WO2000065072A1 - Nouvelle mannose isomerase et adn codant pour cette enzyme - Google Patents

Nouvelle mannose isomerase et adn codant pour cette enzyme Download PDF

Info

Publication number
WO2000065072A1
WO2000065072A1 PCT/JP2000/002545 JP0002545W WO0065072A1 WO 2000065072 A1 WO2000065072 A1 WO 2000065072A1 JP 0002545 W JP0002545 W JP 0002545W WO 0065072 A1 WO0065072 A1 WO 0065072A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
dna
mannose
aqueous medium
isomerase activity
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/002545
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Satoshi Koizumi
Kazuhiko Tabata
Tetsuo Endo
Akio Ozaki
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority to EP00917363A priority Critical patent/EP1172440A4/en
Priority to AU38395/00A priority patent/AU3839500A/en
Priority to US09/958,548 priority patent/US6673581B1/en
Publication of WO2000065072A1 publication Critical patent/WO2000065072A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01007—Mannose isomerase (5.3.1.7)

Definitions

  • the present invention relates to a protein having a mannose isomerase activity, a DNA encoding the protein, a recombinant DNA containing the DNA, a transformant carrying the recombinant DNA, and a mannose isomerase using the transformant. And a method for producing fructose, mannose, xylulose and lyxose using the transformant.
  • Mannose isomerase derived from Escherichia coli has been purified and its properties have been investigated [J. Gen. Microbiol., 124, 219 (1981)], but the amino acid sequence of the enzyme has not been analyzed. .
  • Escherichia coli the nucleotide sequence of the chromosomal DNA has been determined [Science, ⁇ , 1453 (1997)], and the DNA sequence of the E. coli Genetic Stock Center at Yale University (http: // cgsc. biology. yale. edu), it is estimated that the mannosisomerase gene is located at about 87.6 minutes on the chromosome. However, the gene has not been identified and has not been isolated.
  • An object of the present invention is to provide a protein having mannose isomerase activity, a DNA encoding the protein, a method for producing a protein having mannose isomerase activity using the DNA, and a method using the protein. It is to provide an efficient method for producing fructose, mannose, xylulose, and lyxose.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, succeeded in isolating DNA encoding mannose isomerase from a microorganism belonging to the genus Escherichia, and utilizing the DNA. As a result, it was found that sugars such as mannose can be efficiently produced, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following (1) to (11).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and which has a mannose isomerase activity.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having mannose isomerase activity is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). (Hereinafter abbreviated as molecular 'cloning second edition'), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as current 'protocols' in 'molecular' biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Proc. Natl. Acad.
  • Specific examples of the protein prepared by the method include a protein obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Can be.
  • amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, one to several tens, particularly one to several amino acids are preferable.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to the DNA described in any one of the above (2) to (4) as a probe, a colony hybridization method, and a plaque hybridization method.
  • Hybridization is available from Molecular 'Clothing 2nd Edition, Current' Protocols 'In''Molecular' Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. It can be performed according to the method described in the experiment book.
  • Specific examples of the hybridizable DNA include a DNA having at least 80% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably a DNA having at least 95% homology.
  • SEQ ID NO: 2 preferably a DNA having at least 95% homology.
  • a transformant obtained by introducing the recombinant DNA according to (6) into a host cell A transformant obtained by introducing the recombinant DNA according to (6) into a host cell.
  • a culture solution of a transformant obtained by introducing DNA encoding a protein having a mannose isomerase activity or a processed product of the culture solution is used as an enzyme source, and the enzyme source and mannose are used in an aqueous medium. And producing fructose in the aqueous medium, and collecting fructose from the aqueous medium.
  • a culture solution of a transformant obtained by introducing a DNA encoding a protein having a mannose isomerase activity or a processed product of the culture solution is used as an enzyme source, and the enzyme source and fructose are dissolved in an aqueous medium.
  • a culture solution of a transformant obtained by introducing a DNA encoding a protein having mannose isomerase activity or a processed product of the culture solution the enzyme source and lyxose are used.
  • a method for producing xylulose wherein xylulose is produced in an aqueous medium, xylulose is produced and accumulated in the aqueous medium, and xylulose is collected from the aqueous medium.
  • a culture solution of a transformant obtained by introducing DNA encoding a protein having a mannose isomerase activity or a processed product of the culture solution is used as an enzyme source, and the enzyme source and xylulose are present in an aqueous medium.
  • Lyxose wherein lyxose is produced and accumulated in the aqueous medium, and lyxose is collected from the aqueous medium. Manufacturing method of raw materials.
  • DNA encoding mannose isomerase can be prepared from a microorganism belonging to the genus Escherichia.
  • a microorganism belonging to the Eshierihia genus Escherichia col i, Escherichia blattae, Eschencnia fergusoni i, Escherichia hermannii Escherichia intermedia ⁇ Escherichia such as Ki de be mentioned vulneris, specifically Escherichia coli XL1-Blue s Escherichia coli XL2-Blue,
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia is cultured according to a known method (for example, current 'protocoldzine' molecular biotechnology), and the chromosome DNA of the microorganism is isolated and purified.
  • a primer was prepared based on the nucleotide sequence at about 87.6 minutes on the chromosome of Escherichia coli, and genomic DNA was subjected to PCR (PCR Protocols, Academic Press (1990)).
  • a fragment containing DNA encoding mannose disomerase derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia can be obtained.
  • DNA encoding mannodisomerase can be obtained by a hybridization method or the like using a synthetic DNA designed based on the base sequence of the genome as a probe.
  • the obtained DNA is used as it is, or after digestion with an appropriate restriction enzyme, etc., and integrated into a vector by a conventional method.
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method for example, 373A, DNA Sequencer-1 (Perkin Elma Inc.) or the like is used.
  • Jidokishi method using [p roc. Natl. Acad. Sci . USA, 74, 5463 (1977) ] by determining the nucleotide sequence of the DNA.
  • Examples of the vector incorporating the DNA include pBluescript KS + (manufactured by Stratagene), pDIRECT CNucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK + (manufactured by Stratagene), pT7Blue (manufactured by Novazidin), pCR II (manufactured by Invitrogen), pCR-TRAP (manufactured by Genehan Yuichi) and pNoTA T7 (manufactured by 5 Prime and 3 Prime) can be exemplified.
  • DNA having the nucleotide sequence obtained as described above examples include, for example, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes, for example, Escherichia coli NM522 / pYP27.
  • a desired DNA can be prepared by chemical synthesis using an 8905 DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the above host cells.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method JP-A-63-248394
  • electroporation method CNucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)].
  • the DNA is expressed in a host cell by the following method, for example, whereby the mannose isomerase activity is obtained.
  • DNA is prepared by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the protein having the mannose isomerase activity so that the nucleotide sequence becomes the optimal codon for expression in the host.
  • the DNA is useful for improving the production efficiency of a protein having mannose isomerase activity.
  • a recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length DNA downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
  • a transformant producing a protein having mannose isomerase activity can be obtained.
  • any prokaryotic cell, yeast, animal cell, insect cell, plant cell, or the like can be used as long as it can express the gene of interest.
  • an animal individual or a plant individual can also be used.
  • the expression vector may be a promoter that is capable of autonomous replication in the host cell or that can be integrated into the chromosome and that is suitable for transcription of DNA encoding a protein having mannose isomerase activity. Is used.
  • an expression vector for expressing the DNA is capable of autonomous replication in the prokaryote, and has a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA and a transcription termination sequence. It is preferable that the expression vector is composed of: A gene that controls the promoter may be included.
  • expression vectors include pBTrp2, pBTacK and pBTac2 (both are commercially available from Boehringer Mannheim), PKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrodin), pGEMEX-II (Promega) , PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pQE-30 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (JP-A-58-110600), pKYP200 CAgric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl CAgric Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter may be any promoter that can be expressed in the host cell.
  • - defense promoter P ⁇ £
  • la_ Promo Isseki one P 1
  • artificially designed and modified promoters such as two P; ⁇ promoters (P ⁇ ££ x 2), tac promoter, letl promoter, lacT7 promoter and let I promoter are used. be able to.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not always necessary for expression of the desired DNA, it is desirable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Host cells include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacteriumium Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobaci llus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Chromatium, Erwinia , Methylobacterium, Phormidiim, Rhodobacter eu, Rhodopseudomonas., Rhodospiril lum, Scenedesmun, Streptomyces,
  • Microorganisms belonging to the genus Synnecoccus, the genus Z momonas and the like can be mentioned, and preferably, the genus Escherichia, the genus Bacil lus, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium, the Pseudomonas Genus, Agrobacteriqg, Alicyclobac i 1 lus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, ⁇ _hromat-ium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Scenedesmmi, Microorganisms belonging to the genus Streptomyces, the genus Synnecoccus, the genus Zymomonas and the like can be mentioned.
  • microorganism examples include, for example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Serratia f icaria s Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens Bacillus subtilis, Bacillus ammyomabacerium bacterium, Bacillus ammiobacerium bacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevi
  • Rhodobacter capsulatus Rhodobacter sphaeroides N Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marinas Rhodopseudomonas palustris Rhodospir ilium rubrum, Rhodospir ilium salexigens, Rhodospir ilium salinarum s Streptomyces ambofacienss Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus ⁇ Streptomyces fungicidicus Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces lividans, Streptomyces, Streptomyces olipus, Streptomyces olipus, Streptomyces olipus, Streptomyces olipusg
  • any method for introducing the recombinant DNA any method can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the above host cells, and examples thereof include an electoporation method (Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)), Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], a protoplast method (JP-A-63-248394), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • examples of expression vectors include YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast.
  • PH05 promoter PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter And promoters such as heat shock protein promoter, MF promoter and CUP1 promoter.
  • Saccharomyces cerevisiae examples include Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, Candida utilis, and the like.
  • any method for introducing DNA into yeast can be used.
  • the electroporation method! Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)
  • Spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75, 1929 (1978)
  • lithium acetate method J. Bacteriol., 153, 163 ( Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • expression vectors include, for example, pcDNAI / Amp, pcDNAI, pCDM8 (all commercially available from Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990). )], PREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pAGE210, ⁇ , ⁇ [J. Biol. Chem., 268, 222782-2787 (1993), also known as pAMoPRSA ( JP-A-05-336963), pAS3-3 (JP-A-2-227075) and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the promoter of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (human CMV), SV4 0 early promoter, Moroni 'Mulin' mouth Long Terminal Repeat Promoter of Michiney Winores (Moloney Murine Leukemia Virus), Promoter of Retrovirus, Heat Shock Promoter First, SR promoters, or metallotionin promos, etc. can be mentioned.
  • the IE gene Enhansa of human CMV may be used together with the promotion.
  • Host cells include mouse and myeloid cells, rat's myeloma cells, mouse'hypridoma cells, Chinese 'hamster cells, CH0 cells, BHK cells, African green monkey kidney cells, and human cells, Namalwa cells. Or Namalwa KJM-1 cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and human colon cancer cell lines.
  • Mouse / myeloma cells include SP2 / 0, NS0, etc. YB2 / 0, etc .; HEK293 (ATCC: CRL-1573), etc. as human fetal kidney cells; BALL-1, etc. as human leukemia cells; COS-1, C0S-7, African colorectal cancer as African green monkey kidney cells HCT-15 etc. can be mentioned as a cell line.
  • any method capable of introducing DNA into animal cells can be used.
  • the electoral poration method any method capable of introducing DNA into animal cells.
  • the electoral poration method any method capable of introducing DNA into animal cells.
  • the recombinant gene transfer vector and the baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain the recombinant virus in the culture supernatant of the insect cells, and the recombinant virus is further infected into the insect cells to express the protein. Can be done.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacII I (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • the baculovirus for example, can be used burglar Gaka insects is a virus that infects ⁇ Utogurafa 'californica force' nuclease one virus 'Doroshisu to poly' (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) and the like 0
  • ovary cells of Spodoptera frugiperda ovary cells of Trichoplusia ni, cultured cells derived from silkworm ovary, and the like can be used.
  • Ovarian cells of Spodoptera frugiperda include Sf9 and Sf21 (baculovirus The ovarian cells of Trichoplusi
  • ii are High 5, BTI-TN-5B1-4 (manufactured by Invitrogen), etc., and Bombyx mori is the cultured cells derived from silkworm ovaries. N4 etc. can be given.
  • Methods for co-transfection of the above-mentioned recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • DNA can be introduced into insect cells using the same method as that used to introduce DNA into animal cells.
  • electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method JP-A-2-227075
  • Lvov: c Cushion Method ! Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • the protein is produced according to a known method [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)]. can do.
  • expression vectors include Ti plasmid, tobacco mosaic virus vector, and the like.
  • any bromo overnight can be used as long as it can be expressed in plant cells.
  • cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter overnight, inineactin 1 promoter evening, etc. I can give it.
  • the expression efficiency of the gene can also be increased by inserting the yeast dehydrogenase gene intron 1 between the promoter and the gene to be expressed.
  • Examples of the host cell include plant cells such as potato, tobacco, corn, rice, rape, soybean, tomato, carrot, wheat, barley, rye, Alfalpha, flax and the like.
  • any method for introducing DNA into plant cells can be used.
  • Agrobacterium Agrobacterium
  • Elect port Japanese patent application 60-251887
  • a method using a particle gun Gene gun
  • Japanese Patent No. 2517813 Japanese Patent No. 2517813
  • the cells or organs of the plant into which the gene has been introduced can be cultured in large quantities using Jaruf Amen.
  • the culture medium to be used may be a commonly used Murashige-n-Square (MS) medium, a white (White) medium, or a medium to which plant hormones such as auxin and cytokinin are added.
  • MS Murashige-n-Square
  • White white
  • plant hormones such as auxin and cytokinin are added.
  • the cultivation is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a plant into which the gene has been introduced (transgenic plant) can also be created.
  • the target protein can also be produced using animal individuals.
  • a gene is introduced according to a known method, CA American Journal of Clinical Nutrition. 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)).
  • the desired protein can be produced in the resulting animal.
  • any one that can be expressed in animals can be used.
  • cycasein promoter, casein promoter, and lactoglobulin promoter which are mammary cell-specific promoters, can be used.
  • Whey acid ⁇ ! "A raw protein promoter is preferably used.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which DNA encoding the protein of interest has been incorporated is cultured according to a conventional culture method to produce the protein. By accumulating and collecting the protein from the culture, the protein can be produced.
  • the protein is bred or cultivated in accordance with a usual method to produce and accumulate the protein, and the protein is collected from the animal or plant to obtain the protein. Can be manufactured.
  • a protein having mannose isomerase activity A non-human transgenic animal carrying the encoding DNA is bred to produce and accumulate the protein encoded by the recombinant DNA in the animal, and the protein is collected from the animal to obtain mannose isomerase activity. Can be produced. Examples of the production / accumulation site in the animal include milk, eggs, and the like of the animal.
  • a transgenic plant having a DNA encoding a protein having mannose isomerase activity is cultivated, and a protein encoded by the recombinant DNA is produced and accumulated in the plant.
  • a protein having mannose isomerase activity can be produced.
  • the transformant for producing the protein having the mannose isomerase activity of the present invention is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast
  • these transformants are cultured in a medium, and the culture is performed.
  • a protein having mannose isomerase activity can be produced.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the body.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by each microorganism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and ethanol. Alcohols such as propanol and the like can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc., ammonium salts of various inorganic and organic acids, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn starch. Ipplica, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and their Digested products are used.
  • potassium potassium phosphate potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin, kanamycin and chloramphenicol may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium if necessary.
  • an inducer For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, isopropyl-1-D-thiogalactovyranoside (IPTG) and the like are used in an expression vector using a promoter.
  • IPTG isopropyl-1-D-thiogalactovyranoside
  • IAA indoleacrylic acid
  • Culture is carried out usually p H 6 ⁇ 8, 2 5 ⁇ 4 0 ° C, 5% C 0 2 under the conditions such as the presence 1-7 days.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, and streptomycin may be added to the medium during the culture.
  • TM-FH medium manufactured by CPharmingen
  • Sf-900 II SFM medium Gabco BR L
  • ExCell400 ExCe 11405
  • Grace's Insect Medium Grace TCC, Nature, 195, 788 (1962)
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium during the culture.
  • the full-length protein having the mannose isomerase activity or the partial polypeptide containing the region having the protein activity having the mannose isomerase activity is described in Molecular Cloning Second Edition in addition to direct expression.
  • the protein can be expressed as a secretory protein or a fusion protein according to the method described above.
  • the proteins to be fused include?
  • Methods for producing a protein having a mannose isomerase activity include a method of producing the protein in a host cell, a method of secreting the protein out of the host cell, and a method of producing the protein on the host cell outer membrane. These methods can be selected by changing the structure of the protein having mannose isomerase activity to be produced.
  • a protein having mannose isomerase activity is produced in the host cell or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (picture)] Natl. Acad. Sci.
  • expression is achieved by adding a signal peptide before the polypeptide containing the active site of a protein having mannose isomerase activity.
  • a protein having mannose isomerase activity can be actively secreted out of host cells.
  • a purification and detection primer can be added between the signal peptide and the polypeptide containing the catalytic region or at the C-terminus of the polypeptide containing the catalytic region.
  • Tags for ??-galactosidase protein A, IgG binding region of protein A, chloramphenicol acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu ), Protein G, maltose binding protein, glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green fluorescein 'protein And ebitopes of any antibody [Yamakawa, Akio, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)].
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • a general enzyme isolation / purification method can be used. it can.
  • the cells in the culture are collected by centrifuging the culture, and the cells are washed. After that, the cells are crushed with an ultrasonic crusher, French press, Mantongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a purified product can be obtained.
  • the protein having the mannose isomerase activity is expressed in the form of an insoluble substance in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a protein.
  • the insoluble form of the protein having the mannose isomerase activity is solubilized with a protein denaturant.
  • the solubilized solution is diluted or dialyzed into a solution containing no protein denaturing agent or diluted so that the protein denaturing agent does not denature the protein, and the protein having the mannose isomerase activity is converted into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation purification method as described above.
  • a protein having mannose isomerase activity When a protein having mannose isomerase activity is secreted extracellularly, the culture is treated by a technique such as centrifugation to obtain a soluble fraction. From the soluble fraction, a purified sample of the protein having the mannose isomerase activity can be obtained by the same method as the above-mentioned isolation and purification method from the cell-free extract supernatant.
  • polypeptide of the present invention is produced as a fusion protein with another protein, and purified using affinity chromatography using a substance having affinity for the fused protein.
  • a protein having mannose isomerase activity can be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • a protein having mannose isomerase activity can be produced as a fusion protein with a FLAG peptide and purified by affinity chromatography using an anti-FLAG antibody [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)].
  • the protein can be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein having mannose isomerase activity itself.
  • polypeptide of the present invention can be prepared by known methods (J. Biomolecular NMR, 6, 129 (1995), Science, 242, 1162 (1988), J. Biochem., 110, 166 (1991)], and can be produced using an in vitro transcription / translation system.
  • Advanced ChemTech Parkin Elma, Pharmacia Biotech, Protein 'Technology' Instrument Technology, Synthecell-Vega, Persective Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as (PerSeptive), Shimadzu Corporation.
  • a peptide synthesizer such as (PerSeptive), Shimadzu Corporation.
  • lixose a culture solution of the transformant obtained by the culture described in the above [2] or a processed product of the culture solution as an enzyme source, producing fructose, mannose, xylulose and lyxose in an aqueous medium (hereinafter, referred to as “lixose”). (Sometimes referred to as the manufacture of the present invention).
  • Examples of the processed product of the culture solution include a concentrate of the culture solution, a dried product of the culture solution, cells obtained by centrifuging the culture solution, a dried product of the cells, a freeze-dried product of the cells, and the cells.
  • Surfactant treated product, ultrasonically treated product of the cells, mechanically ground product of the cells, solvent-processed product of the cells, enzyme-treated product of the cells, protein content of the cells examples thereof include a product, an immobilized product of the cells, and an enzyme preparation obtained by extraction from the cells.
  • the enzyme source used in the production of the present invention has an activity capable of producing 1 mmol of fraction, mannose, xylulose and lyxose per minute at 37 ° C. as 1 unit (U), and is defined as lmU / l ⁇ .
  • the concentration is 1,000 U / 1, preferably 1 OmU / 1 to 100 U / 1.
  • aqueous medium used in the production of the present invention examples include water, phosphates, carbonates, acetates, borates, citrates, buffers such as tris, alcohols such as methanol and ethanol, and ethyl acetate. Esters, ketones such as acetone, acetoamide, etc. Amides and the like. Further, a culture solution of the microorganism used as the enzyme source can be used as an aqueous medium.
  • a surfactant or an organic solvent may be added as necessary.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene octyldecylamine (for example, Nimeen S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium “bromidealkyldimethyl” benzylammonium chloride.
  • Cationic surfactants such as Ride (for example, Cation F2-40E, manufactured by NOF Corporation), anionic surfactants such as lauroyl'zarcosinate, alkyldimethylamines (eg, tertiary amine FB, NOF Corporation) And tertiary amines such as fructose, mannose, xylulose, and lyxose. Any of these may be used, and one or more of them may be used in combination.
  • the surfactant is usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / 1.
  • organic solvent examples include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, ethyl acetate and the like, which are usually used at a concentration of 0.1 to 5 Oml / 1. L10, preferably pH 6-8, 20-60 ° C. for 1-96 hours.
  • xylene toluene
  • aliphatic alcohol preferably acetone
  • ethyl acetate preferably acetone
  • ethyl acetate preferably 2-butanethyl acetate
  • L10 preferably pH 6-8, 20-60 ° C. for 1-96 hours.
  • a non-machine salts of MgC 1 2 or the like if necessary.
  • Quantification of fructose, mannose, xylulose and lyxose produced in the aqueous medium can be carried out using a sugar analyzer manufactured by Dionex (Anal. Biochem., 189, 151 (1990)).
  • Fractose, mannose, xylulose or lyxose produced in the reaction solution can be collected by a usual method using activated carbon, ion exchange resin or the like.
  • FIG. 1 is a view showing a step of constructing a plasmid pYP27 expressing mannose isomerase.
  • ⁇ represents the ampicillin resistance gene
  • Ptrp represents the tributophan promoter
  • yihS represents the mannose isomerase gene.
  • the Escherichia coli W3110 (ATCC27325) strain was cultured according to a known method [for example, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)], and the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified.
  • Nucleotide sequence of the known Escherichia coli chromosome DNA (Science, 277, 1453 (1997)), information on the location of the mannose isomerase gene on the chromosome estimated by Yale University, and 87.7
  • a DNA primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a DNA primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 were obtained by Perceptive Biosystems Inc. 8905 It was synthesized using a type DNA synthesizer.
  • PCR was performed using the synthetic DNA as a primer set and the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 strain as type III.
  • PCR was performed using 0.5 mol / L Pfu DNA polymerase (Stratagene) for each chromosome DNAO. Lj g and primer 2.5 units, x10 buffer for Pfu DNA polymerase (Stratagene) The reaction was performed by repeating the steps of 94 ° C for 1 minute, 42 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes 30 times using a reaction solution 401 containing 4 l and 200 mol / L of deoxyNTP each. .
  • the DNA precipitate was dissolved in 20 ⁇ 1 TE. Using the lysis solution 51, the DNA was digested with restriction enzymes C1aI and BamHI, and the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis. Collected. After digesting 0.2 pg of pTrS30 DNA with restriction enzymes C1aI and BamHI, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and a 4.2 kb fragment was recovered in the same manner.
  • the 1.3 kb and 4.2 kb fragments were subjected to ligation reaction at 16 ° C. for 16 hours using a Ligation kit.
  • the ligation reaction solution was used to transform Escherichia * UNM522 strain according to the above-mentioned known method, and the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 g / ml of ambicilin, and then cultured at 30 ° C overnight. did.
  • Blasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with the above-mentioned known method to obtain pYP27 as an expression plasmid.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 1).
  • the transformant containing the plasmid is hereinafter referred to as Escherichia coli NM522 / pYP27.
  • Example 2 Production of mannose, fructoses, xylulose and lyxose
  • the Escherichia coli NM522 / pYP27 strain obtained in Example 1 was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin. , 28 °. For 17 hours.
  • the culture solution was inoculated at 1% into a large test tube containing 8 ml of M9 medium containing 50 g / ml of ampicillin, and cultured at 37 ° C for 7 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells can be stored at ⁇ 20 ° C. if necessary, and can be thawed before use.
  • reaction product was analyzed using a sugar analyzer (DX-500) manufactured by Dionex.
  • mannose isomerase can be produced in large quantities by a genetic recombination technique.
  • mannose, fructose, xylulose, and lyxose can be efficiently produced by using the enzyme.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

