和一个未知功能的基因位于大肠杆菌染色体的87.7分钟处的信息,用DNA合成仪(Model 8905,PerSeptive Biosystems)合成DNA引物,一条具SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,另一条具SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
用上述合成的DNA作为一对引物,以大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板进行PCR。
就是说,PCR进行30个循环,每个循环由94℃反应1分钟,42℃反应2分钟,72℃反应3分钟组成。所用的40μl反应混合液包含0.1μg染色体DNA、每条引物0.5μmol/l、2.5单位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)、4μl Pfu DNA聚合酶缓冲液(10-倍)(Stratagene)以及每种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)分别200μmol/l。
取所得反应混合液的十分之一用于琼脂糖凝胶电泳,以确证基于引物的DNA片段被扩增。然后,将剩余的反应混合液与等体积的TE[10mmol/l Tris-HCl(pH8.0),1mmol/l EDTA]饱和的酚/氯仿(1体积/1体积)混匀。
对所得混合液进行离心,取上层,与两倍体积的冷乙醇混匀,于-80℃放置30分钟。
对所得混合液进行离心,获得DNA沉淀。
将DNA沉淀溶于20μl TE,取5μl溶液用于DNA的切割反应,限制性酶为Cla I和BamH I,琼脂糖电泳分离DNA片段,用Gene CleanII试剂盒回收1.3kb的片段。pTrS30 DNA(0.2μg)用限制性酶Cla I和BamH I酶切,琼脂糖电泳分离DNA片段,以同样方式回收4.2kb的片段。
用连接试剂盒将上面得到的1.3kb片段和4.2kb片段于16℃,连接16小时。根据上述公知的方法,用连接混合液转化大肠杆菌NM522,涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上,于30℃过夜培养。
根据上述公知的方法,从生长在培养基上的转化子菌落提取质粒,由此获得表达质粒pYP27。通过限制性酶消化证实所得到的质粒结构是正确的(图1)。此后将携带质粒的转化子称为大肠杆菌NM522/pYP27。
实施例2
甘露糖、果糖、木酮糖和来苏糖的生产
将实施例1得到的大肠杆菌NM522/pYP27接种于大试管中的8ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,于28℃培养17小时。
所得到的培养物按1%的量接种于大试管中的8ml含50μg/ml氨苄青霉素的M9培养基中,于37℃培养7小时。
所得到的培养物离心,收获湿细胞。
湿细胞可贮存在-20℃,并可根据需要,融化后使用。
向包含100mmol/l Tris-HCl(pH7.5),50mmol/l MgCl2和0.4%Nymeen S-215的溶液中,分别加入100mmol/l果糖制备生产甘露糖的反应混合液,加入100mmol/l甘露糖制备生产果糖的反应混合液,加入100mmol/l来苏糖制备生产木酮糖的反应混合液,以及加入100mmol/l木酮糖制备生产来苏糖的反应混合液。
向0.1ml每个制备好的反应混合液中加入上面所获得的湿细胞,使其终浓度为60mg/ml,然后37℃反应1小时。
反应结束后,用糖分析系统(DX-500,Dionex)分析反应产物。
在各自的反应混合物中,分别形成并累积了21.9mmol/l甘露糖、74.4mmol/l果糖、70.4mmol/l木酮糖、24.4mmol/l来苏糖。
只携带载体的大肠杆菌NM522/pTrS30没有形成任何糖类。
工业适用性
根据本发明,通过重组DNA技术可大量生产甘露糖异构酶。用该酶可有效生产甘露糖、果糖、木酮糖和来苏糖。
[列在Free Text的序列]SEQ ID NO:3-对人造序列的描述:合成DNA。SEQ ID NO:4-对人造序列的描述:合成DNA。
Claims (14)
1.一种由氨基酸序列组成的蛋白质,其中SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被删除、替换或添加,并且具有甘露糖异构酶活性。
2.一种编码蛋白质的DNA,其中蛋白质由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
3.一种编码由氨基酸序列组成的蛋白质之DNA,其中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被删除、替换或添加,并且具有甘露糖异构酶活性。
4.一种DNA,其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
5.一种DNA,其在严格条件下可与根据权利要求2-4中任意一项所述的DNA杂交,并且编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质。
6.一种重组DNA,其通过将权利要求2-5中任意一项所述的DNA插入载体而获得。
7.一种转化子,其通过将权利要求6的重组DNA导入宿主细胞而获得。
8.根据权利要求7的转化子,其为大肠杆菌。
9.一种产生具甘露糖异构酶活性之蛋白质的方法,其包括在培养基中培养根据权利要求7或8的转化子,使得在培养物中形成并累积具甘露糖异构酶活性的蛋白质,以及从培养物中回收蛋白质。
10.一种产生果糖的方法,其包括使水性培养基中存在以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及甘露糖,从而在水性培养基中形成并累积果糖,以及从水性培养基中回收果糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
11.一种产生甘露糖的方法,其包括使水性培养基中存在以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及果糖,从而在水性培养基中形成并累积甘露糖,以及从水性培养基中回收甘露糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
12.一种产生木酮糖的方法,其包括使水性培养基中存在以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及来苏糖,从而在水性培养基中形成并累积木酮糖,以及从水性培养基中回收木酮糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
13.一种产生来苏糖的方法,其包括使水性培养基中,以转化子的培养物或其处理物作为酶源以及木酮糖,从而在水性培养基中形成并累积来苏糖,以及从水性培养基中回收来苏糖;其中所述转化子是通过导入编码具甘露糖异构酶活性的蛋白质之DNA而获得的。
14.根据权利要求10-13中任意一项所述的方法,其中转化子是根据权利要求7或8的转化子。
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