明 細 書
新規マンノースイソメラ一ゼおよび該酵素をコードする D N A 技術分野
本発明は、 マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする D NA、該 D N Aを含有する組換え体 D N A、該組換え体 D N Aを保有する形質転 換体、該形質転換体を用いたマンノースイソメラーゼの製造法、 および該形質転換 体を用いたフラクトース、 マンノース、 キシルロースおよびリキソースの製造法に 関する。 景技術
マンノースイソメラーゼに関し、 シユードモナス属 〔J. Biol. Chem. , 218, 535 ( 1956)、 特開平 6-292578、 US Patent 5, 124,262( 1992)) 、 マイコバクテリゥム属 J. Bacteriol. , 101, 777 (1970)) , キサントモナス属 〔Agric. Biol . Chem.， ， 605 (1964)〕 、 ストレプトマイセス属 〔Agric. Biol. Chem. , 31, 35 (1967)〕、 ァシネトバクタ一属（特開平 8-9986)およびェシヱリヒア属 〔J. Gen. Microbiol. , 97, 257 ( 1976)) に属する微生物において、 その存在が知られているが、 いずれの 微生物においても該酵素をコ一ドする D N Aは単離されていない。
ェシエリヒア'コリ由来のマンノースィソメラ一ゼは精製され、該酵素の性質が 調べられているが 〔J. Gen. Microbiol. , 124, 219 ( 1981)〕 、 該酵素のアミノ酸 配列は解析されていない。 ェシエリヒア 'コリにおいては、 染色体 D NAの塩基配 列は決定されており 〔Science，^， 1453 ( 1997)〕 、 エール大学の E. coli Genetic Stock Centerのデ一夕ベ一ス ( http： //cgsc .biology. yale .edu)より、 マンノ一スィ ソメラ一ゼ遺伝子は染色体上 87.6分付近の位置にあると推定されている。しかしな がら、 該遺伝子は特定されておらず、 単離されていない。
マンノースイソメラーゼを利用した糖の製造法として、シュ一ドモナス属細菌由 来 (特開平 6-292587)およびァシネトバク夕ー属細菌由来 (特開平 8-9986)のマンノ ースィソメラ一ゼを利用したマンノースの製造法が知られている。 しかしながら、 これら方法では、 菌体あたりの該酵素の活性が低いため、 長時間の反応が必要であ り、 マンノースの工業的生産には適していない。
これまで、マンノースィソメラ一ゼを利用した糖の効率的な製造法は知られてい ない。 発明の開示
本発明の目的は、 マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコ一 ドする D N A、該 D N Aを用いたマンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質の製 造法、 および該蛋白質を用いたフラクトース、 マンノースおよびキシルロース、 リ キソースの効率的な製造法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ェシエリヒア属に属す る微生物よりマンノースィソメラ一ゼをコ一ドする D N Aを単離することに成功 し、該 D N Aを利用することによりマンノース等の糖を効率的に製造することが可 能であることを見出し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は、 下記 （ 1 ) 〜 （ 1 1 ) に関する。
( 1 ) 配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換若 しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつマンノースィソメラ一ゼ活性を有す る蛋白質。
本明細書において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸 配列からなり、 かつマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) (以下、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版と略す） 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons ( 1987-1997) (以下、 カレ ント 'プロトコールズ 'ィン 'モレキュラー'バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 ( 1982)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci . , USA, 79, 6409( 1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 ( 1985) 、 Gene, 34, 315 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて調製することが できる。 該方法により調製された蛋白質の具体的な例としては、配列番号 1で示されるァ ミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DN Aに部位特異的変異を導入すること により得られた蛋白質をあげることができる。
欠失、 置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 1個から数 十個、 特に 1個から数個のアミノ酸が好ましい。
( 2 ) 配列番号 1記載のァミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。
(3) 配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換若 しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有す る蛋白質をコードする DNA。
( 4 ) 配列番号 2記載の塩基配列を有する D N A。
(5) 上記（2) ~ (4)いずれか 1つに記載の DN Aとストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコ一 ドする DNAである。
本明細書において、 「ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNA」 とは、 上記 （2)〜 （4)いずれかに記載の DNAをプローブとして、 コロニー · ハイブリダィゼ一シヨン法、 プラーク 'ハイブリダィゼ一シヨン法あるいはサザン ハイブリダィゼ一シヨン法等を用いることにより得られる DN Aを意味し、具体的 には、 コロニーあるいはプラーク由来の DN Aを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0MのNaCl存在下、 65 °Cでハイブリダィゼ一シヨンを行った後 、 0. 1〜 2倍濃度の S S C溶液（ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150 mM塩 化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下で フィル夕一を洗浄することにより同定できる DN Aをあげることができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレント 'プ 口トコールズ 'ィン 'モレキユラ一'バイオロジー、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等の実験書に 記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダィズ可能な D N Aとし て具体的には、配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 80%以上の相同性を有 する DNA、 好ましくは 95%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。 (6) 上記 （2)〜 （5)いすれか 1つに記載の DN Aをぺク夕一に組み込んで 得られる組換え体 DNA。
(7) 上記（6)記載の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形質転換 体。
( 8 ) 形質転換体がェシヱリヒア ·コリである、 上記 （ 7 ) 記載の形質転換体。
(9) 上記 （ 7 ) または （ 8 ) 記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中にマ ンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質 を採取することを特徴とするマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質の製造 方法。
(10) マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする DN Aを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびマンノースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でフラクトース を生成蓄積させ、該水性媒体中からフラクトースを採取することを特徴とするフラ クトースの製造法。
(11) マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする DNAを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびフラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でマンノ一ス を生成蓄積させ、該水性媒体中からマンノースを採取することを特徴とするマンノ ースの製造法。
(12) マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコ一ドする DN Aを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびリキソースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でキシルロース を生成蓄積させ、該水性媒体中からキシルロースを採取することを特徴とするキシ ルロースの製造法。
(13) マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DN Aを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびキシルロースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でリキソース を生成蓄積させ、該水性媒体中からリキソースを採取することを特徴とするリキソ ースの製造法。
( 1 4 ) 形質転換体が、 上記 （ 7 ) または （ 8 ) 記載の形質転換体である、 請求 項 1 0〜 1 3いずれか 1つに記載の製造法。
以下に本発明を詳細に説明する。
[ 1 ] マンノースイソメラ一ゼをコードする D N Aの調製
マンノースイソメラ一ゼをコードする D N Aはェシエリヒア (Escherichia) 属 に属する微生物より調製することができる。ェシエリヒア属に属する微生物として は、 Escherichia col i、 Escherichia blattae、 Eschencnia fergusoni i、 Escherichia hermannii Escherichia intermedia^ Escherichia vulneris等をあげることがで き、 具体的には Escherichia coli XL1-Blues Escherichia coli XL2-Blue、
Escherichia coli DH1、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB10U Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110(ATCC27325)、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli MP347、 Escherichia coli NM522、 Escherichia blattae ATCC33430、 Escherichia fergusoni i ATCC35473, Escherichia hermannii ATCC33652 、 Escherichia intermedia ATCC21073、 Escherichia vulneris ATCC39368等をあげ ることができる。
公知の方法 （例えば、 カレント 'プロトコ一ルズ■ィン 'モレキュラー ·バイオ 口ジ一） に従って、 ェシエリヒア属に属する微生物を培養し、 該微生物の染色体 D N Aを単離 ·精製する。
ェシエリヒア 'コリにおいては、 染色体 D N Aの塩基配列は決定されており 〔 Science, 277, 1453 ( 1997)〕 、 エール大学の Ε· coli Genetic Stock Centerのデ 一夕べ一ス（http：〃 cgsc.biology.yale. edu)より、マンノ一スィソメラ一ゼ遺伝子 は染色体上 87.6分付近の位置にあると推定されている。
該情報を基に、 ェシエリヒア 'コリの染色体上 87.6分付近の塩基配列に基づいた プライマ一を調製し、ゲノム D N Aを銪型として、 P C R (PCR Protocols, Academic Press ( 1990)〕 を行うことにより、 ェシエリヒア属に属する微生物由来のマンノー スィソメラーゼをコードする D N Aを含む断片を取得することができる。 また、ゲノムの塩基配列に基づいて設計された合成 D N Aをプローブとしたハイ ブリダイゼ一シヨン法等により、マンノ一スィソメラ一ゼをコ一ドする D N Aを取 得することもできる。
取得した D N Aをそのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断後常法によりべク 夕一に組み込み、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えば 373A，D N Aシークェ ンサ一（パーキン 'エルマ一社製）等を用いたジデォキシ法〔proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 ( 1977)〕 により該 D N Aの塩基配列を決定する。
該 D N Aを組み込むベクタ一としては、 pBluescript KS+ (ストラタジーン社製 )、 pDIRECT CNucleic Acids Research, 18， 6069 ( 1990)〕、 pCR-Script Amp SK+ (ストラタジーン社製） 、 pT7Blue (ノバジヱン社製） 、 pCR II (インビトロジェ ン社製） 、 pCR-TRAP (ジーンハン夕一社製） および pNoTAT7 ( 5プライム 3プライ ム社製） 等をあげることができる。
上記のようにして取得された塩基配列を有する D N Aとして、例えば、配列番号 2で表される塩基配列を有する D N A等をあげることができる。
配列番号 2で表される配列を有する D N Aを含むプラスミ ドを保有する大腸菌 として、 例えば Escherichia coli NM522/pYP27をあげることができる。
更に、 決定された D N Aの塩基配列に基づいて、 パーセプティブ ·バイオシステ ムズ社製 8905型 D N A合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする D NAを調製することもできる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 ( 1972)〕 、 プロトプラスト法 （特開昭 63-248394 ) 、 エレクトロポレーシヨン法 CNucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)〕 等 をあげることができる。
[ 2 ] 本発明の蛋白質の調製
上記 [ 1 ] に記載の方法により取得した、 マンノースイソメラーゼ活性を有する 蛋白質をコードする D NAを用い、例えば以下の方法により、該 D N Aを宿主細胞 中で発現させることにより、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を製造す ることができる。
上記 [ 1 ]の方法に準じて取得したマンノースィソメラーゼ活性を有する蛋白質 をコードずる D N Aを基にして、必要に応じて、 マンノースイソメラーゼ活性を有 する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さの D N A断片を調製する。
また、マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列 を、 宿主の発現に最適なコドンとなるように、 塩基を置換した D NAを調製する。 該 D N Aはマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質の生産効率の向上に有用 である。
該 D N A断片、または全長 D N Aを適当な発現ベクターのプロモ一夕一の下流に 挿入することにより、 組換え体 D N Aを作製する。
該組換え体 D N Aを、該発現べク夕一に適合した宿主細胞に導入することにより 、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を生産する形質転換体を得ることが できる。
宿主細胞としては、 原核細胞、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的と する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。 また、動物個 体や植物個体を用いることもできる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製が可能、 または染色体中 への組込みが可能で、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする D N Aの転写に適した位置にプロモ一夕一を含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、上記 D N Aを発現させるための 発現べクタ一は該原核生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボ ゾーム結合配列、上記 D N Aおよび転写終結配列より構成された発現えベクターで あることが好ましい。 プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 発現べクタ一としては、 pBTrp2、 pBTacK pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハ ィム社より市販） 、 PKK233-2 (フアルマシア社） 、 pSE280 (インビ卜ロジヱン社） 、 pGEMEX-Ι 〔プロメガ (Promega)社製〕、 pQE-8 (キアゲン（QIAGEN)社製) 、 pQE-30 (QIAGEN社製） 、 pKYPIO (特開昭 58-110600) 、 pKYP200 CAgric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)〕 、 pLSAl CAgric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕 、 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 82, 4306 ( 1985 )〕 、 pBluescript I I SK+ (ストラタジーン社製 )、pBluescript I I SK- (ストラ夕ジーン社製）、 pTrs30 (FERM BP- 5407)、 pTrs32(FERM BP-5408)、 pGHA2(FERM BP-400)、 pGKA2(FERM BP-6798 ), pTerm2 (特閧平 3- 22979、 US468619K US4939094, US5160735) 、 pEG400 〔J. BacterioL , V[Z , 2392 ( 1990 ) D、 pGEX (フアルマシア社製）、 pETシステム （ノバジェン社製）、 pSupex、 pUBllO 、 pTP5、 pC194、 pTrxFus ( Invitrogen社製） 、 pMAL-c2 (New England Biolabs社製 ) 、 pUC18 Cgene, 33, 103 ( 1985 )〕 、 pUC19 Gene, 33, 103 ( 1985 )〕 、 pSTV29 (宝酒造社製)、 pSTV28 (宝酒造社製)、 pUC118(宝酒造社製）、 pPAl (特開昭 63-233798 ) 等を例示することができる。
プロモー夕一としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでも よい。 例えば、 卫プロモーター （P^£) 、 la_ プロモ一夕一 （P 1 ） 、 PLプロモ 一夕一、 PRプロモー夕一、 PSEプロモーター等の、 大腸菌やファージ等に由来するプ ロモ—夕一、 spoiプロモータ一、 SP02プロモーター、 penPプロモー夕一等をあげる ことができる。 また P; 卫を 2つ直列させたプロモーター （P^££x 2 ) 、 tacプロ モータ一、 letlプロモーター、 lacT7プロモータ一、 let Iプロモーターのように人 為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン—ダルガノ （Shine-Dalgarno)配列と開始コ ドンとの間を適当な距離（例えば 6〜1 8塩基）に調節したプラスミ ドを用いるこ とが好ましい。
目的とする D N Aの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝 子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium 属、 Corynebacterium属、 Microbacterium属ヽ Pseudomonas属、 Agrobacterium属、 Alicyclobaci llus属、 Anabaena属、 Anacystis属、 Arthrobacter属、 Azobacter属、 Chromatium属、 Erwinia属、 Methylobacterium属、 Phormidiim属、 Rhodobacter禹、 Rhodopseudomonas.属、 Rhodospiri l lum属、 Scenedesmun属、 Streptomyces属、
Synnecoccus属、 Z momonas属等に属する微生物をあげることができ、 好ましくは、 Escherichia属、 Bacil lus属、 Brevibacterium属、 Corynebacterium属、 Pseudomonas 属、 Agrobacteriqg属、 Alicyclobac i 1 lus属、 Anabaena属、 Anacystis属、 Arthrobacter 属、 Azobacter属、 ^_hromat-ium属、 Erwinia属、 Methylobacterium属、 Phormidium 属、 Rhodobacter属、 Rhodopseudomonas属、 Rhodospirillum属、 Scenedesmmi属、 Streptomyces属、 Synnecoccus属、 Zymomonas属に属する微生物等をあげることがで きる。
該微生物の具体例として、例えば、 Escherichia coli XL1-Blue、 Escherichia coli XL2 - Blue、 Escherichia coli DH1、 Escherichia coli DH5ひ、 Escherichia coli MC1000 、 Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli MP347、 Escherichia coli NM522、 Serratia f icarias Serratia fonticola、 Serratia liquefaciens、 Serratia marcescens Bacillus subtilis、 Bacillus amy loliquefacines、 Corynebacterium ammmoniagenes ATCC6872、 Brevibacterium immariophilum ATCC14068、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、 Brevibacterium f lavum ATCC14067、 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、 Brevibacterium divaricatum ATCC14020、
Brevibacterium roseum ATCC13825、 Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240、 Corynebacterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC14297 、 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Corynebacterium
acetoglutamicum ATCC15806、 Corynebacterium callunae ATCC1599K
Corynebacterium lilium ATCC15990、 Corynebacterium melassecola ATCC17965、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354S Pseudomonas sp. D - 0110、 Agrobacterium radiobacter -、 Agrobacterium rhizogenes、 Agrobacterium rubi、 Anabaena cylindrical Anabaena doliolumN Anabaena flos - aquae、 Arthrobacter aurescens 、 Arthrobacter citreus、 Arthrobacter globformis、 Arthrobacter
hydrocarboglutamicus、 Arthrobacter mysorens、 Arthrobacter nicotianaes Arthrobacter paraffineus^ Arthrobacter protophormiaes Arthrobacter roseoparaffinuss Arthrobacter sulfureus、 Arthrobacter ureafaciens Chromatium buderix Chromatium tepidum Chromatium vinosum Chromatium warmingi Chromatium f luviatile. Erwinia uredovora^ Erwinia carotovoras Erwinia ananas 、 Erwinia herbicola、 Erwinia punctata^ Erwinia terreus、 Methyl obacterium rhodesianunu Methylobacterium extorquens. Phormidium sp. ATCC29409、 Rhodobacter capsulatus、 Rhodobacter sphaeroidesN Rhodopseudomonas blastica 、 Rhodopseudomonas marinas Rhodopseudomonas palustris Rhodospir ilium rubrum 、 Rhodospir ilium salexigens、 Rhodospir ilium salinarums Streptomyces ambofacienss Streptomyces aureofaciens、 Streptomyces aureus^ Streptomyces fungicidicus Streptomyces griseochromogenes、 Streptomyces griseus、 Streptomyces lividans、 Streptomyces olivogriseus、 Streptomyces rameus、 Streptomyces tanashiensis、 Streptomyces vinaceus、 Zymomonas mobilis等をあ げることができる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 〔Nucleic Acids Res. , 16, 6127 ( 1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、 プロトプラスト法（特開昭 63-248394)、 または Gene, 17, 107 ( 1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 ( 1979)に記載の方法 等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEpl3 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 、 pHS19、 pHS15等を例 示することができる。
プロモー夕一としては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく 、 例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモ一夕一、 ADHプロモ一 夕一、 gal 1プロモ一夕一、 gal 10プロモーター、 ヒートショック蛋白質プロモ一 夕一、 MFひ 1プロモーター、 CUP1プロモー夕一等のプロモー夕一をあげることがで きる。
宿主細胞としては、 SaccharomyceS-属、 Schizosaccharomyces属、 Kluyveromyces 属、 Trichosporon属、 Schwanniomyces属、 Pichia属、 Candida属等に属する酵母菌 株をあげることができ、 具体的には、 Saccharomyces cerevisiae.、 Schizosaccharomyces pombe、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans、 Schwanniomyces alluvius、 Pichia pastoris、 Candida utilis等をあげることがで さる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、酵母に D N Aを導入する方法であればいず れも用いることができ、例えば、エレクトロポレーシヨン法！: Methods in Enzymol. , 194, 182 ( 1990)〕 、 スフエロプラスト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75, 1929 ( 1978)) 、 酢酸リチウム法 〔J. Bacteriol. , 153, 163( 1983)〕、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 ( 1978)記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 pcDNAI/Amp、pcDNAI、pCDM8(いずれもフナコシ社より市販）、 pAGE107〔特開平 3-22979 、 Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)〕 、 pREP4 (インビトロジェン社製） 、 pAGE103 〔J. Biochem. , 101, 1307 ( 1987)) 、 pAGE210、 ρΑΜο、 ρΑΜοΑ〔J. Biol. Chem.， 268， 22782- 22787 ( 1993)、別名 pAMoPRSA (特開平 05-336963)〕、 pAS3-3 (特開平 2-227075 ) 等を例示することができる。
プロモー夕一としては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いるこ とができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （ヒト C MV)の I E (immediate early ) 遺伝子のプロモ一夕一、 S V 4 0の初期プロモーター、 モロニ一 ' ミュリン '口 ィケミア · ウイノレス (Moloney Murine Leukemia Virus) のロング ·夕一ミナル · リピート ·プロモ一夕一 （Long Terminal Repeat Promoter) 、 レトロウィルスの プロモーター、 ヒートショックプロモ一夕一、 S Rひプロモーター、 あるいはメタ ロチォネィンのプロモ一夕一等をあげることができる。 また、 ヒト C MVの I E遺 伝子のェンハンサ一をプロモー夕一と共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 マウス · ミエ口一マ細胞、 ラット ' ミエローマ細胞、 マウス 'ハイプリ ドーマ細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 BHK細胞 、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞、 ヒ卜の細胞である Namalwa細胞または Namalwa KJM-1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、 ヒト白血病細胞、 HBT5637 (特開昭 63— 299) 、 ヒ ト大腸癌細胞株等をあげることができる。
マウス · ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NS0等、 ラット ' ミエローマ細胞とし ては YB2/0等、 ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC: CRL-1573)等、 ヒト白血病 細胞としては BALL- 1等、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞としては COS- 1、 C0S-7、 ヒト 大腸癌細胞株としては HCT- 15等をあげることができる。
動物細胞への組換え体 D N Aの導入法としては、動物細胞に D N Aを導入できる いかなる方法も用いることができ、 例えば、 エレクト口ポーレーシヨン法 〔
Cytotechnology, 3, 133( 1990)〕 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2— 2 2 7 0 7 5 )、 リポフエクシヨン法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)〕、 Virology, 52, 456 ( 1973)に記載の方法等を用いることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えば、 バキュロウィルス ·イクスプレ ヅシヨン ·ベクタ一ズ ァ ·ラボラトリ—— 'マ二ユアノレ 〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York ( 1992) 〕、モレキュラー'バイオロジー ァ 'ラボラトリ一 'マニュアル（Molecular Biology, A Laboratory Manual) 、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイ ォロジ一 サプルメント 1〜3 8 (Current Protocols in Molecular Biology) 、 Bio/Technology, 6, 47 ( 1988)等に記載された方法によって、 蛋白質を発現するこ とができる。
即ち、組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入し て昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えゥィルスを昆虫細 胞に感染させ、 蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacII I (いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる ο
バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるァ ゥトグラファ 'カリフォルニ力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる 0
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusia niの卵巣 細胞、 カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としては Sf9、 Sf21 (バキュロウィルス 'イク スプレヅシヨン 'ベクタ一ズ ァ 'ラボラトリ一'マニュアル）等、 Trichoplusi |ii の卵巣細胞としては High 5、 BTI-TN-5B1-4 (インビトロジェン社製） 等、 カイコ卵 巣由来の培養細胞としては Bombyx mori N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法（特 開平 2-227075)、 リポフエクシヨン法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 ( 1987) 〕 等をあげることができる。
また、動物細胞に D N Aを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞に D N Aを導入することもでき、例えば、エレクトロボレ一シヨン法〔Cytotechnology， 3, 133 ( 1990)〕、 リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、 リボフ： cクシヨン法!: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 ( 1987)〕 等をあげることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、 公知の方法 〔組織培養， 20 (1994)、 組織培養， 21 ( 1995)、 Trends in Biotechnology, 15, 45 ( 1997)〕 に 準じて蛋白質を生産することができる。
発現べクタ一として、 例えば、 T iプラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクタ 一等をあげることができる。
遺伝子発現に用いるブロモ一夕一としては、植物細胞中で発現できるものであれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35Sプロモ一夕一、 ィネアクチン 1プロモー夕一等をあげることができる。 また、 プロモーターと発現させる遺伝子の間に、 トゥモロコシのアルコール脱水素酵素遺 伝子のィントロン 1等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもで きる。
宿主細胞としては、 ポテト、 タバコ、 トウモロコシ、 イネ、 アブラナ、 大豆、 ト マト、 ニンジン、 小麦、 大麦、 ライ麦、 アルフアルファ、 亜麻等の植物細胞等をあ げることができる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、植物細胞に D N Aを導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) (特 閧昭 59- 140885、 特開昭 60- 70080、 W094/00977) 、 エレクト口ポレーシヨン法 （特 開昭 60-251887) 、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許第 2606856、 特許第 2517813) 等をあげることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーフアーメン夕一を用いて大量培養 することができる。
培養する培地としては、 一般に使用されているムラシゲ ·アンド ·スク一グ (MS) 培地、 ホワイ ト（White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイ トカイニン等、 植物ホルモンを添加した培地等を用レヽることができる。
培養は、 通常 p H 5〜9、 2 0〜4 0 °Cの条件下で 3〜6 0日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を培 地に添加してもよい。
また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された 植物個体 （トランスジエニック植物） を造成することもできる。
動物個体を用いて目的とする蛋白質を生産することもできる。例えば、公知の方 法 CAmerican Journal of Clinical Nutrition. 63, 639S ( 1996)、 American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S ( 1996)、 Bio/Technology, 9, 830 ( 1991 )〕 に 準じて、 遺伝子を導入した動物中に目的とする蛋白質を生産することができる。 ブロモ一夕一としては、動物で発現できるものであればいずれも用いることがで きるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモーターであるひカゼインプロモー夕一、 カゼインプロモー夕一、 ?ラクトグロブリンプロモータ一、 ホェ一酸^！ "生プロティ ンプロモー夕一等が好適に用いられる。
目的とする蛋白質をコードする D N Aを組み込んだ組換え体べクタ一を保有す る微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方法に従 つて培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することによ り、 該蛋白質を製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育また は栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物値体または植物個体より該蛋白質を採 取することにより、 該蛋白質を製造することができる。
即ち、 動物個体の場合、 例えば、 マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質を コードする D N Aを保有する非ヒトトランスジエニック動物を飼育し、該組換え体 D N Aのコードする蛋白質を該動物中に生成 ·蓄積させ、該動物中より該蛋白質を 採取することにより、マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質を製造すること ができる。 該動物中の生成 ·蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク、 卵等を あげることができる。
植物個体の場合、例えば、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコード する D N Aを保有するトランスジエニック植物を栽培し、該組換え体 D N Aのコー ドする蛋白質を該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することに より、 マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を製造することができる。 本発明のマンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を製造するための形質転 換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、 これら形質転換体を 培地に培養し、培養物中にマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質を生成蓄積 させ、 該培養物から採取することにより、 マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋 白質を製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方 法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換 体を培養する培地としては、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含 有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいず れを用いてもよい。
炭素源としては、 それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、 グルコース 、 フラクトース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン 加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノ —ルなどのアルコール類が用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アン モニゥム、 リン酸アンモニゥム、 等の各種無機酸や有機酸のアンモニゥム塩、 その 他含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチ一プリカ 一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびそ の消化物等が用いられる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシゥ ム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭 酸カルシウム等が用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度 は 1 5〜4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 5時間〜 7日間である。 培養中 p Hは、 3 . 0〜9 . 0に保持する。 p Hの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液 、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、 アンピシリン、 カナマイシン、 クロラムフエニコ一ル 等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモー夕一として誘導性のプロモ一夕一を用いた発現べク夕一で形質転換し た微生物を培養するときには、必要に応じてィンデューサ一を培地に添加してもよ レ、。 例えば、 1 £プロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養 するときにはイソプロピル一^— D—チォガラクトビラノシド （I P T G) 等を、 ^プロモー夕一を用いた発現べク夕一で形質転換した微生物を培養するときには インドールアクリル酸 （I AA) 等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている RPMI 1640培地 The Journal of the American Medical Association, 199, 519 ( 1967)〕 、 Eagleの MEM培地 〔Science， 122, 501 ( 1952)〕 、 DMEM培地 （； Virology,さ， 396 ( 1959)〕、 199培地!; Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1( 1950)〕 またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用 いられる。
培養は、 通常 p H 6〜8、 2 5〜4 0 °C、 5 % C 02存在下等の条件下で 1〜 7 日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン、 ス トレプトマイシン等 の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている TM-FH培地 CPharmingen社製〕 、 Sf-900 I I SFM培地 （ギブコ B R L社製)、 ExCell400、 ExCe 11405〔いずれも JRH Biosciences社製〕、 Grace' s Insect Medium Grace, T. C. C.， Nature, 195, 788 ( 1962)〕 等を用いることができる。 培養は、 通常 p H 6〜7、 2 5〜3 0 °C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、 ゲン夕マイシン等の抗生物質を培地に添加してもよ レ^
上記のマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質全長またはマンノースイソ メラーゼ活性を有する蛋白質活性を有する領域（触媒領域）を含む部分ポリべプチ ドは、 直接発現させる以外に、 モレキュラー 'クローニング第 2版に記載されてい る方法等に準じて、分泌夕ンパク質または融合夕ンパク質として発現させることも できる。 融合させるタンパク質としては、 ? -ガラクトシダ一ゼ、 プロテイン A、 プロテイン Aの I g G結合領域、 クロラムフエ二コール'ァセチルトランスフェラ —ゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G l u ) 、 プロテイン G、 マルトース結合タンパク 質、 グル夕チオン S -トランスフェラーゼ、 ポリヒスチジン鎖 （His-tag)、 Sぺプ チド、 D N A結合タンパク質ドメイン、 T a c抗原、 チォレドキシン、 グリーン · フルォレツセント 'プロテイン、 および任意の抗体のェピトープ等があげられる 〔 山川彰夫， 実験医学， ， 469-474 ( 1995)〕。
マンノースィソメラーゼ活性を有する蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に 生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産さ せる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるマンノースイソメラ一ゼ活性を 有する蛋白質の構造を変えることにより、 これら方法を選択することができる。 マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外 膜上に生産される場合には、 ポールソンらの方法 〔J. Biol . Chem. , 264, 17619 (画）〕、 ロウらの方法 Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 86, 8227 ( 1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕 、 または特開平 05-336963、 W094/23021等に記載の方 法を準用することにより、該マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を宿主細 胞外に積極的に分泌させることができる。
即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、 マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白 質の活性部位を含むポリべプチドの手前にシグナルぺプチドを付加した形で発現 させることにより、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を宿主細胞外に積 極的に分泌させることができる。さらに、 シグナルペプチドと触媒領域を含むポリ ペプチドの間、 または触媒領域を含むポリペプチドの C末端に、 精製，検出用の夕 グを付加することもできる。
精製 '検出用のタグとしては、 ? -ガラクトシダ一ゼ、 プロテイン A、 プロティ ン Aの I g G結合領域、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラ一ゼ、 ポ リ （A r g ) 、 ポリ （G l u ) 、 プロテイン G、 マルト一ス結合タンパク質、 グル 夕チオン S -トランスフェラ一ゼ、 ポリヒスチジン鎖 （His-tag)、 Sペプチド、 D N A結合タンパク質ドメイン、 T a c抗原、 チォレドキシン、 グリーン ·フルォレ ッセント 'プロテイン、 および任意の抗体のェビトープ等があげられる 〔山川彰夫 , 実験医学， 13, 469-474 ( 1995)〕 。
また、 特開平 2- 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素遺 伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を製造するための形質転換体の培 養物から、 本発明のポリペプチドを単離 ·精製するには、 通常の酵素の単離 ·精製 法を用いることができる。
例えば、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質が形質転換体の細胞内に溶 解状態で蓄積する場合には、 培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を 集め、 該細胞を洗浄した後に、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリン ホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破碎し、 無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 溶媒抽出法、硫安 等による塩析法脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル（D E A E ) ーセファロース、 DIAI0N HPA-75 (三菱化成社製） 等レジンを用いた陰イオン交 換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (フアルマシア社製） 等のレジンを用い た陽イオン交換クロマトグラフィー法、 ブチルセファロ一ス、 フエ二ルセファロー ス等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一法、 クロマトフオーカシング法、等電点電気泳 動等の電気泳動法等の手法を用い、 精製標品を得ることができる。 また、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質が細胞内に不溶体を形成して 発現した場合は、 同様に細胞を回収後破碎し、遠心分離を行うことにより得られた 沈殿画分より、通常の方法により該マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質を 回収後、該マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で 可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度 が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、該マンノースィ ソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単 離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外にマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質が分泌される場合には、該 培養物を遠心分離等の手法により処理し、 可溶性画分を取得する。該可溶性画分か ら、 上記無細胞抽出液上清からの単離精製法と同様の手法により、該マンノースィ ソメラ一ゼ活性を有する蛋白質の精製標品を得ることができる。
また、本発明のポリぺプチドを他の夕ンパク質との融合夕ンパク質として生産し 、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフ ィーを利用して精製することもできる 〔山川彰夫， 実験医学， ， 469-474 ( 1995) o
例えば、 ロウらの方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 86, 8227 ( 1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕 、 特開平 05-336963、 W094/23021に記載の方法に準じ て、マンノースィソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をプロティン Aとの融合タンパク 質として生産し、ィムノグロブリン Gを用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィー により精製することができる。
また、マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質を F L A Gペプチドとの融合 タンパク質として生産し、抗 F L A G抗体を用いるァフィ二ティ一クロマトグラフ ィ一により精製することができる 〔Pro Natl . Acad. Sci . USA, 86, 8227 ( 1989) 、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕 。
更に、マンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質自身に対する抗体を用いたァ フィニティ一クロマトグラフィ一で精製することもできる。
本発明のポリペプチドは、 公知の方法 〔J. Biomolecular NMR, 6, 129 ( 1995)、 Science, 242, 1162 (1988)、 J. Biochem. , 110, 166 (1991)〕 に準じて、 in vitro 転写 ·翻訳系を用いて生産することもできる。
上記で取得されたマンノースイソメラーゼ活性を有する蛋白質のァミノ酸情報 を基に、 Fmo c法 （フルォレニルメチルォキシカルボニル法）、 tBo (t 一プチルォキシ力ルポ二ル法）等の化学合成法によってもマンノースイソメラ一ゼ 活性を有する蛋白質を製造することができる。
また、 ァドバンスト ·ケムテック （Advanced ChemTech)社、 パーキン ·エルマ —社、 フアルマシアバイオテク社、 プロテイン 'テクノロジ一'インストウルメン 卜 (Protein Technology Instrument)社、 シンセセル -ベガ (Synthecell— Vega )社、 パーセブティブ （PerSeptive)社、 島津製作所等のペプチド合成機を利用し 化学合成することもできる。
[3] フラクト一ス、 マンノース、 キシルロース、 リキソースの製造
上記 [ 2 ]記載の培養により得られた形質転換体の培養液または該培養液の処理 物を酵素源として用い、 水性媒体中でフラクト一ス、 マンノース、 キシルロースお よびリキソースをそれぞれ製造（以下、 本発明の製造と呼ぶこともある） すること ができる。
培養液の処理物としては、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を遠心分離 して得られる菌体、 該菌体の乾燥物、 該菌体の凍結乾燥物、 該菌体の界面活性剤処 理物、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩碎処理物、 該菌体の溶媒処理物、 該菌体の酵素処理物、 該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体よ り抽出して得られる酵素標品等をあげることができる。
本発明の製造において用いられる酵素源は、 37°Cで 1分間に 1ミリモルのフラ クト一ス、 マンノース、 キシルロース、 リキソースを生成することのできる活性を 1単位 （U) として、 lmU/l~ 1， 000U/1であり、 好ましくは 1 OmU /1~100U/1の濃度で用いる。
本発明の製造において用いられる水性媒体としては、 水、 りん酸塩、 炭酸塩、 酢 酸塩、 ほう酸塩、 クェン酸塩、 トリス等の緩衝液、 メタノール、 エタノール等のァ ルコール類、 酢酸ェチル等のエステル類、 ァセトン等のケトン類、 ァセトアミ ド等 のアミ ド類等をあげることができる。 また、酵素源として用いた微生物の培養液を 水性媒体として用いることができる。
本発明の製造において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加しても よい。 界面活性剤としては、 ポリオキシエチレン ·ォク夕デシルァミン （例えばナ イミーン S-215、 日本油脂社製） 等の非イオン界面活性剤、 セチルトリメチルアン モニゥム 'ブロマイ ドゃアルキルジメチル 'ベンジルアンモニゥムクロライ ド （例 えばカチオン F2-40E、 日本油脂社製）等のカチオン系界面活性剤、 ラウロイル 'ザ ルコシネート等のァニオン系界面活性剤、 アルキルジメチルァミン（例えば三級ァ ミン FB、 日本油脂社製） 等の三級アミン類等、 フラクトース、 マンノース、 キシル ロース、 リキソースの生成を促進するものであればいずれでもよく、 1種または数 種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、 通常 0 . 1〜5 0 g/ 1の濃 度で用いられる。 有機溶剤としては、 キシレン、 トルエン、 脂肪族アルコール、 ァ セトン、 酢酸ェチル等が挙げられ、 通常 0 . 1〜5 O m l / 1の濃度で用いられる 本発明の製造は水性媒体中、 p H 5〜 l 0、 好ましくは p H 6〜8、 2 0〜6 0 °Cの条件で 1〜9 6時間行う。 該生成反応において、 必要に応じて MgC 12等の無 機塩等を添加することができる。
水性媒体中に生成したフラクトース、 マンノース、 キシルロースおよびリキソ一 スの定量は Dionex社製の糖分析装置等を用いて行うことができる〔Anal. Biochem. , 189, 151 ( 1990)〕 。
反応液中に生成したフラクト一ス、 マンノース、 キシルロースまたはリキソース の採取は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うことができ る。 図面の簡単な説明
第 1図 マンノースイソメラ一ゼ発現プラスミ ド p Y P 2 7の造成工程を示す図で ある。 図中、 ΑπιρΊまアンピシリン耐性遺伝子、 Ptrpはトリブトファンプロモーター 、 yihSはマンノースイソメラーゼ遺伝子を表す。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな い。
実施例 1 ェシエリヒア'コリ由来のマンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質 をコードする DN A発現株の造成
ェシエリヒア ·コリ W3110(ATCC27325)株を公知の方法 〔例えば、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)〕 に従って培 養し、 該微生物の染色体 DN Aを単離，精製した。
公知のェシエリヒア 'コリの染色体 DN Aの塩基配列 〔Science, 277, 1453 (1997)〕情報、エール大学により推定された染色体上のマンノースイソメラーゼ遺 伝子位置情報、およびェシヱリヒア ·コリの染色体上の 87.7分の位置に機能未知の 遺伝子が存在するとの情報を基に、配列番号 3記載の塩基配列を有する D N Aブラ イマ一と配列番号 4記載の塩基配列を有する D N Aプライマーをパーセプティブ •バイオシステムズ社製 8905型 DN A合成機を用いて合成した。
該合成 DNAをプライマ一セットとしてェシエリヒア ·コリ W3110株の染色体 D NAを錡型として PCRを行った。
PCRは染色体 DNAO. lj g, プライマ一各 0. 5 mol/L Pf u DNA ポリメラーゼ（ストラタジーン社製） 2. 5 units, Pf u DNAポリメラ一ゼ用x 10緩衝液（ストラ夕ジーン社製） 4 l、deoxyNTP各 200 mol/Lを含む反応 液 40 1を用い、 94°C— 1分、 42°C— 2分、 72 °C— 3分の工程を 30回繰 り返すことにより行った。
該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、用いたプライマーに基づく DNA断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量の TE〔10 mmol/L Tr i s-HC 1 (pH8. 0) 、 1 mmol/L EDTA〕飽和フエノール/クロ口 ホルム （ l vo l/l vo l) 溶液を添加し、 混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に 2倍容量の冷エタノールを加えて混合し 、 —80°Cで 30分間放置した。 該放置液を遠心分離し DN Aの沈殿を得た。
該 DNAの沈殿を 20〃1の TEに溶解した。該溶解液 5 1を用い、 DNAを 制限酵素 C 1 a Iおよび B amH Iで切断し、ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離した後、 ジーンクリーン IIキットを用いて 1. 3 kbの断片を回収し た。 pTr S 30 DNA0. 2 j gを制限酵素 C 1 a Iおよび B amH Iで切断 後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 同様に 4. 2 kbの断片 を回収した。
該 1. 3kbおよび 4. 2 kbの断片をライゲ一シヨンキットを用いて、 16°C 、 1 6時間、 連結反応を行った。該連結反応液を用いてェシヱリヒア * UNM 5 22株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンビシリン 50 g/mlを含む LB寒天培地に塗布後、 30°Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってブラスミ ド を抽出し、 発現プラスミ ドである pYP 27を得た。該プラスミ ドの構造を制限酵 素消化により確認した （第 1図） 。 該プラスミ ドを含有する形質転換体を、 以下、 Escherichia coli NM522/pYP27と呼ぶ。
実施例 2. マンノース、 フラクト一ス、 キシルロースおよびリキソースの製造 実施例 1で取得した Escherichia coli NM522/pYP27株をァンピシリン 50〃 g/ mlを含む LB培地 8 mlの入った太型試験管に接種し、 28°。で 1 7時間培養し た。
該培養液を、アンピシリン 50 g/m 1を含む M 9培地 8mlの入った太型試 験管に、 1%接種し、 37°Cで 7時間培養した。
該培養液を遠心分離し、 湿菌体を取得した。
該湿菌体は必要に応じて— 20 °Cで保存することが可能で、使用前に解凍して用 いることができる。
100 画 ol/L T r i s— HC 1 (pH 7. 5) 、 50 誦 ol/L M g C 12、 0. 4% ナイミーン S— 2 1 5からなる溶液に、マンノースの製造では 100 讓 ol/L フラクトースを、 フラクト一スの製造では 100 薩 ol/L マンノースを、 キシル口 —スの製造では 100 腿 ol/L リキソースを、 リキソースの製造では 100 廳 ol/L キシルロースをそれぞれ添加した反応液を調製した。
調製したこれら反応液 0. 1mlに、 上記で取得した湿菌体を終濃度 6 Omg/ ml添加し、 37°Cで 1時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイォネックス社製糖分析装置 (DX-500)を用いて分析 した。
反応液中に、 21. 9 腿 ol/Lのマンノース、 74. 4 顧 ol/Lのフラクト一ス、 70. 4 腿 ol/Lのキシルロースおよび 24. 4 讓 ol/Lのリキソースがそれぞれ生 成蓄積していた。
ぺク夕一のみを含む ^ coli NM522/pTrS30株ではいずれの糖の生成も認められな かった。 産業上の利用可能性
本発明により、マンノースイソメラ一ゼを遺伝子組換え手法により大量に生産す ることができる。 また、 該酵素を用いることにより効率的にマンノース、 フラクト ース、 キシルロース、 リキソースを製造できる。
「配列表フリ一テキスト」
配列番号 3—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 4—人工配列の説明：合成 D N A

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換 若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつマンノースイソメラ一ゼ活性を有 する蛋白質。
2. 配列番号 1記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする D NA。
3. 配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換 若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつマンノースイソメラ一ゼ活性を有 する蛋白質をコードする D N A。
4. 配列番号 2記載の塩基配列を有する D N A。
5. 請求項 2〜4いずれかに記載の D N Aとストリンジェントな条件下でハ ィブリダイズし、かつマンノ一スィソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする D N A。
6. 請求項 2〜 5いずれか 1項に記載の D N Aをベクターに組み込んで得ら れる組換え体 D NA。
7. 請求項 6記載の組換え体 D N Aを宿主細胞に導入して得られる形質転換 体。
8. 形質転換体がェシエリヒア ·コリである、 請求項 7記載の形質転換体。
9. 請求項 7または 8記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中にマンノ —スイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採 取することを特徴とする、マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質の製造方法
10. マンノースィソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする D N Aを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびマンノースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でフラクトース を生成蓄積させ、該水性媒体中からフラクトースを採取することを特徴とするフラ クトースの製造法。
11. マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする D N Aを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびフラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でマンノース を生成蓄積させ、該水性媒体中からマンノースを採取することを特徴とするマンノ ースの製造法。
12. マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする D N Aを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびリキソースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でキシルロース を生成蓄積させ、該水性媒体中からキシルロースを採取することを特徴とするキシ ルロースの製造法。
13. マンノースイソメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする D NAを導入 して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該 酵素源およびキシルロースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でリキソース を生成蓄積させ、該水性媒体中からリキソースを採取することを特徴とするリキソ ースの製造法。
14. 形質転換体が、 請求項 7または 8記載の形質転換体である、 請求項 1 0 〜 1 3いずれか 1項に記載の製造法。
PCT/JP2000/002545 1999-04-22 2000-04-19 Nouvelle mannose isomerase et adn codant pour cette enzyme WO2000065072A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00917363A EP1172440A4 (en) 1999-04-22 2000-04-19 MANNOSE ISOMERASE AND DNA ENCODING THE ENZYME
AU38395/00A AU3839500A (en) 1999-04-22 2000-04-19 Novel mannose isomerase and dna encoding the enzyme
US09/958,548 US6673581B1 (en) 1999-04-22 2000-04-19 Mannose isomerase and DNA encoding the enzyme

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11429499 1999-04-22
JP11/114294 1999-04-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000065072A1 true WO2000065072A1 (fr) 2000-11-02

Family

ID=14634271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/002545 WO2000065072A1 (fr) 1999-04-22 2000-04-19 Nouvelle mannose isomerase et adn codant pour cette enzyme

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6673581B1 (ja)
EP (1) EP1172440A4 (ja)
KR (1) KR100750846B1 (ja)
CN (1) CN1332031C (ja)
AU (1) AU3839500A (ja)
WO (1) WO2000065072A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013062102A1 (ja) * 2011-10-27 2013-05-02 国立大学法人香川大学 ポリオール酸化酵素
WO2022149542A1 (ja) * 2021-01-06 2022-07-14 国立大学法人山口大学 Ｄ－マンノース異性化酵素及びｄ－フルクトースの製造方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161514B (zh) * 2018-09-28 2020-08-04 江南大学 一种重组d-甘露糖异构酶及其在d-甘露糖生产中的应用
CN115725558A (zh) * 2022-09-01 2023-03-03 沈阳农业大学 一种高稳定性耐乙醇型甘露糖异构酶及其编码基因

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06292578A (ja) * 1993-04-08 1994-10-21 Amano Pharmaceut Co Ltd 耐熱性マンノースイソメラーゼ及びその製造法並びにこれを用いたマンノースの製造法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4492755A (en) * 1982-06-30 1985-01-08 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing L-mannose to L-fructose
US5240717A (en) * 1990-02-28 1993-08-31 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Process for mannose and mannose isomerase production using mannose isomerase-producing pseudomonas
JPH089986A (ja) 1994-07-01 1996-01-16 Nisshin Seito Kk マンノースまたはマンノース・フラクトース混合物の 製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06292578A (ja) * 1993-04-08 1994-10-21 Amano Pharmaceut Co Ltd 耐熱性マンノースイソメラーゼ及びその製造法並びにこれを用いたマンノースの製造法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.J. STEVENS ET AL.: "Some properties of D-maannose isomerase from Escherichia coli K12", J. GEN. MICROBIOL.,, vol. 124, no. 1, 1981, pages 219 - 223, XP002929580 *
FREDERICK R. BLATTNER ET AL.: "The complete genome sequence of Escherichia coli K-12", SCIENCE,, vol. 277, no. 5331, 1997, pages 1453 - 1474, XP002929582 *
GUY PLUNKETT III. ET AL.: "Analysis of the Escherichia coli genome. III. DNA sequences of the region from 87.2 to 89.2 minutes", NUCLEIC ACIDS RES.,, vol. 21, no. 15, 1993, pages 3391 - 3398, XP002929581 *
See also references of EP1172440A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013062102A1 (ja) * 2011-10-27 2013-05-02 国立大学法人香川大学 ポリオール酸化酵素
WO2022149542A1 (ja) * 2021-01-06 2022-07-14 国立大学法人山口大学 Ｄ－マンノース異性化酵素及びｄ－フルクトースの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1332031C (zh) 2007-08-15
EP1172440A1 (en) 2002-01-16
AU3839500A (en) 2000-11-10
KR20010110786A (ko) 2001-12-13
KR100750846B1 (ko) 2007-08-22
EP1172440A4 (en) 2002-09-04
CN1347455A (zh) 2002-05-01
US6673581B1 (en) 2004-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4188561B2 (ja) 糖転移酵素および該酵素をコードするｄｎａ
JP4275529B2 (ja) α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素およびシアル酸含有複合糖質の製造法
US7939294B2 (en) DNA encoding proteins having dipeptide-synthesizing activity and methods of using the same
JP3939096B2 (ja) Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼおよび該酵素をコードするｄｎａ
WO2000065072A1 (fr) Nouvelle mannose isomerase et adn codant pour cette enzyme
WO2006101023A1 (ja) ジペプチドの製造法
JP4048173B2 (ja) α１，２−フコース転移酵素および該酵素をコードするＤＮＡ
WO2001021774A1 (fr) Nouveau gene transaldolase
US20090068713A1 (en) Process for producing gamma-glutamylamide compounds
JPWO2002088364A1 (ja) β１，３−ガラクトース転移酵素および該酵素をコードするＤＮＡ
WO2001077314A1 (fr) Gene $g(a)2,3-sialyltransferase modifie, son procede de production et saccharide complexe contenant de l'acide sialique
JPWO2002033070A1 (ja) Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素および該酵素をコードするｄｎａ
JP4142582B2 (ja) β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素およびＮ−アセチルグルコサミン含有複合糖質の製造法
JP4124732B2 (ja) α１，４−ガラクトース転移酵素およびガラクトース含有複合糖質の製造法
JPWO2008056759A1 (ja) ジペプチドの製造法
JP2002119288A (ja) α１，２−フコース転移酵素および該酵素をコードするＤＮＡ
JP2002335969A (ja) α１，４−グルコース／ガラクトース転移酵素および該酵素をコードするＤＮＡ
WO2001077337A1 (fr) Gene transferase $g(a)1,4-n-acetylgalactosamine et procede de production de cette enzyme et glucide complexe contenant n-acetylgalactosamine
JP2009171948A (ja) ジペプチドの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 00806537.3

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09958548

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020017013397

Country of ref document: KR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2000 614406

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000917363

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020017013397

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000917363

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642